Vesikel Bakteria Menyekat Replikasi Viral dalam Makrofaj Melalui TLR4-paksi TRIF
Sep 27, 2023
Abstrak
Bakteria gram-negatif secara semula jadi merembeskan vesikel membran luar (OMVs) bersaiz nano, yang merupakan perantara penting komunikasi dan patogenesis. Pengambilan OMV oleh sel hos mengaktifkan isyarat TLR melalui PAMP yang diangkut. Sebagai sel imun pemastautin yang penting, makrofaj alveolar terletak di antara muka tisu udara di mana ia terdiri daripada barisan pertahanan pertama terhadap mikroorganisma dan zarah yang disedut. Sehingga kini, sedikit yang diketahui tentang interaksi antara makrofaj alveolar dan OMV daripada bakteria patogen. Tindak balas imun terhadap OMV dan mekanisme asas masih sukar difahami. Di sini, kami menyiasat tindak balas makrofaj manusia utama kepada vesikel bakteria (Legionella pneumophila, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Salmonella enterica, Streptococcus pneumoniae) dan memerhatikan pengaktifan NF-κB yang setanding merentas semua vesikel yang diuji. Sebaliknya, kami menerangkan isyarat IFN jenis pembezaan dengan fosforilasi STAT1 yang berpanjangan dan induksi Mx1 yang kuat, menyekat replikasi virus influenza A hanya untuk OMV Klebsiella, E.coli dan Salmonella. Kesan antivirus yang disebabkan oleh OMV kurang ketara untuk Clear coli OMV bebas endotoksin dan OMV yang dirawat Polymyxin. Rangsangan LPS tidak dapat meniru status antivirus ini, manakala kalah mati TRIF membatalkannya. Yang penting, supernatan daripada makrofaj yang dirawat OMV mendorong tindak balas antivirus dalam sel epitelium alveolar (AEC), mencadangkan komunikasi antara sel yang disebabkan oleh OMV. Akhirnya, keputusan telah disahkan dalam model jangkitan ex vivo dengan tisu paru-paru manusia primer. Kesimpulannya, OMV Klebsiella, E.coli dan Salmonella mendorong imuniti antivirus dalam makrofaj melalui isyarat TRIF4-TLR untuk mengurangkan replikasi virus dalam makrofaj, AEC dan tisu paru-paru. Bakteria gram-negatif ini mendorong imuniti antivirus dalam paru-paru melalui OMV, dengan kesan yang berpotensi menentukan dan besar pada hasil koinfeksi bakteria dan virus.
sistem imun yang meningkatkan tumbuhan cistanche
Kata kunci
Vesikel ekstraselular, Vesikel membran luar, Jangkitan bersama bakteria dan virus, Pneumonia, Makrofaj, Sel epitelium alveolar, Imuniti semula jadi antivirus
pengenalan
Vesikel membran luar (OMV) secara semula jadi dikeluarkan oleh bakteria gram-negatif, yang berukuran sehingga 300 nm diameter. Bakteria Gram-positif sama-sama mampu melepaskan vesikel membran (MV). Hasil daripada biogenesisnya, struktur membran dwilapisan lipid ini mengandungi, sebagai tambahan kepada kandungan periplasmik, komponen utama membran bakteria (luar) seperti lipid, protein, dan, dalam kes bakteria gram-negatif, lipopolisakarida (LPS) [1]. Sebagai tambahan kepada peranannya dalam komunikasi bakteria, OMV telah dikaitkan dengan kesan patogenik dan pengangkutan faktor virulensi, contohnya VacA daripada Helicobacter pylori, toksin Shiga daripada Shigella dysenteriae atau ClyA daripada enterohemorrhagic Escherichia coli [2]. OMV ini ditunjukkan untuk memanipulasi sel epitelium dan tindak balas imun. Kehadiran endotoksin bakteria pada permukaan OMV bersama-sama dengan corak molekul berkaitan patogen (PAMP) yang diangkut lain menjadikannya perangsang kuat untuk sel imun, kerana ia masih boleh dikenali oleh reseptor masing-masing [3]. Penglibatan reseptor Tolllike (TLR) dan reseptor seperti Nod dalam sel imun semula jadi boleh mencetuskan pembebasan sitokin pro-radang dan imunoregulasi, termasuk pengambilan neutrofil atau gangguan persimpangan ketat dalam lapisan sel epitelium [4]. Satu jenis sel imun pemastautin yang penting dalam paru-paru ialah makrofaj alveolar (AMs), yang berada di antara muka tisu udara dalam alveoli. Melalui pengambilan zarah yang disedut, AM mewakili barisan pertahanan pertama terhadap mikroorganisma dan zarah melalui fagositosis dan degradasi. Apabila pertemuan patogen, makrofaj membentangkan antigen kepada sel imun adaptif dan membebaskan sitokin pro-radang. Oleh itu, mereka boleh bertindak pada sel epitelium alveolar jenis I dan II (AEC) dan sel imun lain (Fail tambahan 1: Rajah S1A). AM boleh diaktifkan oleh beberapa PAMP untuk mendorong isyarat intraselular dan induksi corak ekspresi gen yang berbeza melalui reseptor imun yang pelbagai [5, 6], yang membawa kepada isyarat MyD88 atau TRIF, yang kedua-duanya, seterusnya, mendorong subset gen yang berbeza (Fail tambahan 1 : Rajah S1B). Selain itu, mereka memenuhi fungsi lain dalam homeostasis dan patogenesis pulmonari, menjadikannya hab isyarat pusat dan pengatur dalam imuniti paru-paru. Virus influenza tergolong dalam keluarga Orthomyxoviridae dan menyebabkan jangkitan saluran pernafasan atas dan bawah, daripada kes ringan hingga teruk. Walaupun kebanyakan jangkitan virus influenza bermusim adalah membatasi diri, sesetengah pesakit mengalami radang paru-paru dan sindrom gangguan pernafasan akut yang dianggarkan mengakibatkan sehingga 650,000 kematian tahunan di seluruh dunia [7]. Virus Influenza A (IAV) terutamanya menjangkiti sel epitelium saluran pernafasan dan mereplikasi di dalamnya. Jangkitan virus membawa kepada pengaktifan reseptor pengecaman corak (PRR) dan isyarat melalui beberapa faktor transkripsi, iaitu faktor nuklear kappa B (NF-κB) dan faktor pengawalseliaan interferon (IRF)-3/7, yang mendorong jenis I dan III pengeluaran interferon (IFN). Tindak balas IFN yang menonjol ini akibatnya mendorong "keadaan antivirus" selular dalam cara auto- dan paracrine [8]. Selain itu, beberapa sitokin dan kemokin lain dirembeskan apabila dijangkiti. Rangkaian sitokin pertahanan hos yang dikawal ketat ini merekrut populasi sel imun ke tapak jangkitan dan mengatur tindak balas imun semula jadi dan adaptif [9]. Walau bagaimanapun, IAV juga boleh menjangkiti AM, mengakibatkan bilangan AM berkurangan secara drastik semasa jangkitan akut, yang perlu diwujudkan semula untuk menyelesaikan jangkitan. Pengaktifan sel imun semula jadi dan rembesan sitokin pro-radang membawa kepada pengambilan sel semula jadi tambahan, mengawal jangkitan dan memulakan pembaikan tisu [10, 11]. Di sini, kami menganalisis tindak balas makrofaj kepada vesikel ekstraselular bakteria dan kesannya terhadap jangkitan IAV berikutnya.
faedah suplemen cistanche-bagaimana untuk menguatkan sistem imun
Klik di sini untuk melihat produk Cistanche Enhance Immunity
【Minta lebih lanjut】 E-mel:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Bahan dan kaedah
Bahan kimia dan antibodi
Medium F12 Ham diperolehi daripada GE Healthcare Europe (Freiburg, Jerman). RPMI-1640, DMEM, GlutaMAX, Penicillin/Streptomycin dan FCS telah dibeli daripada Life Technologies (Darmstadt, Jerman). PBS diperoleh daripada Capricorn Scientific GmbH (Ebsdorfergrund, Jerman). Opti-MEM diperoleh daripada Thermo Fisher Scientific (Frankfurt, Jerman). Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) dibekalkan oleh Sigma-Aldrich Chemie (Munich, Jerman). LPS (Salmonella Minnesota R595, gred TLR) diperoleh daripada Enzo Life Sciences (Lausen, Switzerland). Pam3CSK4 telah dibeli dari Invivogen (San Diego, Amerika Syarikat). Perencat JAK Ruxolitinib diperoleh daripada Biozol Diagnostics Vertrieb GmbH (Eching, Jerman). Polymyxin B telah dibeli daripada Merck Millipore (Billerica, USA). Antibodi diperoleh daripada Abcam (Cambridge, UK): Mx1 (ab95926), nukleoprotein influenza (9G8); Isyarat Sel (Cambridge, UK): phospho-IRF-3 (Ser396)(4D4G), phospho-TBK-1 (Ser172)(D52C2), TBK-1 (61223S), phospho- STAT1 (Tyr)(58D6), STAT1 (D1K9Y), anti-arnab tetikus (L27A9), IRAK-1 (4359S), phospho-p38 (Tr180/Tyr182)(9211S), p38 (9212S); Thermo Fisher Scientific: anti-tikus kambing (Alexa untuk 488); ProteinTech: anti-IRF-3 (66670-1) atau Santa Cruz Biotechnology (Heidelberg, Jerman): -actin (C4), anti-tikus (mIgGκBPHRP, sc-516102). Semua bahan kimia terpakai lain adalah gred analitikal dan diperoleh daripada sumber komersial.
Kultur bakteria dan penyediaan OMV/MV
L. pneumophila strain Corby wildtype telah dikendalikan seperti yang diterangkan sebelum ini [12]. K. pneumoniae (#700721/ MGH78578), E.coli (#25922) dan S. enterica serovar Typhimurium (#14028) diperoleh daripada American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). ClearColi™ BL21 adalah daripada BioCat GmbH (Heidelberg, Jerman). S. pneumoniae D39 Δcps telah disediakan oleh Sven Hammerschmidt. Bakteria ditanam pada plat agar semalaman (MacConkey: Kp, Ec, Sal; LB: Clear coli; blood agar plates: Sp) dan kemudian digunakan untuk menyuntik media cecair (LB: Kp, Ec, Sal, Clear coli; THY: Sp) . Bakteria telah ditanam sehingga fasa logaritma lewat pada 37 darjah di bawah goncangan berterusan (MaxQ 6000, Thermo Fisher Scientific, Karlsruhe, Jerman; kecuali Sp). Kultur bakteria kemudiannya dipusing ke bawah tiga kali (4,500×g, 15 min, 4 darjah; Multifuge X3R, Thermo Fisher Scientific). Bakteria yang tinggal telah disingkirkan melalui penapisan steril melalui liang 0.22 µm. Supernatan itu tertumpu dengan penapis pemotongan berat molekul 100 kDa (Merck KGaA, Darmstadt, Jerman) dan vesikel telah disucikan sama ada dengan ultrasentrifugasi atau mengikut kromatografi pengecualian saiz (SEC). Untuk ultrasentrifugasi, supernatan telah ultrasentrifugasi pada 100,000×g, 3 jam, 4 darjah . Selepas membasuh pelet OMV/MV yang diperoleh dengan PBS steril, ultrasentrifugasi diulang dan pelet vesikel dibubarkan dalam PBS steril. Kandungan protein ditentukan oleh kit ujian protein Pierce BCA mengikut arahan pengilang (Thermo Fisher Scientific), dan jumlah protein yang sama digunakan untuk eksperimen rangsangan. Untuk SEC, supernatan telah tertumpu kepada 500 µL dan dimuatkan pada lajur asal/70 nm Gen 2 (IZON Science LTD, Lyon, Perancis), yang telah dicuci terlebih dahulu dengan 10 mL PBS mengikut protokol pengeluar. Vesikel telah dielusi menggunakan PBS steril dan pecahan 500 µL dikumpulkan. Vesikel telah dielusi dalam pecahan 7-12, yang ditentukan oleh sitometri aliran nano (nFCM; NanoFCM Co., Ltd, Nottingham, UK). Pecahan yang mengandungi vesikel terkumpul telah ditumpukan kepada 200-400 µL menggunakan penapis potong berat molekul (Merck KGaA). Kepekatan vesikel semua persediaan ditentukan oleh nFCM dan jumlah vesikel yang sama digunakan untuk eksperimen rangsangan. Penyediaan OMV/MV bagi kedua-dua kaedah penulenan telah diperiksa untuk mencemari bakteria dengan menyadur dan menyimpan dalam aliquot pada -20 darjah .
NFC
Untuk nFCM, Nano Analyzer, (NanoFCM Co., Ltd, Nottingham, UK) yang dilengkapi dengan laser 488 nm telah ditentukur dengan manik polistirena 200 nm (NanoFCM Co.) dengan kepekatan tertentu 2.08×10^8 zarah/ ml dan juga digunakan sebagai rujukan untuk kepekatan zarah. Di samping itu, manik silika monodisperse (NanoFCM Co.) daripada empat saiz berbeza digunakan sebagai piawai rujukan saiz untuk menentukur saiz vesikel. 1×PBS yang baru ditapis (0.1 µm) dianalisis sebagai isyarat latar belakang dan ditolak daripada ukuran lain. Setiap histogram taburan atau plot titik diperoleh daripada data yang dikumpul selama 1 minit dengan tekanan sampel 1 kPa. Sampel OMV telah dicairkan dengan ditapis (0.1 µm) 1×PBS, menghasilkan kiraan zarah dalam julat optimum 2,500–12,000 peristiwa. Kepekatan zarah dan taburan saiz dikira menggunakan perisian nFCM (NF Profession V1.08).
Mikroskopi elektron penghantaran (TEM)
Grid kuprum bersalut karbon (400 mesh) telah dihidrofilkan dengan nyahcas cahaya (PELCO easiGlow, Ted Pella, USA). Lima µL sampel telah digunakan pada grid terhidrofilik, dan diwarnai dengan 2% (w/v) uranil asetat selepas satu langkah membasuh yang singkat dengan air suling berganda. Sampel dianalisis dengan mikroskop elektron penghantaran JEOL JEM-2100 menggunakan voltan pecutan 120 kV. Imej diperoleh dengan kamera F214 FastScan CCD (TVIPS, Gauting, Jerman).
cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun
Kultur sel
Talian sel manusia (THP-1, A549, BEAS2B, Calu-3, HCC827) diperoleh daripada Koleksi Budaya Jenis Amerika. Sel Madin-Darby Canine Kidney II (MDCK II) telah dibeli dari ECACC-Sigma-Aldrich (Darmstadt, Jerman). Sel THP-1 Dual™ (Dual) dan THP-1 Dual™ TRIF-KO (TRIF−/−) diperoleh daripada Invivogen Europe (Toulouse, Perancis). Sel telah ditanam dalam Ham F12, DMEM atau RPMI-1640 ditambah dengan 1 mM natrium piruvat, 2 mM glutamin serta 10% haba FCS yang diaktifkan pada keadaan kultur sel. THP-1 Dual™ sel telah ditanam dalam RPMI-1640 ditambah dengan 1% Penicillin/Streptomycin, 2 mM glutamin, 10% haba tidak aktif FCS, 100 µg/mL Normocin™ dan 25 mM HEPES penimbal. Sel THP-1, Dual, dan TRIF−/− dibezakan dalam sel seperti makrofaj dengan penambahan 20 nM PMA selama 24 jam.
Pengklonan Mx1 ke dalam vektor SparQ
Urutan pengekodan Mx1 dijana daripada THP-1 cDNA oleh Phusion PCR menggunakan Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, Ipswich, USA) mengikut arahan pengilang. HAtag telah ditambahkan dengan menggabungkan jujukan pengekodan HA kepada primer terbalik (deria: 5′-atcggaTTCGAAATGGTTGTT TCCGAAGTGGAC-3′, antisense: 5′-tccgatGCGGCC GCTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAA CCGGGGAACT}}}′′). Serpihan PCR serta vektor SparQ (Addgene, Watertown, Amerika Syarikat) telah dicerna dengan enzim sekatan BstbI dan NotI (Thermo Fisher Scientific) dan diikat dengan T4 DNA Ligase (New England Biolabs) ke dalam vektor SparQ.
Pemindahan sel HEK293T dan pengeluaran Lentivirus
Sel HEK293T telah ditransfeksi dengan vektor SparQ yang dicairkan dalam Opti-MEM yang mengandungi jujukan untuk Mx1 dan jujukan GFP, vektor pembungkusan virus psPAX2 dan sampul plasmid pVSV-G (Addgene) dengan Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) mengikut protokol pengeluar. Lentivirus dihasilkan dan supernatan yang mengandungi virus dikumpulkan setiap hari selama 72 jam. Supernatan telah ditapis menggunakan penapis 0.45 µm dan sel THP{10}} telah ditransduksi (lihat di bawah). Vektor SparQ kosong tanpa jujukan Mx1 telah digunakan untuk transduksi sel untuk menjana garis sel kawalan yang sepadan (VC{12}}kawalan vektor).
Transduksi sel THP‑1
Sel THP-1 telah ditransduksi dengan lentivirus daripada supernatan ditapis kultur sel HEK293T (lihat di atas). Polybrene (4 µg/mL, Sigma-Aldrich) telah ditambah untuk meningkatkan keberkesanan transduksi. Sel telah diinkubasi sehingga enam hari. Sel-sel positif GFP telah diisih mengikut sitometri aliran.
Pengasingan dan pembezaan BDM
Monosit manusia daripada penderma yang sihat telah diasingkan oleh pemilihan positif CD14 magnetik daripada sel mononuklear darah periferal dan dibezakan kepada makrofaj yang diperolehi darah (BDM) dengan kehadiran 1% ABserum manusia seperti yang diterangkan sebelum ini [13].
Rangsangan OMV/MV makrofaj
Makrofaj manusia utama atau sel THP-1 yang dibezakan telah diinkubasi dengan OMV/MV yang telah disucikan (1 µg/mL setiap satu untuk vesikel yang disucikan melalui ultrasentrifugasi dan kepelbagaian vesikel (MOV) sebanyak 1,000 untuk SEC-purified vesikel) sehingga 20 jam dalam media yang lengkap. Permohonan perencat tambahan dilakukan 1 jam sebelum rawatan vesikel. Makrofaj yang dirangsang Te sama ada digunakan untuk pengasingan protein atau RNA atau eksperimen jangkitan berikutnya. Supernatan yang mengandungi sitokin yang diperoleh digunakan untuk analisis ELISA atau LDH atau ditapis steril dan digunakan untuk rangsangan sel epitelium.
Pembersihan virus dan titrasi virus
Pembersihan virus dan titrasi virus dilakukan dalam sel MDCK II seperti yang diterangkan sebelum [14]. Titer virus ditentukan oleh ujian plak seperti yang diterangkan sebelum ini [15]. Secara ringkas, sel MDCK II yang bercampur telah dijangkiti virus atau supernatan tisu yang dicairkan secara bersiri (dalam medium kultur MDCK II tanpa FCS). Virus ini dibenarkan untuk menjerap ke dalam sel selama 1 jam pada suhu 37 darjah. Sepuluh, inokulum telah digantikan dengan media segar (ditambah dengan 1 ug/mL TPCK yang dirawat trypsin (untuk IAV) dan 1% Avicel® PH-101 (Sigma-Aldrich)). Sel MDCK II telah diwarnai dengan kristal ungu atau sel yang dijangkiti virus telah diwarnai dengan antibodi primer (1:2,000) (nukleoprotein anti-influenza A tikus, MCA400, Bio-Rad, Jerman) dan antibodi sekunder ( 1:4,000) (Goat Anti-Mouse IgGHRP, 170–6516, Bio-Rad, Jerman) untuk ujian plak. Plak dikira secara manual dan dinyatakan sebagai unit pembentuk plak (pfu) setiap mL.
manfaat cistanche untuk lelaki-menguatkan sistem imun
Jangkitan virus
Selepas 20 jam pra-stimulasi dengan vesikel bakteria atau supernatan yang mengandungi sitokin, sel telah dijangkiti IAV atau virus stomatitis vesikular (VSV). Makrofaj telah dijangkiti H1N1 (A/WSN/33) atau VSV, manakala sel epitelium dijangkiti H1N1 (A/Hamburg/2009/PDM) kedua-duanya dalam media segar tanpa FCS. Selepas 1 jam inokulasi, virus bebas dikeluarkan dan media digantikan dengan media yang mengandungi TPCK-trypsin untuk IAV atau media kosong untuk VSV. Sel telah diinkubasi sehingga 48 jam untuk membolehkan replikasi multicyclic.
Penyediaan PCLS manusia
Tisu paru-paru diperoleh daripada pesakit yang menjalani reseksi lobus akibat kanser paru-paru di Sekolah Perubatan Hannover (MHH, Hannover, Jerman). Hanya tisu daripada bahagian paru-paru yang bebas penyakit secara makroskopik dan mikroskopik digunakan untuk eksperimen. Potongan paru-paru potong ketepatan manusia (PCLS) telah disediakan seperti yang diterangkan sebelum [16]. Dua hirisan tisu setiap telaga telah ditanam dalam 24-plat perigi dalam keadaan terendam (DMEM/F12 ditambah dengan 1% Penicillin/Streptomycin) pada 37 darjah , 5% CO2 semalaman.
Jangkitan IAV PCLS
PCLS telah dirangsang dengan 1 µg/mL OMV yang disucikan daripada L. pneumophila atau K. pneumoniae yang dicairkan dalam DMEM/F12 ditambah dengan 1% Penicillin/Streptomycin pada 37 darjah , 5% CO2 selama 20 h. Media telah dialih keluar dan PCLS telah diinokulasi dengan 25,000 pfu/telaga dalam 250 µL virus influenza A/California/04/2009(H1N1pdm). PCLS diinkubasi pada 35 darjah dan digoyangkan setiap 15 minit semasa inokulasi untuk membolehkan jangkitan virus homogen. Selepas itu, inokulum dibuang dan digantikan dengan DMEM/F12 ditambah dengan 1% Penicillin/Streptomycin. Selepas pengeraman selama 48 jam, supernatan dikumpulkan untuk pengesanan virus, pelepasan LDH, dan kuantifikasi sitokin. Sampel untuk pengukuran sitokin telah ditambah dengan koktel perencat protease 0.2% (P1860, Sigma-Aldrich, Munich, Jerman) dan disimpan pada 80 darjah sehingga analisis. PCLS dibekukan dan disimpan pada 80 darjah sehingga pemurnian RNA seperti yang diterangkan sebelum ini [17].
LDH
Ujian pelepasan LDH dilakukan mengikut arahan pengilang menggunakan Kit Ujian Sitotoksisiti LDH Pierce™ yang diperoleh daripada Roche (Mannheim, Jerman) atau Kit Pengesanan SitotoksisitiPLUS (LDH) (Roche, Merck). Penyerapan diukur menggunakan pembaca plat mikro F200Pro tak terhingga (Tecan, Männedorf, Switzerland).
ELISA
Sitokin CXCL8/IL-8, CXCL10/IP-10 dan IL-1 dikira daripada supernatan bebas sel menggunakan kit ELISA yang tersedia secara komersial (Sistem R&D, Wiesbaden, Jerman) mengikut pengilang arahan.
QUANTI‑blue™ assay
Untuk menentukan aktiviti pelapor SEAP dalam supernatan kultur sel daripada THP-1 Dual™ dan sel TRIF−/− yang sepadan, ujian QUANTI-Blue™ telah dilakukan mengikut protokol pengeluar. Secara ringkas, supernatan kultur sel dikumpulkan selepas rangsangan sel dengan OMV. Mula-mula, Penyelesaian QUANTI-Blue™ dan supernatan kultur sel diagihkan dalam plat perigi 96-bawah lemak. Selepas pengeraman pada 37 darjah selama 150 minit, ketumpatan optik pada 630 nm ditentukan dalam pembaca plat mikro F200Pro tak terhingga.
QUANTI‑luc™ assay
Untuk menentukan aktiviti wartawan Lucia luciferase dalam supernatan kultur sel daripada THP{{0}} Dual™ dan sel TRIF−/− yang sepadan, ujian QUANTI-Luc™ telah dilakukan mengikut protokol pengeluar. Secara ringkas, supernatan kultur sel telah disalurkan dalam plat perigi 96-bawah lemak putih (BRAND GmbH & Co. KG, Wertheim, Jerman). Penyelesaian ujian QUANTI-Luc™ telah ditambah dan pengukuran luminescence serta-merta dilakukan dengan masa bacaan 0.1 s dalam pembaca plat mikro F200Pro tak terhingga.
penghapusan Barat
Untuk penentuan ekspresi protein atau fosforilasi, Western Blot dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini [18].
Penyediaan RNA dan PCR masa nyata
Untuk analisis ekspresi gen, pengasingan RNA dijalankan oleh pengekstrakan fenol-kloroform dan ditranskripsi terbalik seperti yang diterangkan sebelum ini [12]. PCR masa nyata kuantitatif kemudiannya dilakukan dalam ViiA7 (Thermo Fisher Scientific) dengan Luna Universal qPCR Master Mix (New England BioLabs) dan pasangan primer tertentu. Dengan menggunakan kaedah 2−ΔΔCT [19], induksi kali ganda dikira dan keputusan dinormalisasi kepada sel kawalan yang sepadan. 18S: fwd: 5′-GACTCTTTCGAGGCCCTGTA-3′, pusingan: 5′-CACCAGACTTGCCCTCCCAAT-3′ CXCL8: fwd: 5′-ACTGAGAGTGATTGAGAG TGGAC-3′, pusingan: 5{AAGCCTTCTCT5-3}' {20}}′ IFI44: fwd: 5′-TATCCAGACAGAGCAGCTACC-3′, rev: 5′-ATAGAGAAGGCTAAGCCGCTTC-3′ IFIT1: fwd: 5′-ATGCAGGAAGAACATGACAACC-3', rev: ′-TCTGGACACTCCATTCTATAGCG-3′ IFNA1: fwd: 5′-ACAGGAGGACCTTGATGCTC-3′, pusingan: 5′-TCTGCTGGATCAGCTCATGG-3′ IFNB: fwd: 5′-AACATGACCA′{41}}' IFNB: fwd: 5′-AACATGACCA′{41}}} , pusingan: 5′-TGTCCTTGAGGCAGTATTCAAG-3′ IL1B: fwd: 5′-AGCTCGCCAGTGAAATGATGG-3′, pusingan: 5′-CAGGTCCTGGAAGGAGCACTTC-3′ IL12B: fwd: 5′-GCTGACAGA 58}}′, pusingan: 5′-CACCATTTTCCAGGGGCAT-3′ Mx1: fwd: 5′-GGGCTTTGGAATTCTGTGGC-3′, pusingan: 5′-CCTTGGAATGGTGGCTGGAT-3′ NP: fwd: 5' -GAAATTTCAAACAGCTGCACAAAG -3′, pusingan: 5′-AATATGAGTGCAGACCGTGC-3′ RPS18: fwd: 5'-GCGGCGGAAAATAGCCTTTG-3′, pusingan: 5′-GATCACACGTTCCACCT}′{{81}
Imunofluoresensi
Sel THP{{0}} telah dibezakan pada coverlips dengan penambahan 20 nM PMA dan diinkubasi dengan OMV/MV selama 20 jam. Sel-sel kemudiannya dijangkiti H1N1 (A/WSN/33; kepelbagaian jangkitan (MOI) 0.1) selama 4 jam. Selepas penetapan 15 minit dengan 3% paraformaldehid, slaid dicuci tiga kali dengan PBS dan dipermudahkan dengan 0.2% triton X-100 dalam TBS (10 min, suhu bilik). Selepas menyekat (1% BSA dalam TBS/0.2% triton X-100), sel telah diinkubasi dengan antibodi -NP (1:250, dalam larutan penyekat). Antibodi sekunder (1:1000) bersama DAPI (1:2000) diinkubasi selama 1 jam dalam gelap. Slip penutup yang dipasang telah dianalisis pada mikroskop pendarfluor (AxioVision, Zeiss, Jena, Jerman).
Kenyataan beretika
Eksperimen dengan hirisan tisu paru-paru manusia telah diluluskan oleh jawatankuasa etika Sekolah Perubatan Hannover (MHH, Hannover, Jerman) dan mematuhi Kod Etika Persatuan Perubatan Dunia (nombor 2701–2015). Semua pesakit atau waris mereka memberi kebenaran bertulis secara bertulis untuk penggunaan tisu paru-paru untuk penyelidikan. Semua penderma darah memberikan kebenaran bertulis yang dimaklumkan (nombor kelulusan etika: 161/17).
Rajah 1 Pencirian vesikel bakteria dan tindak balas dalam makrofaj manusia. A Pemisahan vesikel ekstrasel bakteria daripada protein bebas melalui kromatografi pengecualian saiz daripada supernatan bakteria yang berbeza (Legionella pneumophila (Lp), Klebsiella pneumoniae (Kp), Escherichia coli (Ec), Salmonella enterica serovar Typhimurium (Sal), dan Streptococcus pneumoniae (Sp) ). Kepekatan vesikel dalam setiap pecahan ditentukan oleh sitometri aliran nano (nFCM) dan protein dikira oleh BCA. B Taburan saiz vesikel OMV/MV yang telah dimurnikan ditentukan oleh NFC. Imej C TEM bagi OMV/MV yang telah dimurnikan. Bar skala=50 nm. BDM D-G telah dirangsang dengan OMV/MV (1 µg/mL setiap satu) daripada bakteria berbeza atau dibiarkan tanpa rawatan untuk kawalan sehingga 48 jam. D Keluaran CXCL8 ditentukan oleh ELISA dan digambarkan dalam ng/mL. Ungkapan IL1B (E) dan IL12B (F) ditentukan oleh qPCR, keputusan dinormalisasi kepada RPS18 dan digambarkan relatif kepada sel kawalan yang tidak dirawat. G Selepas 1 jam pengeraman dengan vesikel bakteria, ekspresi dan fosforilasi IRAK-1, p38 dan TBK-1 ditentukan oleh Western Blot. Keputusan perwakilan empat replika bebas biologi ditunjukkan. Bar mewakili nilai min+SEM daripada tiga (B) hingga empat (D–F) eksperimen bebas. Statistik: 2-cara ANOVA (DF); *hlm<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001; ns=not significant; n=3–4
Perangkaan
Data ditunjukkan sebagai nilai min+SEM untuk sekurang-kurangnya tiga eksperimen bebas biologi. Prisma 6.07 (GraphPad, La Jolla, USA) telah digunakan. Ujian ANOVA satu atau dua hala telah dilakukan untuk sampel yang tidak berpasangan. Nilai-P Kurang daripada atau sama dengan 0.05 dianggap signifikan secara statistik. Jika tidak dinyatakan sebaliknya, ujian telah dilakukan berbanding kawalan sepadan (*).
Ketersediaan data dan bahan
Semua data yang dijana atau dianalisis semasa kajian ini disertakan dalam artikel ini dan fail tambahannya.
Keputusan
Pengaktifan pro-radang makrofaj oleh OMV/MV
Untuk menguji tindak balas imun semula jadi makrofaj yang berasal dari darah primer manusia (BDM) kepada OMV/MV daripada bakteria berbeza, vesikel daripada Legionella pneumophila (Lp), Klebsiella pneumoniae (Kp), Escherichia coli (Ec), Salmonella enterica serovar Typhimurium (Sal). ) dan Streptococcus pneumoniae (Sp) telah diasingkan melalui kromatografi pengecualian saiz (SEC). Pecahan dianalisis untuk bilangan vesikel oleh sitometri aliran nano (nFCM) dan untuk kehadiran protein oleh BCA (Rajah 1A). Vesikel daripada pecahan 7–12 dikumpulkan dan digunakan untuk eksperimen. OMV/MV mempunyai profil pengedaran saiz yang setanding (Rajah 1B), tidak berbeza dalam saiz purata (Fail tambahan 1: Rajah S2A), tertumpu sama (Fail tambahan 1: Rajah S2B), dan divisualisasikan oleh elektron penghantaran mikroskop (TEM; Rajah 1C). BDM telah dirangsang dengan OMV/MV sehingga 48 jam, sepadan dengan kepekatan vesikel yang sama bagi bakteria berbeza (Fail tambahan 1: Rajah S2C). Pengeraman BDM dengan vesikel tidak sitotoksik (Fail tambahan 1: Rajah S2D). OMV/MV secara meluas mendorong ekspresi dan pelepasan CXCL8 daripada makrofaj (Fail tambahan 1: Rajah S3A dan 1D), manakala induksi mRNA IL1B dan IL12B bergantung kepada masa dan spesies (Rajah 1E+F). Pembebasan IL-1 bergantung pada spesies yang diasingkan vesikel bakteria (Fail tambahan 1: Rajah S3B). Walaupun fosforilasi p38 adalah setanding dalam BDM selepas 1 jam pengeraman vesikel, hanya OMV daripada degradasi IRAK-1 dan fosforilasi TBK-1 yang disebabkan oleh bakteria gram-negatif tetapi bukan MV daripada gram-positif (Rajah 1G dan Fail tambahan 1: S4A-D).
Rajah 2 Vesikel ekstrasel bakteria mengaktifkan tindak balas interferon jenis I dalam BDM. BDM telah dirangsang dengan OMV/MV (1 µg/mL setiap satu) daripada bakteria yang berbeza atau tidak dirawat sebagai kawalan. Fosforilasi dan ekspresi IRF-3 ditentukan selepas 1 jam pengeraman OMV/MV oleh Western Blot. Keputusan perwakilan tiga replika bebas biologi ditunjukkan. Ungkapan IFNA1 (B), IFNB (C), IFIT1 (E), dan IFI44 (F) diukur oleh qPCR, keputusan dinormalisasi kepada RPS18 dan digambarkan relatif kepada sel kawalan yang tidak dirawat. D Fosforilasi STAT1 ditentukan oleh Western Blot selepas 2 jam rangsangan OMV/MV. Hasil perwakilan empat replika bebas biologi ditunjukkan. G Fosforilasi STAT1 dan ekspresi Mx1 ditentukan oleh Western Blot selepas 20 jam rangsangan vesikel bakteria. Keputusan perwakilan empat replika bebas biologi digambarkan. Bar mewakili nilai min+SEM daripada empat eksperimen bebas. Statistik: 2-cara ANOVA; *hlm<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001; n=4
Selain pengaktifan NF-κB dan AP-1 dan sasaran hilirannya, isyarat PRR boleh membawa kepada pengaktifan IRF. Oleh itu, fosforilasi IRF-3 telah ditentukan. Kp/Ec/SalOMVs meningkatkan fosforilasi IRF-3 dalam BDM (Rajah 2A), menghasilkan ungkapan IFN I (Rajah 2B+C), fosforilasi hiliran STAT1 (Rajah 2D dan Fail Tambahan 1: S4E) dan induksi gen yang dirangsang interferon (ISG; IFIT1, IFI44 dan Mx1; Rajah 2E-G). Memandangkan peristiwa fosforilasi lazimnya berumur pendek dan diketahui memainkan peranan penting dalam menghidupkan lata isyarat imun, fosforilasi STAT1 juga diperiksa 20 jam selepas penambahan Kp/Ec/SalOMVs (Rajah 2G dan Fail Tambahan 1: S4F+G). Eksperimen menunjukkan bahawa OMV bukan sahaja mengaktifkan isyarat pro-radang dalam makrofaj tetapi juga isyarat antivirus diinduksi.
Pra-inkubasi OMV mengubah replikasi IAV dalam makrofaj
Mx1 ialah faktor antivirus yang terkenal menghalang replikasi IAV [20], yang dinyatakan semasa rawatan Kp/Ec/SalOMV terhadap makrofaj. Oleh itu, kami membuat hipotesis bahawa pra-rawatan OMV mengubah replikasi virus. Percubaan jangkitan IAV telah disediakan dalam sel THP-1, yang menyatakan tahap Mx1 yang serupa apabila rawatan Kp/Ec/SalOMV pada tahap mRNA dan protein (Fail tambahan 1: Rajah S5A+B) dan mendorong pemfosforilasi STAT1 , manakala jumlah protein STAT1 kekal stabil (Fail tambahan 1: Rajah S5C), dengan strain H1N1 (A/WSN/33) yang menjangkiti dan mereplikasi dalam makrofaj [21]. Pra-stimulasi sel THP-1 dengan LpOMV/SpMV meningkatkan replikasi IAV 24 jam selepas jangkitan (pi) berbanding kawalan yang dijangkiti (--), manakala pra-rawatan dengan Mx1-mendorong OMV (Kp /Ec/Sal) menyekat replikasi IAV (Rajah 3A). Walaupun pra-rawatan Pam3CSK4 agonis TLR2/1 boleh meniru kesan yang diperhatikan dengan LpOMV/SpMV, yang kedua-duanya diketahui memberi isyarat melalui TLR2/1 [12, 22, 23], LPS larut sebagai agonis TLR4 tidak menghasilkan semula Kp/Ec /Kesan SalOMV (Fail tambahan 1: Rajah S5D). Perbezaan dalam beban IAV selepas pra-rawatan juga boleh diperhatikan dengan pewarnaan imunofluoresensi terhadap nukleoprotein virus (NP) (Rajah 3B). Pra-rawatan Kp/Ec/SalOMV menyekat replikasi IAV dan kawasan NP-positif dikurangkan dengan ketara (Rajah 3C). Ini tidak dapat diperhatikan selepas pra-rawatan LpOMV/SpMV. Untuk menyiasat sama ada induksi Mx1 mencukupi untuk replikasi IAV yang disekat yang diperhatikan, Mx1 telah diekspresikan secara stabil (seks) dalam makrofaj THP-1 untuk meniru pra-stimulasi OMV (Fail tambahan 1: Rajah S5E). Jangkitan IAV sel Mx1oex mengakibatkan pengurangan kawasan NP-positif imunofluoresen 4 h pi (Rajah 3D) dan dalam replikasi virus yang dikurangkan 6 h pi berbanding kawalan vektor kosong (VC) (Rajah 3E) walaupun kepada yang lebih rendah. takat berbanding dengan prastimulasi OMV (Rajah 3A). Kesimpulannya, Kp/Ec/SalOMV mengaktifkan makrofaj dalam cara pro-radang klasik dan gen antivirus yang diinduksi mengakibatkan pengaktifan IFN-/reseptor (IFNAR), fosforilasi hiliran STAT1 dan ekspresi Mx1, yang boleh mengganggu replikasi IAV secara langsung ( Rajah 4A). Untuk mengesahkan kepentingan isyarat JAK / STAT untuk induksi tindak balas antivirus yang diperhatikan, perencat JAK (JAKi) digunakan sebelum rangsangan vesikel. Perencatan JAK tidak mengubah ekspresi CXCL8 yang disebabkan oleh Kp/SalOMV (Rajah 4B), tetapi dengan ketara mengurangkan Mx1 pada mRNA (Rajah 4C) dan tahap protein walaupun semasa jangkitan IAV (Rajah 4D dan Fail Tambahan 1: S6A). Sehubungan itu, JAKi membalikkan sekatan replikasi virus yang disebabkan oleh OMV (Rajah 4E).
Rajah 3 Mx1-mendorong OMV menyekat replikasi virus influenza A dalam sel THP-1. Replikasi virus Influenza A dalam sel THP-1 yang dibezakan. Sel sama ada pra-rawatan dengan OMV/MV (1 µg/mL setiap satu) atau dibiarkan tanpa rawatan untuk kawalan (-). Selepas 2{11}} jam pra-rawatan, sel telah dijangkiti A/ WSN/33(H1N1) (MOI 0.001) selama 24 dan 48 jam. Replikasi IAV ditentukan oleh qPCR terhadap IAV-NP yang dinormalkan kepada 18S. Nilai min±SEM daripada tiga hingga lima eksperimen bebas ditunjukkan. B sel THP{17}} yang dibezakan telah dirawat terlebih dahulu dengan OMV/MV (1 µg/mL setiap satu) atau dibiarkan tanpa rawatan untuk kawalan (–). Selepas 20 jam pra-inkubasi, sel telah dijangkiti dengan A/WSN/33(H1N1) (MOI 0.1) selama 4 jam. Selepas penetapan, sel telah diwarnai dengan antibodi NP -influenza (kuning) dan DAPI (biru). Keputusan wakil daripada empat eksperimen bebas biologi ditunjukkan. C Kuantifikasi kawasan NP positif (NP+) daripada (B). Bar mewakili nilai min bagi empat eksperimen bebas+SEM. Sel D THP-1 yang secara stabil mengekspresikan berlebihan Mx1 (Mx1oex) dan sel kawalan vektor kosong (VC) telah dijangkiti virus influenza A/WSN/33(H1N1) (MOI 0.1) selama 4 jam. Selepas penetapan dan pewarnaan imunofluoresensi dengan -influenza NP, kawasan NP+ dikira dan digambarkan secara relatif kepada sel VC. Bar menunjukkan nilai min bagi empat eksperimen bebas+SEM. E Mx1oex dan sel VC telah dijangkiti A/WSN/33(H1N1) (MOI 0.001) selama 6 jam. Replikasi virus ditentukan oleh ujian plak dan hasilnya digambarkan sebagai unit pembentuk plak (pfu) per mL. Bar mewakili nilai min+SEM bagi empat eksperimen bebas. Statistik: 2-cara ANOVA (A), 1-cara ANOVA (C), ujian-t tidak berpasangan (D+E); *hlm<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001; n=3–5
Tindak balas antivirus terhadap OMV bergantung kepada TLR4‑TRIF
Untuk mengenal pasti PRR yang terlibat, agonis imun komersial digunakan secara bersendirian atau digabungkan dengan LPS untuk meniru OMV. Walau bagaimanapun, tiada induksi Mx1 yang dicerminkan diperhatikan dengan KpOMV (Fail tambahan 1: Rajah S7), mencadangkan pengaktifan makrofaj yang berbeza dan berpanjangan oleh OMV disebabkan oleh komposisi ligan atau persembahan spatial kepada PRR. Reseptor imun yang terlibat dinilai selanjutnya oleh sel wartawan THP-1 untuk isyarat NF-κB- dan IRF (Rajah 5A). Selepas rawatan KpOMV, sel THP-1 menunjukkan ekspresi protein Mx1 yang meningkat dengan ketara (Rajah 5B dan Fail Tambahan 1: S6B), yang hilang dalam sel THP-1 kekurangan TRIF (TRIF−/−) ( Rajah 5B dan Fail tambahan 1: S6B). Perkara yang sama diperhatikan untuk wartawan IRF (Rajah 5C), manakala pengaktifan wartawan NF-κB dan induksi CXCL8 adalah tinggi dalam kedua-dua sel THP-1 dan TRIF−/− apabila dirangsang (Rajah 5D+E). Ekspresi gen IFIT1, IFI44 dan Mx1 yang bergantung kepada STAT telah diinduksi pada rangsangan KpOMV dalam sel wartawan THP-1 (Rajah 5E), manakala ia berkurangan dengan ketara dalam sel TRIF−/− yang sama dirangsang (Rajah 5E). Jangkitan IAV tambahan selepas pra-rangsangan mengakibatkan pengurangan replikasi virus, manakala pemadaman TRIF menyelamatkan replikasi IAV (Rajah 5F). Untuk menyiasat sama ada KpOMV menimbulkan tindak balas antivirus umum dalam makrofaj, sel-sel telah dijangkiti virus stomatitis vesikular (VSV), yang mereplikasi dalam sel kawalan, tetapi disekat dalam sel pra-rawatan KpOMV dan boleh diselamatkan oleh pemadaman TRIF juga (Rajah 1). 5G). Oleh kerana pengiktirafan LPS melalui TLR4 adalah penting untuk endositosis dan pengaktifan TRIF, LPS pada permukaan OMV telah dineutralkan oleh antibiotik lipopeptida Polymyxin B (PB), mengakibatkan 50% penurunan induksi Mx1 (Rajah 6A+B dan Fail Tambahan 1 : S6C), tetapi tiada perbezaan ketara dalam transkripsi CXCL8 yang bergantung kepada NF-κB (Rajah 6C). Replikasi virus telah diselamatkan ke tahap basal apabila pra-stimulasi KpOMV+PB (Rajah 6D). Oleh kerana perencatan pengiktirafan LPS oleh PB tidak mencukupi untuk menyekat sepenuhnya Mx1, OMV daripada Clear coli (Cc) bebas endotoksin telah diasingkan dan digunakan untuk pra-stimulasi. Cc menyatakan lipid A yang diubah dan tidak boleh mendorong kompleks TLR4/MD2 yang diaktifkan [24]. CcOMV tidak mendorong Mx1 (Rajah 6A+B dan Fail tambahan 1: S6C) dan tidak mengurangkan replikasi IAV dalam makrofaj (Rajah 6D). Adalah diketahui umum bahawa pengasingan vesikel ekstraselular melalui ultrasentrifugasi berbeza menghasilkan pengasingan bersama bahan cemar (cth protein atau pelengkap sel bakteria) bersama vesikel. Selaras dengan garis panduan MISEV2018 [25], percubaan utama telah diulang dengan OMV yang diasingkan melalui gabungan ultrafiltrasi (UF) dan kromatografi pengecualian saiz (SEC). Rangsangan sel wartawan THP-1 dengan KpOMV yang telah dimurnikan UF-SEC menghasilkan induksi Mx1 (Fail tambahan 1: Rajah S8A) dan wartawan IRF (Rajah S8B), manakala ia hilang dalam makrofaj TRIF−/− ( Fail tambahan 1: Rajah S8A+B). Replikasi IAV telah disekat dalam sel prarawat KpOMV dan diselamatkan apabila pemadaman TRIF (Fail tambahan 1: Rajah S8C). Aktiviti wartawan NF-κB telah diinduksi oleh KpOMV tanpa mengira status TRIF sel (Fail tambahan 1: Rajah S8D).
Rajah 4 Perencatan isyarat JAK menyelamatkan replikasi virus influenza A dalam makrofaj. OMV mengaktifkan isyarat TRIF-IRF dalam makrofaj, yang seterusnya mendorong ekspresi IFN dan melepaskan dengan isyarat IFNAR berikutnya. IFNAR memberi isyarat melalui JAK/STAT dan mendorong ekspresi ISG, salah satunya ialah Mx1. Ini membawa kepada sekatan replikasi IAV. Sel B–E THP-1 telah dipraeram selama 1 jam dengan 10 µM JAK inhibitor (JAKi) sebelum penambahan OMV (1 µg/mL; Kp/Sal) selama 2{{22 }} h. Ungkapan B–C CXCL8 (B) dan Mx1 (C) ditentukan oleh qPCR dan keputusan dinormalisasi kepada RPS18 dan digambarkan berbanding kawalan yang tidak dirawat. Bar menunjukkan nilai min tiga hingga empat eksperimen bebas+SEM. Sel pra-rawatan D+E OMV juga dijangkiti IAV (MOI 0.001). D Western blot menunjukkan ekspresi protein Mx1 pada 0-3 jam selepas jangkitan (pi). E Replikasi virus ditentukan oleh ujian plak 24 jam selepas jangkitan. Bar menunjukkan nilai min bagi empat eksperimen bebas+SEM. Statistik: 1-cara ANOVA (B+C+E); *hlm<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001; *compared to DMSO control, # as depicted in the graph; ns=not significant; n=4
Rajah 5 OMV mendorong isyarat antivirus dalam makrofaj melalui TRIF. A THP-1 Sel wartawan dwi mendorong ekspresi fosfatase alkali embrionik (SEAP) yang dirembeskan selepas pengaktifan laluan NF-κB dan ekspresi serta rembesan Lucia luciferase apabila pengaktifan laluan IRF. Selain itu, TRIF (bar kelabu) telah dibezakan dan seterusnya dirangsang dengan -/− sel mempunyai kalah mati yang stabil daripada molekul penyesuai TRIF. (BF) sel wartawan THP-1 (=Dwi; bar hitam) dan sel TRIF−/− KpOMV (1 µg/mL) selama 20} jam atau dibiarkan tanpa rawatan untuk kawalan. Selepas masa yang dinyatakan, supernatan, RNA dan/atau protein dikumpulkan. Imej B Perwakilan Western Blot bagi ekspresi protein Mx1. Aktiviti wartawan C+D Lucia (C) dan aktiviti wartawan SEAP (D) ditentukan dalam supernatan kultur sel. Supernatan yang sama digunakan untuk menentukan aktiviti kedua-dua wartawan. E Ekspresi mRNA relatif untuk gen sasaran yang bergantung kepada STAT- dan NF-κB (dari atas ke bawah: IFIT1, IFI44, Mx1, CXCL8) ditentukan oleh qPCR dan keputusan dinormalisasi kepada RPS18 dan digambarkan berbanding dengan kawalan Dual yang tidak dirangsang. Perubahan lipatan telah diubah log2. Sel juga telah dijangkiti A/WSN/33(H1N1) (MOI 0.1) selama 24 jam (F) atau VSV (MOI 0.1) selama 12 jam (G). Replikasi virus ditentukan oleh ujian plak. Bar menunjukkan nilai min bagi empat (C–F) hingga lima (G) eksperimen bebas+SEM. Statistik: 2-cara ANOVA (C–G); *hlm<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001; * compared to unstimulated Dual control, # as depicted in the graph; ns=not signifcant; n=4–5
Rajah 6 Ungkapan Mx1 akibat OMV hilang selepas perencatan LPS. Sel THP-1 diinkubasi selama 20 jam dengan OMV (1 µg/mL; Kp atau Clear coli (Cc)) sahaja atau digabungkan dengan 20 µg/mL Polymyxin B (PB) atau tidak dirawat untuk kawalan. Ekspresi protein Mx1 ditentukan oleh Western Blot. Keputusan perwakilan tiga eksperimen bebas biologi ditunjukkan. Ungkapan Mx1 B dan CXCL8 C ditentukan oleh qPCR. Bar menunjukkan nilai min bagi empat eksperimen bebas+SEM. Sel D THP-1 diinkubasi selama 20 jam dengan OMV (1 µg/mL; Kp atau Cc) sahaja atau digabungkan dengan 20 µg/mL PB atau tidak dirawat untuk kawalan dan kemudian dijangkiti dengan A/WSN/33. (H1N1) (MOI 0.001). Replikasi virus ditentukan oleh ujian plak 24 jam selepas jangkitan. Bar menunjukkan nilai min bagi empat eksperimen bebas+SEM. Statistik: 1-cara ANOVA B–D; *hlm<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001; *compared to control, #compared to KpOMV; ns=not significant; n=3–4
Kesan perencatan replikasi IAV OMV boleh dipindahkan kepada AEC
Memandangkan makrofaj bukanlah jenis sel utama untuk replikasi IAV dalam paru-paru dan kerana IFN I juga bertindak paracrine, kebolehpindahan kesan replikasi IAV kepada AEC telah diuji, kerana sel-sel ini, tidak seperti makrofaj, tidak bertindak balas secara langsung kepada OMV/MV ( Fail tambahan 1: Rajah S9). Supernatan (SN) daripada makrofaj yang dirawat KpOMV menyebabkan Mx1 dalam sel A549, berbeza dengan LpOMV-SN (Rajah 7A), manakala CXCL8 diinduksi selepas kedua-duanya (Rajah 7B). KpOMVSN mengurangkan replikasi virus (Rajah 7C), yang selaras dengan eksperimen makrofaj dan corak induksi Mx1. Untuk mengesahkan kebergantungan kesan IAVlimiting yang diperhatikan pada isyarat JAK/STAT, KpOMV-SN telah digabungkan dengan JAKi, menyekat induksi Mx1 pada rawatan KpOMV-SN (Rajah 7A) dan memulihkan replikasi IAV (Rajah 7C). Untuk meniru peraturan kompleks proses imun dalam paru-paru, jangkitan ex vivo IAV bagi kepingan paru-paru potong ketepatan manusia (PCLS) telah disediakan. Lp/KpOMV tidak sitotoksik kepada PCLS (Rajah 8A) dan gabungan pra-rangsangan OMV dan jangkitan IAV menghasilkan induksi Mx1 (Rajah 8B) dan pelepasan CXCL10 (Rajah 8C). KpOMV tetapi bukan LpOMV mengurangkan replikasi IAV dengan ketara dalam PCLS (Rajah 8D). Kesan yang diperhatikan telah dimansuhkan oleh jangkitan dengan IAV yang tidak diaktifkan UV (Rajah 8A–C). Penemuan kami membawa kepada model keradangan paru-paru di mana AM bertindak balas kepada OMV daripada bakteria gram-negatif dengan induksi IFN I, mendorong tindak balas antivirus secara autokrin dalam AM dan secara paracrine dalam AEC secara in vitro dan dalam model PCLS ex vivo. (Gamb. 8E).
Rajah 7 Kesan perencatan replikasi virus Influenza A OMV boleh dipindahkan kepada AEC. Sel THP-1 diinkubasi dengan LpOMV atau KpOMV selama 20} jam atau dibiarkan tanpa rawatan untuk kawalan. Supernatan (SN) telah ditapis steril dan digunakan untuk prastimulasi sel A549 selama 2{19}} jam sahaja atau digabungkan dengan 10 µM JAKi. Ekspresi A+B Mx1 (A) dan CXCL8 B ditentukan oleh qPCR pada titik masa jangkitan (0 h pi). Bar menunjukkan nilai min bagi empat eksperimen bebas+SEM yang dinormalkan kepada sel kawalan yang tidak dirawat. C Sel A549 pra-rawatan tambahan telah dijangkiti virus influenza A/Hamburg/5/2009(H1N1pdm) (MOI 0.01) selama 24 jam. Replikasi virus ditentukan oleh ujian plak. Bar ialah nilai min bagi empat eksperimen bebas+SEM. Statistik: 1-cara ANOVA; **hlm<0.01, ****p<0.0001; * compared to control-SN; # compared to KpOMV-SN; n=4
Perbincangan
Kami mendapati bahawa vesikel daripada bakteria yang berbeza mendorong isyarat pembezaan dalam makrofaj yang dapat mengehadkan replikasi IAV dalam jangkitan berikutnya. Selaras dengan kesusasteraan, OMV terpencil daripada Lp, Kp, Ec, dan Sal, dan MV daripada Sp adalah setanding dari segi saiz [26–28]. Makrofaj yang diinkubasi dengan vesikel bakteria tidak menunjukkan sitotoksisiti [29, 30], tetapi mendorong tindak balas pro-radang. Semua vesikel mencetuskan fosforilasi p38 dan pembebasan CXCL8 dan IL-1 daripada makrofaj manusia primer, manakala terdapat perbezaan dalam aruhan IFN I dan isyarat hilirannya. Kami dan yang lain telah menunjukkan bahawa isyarat LpOMV melalui TLR2 [12, 22] dan juga SpMVs mendorong corak pengaktifan yang berbeza dalam makrofaj [31]. LpOMVs/SpMVs mengaktifkan gen sasaran NF-κB pro-radang, seperti yang diterangkan untuk bakteria asal [12, 22, 31]. Namun, pengiktirafan Kp/Ec/SalOMV mencetuskan, sebagai tambahan kepada gen sasaran NF-κB, induksi fosforilasi IRF{18}} dengan ekspresi IFNB hiliran dan fosforilasi STAT1 yang tahan lama bersama-sama dengan aruhan ISG, dengan alasan untuk aktif Isyarat IFNAR-JAK/STAT. OMV membawa LPS pada permukaannya, tetapi kapasiti pro-radang OMV tidak dapat ditiru dengan LPS tulen. Kami dan yang lain memerhatikan bahawa makrofaj lebih sensitif kepada OMV berbanding dengan jumlah LPS tulen yang sama [32, 33]. OMV mengandungi sejumlah agonis imun yang diperlukan untuk induksi tindak balas imun yang teguh [32]. Agonis TLR dan RIG-I komersial sahaja atau digabungkan dengan LPS tidak dapat meniru kesannya. Ia telah ditunjukkan sebelum ini bahawa liposom yang dimuatkan LPS mendorong pengaktifan TRIF-IRF{29}} yang lebih berpanjangan dalam makrofaj berbanding LPS percuma [34]. Dengan menggunakan makrofaj TRIF−/−, kami menunjukkan pergantungan induksi ISG pada molekul penyesuai ini. Selain itu, CcOMV atau OMV bebas endotoksin digabungkan dengan LPSmasking PB adalah mencukupi untuk membatalkan tindak balas makrofaj. Ini menunjukkan pengiktirafan OMV melalui TLR4 dengan endositosis dan isyarat TRIF seterusnya. Oleh itu, Kp / Ec / SalOMVs dapat mendorong pengaktifan pro-radang makrofaj melalui TLR4 yang membawa kepada isyarat MyD88 dan ekspresi gen bergantung NF-κB serta isyarat TRIF dengan tindak balas IFN I. Ini adalah selaras dengan literatur yang menunjukkan bahawa TLR4 dan TRIF bersama-sama diperlukan untuk imunogenisiti Neisseria meningitidis OMVs pada tikus [35]. Memandangkan IFN jenis I ialah pengawal selia induk bagi tindak balas antivirus, kami membuat hipotesis bahawa pengiktirafan Kp/Ec/SalOMV mempengaruhi replikasi IAV. Kami menunjukkan bahawa makrofaj dengan cekap menyekat replikasi IAV dan VSV selepas pra-rawatan OMV yang mengaktifkan TRIF, manakala TRIF−/− menyelamatkan replikasi virus. Untuk menentukan kesan pada isyarat IFNAR, perencatan JAK1/2 digabungkan dengan OMV, berjaya menyekat induksi Mx1 yang bergantung kepada STAT{44}}dan menyelamatkan replikasi virus dalam makrofaj. Gabungan KpOMV dengan PB atau penggunaan CcOMV bebas endotoksin tidak mengurangkan replikasi IAV dalam makrofaj kerana ia tidak mampu mendorong gen antivirus. Oleh kerana persediaan vesikel ekstraselular yang diperoleh melalui ultrasentrifugasi mengandungi protein bebas dan lampiran sel bakteria bersama vesikel, persediaan OMV juga dihasilkan melalui gabungan ultraturasan dan kromatografi pengecualian saiz [25].
Tumbuhan cistanche herba Cina-Antitumor
Persediaan vesikel tulen yang diperolehi sama-sama mampu mendorong isyarat TRIF-IRF dengan induksi Mx1 hiliran dan replikasi virus yang disekat dengan alasan untuk kesan vesikel langsung. Walaupun ATM adalah barisan pertahanan pertama dalam paru-paru, majoriti jangkitan IAV dan replikasi dalam paru-paru manusia berlaku dalam AEC [36]. Oleh itu, AEC telah dirangsang dengan OMV, tetapi mereka tidak bertindak balas terhadap rangsangan seperti makrofaj. Hanya garis sel epitelium bronkial BEAS2B bertindak balas dengan ekspresi CXCL8, tetapi tidak mempunyai induksi Mx1. Oleh kerana kami boleh menunjukkan ekspresi gen antivirus bergantung kepada TLR4 dan TRIF dalam makrofaj, kami membuat hipotesis bahawa empat garisan sel epitelium yang diuji tidak mengekspresikan TLR4 pada tahap yang sama seperti makrofaj dan bahawa mereka gagal mengendosit OMV apabila pengaktifan TLR4. Ini selaras dengan literatur yang menunjukkan bahawa AEC manusia terpencil tidak bertindak balas kepada LPS seperti yang dilakukan oleh AM berpasangan [37]. Semasa kami mengaitkan status antivirus semasa pra-inkubasi OMV kepada IFN I, kami menggunakan supernatan makrofaj yang dirangsang OMV untuk pra-merangsang AEC. Medium terkondisi makrofaj yang dirangsang KpOMV, tidak seperti rangsangan vesikel langsung, mendorong ekspresi Mx1 dalam sel-sel ini dan mengurangkan replikasi IAV dalam eksperimen jangkitan berikutnya. Supernatan daripada makrofaj yang dirawat LpOMV menyebabkan CXCL8 dalam sel epitelium tetapi tidak menyebabkan induksi Mx1 dan perubahan dalam replikasi virus. Untuk mengaitkan kesan yang diperhatikan dengan media terkondisi kepada IFN I, supernatan itu digabungkan dengan perencat JAK1/2, menyekat induksi Mx1, dan tidak mempunyai kesan ke atas replikasi virus. Oleh kerana interaksi jenis sel yang berbeza dalam paru-paru manusia adalah lebih kompleks dan tidak dapat ditiru sepenuhnya oleh media terkondisi, kami memperluaskan pendekatan kami kepada bahagian tisu paru-paru distal manusia yang berdaya maju, yang telah digunakan secara meluas untuk kajian tentang interaksi hos-patogen termasuk virus influenza dan jangkitan bakteria [38–41]. Berbeza dengan model in vitro yang digunakan, tisu paru-paru manusia ex vivo mengekalkan seni bina tiga dimensi paru-paru dan membenarkan interaksi fisiologi antara jenis sel pemastautin dalam paru-paru, namun ia tidak mempunyai kemungkinan kemasukan sel-sel imun yang direkrut selanjutnya. Jangkitan berturut-turut PCLS yang dirangsang KpOMV dengan IAV mengurangkan beban virus berbanding kawalan tanpa pra-rawatan. Oleh kerana semua AEC yang diuji secara in vitro tidak bertindak balas terhadap rangsangan vesikel bakteria secara langsung, kami membuat hipotesis bahawa dalam model ex vivo ini, AM adalah jenis sel bertindak balas yang utama. Memandangkan pengasingan influenza dipilih untuk jangkitan berikutnya yang secara eksklusif menjangkiti dan mereplikasi dalam AEC, ia boleh dianggap bahawa ini adalah kesan antivirus paracrine yang berasal daripada AM dan dihantar kepada AEC. Berdasarkan data yang diperoleh di sini, kami mencadangkan model berikut (Rajah 8E): OMV daripada bakteria gram-negatif boleh mengaktifkan makrofaj manusia dengan cara pro-radang klasik dan anti-virus utama melalui TLR4 dan TRIF selepas endositosis berjaya vesikel. IFN I keluarkan seterusnya boleh menjadikan makrofaj dan/atau AEC antivirus melalui isyarat IFNAR dan JAK/STAT. Jangkitan sel-sel ini seterusnya menyebabkan penurunan Mx{31}}diantara dalam beban virus. Memandangkan kami tidak mempunyai akses kepada AM manusia utama, eksperimen dilakukan menggunakan BDM manusia sebagai model. Memandangkan asal-usul perkembangan yang berbeza dan penyebuan makrofaj ini, boleh difikirkan bahawa AM akan menunjukkan tindak balas pro-radang yang lebih lemah berbanding dengan BDM. Vesikel bakteria telah digunakan dalam strategi vaksinasi terhadap patogen penyebab radang paru-paru yang berbeza (disemak dalam [42]). Oleh itu, OMV bukan sahaja mewakili alat untuk strategi vaksinasi sistemik yang berpotensi terhadap bakteria perumah mereka tetapi juga boleh digunakan secara tempatan untuk memerangi jangkitan virus dengan mengaktifkan sel imun semula jadi pemastautin. Kajian in vivo masa hadapan diperlukan untuk menguji sama ada penemuan in vitro ini boleh digunakan untuk patogen virus lain. Di samping itu, perlu diperhatikan bahawa tindak balas endotoksik yang mungkin berlaku mesti dipantau secara kritikal untuk mengelakkan tindak balas imun yang berlebihan dalam vivo. Induksi IFN jenis I perlu dikawal dengan ketat, seperti yang ditunjukkan pada individu yang sihat bahawa penyedutan agonis TLR7 pada mulanya diterima dengan baik selepas dos pertama, tetapi membawa kepada peningkatan tindak balas TNF- dan IFN I dan gejala seperti influenza. , selepas dos kedua [43]. Untuk memerangi kesan buruk, versi OMV yang diubah suai secara genetik mungkin diperlukan, mendorong tindak balas imun yang seimbang dan mencapai kebolehgunaan yang baik. Secara keseluruhan, kami di sini membentangkan model bagaimana OMV boleh mendorong isyarat antivirus dalam makrofaj manusia dan bagaimana ini boleh digunakan untuk mencegah replikasi IAV.
Rajah 8 KpOMV mengurangkan replikasi virus influenza A dalam hirisan paru-paru potong ketepatan manusia. PCLS manusia diinkubasi dengan 1 µg/mL OMV (Lp/Kp) selama 20 jam dan kemudian dijangkiti influenza A/California/04/2009(H1N1pdm) tambahan selama 48 jam. Penyahaktifan UV virus berfungsi sebagai kawalan. Sitotoksisiti ditentukan oleh kuantifikasi LDH yang dibebaskan daripada PCLS dan digambarkan dalam% berbanding jumlah lisis. Ekspresi B Mx1 dikira oleh qPCR dan dibentangkan berbanding RPS18 dan PCLS kawalan yang tidak dirawat. Keluaran C CXCL10 ditentukan oleh ELISA dan digambarkan dalam ng/mL. D Replikasi virus ditentukan oleh ujian plak dan digambarkan dalam pfu/mL. Bar menunjukkan nilai min tiga hingga lima replika biologi+SEM. E Model yang dicadangkan untuk induksi imuniti antivirus OMV dalam paru-paru. Statistik: 1-cara ANOVA (AC), Friedman-test (D); *hlm<0.05, ***p<0.001, ****p<0.0001; * compared to IAV infected, but not pre-treated PCLS, # as depicted in the graph; ns=not significant; n=5
Rujukan
1. Kulp A, Kuehn MJ. Fungsi biologi dan biogenesis vesikel membran luar bakteria yang dirembes. Annu Rev Microbiol. 2010;64:163–84.
2. Ellis TN, Kuehn MJ. Virulensi dan peranan imunomodulator vesikel membran luar bakteria. Microbiol Mol Biol Rev. 2010;74(1):81–94.
3. Giordano NP, Cian MB, Dalebroux ZD. Rembesan lipid membran luar dan tindak balas imun semula jadi kepada bakteria gram-negatif. Jangkitan Immun. 2020. https://doi.org/10.1128/IAI.00920-19.
4. Mancini F, et al. Vaksin OMV dan peranan agonis TLR dalam tindak balas imun. Int J Mol Sci. 2020. https://doi.org/10.3390/ijms21124416.
5. Hu G, Christman JW. Editorial: makrofaj alveolar dalam keradangan dan resolusi paru-paru. Imunol hadapan. 2019;10:2275.
6. Grassin-Delyle S, et al. Peranan reseptor seperti tol dalam pengeluaran sitokin oleh makrofaj paru-paru manusia. J Immun bawaan. 2020;12(1):63–73.
7. Lembaran Fakta Influenza (Bermusim). 2018; https://www.who.int/news-room/ fact-sheets/detail/influenza-(bermusim)
8. Crotta S, et al. Interferon jenis I dan jenis III memacu gelung penguatan berlebihan untuk mendorong tandatangan transkrip dalam epitelium saluran pernafasan yang dijangkiti influenza. Pathog PLoS. 2013;9(11): e1003773.
9. Bals R, Hiemstra PS. Imuniti semula jadi dalam paru-paru: bagaimana sel epitelium melawan patogen pernafasan. Eur Respir J. 2004;23(2):327–33.
10. Helft J, et al. CD penyampaian silang103+ sel dendritik dilindungi daripada jangkitan virus influenza. J Clin Invest. 2012;122(11):4037–47.
11. Ghoneim HE, Thomas PG, McCullers JA. Penipisan makrofaj alveolar semasa jangkitan influenza memudahkan superinfeksi bakteria. J Immunol. 2013;191(3):1250–9.
12. Jung AL, et al. Vesikel membran luar yang berasal dari Legionella pneumophila menggalakkan replikasi bakteria dalam makrofaj. Pathog PLoS. 2016;12(4): e1005592.
13. Lindhauer NS, et al. Aktiviti antibakteria Tribolium castaneum defen‑ sin dalam model jangkitan in vitro Streptococcus pneumoniae. Keganasan. 2019;10(1):902–9.
14. Danov O, et al. Asap rokok menjejaskan populasi sel dendritik, fungsi penghalang epitelium, dan tindak balas imun terhadap jangkitan virus dengan H1N1. Medan Depan. 2020. https://doi.org/10.3389/fmed.2020.571003.
15. Matrosovich M, et al. Medium tindanan kelikatan rendah baharu untuk ujian plak virus. Virol J. 2006;3:63. 16. Neuhaus V, et al. Penilaian kesan sitotoksik dan imunomodulator bahan dalam hirisan paru-paru potong ketepatan manusia. J Vis Exp. 2018. https://doi.org/10.3791/57042. 17. Niehof M, et al. Pengasingan RNA daripada kepingan paru-paru potong ketepatan (PCLS) daripada spesies yang berbeza. Nota BMC Res. 2017;10(1):121.
18. Schulz C, et al. THP-1-makrofaj yang diperolehi menjadikan sel epitelium paru-paru tidak responsif kepada Legionella pneumophila - kajian biologi sistem. Sci Rep. 2017;7(1):11988.
19. Livak KJ, Schmittgen TD. Analisis data ekspresi gen relatif menggunakan PCR kuantitatif masa nyata dan kaedah 2(-Delta Delta C(T)). Kaedah. 2001;25(4):402–8. https://doi.org/10.1006/meth.2001.1262.
20. Haller O, et al. Mx GTPases: mesin antivirus seperti dinamin dengan imuniti semula jadi. Trend Microbiol. 2015;23(3):154–63. 21. Anastasia M, et al. Terminal C protein NS1 virus influenza A/ WSN/1933(H1N1) memodulasi tindak balas antiviral dalam makrofaj dan tikus manusia yang dijangkiti. J Jen Virol. 2015;96(8):2086–91.
22. Jager J, et al. Percantuman vesikel membran luar Legionella pneumophila dengan sistem membran eukariotik adalah mekanisme untuk menghantar faktor patogen ke membran sel perumah. Mikrobiol Sel. 2015;17(5):607–20.
23. Lammers AJ, et al. Peranan TLR2 dalam tindak balas tuan rumah kepada pneumonia pneumokokus jika tiada limpa. BMC Infect Dis. 2012. https://doi. org/10.1186/1471-2334-12-139.
24. Mamat U, et al. Pengeluaran protein bebas endotoksin—teknologi ClearColi™. Kaedah Nat. 2013;10:916.
25. Théry C, et al. Maklumat minimum untuk kajian vesikel ekstraselular 2018 (MISEV2018): pernyataan kedudukan Persatuan Antarabangsa untuk Vesikel Ekstraselular dan kemas kini garis panduan MISEV2014. J Vesikel Sel Tambahan. 2018;7(1):1535750. https://doi.org/10.1080/20013078.2018. 1535750. 26. Bonnington KE, Kuehn MJ. Pengeluaran vesikel membran luar memudahkan pembentukan semula lps dan penyelenggaraan membran luar dalam salmonella semasa peralihan alam sekitar. MBio. 2016. https://doi.org/10.1128/mBio. 01532-16.
27. Jasim R, et al. Analisis lipidomik vesikel membran luar daripada pencilan klinikal klebsiella pneumoniae yang mudah terdedah dan tahan polimiksin berpasangan. Int J Mol Sci. 2018. https://doi.org/10.3390/ijms19082356.
28. Olaya-Abril A, et al. Pencirian vesikel terhasil membran ekstraselular pelindung yang dihasilkan oleh Streptococcus pneumoniae. J Proteomik. 2014;106:46–60.
29. Kuhn T, Koch M, Fuhrmann G. Probiomimetics-novel lactobacillus meniru zarah mikro menunjukkan kesan anti-radang dan pelindung halangan dalam model gastrousus. Kecil. 2020;16(40): e2003158.
30. Mehanny M, et al. Vesikel membran ekstrasel streptokokus dihayati dengan cepat oleh sel imun dan mengubah pembebasan sitokinnya. Imunol hadapan. 2020;11:80.
31. Volgers C, et al. Peranan imunomodulator untuk vesikel membran yang dikeluarkan oleh makrofaj THP-1 dan patogen pernafasan semasa jangkitan makrofaj. Mikrobiol BMC. 2017;17(1):216.
32. Ellis TN, Leiman SA, Kuehn MJ. Vesikel membran luar yang dihasilkan secara semula jadi daripada Pseudomonas aeruginosa menimbulkan tindak balas imun semula jadi yang kuat melalui penderiaan gabungan kedua-dua komponen lipopolisakarida dan protein. Jangkitan Immun. 2010;78(9):3822–31.
33. Alaniz RC, et al. Vesikel membran ialah faksimili imunogenik Salmonella typhimurium yang berpotensi mengaktifkan sel dendritik, tindak balas sel B dan T utama, dan merangsang imuniti pelindung dalam vivo. J Immunol. 2007;179(11):7692–701.
34. Watanabe S, Kumazawa Y, Inoue J. Liposomal lipopolysaccharide memulakan laluan isyarat yang bergantung kepada TRIF tanpa CD14. PLoS SATU. 2013;8(4): e60078.
35. Fransen F, et al. Kesan pembezaan TLR2 dan TLR4 pada tindak balas imun selepas imunisasi dengan vaksin terhadap Neisseria menin‑gitidis atau Bordetella pertussis. PLoS SATU. 2010;5(12): e15692.
36. Travanty E, et al. Kerentanan pembezaan sel primer paru-paru manusia kepada virus influenza H1N1. J Virol. 2015;89(23):11935–44.
37. Mubarak RA, et al. Perbandingan tindak balas pro dan anti-radang dalam sel epitelium saluran pernafasan primer manusia dan alveolar mac-rophages berpasangan. Respir Res. 2018;19(1):126.
38. Wu W, et al. Tindak balas imun semula jadi terhadap jangkitan virus H3N2 dan H1N1 infu-enza dalam model kultur organ paru-paru manusia. Virologi. 2010;396(2):178–88.
39. Wu W, et al. Virus Influenza A(H1N1)pdm09 menindas tindak balas antiviral semula jadi yang dimulakan RIG-I dalam paru-paru manusia. PLoS SATU. 2012;7(11): e49856.
40. Delgado-Ortega M, et al. Tindak balas imun semula jadi terhadap virus influenza babi subjenis H3N2 dalam sel trakea babi yang baru lahir, makrofaj alveolar dan hirisan paru-paru yang dipotong tepat. Vet Res. 2014;45:42.
41. Kolbe U, et al. Induksi sitokin awal apabila jangkitan pseudomonas aeruginosa dalam hirisan paru-paru potong ketepatan murine bergantung pada pengesanan daya maju bakteria. Imunol hadapan. 2020. https://doi.org/10.3389/fmmu. 2020.598636.
42. Jung AL, et al. Peranan klinikal hos dan vesikel ekstraselular yang berasal dari bakteria dalam radang paru-paru. Adv Drug Deliv Rev. 2021. https://doi.org/10. 1016/j.addr.2021.05.021.
43. Delaney S, et al. Toleransi pada lelaki selepas penyedutan dos agonis TLR7 terpilih, AZD8848. BMJ Open Respir Res. 2016;3(1): e000113.
