Aktiviti Anti-melanogenik Dan Anti-oksidan Ekstrak Etanol Kummerowia Striata: Kummerowia Striata Mengawal Aktiviti Anti-melanogenik Melalui Turun Kawalselia TRP-1, TRP-2 Dan Ekspresi MITF

ABSTRAK

Kummerowia striata (K. striata) digunakan sebagai ubat tradisional untuk terapi berkaitan keradangan. Untuk menentukan sama ada ia mempunyai aktiviti anti-melanogenik dan anti-oksida yang bermanfaat, kami menyiasat aktiviti biologi ekstrak etanol Kummerowia striata (EKS) menggunakan pelbagai sistem model kultur in vitro dan sel. Aktiviti anti-melanogenik dinilai dalam sel melanoma B16F10 dari segi sintesis melanin dan aktiviti perencatan in vitro tyrosinase. Ujian anti-oksida telah dilakukan menggunakan garam diammonium 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) dan 2,2ʹ-casino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-asid sulfonic). (ABTS). EKS menunjukkan aktiviti anti-oksida yang kuat dalam ujian DPPH dan ABTS. Tahap transkripsi mRNA dan tahap ekspresi protein tyrosinase, protein berkaitan tyrosinase 1, protein berkaitan tyrosinase 2, dan faktor transkripsi berkaitan microphthalmia menurun mengikut cara yang bergantung kepada dos dengan rawatan EKS.

Selain itu, EKS tidak menjejaskan daya maju sel pada kepekatan berbeza yang digunakan dalam kajian ini, menunjukkan bahawa mekanisme tindakan perencatan sintesis melanin yang dimediasi EKS tidak melibatkan sitotoksisiti. Juga, kami mengesahkan bahawa asid p-kuumarik dan kuersetin adalah sebatian penting untuk sifat anti-melanogenesis dan antioksidan EKS. Secara kolektif, penemuan kami menunjukkan buat kali pertama bahawa EKS mempunyai aktiviti anti-melanogenik dan anti-oksidan. Penilaian lanjut dan pembangunan EKS sebagai suplemen berfungsi atau kosmetik mungkin berguna untuk pemutihan kulit dan mengurangkan kedutan.

Untuk pemutihan, kami mendapati bahawa Cistanche mempunyai kesan pemutihan, dan Cistanche kaya dengan vitamin C, yang dianggap sebagai agen pemutihan yang sangat berkesan. Vitamin C boleh menghalang sintesis melanin iaitu sejenis melanin yang boleh membuatkan kulit orang menjadi kusam. Pada masa yang sama, vitamin C juga boleh menggalakkan penghasilan kolagen iaitu bahan yang menjadikan kulit lebih tegang dan anjal.

Selain ramuan di atas, Cistanche juga mengandungi pelbagai asid amino dan unsur surih, yang juga sangat bermanfaat untuk kesihatan kulit. Sebagai contoh, zink yang terkandung dalam Cistanche boleh membantu merawat jerawat dan selaran matahari, di samping menghalang penuaan kulit. Selain itu, Cistanche juga mempunyai kesan perlindungan yang baik pada hati dan sistem imun.

Klik produk suplemen cistanche deserticola

1. Pengenalan

Kajian mengenai penuaan luaran telah melaporkan bahawa kulit memainkan peranan utama dalam mengenal pasti penuaan manusia [1,2]. Penuaan kulit boleh dibahagikan kepada dua jenis: penuaan kronologi, yang disertai dengan kemerosotan progresif struktur dan fungsi kulit dari masa ke masa, dan satu lagi adalah penuaan eksogen (photoaging) di mana tekstur kulit berubah kerana lama- pendedahan jangka masa kepada cahaya matahari [3,4]. Radikal bebas dan spesies oksigen reaktif adalah komponen terpenting yang mendorong penuaan kulit. Mereka mendorong tekanan oksidatif dalam sel kulit, dan bahan yang dihasilkan semasa proses ini menyebabkan peningkatan pengeluaran melanin dan kedutan.

Melanin disintesis melalui pengoksidaan tyrosinase atau L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) melalui aktiviti tyrosinase dan protein berkaitan tyrosinase 1 (TRP-1). Melanosit memainkan peranan penting dalam melindungi kulit daripada kerosakan sinaran [5,6]. Biosintesis melanin dalam melanosit dimediasi oleh enzim tyrosinase yang mengawal pembentukan L-DOPA melalui hidrolisis tyrosine dan pembentukan DOPA quinone melalui pengoksidaan DOPA [7,8]. Selain itu, faktor transkripsi berkaitan microphthalmia (MITF) ialah faktor transkripsi utama yang mengawal selia transkripsi enzim melanogenik (iaitu, tyrosinase, TRP-1 dan TRP-2) [9,10]. Tyrosinase dan TRP-1 dikawal secara transkripsi oleh MITF, yang memainkan peranan penting dalam laluan sintesis melanin [11,12].

Kummerowia striata (Thunb. ex Murray) Schindl (K. striata) ialah tumbuhan tahunan asli Asia timur, termasuk Korea, China dan Jepun. Tumbuhan ini telah lama digunakan sebagai herba perubatan tradisional dalam terapi anti-radang. Kajian ini bertujuan untuk menganalisis potensi aktiviti anti-melanogenik dan anti-oksida bagi ekstrak etanol K. striata (EKS) dan dua sebatiannya. Aktiviti anti-oksidan telah dinilai dari segi aktiviti penghapusan radikal bebasnya dengan menggunakan garam diammonium (ABTS) 2,2ʹ-casino-bis (3-etilbenzotiazolin-6-asid sulfonic) (ABTS) dan 2,{{11 }}ujian diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH). Aktiviti anti-tirosinase dinilai menggunakan ujian perencatan tyrosinase. Kami mendapati bahawa EKS dan sebatiannya adalah calon yang menjanjikan untuk digunakan dalam produk kosmetik untuk pemutihan kulit dan mengurangkan kedutan.

2. Bahan-bahan dan cara-cara

2.1. Keadaan kultur sel

Talian sel melanoma Murine B16F10 telah dibeli daripada Koleksi Budaya Jenis Amerika (Manassas, VA, Amerika Syarikat). Sel-sel telah dibiakkan dalam Medium Helang Modified Dulbecco (DMEM, Gibco, San Jose, CA, Amerika Syarikat) ditambah dengan 10 peratus serum lembu janin (FBS) dan penisilin/streptomycin (Gibco, Amerika Syarikat) dalam suasana lembap yang mengandungi 5 peratus CO2 dalam udara pada 37 darjah.

2.2. Reagen

Antibodi berikut telah dibeli daripada sumber komersial: anti-tyrosinase, anti-TRP-1, anti-TRP-2 dan anti-MITF (ThermoFisher Scientific, Rockford, IL, USA); anti- -antibodi aktin dan tetikus dan arnab IgG-konjugat peroksidase lobak kuda (Cell Signaling, Beverly, MA, USA).

2.3. Penyediaan ekstrak Kummerowia striata

Bahagian udara K. striata (Thunb. ex Murray) Schindler telah dikumpulkan di Gimpo, Gyeonggi, Korea Selatan pada September 2013 dan dikenal pasti oleh Profesor Joa Sub Oh, Kolej Farmasi, Universiti Dankook, Cheonan, Korea Selatan. Satu spesimen baucar (G63) telah disimpan di Pusat Bio, Pemecut Perniagaan & Sains Gyeonggido, Suwon, Korea Selatan. Bahagian udara K. striata (Thunb. ex Murray) Schindler (1.8 kg) telah diekstrak dengan 70 peratus EtOH (3 × 18 L) pada suhu bilik. Ekstrak EtOH yang digabungkan kemudiannya ditumpukan dalam vakuo pada 40 darjah untuk menghasilkan 180 g sisa. Ekstrak EtOH digantung dalam air suling dan kemudian dibahagikan secara berurutan dengan diklorometana (CH2Cl2), etil asetat (EtOAc), dan butanol (n-BuOH). Pecahan MC (7.52 g) dipisahkan oleh kromatografi lajur cecair [lajur kaca (7.5 × 40 cm) yang dibungkus dengan gel silika (70–230 mesh)] menggunakan campuran kecerunan sebagai eluen (CH2Cl2 → MeOH).

Pecahan eluen F001–F006 diperoleh daripada pengasingan kromatografi cecair awal ini. Pecahan F003 telah ditulenkan dengan kromatografi lajur menggunakan lajur kaca (5.0 × 40 cm) yang dibungkus dengan gel ODS-C18. Lajur itu kemudiannya dicairkan dengan H2O → MeOH menghasilkan tujuh sub-pecahan (F007-F013). asid p-kuumarik (15.2 mg) telah diasingkan daripada F007 oleh kromatografi lajur cecair [lajur kaca (3.0 × 40 cm) yang dibungkus dengan ODS-C18] menggunakan elusi kecerunan (H2O → MeOH). Quercetin (13.5 mg) telah diasingkan daripada F004 oleh kromatografi lajur cecair [lajur kaca (3.0 × 40 cm) yang dibungkus dengan ODS-C18] menggunakan elusi kecerunan (H2O → MeOH). Struktur mereka telah dijelaskan oleh gabungan resonans magnetik nuklear 1D dan 2D (NMR), dan spektrometri jisim, serta dengan perbandingan dengan kesusasteraan yang dilaporkan [13,14].

2.4. Prosedur am

Spektroskopi korelasi 1D dan 2D [1H-1H (COSY), koheren kuantum tunggal heteronuklear (HSQC) dan korelasi ikatan berbilang heteronuklear (HMBC)] NMR diukur pada Bruker Ascend III 70{ {25}} Spektrometer NMR MHz (Rheinstetten, Jerman) dengan tetrametilsilane sebagai standard dalaman. Peralihan kimia dinyatakan sebagai nilai δ. Spektrum jisim pengionan Electrospray (ESI) diperoleh pada spektrometer jisim LTQ Orbitrap XL (Thermo Scientific). Kromatografi lajur terbuka dilakukan menggunakan gel silika (gel Kiesel 60, 70-230 mesh, dan 230-400 mesh; Merck) dan gel ODS-C18 ODS-A (12 nm S7 μm, YMC GEL, Jepun). Kromatografi lapisan nipis dilakukan menggunakan gel silika prasalut 60 F254 (0.25 mm, Merck) dan gel silika prasalut 60 RP-18 F-254S (0.25 mm, Merck) masing-masing. Semua bahan kimia dan pelarut adalah gred analitik dan digunakan tanpa penulenan selanjutnya.

2.5. Ujian daya maju sel

3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-ujian diphenyl-tetrazolium bromide (MTT) telah dilakukan untuk menentukan kesan EKS pada sel daya maju. Sel melanoma tikus B16F10 dibiakkan dalam 96-plat perigi (1 × 104 sel/telaga) dan dirawat dengan EKS selama 24 jam. Secara keseluruhan, 100 μL medium bebas serum yang mengandungi 10 peratus larutan MTT (5 mg/ml) telah ditambah dan diinkubasi selama 3 jam. Medium dikeluarkan dan dibasuh dua kali dengan garam penampan fosfat (PBS). Selepas itu, 100 μL dimetil sulfoksida (DMSO) ditambah kepada setiap telaga dan dilarutkan dalam penggoncang. Penyerapan diukur pada 540 nm menggunakan pembaca ELISA (Peranti Molekul, Amerika Syarikat).

2.6. Kandungan melanin selular

Sel B16F10 dibiakkan dalam 6-plat perigi pada ketumpatan 1 × 105 sel setiap perigi dan diinkubasi selama 24 jam. Melanogenesis diinduksi dengan 100 nM -Melanocyte-stimulating hormone (-MSH). Sel-sel telah dirawat dengan arbutin (kawalan positif) dan EKS pada kepekatan yang berbeza dan dibiakkan selama 72 jam. Selepas mencuci dengan PBS dua kali, penimbal lisis [100 mM natrium fosfat (pH 6.8) dan 0.1 mM fenilmetana sulfonil fluorida (PMSF), 1 peratus Triton X-100] ditambah dan dilarutkan pada −80 darjah selama 30 minit. Selepas penuaian sel, 1 N NaOH yang mengandungi 10 peratus DMSO telah bertindak balas pada 65 darjah selama 1 jam untuk membubarkan pelet, dan penyerapan diukur pada 405 nm.

2.7. Ujian perencatan tyrosinase

Aktiviti perencatan tyrosinase diukur dengan menggunakan kaedah yang diterangkan oleh Yagi et al. [15]. Tindak balas telah dijalankan dalam 0.1 M penampan kalium fosfat (pH 6.5) mengandungi 1.5 mM L-tirosin dan 1250 unit/ml cendawan tyrosinase. Campuran tindak balas diinkubasi pada 37 darjah selama 20 minit. Sampel ujian telah diuji untuk perencatan tyrosinase dengan mengukur kesannya terhadap aktiviti tyrosinase menggunakan pembaca ELISA pada 490 nm. Arbutin digunakan sebagai kawalan positif.

2.8. Ujian aktiviti penghapusan radikal DPPH

Aktiviti scavenging radikal DPPH diukur dengan menggunakan kaedah yang diterangkan oleh Blois [16] dan Ozgen et al. [17]. Secara ringkas, 100 μL larutan DPPH yang dilarutkan dalam metanol telah ditambah kepada 100 μL EKS, yang dicairkan kepada kepekatan yang diperlukan, dan tindak balas telah dijalankan pada suhu bilik selama 30 minit. Penyerapan diukur pada 517 nm menggunakan pembaca ELISA (Peranti Molekul, Amerika Syarikat). Antioksidan butylated hydroxyanisole (BHA) digunakan sebagai kawalan positif, dan nilai IC50 EKS telah ditentukan.

2.9. Aktiviti penghapusan radikal ABTS

Aktiviti penghapusan radikal ABTS diukur dengan menggunakan kaedah yang diterangkan sebelum ini [18,19]. ABTS tambah dibentuk dengan mencampurkan 7 mM larutan ABTS dan 2.45 mM larutan kalium persulfat (K2S2O8) dengan ABTS: K2S2O8 (nisbah 2: 1) selama 12–16 jam untuk membentuk kation (ABTS tambah ). Nilai penyerapan pada 734 nm ialah 1.35 ± 0.05. Secara keseluruhan, 100 μL larutan cair dan 100 μL EKS yang dicairkan kepada kepekatan yang diperlukan telah bertindak balas pada suhu bilik selama 6 minit, dan penyerapan diukur pada 734 nm menggunakan pembaca ELISA. BHA, antioksidan, digunakan sebagai kawalan positif, dan nilai IC50 EKS ditentukan.

2.10. Tindak balas rantai transkripsi-polimerase terbalik (RT-PCR)

Sel melanoma B16F10 telah disemai dalam 6-plat perigi pada ketumpatan 1 × 106 sel/telaga dan dirawat dengan EKS (100–400 ug/mL) selama 72 jam. Untuk mengekstrak jumlah RNA, reagen Trizol (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Inc.) telah ditambahkan pada setiap telaga untuk melisiskan sel dan 200 μL kloroform telah ditambah. Kemudian, campuran itu disentrifugasi pada 13,000 rpm selama 20 minit pada 4 darjah, dan supernatan dicampur dengan isopropanol selama 30 minit pada -70 darjah . Selepas sentrifugasi pada 13,000 rpm selama 20 minit pada 4 darjah , supernatan dikeluarkan dan 70 peratus air EtOH-dietilpirokarbonat ditambahkan pada setiap tiub. Selepas sentrifugasi pada 13,000 rpm selama 5 minit pada 4 darjah , supernatan dikeluarkan dan dikeringkan pada suhu bilik.

Selepas itu, 1 ug jumlah RNA yang diekstrak telah ditranskripsikan secara terbalik kepada cDNA untai tunggal dengan oligo dT menggunakan polimerase DNA Taq dan Sistem Sintesis Untai Pertama SuperScript®III (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Inc.). CDNA telah diperkuatkan dalam MyGene™Series Peltier Thermal Cycler Model MG96 G (LongGene Scientific Instruments, Hangzhou, China) menggunakan primer khusus dan precampuran AccuPower® Pfu PCR (Bioneer Corporation, Daejeon, Republik Korea). Keadaan berbasikal PCR ialah 5 minit pada 95 darjah diikuti dengan 30 kitaran 30 saat pada 95 darjah, 30 saat pada 60 darjah, 1 minit pada 72 darjah, dan lanjutan akhir selama 10 minit pada 72 darjah. Selepas amplifikasi, produk PCR telah dielektroforesis pada 1.5 peratus gel agarosa yang mengandungi etidium bromida dan dianalisis menggunakan transilluminator UV.

2.11. Analisis Western blot

Sel melanoma B16F10 telah dibiakkan dalam DMEM ditambah dengan 10 peratus FBS pada ketumpatan 1 × 106 sel dalam 6-plat perigi pada 37 darjah dan 5 peratus CO2 selama 24 jam. Selepas mengeluarkan medium kultur, EKS (100-400 ug/ml) yang dicairkan dalam medium telah dirawat selama 72 jam. Sel-sel telah dibasuh dengan PBS, dituai menggunakan penimbal RIPA (Sigma Aldrich) dan disentrifugasi pada 15,000 rpm selama 15 minit pada 4 darjah . Jumlah protein diekstrak daripada sel dan dikira menggunakan kaedah Bradford. Protein dipisahkan oleh elektroforesis gel natrium dodesil sulfat-polyacrylamide 8 peratus dan dipindahkan ke membran nitroselulosa (Whatman, Dassel, Jerman). Membran telah disekat dengan 5 peratus BSA selama 1 jam pada suhu bilik dan diinkubasi semalaman dengan antibodi primer pada 4 darjah. Membran kemudiannya dibasuh dan diinkubasi dengan antibodi sekunder konjugasi peroksidase lobak kuda selama 1 jam pada suhu bilik. Membran telah dibasuh dan dikesan oleh SuperSignal® West Pico Chemiluminescent Substrat (ThermoFisher Scientific, Rockford, IL, USA).

2.12. Analisis statistik

Analisis statistik dilakukan menggunakan ujian-t Pelajar dengan Microsoft Excel 2007 (Microsoft Corporation, Redmond, WA, Amerika Syarikat). Keputusan dibentangkan sebagai min ± sisihan piawai, dan p< 0.05 was considered to indicate a statistically significant difference. 

Rajah 1. Kesan ekstrak etanol Kummerowia striata terhadap perencatan tyrosinase, daya maju sel, dan sintesis melanin (A) Aktiviti perencatan tyrosinase ekstrak etanol Kummerowia striata (EKS) telah dianalisis dengan mengukur jumlah dopachrome yang dihasilkan dalam tindak balas. Arbutin digunakan sebagai kawalan positif. (B) Kandungan melanin dalam sel B16F10 dirangsang dengan 100 nM MSH. Kandungan melanin dikira sebagai peratusan kandungan dalam kawalan. (C) Sel melanoma tikus B16F10 telah dirawat dengan EKS (25-400 ug / ml) dan arbutin (400 ug / ml). Sitotoksisiti EKS dan arbutin ditentukan menggunakan ujian MTT. Nilai mewakili min ± SD bagi tiga replika bebas. Kepentingan statistik ditunjukkan sebagai *P <0.05, **P <0.01, berbanding dengan sampel yang tidak dirawat atau sel yang dirawat -MSH.

\

Rajah 2. Aktiviti anti-oksidan ekstrak etanol Kummerowia striata (A dan B) Aktiviti penghapusan radikal bebas ditentukan seperti yang diterangkan. Aktiviti antioksidan diukur dengan menggunakan ujian aktiviti penghapusan radikal DPPH dan ujian kation radikal ABTS ditambah. Hidroksianisole berbutil digunakan sebagai kawalan positif. Nilai mewakili min ± SD bagi tiga replika bebas. Kepentingan statistik ditunjukkan sebagai *P < 0.05, **P < 0.01, berbanding dengan sampel yang tidak dirawat.

3. Keputusan

3.1. Kesan anti-melanogenesis EKS

Untuk menentukan aktiviti anti-melanogenik EKS, kami menggunakan ujian tyrosinase cendawan menggunakan L-tirosin sebagai substrat dan tyrosinase cendawan sebagai sumber enzim. Oleh kerana tyrosinase ialah enzim utama yang memangkinkan langkah mengehadkan kadar dalam biosintesis melanin, kami mula-mula mengukur keupayaan perencatan tyrosinase EKS. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1A, EKS memberikan kesan perencatan yang ketara ke atas aktiviti tyrosinase dalam cara yang bergantung kepada dos. Keputusan ini menunjukkan bahawa EKS menunjukkan kesan perencatan pada aktiviti tyrosinase cendawan, dan kesan perencatan EKS adalah serupa dengan arbutin yang digunakan sebagai kawalan positif.

Seterusnya, untuk menentukan kesan EKS pada sintesis melanin, kandungan melanin sel melanoma B16F10 yang dirawat EKS dikira. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1B, rawatan EKS menurunkan kandungan melanin dalam sel melanoma dalam cara yang bergantung kepada dos, menunjukkan bahawa penurunan dalam melanin selular mungkin disebabkan oleh perencatan aktiviti tyrosinase. Di samping itu, menyiasat kesan EKS pada daya maju sel melanoma B16F10 menunjukkan bahawa EKS tidak mempunyai kesan sitotoksik yang ketara pada sel B16F10 pada kepekatan yang digunakan (Rajah 1C). Penemuan ini jelas menunjukkan bahawa EKS memberikan kesan anti-melanogenik melalui perencatan aktiviti tyrosinase dan sintesis melanin dalam sel melanoma B16F10 tanpa mendorong sitotoksisiti.

3.2. Aktiviti anti-oksida EKS

Aktiviti scavenging EKS ditentukan menggunakan radikal bebas DPPH (Rajah 2A). EKS mempamerkan aktiviti antioksidan yang lebih tinggi (aktiviti scavenging=50.22 peratus , IC50=98.71 ug/ml). Keupayaan mengekang EKS juga dinilai menggunakan kation radikal ABTS (Rajah 2B). Kapasiti penghapusan radikal ABTS bagi EKS adalah serupa dengan kapasiti kawalan positif BHA (kapasiti pengerukan=99.53 peratus , IC50=24.64 ug/ml). Keputusan ini menunjukkan bahawa EKS mempunyai aktiviti antioksidan yang lebih tinggi.

3.3. Kesan EKS pada ekspresi gen sintesis melanin

Untuk menyiasat mekanisme molekul yang EKS mengawal melanogenesis dengan lebih lanjut, kami meneliti perubahan dalam ekspresi gen dan protein melanogenik, seperti tyrosinase, TRP-1, TRP-2 dan MITF, yang memainkan peranan penting. dalam melanogenesis [20]. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3A, ekspresi mRNA tyrosinase, TRP-1, TRP-2 dan MITF telah dicetuskan oleh -MSH; walau bagaimanapun, rawatan EKS menurunkan ekspresi mRNA dengan ketara (100-400 ug/ml). Selain itu, EKS menunjukkan aktiviti perencatan yang kuat sama dengan arbutin kawalan positif. Seterusnya, kesan EKS pada ekspresi protein berkaitan melanogenesis dinilai oleh analisis blot barat. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3B, rawatan EKS merencatkan dengan ketara -paras ekspresi yang disebabkan oleh MSH tyrosinase, TRP-1, TRP-2 dan MITF dalam sel B16F10. Secara keseluruhan, penemuan ini menunjukkan bahawa kesan perencatan EKS pada melanogenesis dalam sel B16F10 mungkin dimediasi melalui pengawalan rendah gen dan protein melanogenik, seperti tyrosinase, TRP1, TRP-2 dan MITF.

Rajah 3. Kesan ekstrak etanol Kummerowia striata terhadap proses biosintesis melanin (A) Ekspresi tyrosinase, TRP1, TRP2, dan MITF pada tahap mRNA ditentukan dengan menggunakan RT-PCR. Arbutin digunakan sebagai kawalan positif. Tyrosinase, TRP1, TRP2, dan mRNA MITF dianalisis oleh protokol densitometri. Arbutin digunakan sebagai kawalan positif. (B) Ekspresi tyrosinase, TRP1, TRP2, dan MITF pada tahap protein ditentukan oleh western blotting. Arbutin digunakan sebagai kawalan positif. Tyrosinase, TRP1, TRP2, dan MITF dianalisis oleh protokol densitometri. Arbutin digunakan sebagai kawalan positif. Nilai mewakili min ± SD bagi tiga replika bebas. Kepentingan statistik ditunjukkan sebagai *P < {{10}}.05, **P < 0.01, berbanding dengan sel yang dirawat -MSH.

Rajah 4. Aktiviti perencatan tyrosinase dan aktiviti anti-oksidan sebatian aktif ekstrak etanol Kummerowia striata (A) aktiviti perencatan tyrosinase asid p-kuumarik dan kuersetin (12.5–50} μM) telah dianalisis. (B) Aktiviti anti-Melanogenik asid kuumarik dan kuersetin (100–400 μM) telah dianalisis dalam sel B16F10. (C) Aktiviti anti-oksidan asid p-kuumarik dan kuersetin (6.25-100 μM) diukur dengan menggunakan ujian kation radikal ABTS ditambah. Arbutin dan BHA digunakan sebagai kawalan positif. Nilai mewakili min ± SD bagi tiga replika bebas. Kepentingan statistik ditunjukkan sebagai * P < 0.05, ** P < 0.01, berbanding dengan sampel yang tidak dirawat.

3.4. asid p-kuumarik dan kuersetin daripada EKS mempamerkan aktiviti anti-melanogenik dan anti-oksida yang kuat

Seterusnya, kami cuba mengenal pasti dan membersihkan sebatian berfungsi yang terdapat dalam EKS yang mempamerkan sifat anti-melanogenik dan anti-oksida yang kuat. Pelbagai sebatian telah dikenalpasti sebagai luteolin, asid p-kuumarik, asid rosmarinik, kuersetin, genistein, dan (tambah)-catechin. Antaranya, asid p-kuumarik dan kuersetin menghalang tyrosinase, dan sintesis melanin dan mempamerkan kapasiti penghapusan serupa dengan arbutin, agen penyahpigmen yang terkenal, dalam cara yang bergantung kepada dos (Rajah 4). Keputusan ini menunjukkan bahawa asid p-kuumarik dan kuersetin adalah sebatian penting untuk sifat anti-melanogenik dan anti-oksida EKS.

4. Perbincangan

Dalam kajian ini, kami bertujuan untuk menganalisis potensi anti-melanogenik dan antioksidan EKS dan dua sebatian asid p-kuumarik dan kuersetin dan mendapati bahawa EKS mempunyai aktiviti anti-melanogenik dan anti-oksida yang kuat.

Pigmentasi kulit kebanyakannya disebabkan oleh melanosit dalam lapisan basal kulit, berikutan rangsangan oleh sinaran UV. Keratinosit yang dirangsang merembeskan -MSH (hormon peptida kecil) [21]. Oleh itu, pendedahan UV mendorong pengeluaran melanin yang mengakibatkan hiperpigmentasi [22]. Baru-baru ini, ramai penyelidik telah memberi tumpuan kepada pembangunan sebatian pemutihan yang baru dan berkesan, kerana kosmetik dengan kesan pemutihan merupakan sebahagian besar daripada pasaran kosmetik. Kajian mengenai perencatan biosintesis melanin mendedahkan bahawa arbutin, asid kojik, dan banyak produk semula jadi lain menghalang melanogenesis dan hiperpigmentasi. Walau bagaimanapun, kesan sampingan arbutin [23] dan asid kojik [24] baru-baru ini telah dilaporkan, dan penggunaan bahan ini mungkin dihadkan. Oleh itu, terdapat keperluan untuk membangunkan bahan pemutih kulit yang selamat tanpa kesan sampingan. Penyelidikan terkini tertumpu kepada pembangunan kosmetik pemutihan kulit daripada bahan semula jadi.

Beberapa kajian telah menunjukkan pelbagai aktiviti biologi ekstrak K. striata. Khususnya, K. striata berkesan secara farmaseutikal untuk keradangan dan pengoksidaan [25,26]. Walau bagaimanapun, kesan dan mekanisme molekul K. striata terhadap melanogenesis belum dilaporkan sehingga kini. Dalam kajian ini, kami menunjukkan buat kali pertama bahawa EKS mempunyai aktiviti anti-melanogenik dan anti-oksidan.

Tyrosinase, TRP-1 dan TRP-2 memainkan peranan penting dalam biosintesis melanin [27]. Oleh itu, mekanisme yang mendasari kesan agen pemutihan kulit melibatkan perencatan pengeluaran melanin dengan mengurangkan aktiviti tyrosinase [28]. Ekspresi gen tyrosinase, TRP-1, dan TRP-2 diketahui dikawal oleh MITF [29]. Dalam kajian ini, aktiviti anti-melanogenik EKS didapati dimediasi oleh perencatan aktiviti tyrosinase dan sintesis melanin yang disebabkan oleh MSH dalam sel melanoma B16F10, tanpa induksi sitotoksisiti (Rajah 1). Aktiviti anti-melanogenik EKS ini didapati dimediasi oleh pengurangan pengawalseliaan mRNA akibat -MSH dan ekspresi protein tyrosinase, TRP-1, TRP-2 dan MITF (Gamb. 3). Aktiviti anti-oksidan diukur dengan ujian DPPH dan ABTS. EKS menunjukkan aktiviti antioksidan yang kuat serupa dengan BHA, yang digunakan sebagai kawalan positif (Rajah 2). Sebatian aktif yang terdapat dalam EKS telah diasingkan dan disahkan sebagai asid p-kuumarik dan kuersetin. Walaupun pelbagai aktiviti biologi, termasuk kardioprotektif [30], anti-radang [31,32], anti-mutagenik [33] anti-oksida [34,35], dan aktiviti anti-melanogenik [36] telah dilaporkan untuk p-couric. asid dan kuersetin daripada pelbagai tumbuhan, ini adalah kajian pertama yang melaporkan bahawa asid p-kuumarik dan kuersetin daripada EKS mempunyai aktiviti anti-melanogenik dan anti-oksidan.

Dalam kajian ini, aktiviti anti-melanogenik dan anti-oksidan EKS telah dinilai. EKS melaksanakan aktiviti anti-melanogenik dan anti-oksida melalui pengawalan aktiviti tyrosinase dan sintesis melanin yang disebabkan oleh MSH dalam sel melanoma B16F10, tanpa mendorong sitotoksisiti. Sebatian aktif utama ialah asid p-kuumarik dan kuersetin. Oleh itu, penemuan kami menunjukkan buat kali pertama bahawa EKS boleh digunakan sebagai agen depigmentasi dan anti-oksidan yang berpotensi.

Konflik kepentingan

Penulis mengisytiharkan tiada konflik kepentingan.

Pembiayaan

Kerja ini disokong oleh Program Pembangunan Teknologi (S2393982) yang dibiayai oleh Kementerian PKS dan Permulaan (MSS, Korea).

Dokumen ketelusan

Dokumen Transparency yang dikaitkan dengan artikel ini boleh didapati dalam versi dalam talian.

Rujukan

[1] P. Limtrakul, S. Yodkeeree, P. Thippraphan, W. Punfa, J. Srisomboon, Kesan anti-penuaan dan perencatan tyrosinase ekstrak butanol bunga Cassia fistula, BMC Complement. Altern. Med. 16 (2016) 497.

[2] A. Gragnani, S. Cornick, V. Chominski, S. Ribeiro de Noronha, S. Alves Corrêa de Noronha, L. Ferreira, Kajian teori utama penuaan kulit, Adv. Penuaan Res. 3 (2014) 265–284.

[3] TD Pedrosa, AO Barros, JR Nogueira, AC Fruet, IC Rodrigues, DQ Calcagno, MA Smith, TP de Souza, SB Barros, MC de Vasconcellos, et al., Kesan anti-kedut dan anti-pemutihan jucá ( Libidibia ferrea Mart.) ekstrak, Arch. Dermatol. Res. 308 (2016) 643–654.

[4] N. Delalle-Lozica, Terapi tempatan sebagai asas pencegahan anti-penuaan, Acta Clin. Croat. 49 (2010) 529–536.

[5] N. Maddodi, A. Jayanthy, V. Setaluri, Cahaya bersinar pada pigmentasi kulit: kesan sinaran UV yang lebih gelap dan cerah, Photochem. Photobiol. 88 (2012) 1075–1082.

[6] C. Dessinioti, AJ Stratigos, D. Rigopoulos, AD Katsambas, Kajian semula gangguan genetik hipopigmentasi: pelajaran yang dipelajari daripada biologi melanosit, Exp. Dermatol. 18 (2009) 741–749.

[7] A. Nishina, A. Miura, M. Goto, K. Terakado, D. Sato, H. Kimura, Y. Hirai, H. Sato, N. Phay, Mansonone E daripada tolok Mansonia menghalang melanogenesis yang disebabkan oleh MSH dalam sel B16 dengan menghalang ekspresi CREB dan fosforilasi dalam laluan PI3K/Akt, Biol. Pharm. lembu jantan. 41 (2018) 770–776.

[8] Pendengaran VJ, TM Ekel, tyrosinase Mamalia. Perbandingan hidroksilasi tyrosine dan pembentukan melanin, Biochem. J. 57 (1976) 549–557.

[9] M. Kanlayavattanakul, N. Lourith, Tumbuhan dan produk semula jadi untuk rawatan hiperpigmentasi kulit – ulasan, Planta Med. (2018), https://doi.org/10.1055/a0583-0410 [Epub mendahului cetakan].

[10] M. Kanlayavattanakul, N. Lourith, Rawatan hiperpigmentasi kulit menggunakan herba: kajian semula bukti klinikal, J. Cosmet. Laser Ther. 20 (2018) 123–131.

[11] JJ Hsiao, DE Fisher, Peranan faktor transkripsi dan pigmentasi berkaitan mikroftalmia dalam melanoma, Arch. Biokim. Biophys. 563 (2014) 28–34.

[12] LA Garraway, HR Widlund, MA Rubin, G. Getz, AJ Berger, S. Ramaswamy, R. Beroukhim, DA Milner, SR Granter, J. Du, C. Lee, et al., Analisis genomik bersepadu mengenal pasti MITF sebagai onkogen survival keturunan yang diperkuatkan dalam melanoma malignan, Nature 436 (2005) 117–122.

[13] X. Zhang, P. Guo, G. Sun, S. Chen, M. Yang, N. Fu, H. Wu, X. Xu, Sebatian fenolik dan flavonoid daripada buah-buahan Pandanus tectorius Soland, J. Med . Tumbuhan Re. 6 (2012) 2622–2626.

[14] H. Li, Q. Ma, Y. Liu, J. Qian, J. Zhou, Y. Zhou, Juzuk kimia daripada Polygonum perfoliatum, Chin. J. Appl. alam sekitar. biol. 15 (2009) 615–620.

[15] A. Yagi, T. Kanbara, N. Morinobu, Perencatan cendawan-tirosinase oleh ekstrak aloe, Planta Med. 56 (1987) 515–517.

[16] MS Blois, Penentuan antioksidan melalui penggunaan radikal bebas yang stabil, Nature 181 (1958) 1199–1200.

[17] U. Ozgen, A. Mavi, Z. Terzi, A. Yιldιrιm, M. Coşkun, PJ Houghton, Sifat antioksidan beberapa spesies Lamiaceae perubatan, Pharm. biol. 44 (2006) 107–112.

[18] NJ Miller, C. Rice-Evans, MJ Davies, V. Gopinathan, A. Milner, Kaedah baru untuk mengukur kapasiti antioksidan dan aplikasinya untuk memantau status antioksidan dalam neonat pramatang, Clin. Sci. 84 (1993) 407–412.

[19] S. Dudonne, X. Vitrac, P. Coutière, M. Woillez, JM Mérillon, Kajian perbandingan sifat antioksidan dan jumlah kandungan fenolik 30 ekstrak tumbuhan kepentingan industri menggunakan ujian DPPH, ABTS, FRAP, SOD dan ORAC , J. Agric. Kimia Makanan. 57 (2009) 1768–1774.

[20] M. Otreba, J. Rok, E. Buszman, D. Wrzesniok, Peraturan melanogenesis: peranan cAMP dan MITF, Postepy Hig. Med. Dosw. 66 (2012) 33–40.

[21] JS Han, JH Sung, SK Lee, Aktiviti antimelanogenesis ekstrak ginseng terhidrolisis (GINST) melalui perencatan kinase protein diaktifkan mitogen JNK dalam sel B16F10, J. Food Sci. 81 (2016) H2085–H2092.

[22] M. Chatatikun, A. Chiabchalard, tumbuhan Thai dengan paras antioksidan yang tinggi, aktiviti penghapusan radikal bebas, aktiviti anti-tirosinase dan anti-kolagenase, BMC Complement. Altern. Med. 17 (2017) 487.

[23] C. Couteau, LJ Coiffard, Penentuan fotostabilitas arbutin, agen pemutih sayuran, Farmaco 55 (2000) 410–413.

[24] Y. Higashi, Y. Fujii, Penentuan asid kojik dalam kosmetik pemutihan kulit dengan kromatografi cecair berprestasi tinggi ditambah dengan pengesanan ultraungu selepas terbitan pra-lajur dengan 4-fluoro-7-nitro{ {6}},1,3-benzoxazole, J. Cosmet. Sci. 63 (2017) 205–212.

[25] JY Tao, L. Zhao, ZJ Huang, XY Zhang, SL Zhang, QG Zhang, Zhang BH FeiXiao, QL Feng, GH Zheng, Kesan anti-radang ekstrak etanol daripada Kummerowia striata (Thunb.) Schindl pada LPS- sel RAW264.7 yang dirangsang, Inflamasi 31 (2008) 154–166.

[26] J.-H. Lee, J.-S. Park, Aktiviti antioksidan bagi pecahan yang diekstrak pelarut daripada Kummerowia striata (Thunb.) Schindl, Indian J. Sci. Technol. 8 (2015) 28–31.

[27] S. Kippenberger, S. Loitsch, F. Solano, A. Bernd, R. Kaufmann, Kuantiti transkrip tyrosinase, TRP-1, dan Trp-2 dalam melanosit manusia oleh daya saing transkripase terbalik multiplex PCR– peraturan oleh hormon steroid, J. Invest.Dermatol. 110 (1998) 364–367.

[28] YD Park, SY Kim, YJ Lyou, DY Lee, JM Yang, TXM13 sel melanoma manusia: sumber baru untuk kinetik perencatan tyrosinase manusia dan untuk penyaringan agen pemutih, Biochem. Biol Sel. 84 (2006) 112–116.

[29] A. Tuerxuntayi, YQ Liu, A. Tulake, M. Kabas, A. Eblimit, HA Aisa, ekstrak Kaliziri mengimbangi tyrosinase, TRP-1, TRP-2 dan ekspresi MITF dalam melanoma murine B16 sel, BMC Complement. Altern. Med. 14 (2014) 166.

[30] N. Prasanna, DN Krishnan, M. Rasool, Kardiotoksisiti yang disebabkan oleh natrium arsenit dalam tikus: peranan perlindungan asid p-kuumarik, polifenol pemakanan biasa, Toxicol. Mech. Kaedah 23 (2013) 255–262.

[31] SJ Pragasam, V. Venkatesan, M. Rasool, Kesan imunomodulator dan anti-radang asid p-kuumarik, polifenol pemakanan biasa pada keradangan eksperimen pada tikus, Keradangan 36 (2013) 169–176.

[32] M. Lee, M. Son, E. Ryu, Kim JG Yu SS, BW Kang, GH Sung, H. Cho, H. Kang, Apoptosis yang disebabkan oleh Quercetin menghalang jangkitan EBV, Oncotarget 6 (2015) 12603–12624 .

[33] LR Ferguson, IF Lim, AE Pearson, J. Ralph, PJ Harris, Anti mutagenesis bakteria oleh asid hidroksisinamik daripada dinding sel tumbuhan, Mutat. Res. 542 (2003) 49–58.

[34] C. Castelluccio, G. Paganga, N. Melikian, GP Bolwell, J. Pridham, J. Sampson, C. Rice-Evans, Potensi antioksidan perantaraan dalam metabolisme fenilpropanoid dalam tumbuhan yang lebih tinggi, FEBS Lett. 368 (1995) 188–192.

[35] IM Erden, A. Kahraman, Kesan perlindungan flavonol quercetin terhadap tekanan oksidatif yang disebabkan oleh ultraviolet dalam tikus, Toxicology 154 (2000) 21–29.

[36] SM An, Koh JS, dan Boo YC: asid p-coumaric bukan sahaja menghalang aktiviti tyrosinase manusia secara in vitro tetapi juga melanogenesis dalam sel yang terdedah kepada UVB, Phytother. Res. 24 (2010) 1175–1180.

For more information:1950477648nn@gmail.com