Merekabentuk Tyrosinase SiRNAs Dengan Algoritma Ramalan Berbilang Dan Penilaian Kesan Anti-Melanogeniknya

Abstrak

Melanin adalah pigmen yang dihasilkan daripada tirosin dalam melanosit. Walaupun melanin mempunyai peranan perlindungan terhadap kerosakan akibat sinaran UVB, ia juga dikaitkan dengan perkembangan melanoma dan warna kulit yang lebih gelap. Tyrosinase ialah enzim kritikal dalam sintesis melanin, yang mengawal langkah mengehadkan kadar semasa penukaran tirosin kepada DOPA dan dopaquinon. Untuk membangunkan terapeutik gangguan RNA yang berkesan, kami mereka bentuk kumpulan siRNA melanin dengan menggunakan pelbagai program ramalan untuk mengurangkan tahap tyrosinase manusia.

Pertama, 272 siRNA melepasi penilaian kebolehcapaian sasaran menggunakan program RNAxs. Kemudian kami memilih 34 jujukan siRNA dengan ΔG Lebih besar daripada atau sama dengan -34.6 kcal/mol, nilai i-Score Lebih besar daripada atau sama dengan 65, dan skor skala siRNA Kurang daripada atau sama dengan 30. siRNA direka bentuk sebagai 19-bp RNA dupleks dengan tidak simetri 3' tidak terjual pada hujung 3' helai antisense. Kami menguji sama ada siRNA ini berkesan mengurangkan ekspresi gen tyrosinase menggunakan qRT-PCR dan mendapati bahawa 17 urutan siRNA lebih berkesan daripada siRNA yang tersedia secara komersial. Tiga siRNA yang diuji selanjutnya menunjukkan perubahan warna visual yang berkesan dalam sel manusia MNT{12}} tanpa kesan sitotoksik, menunjukkan jujukan ini adalah anti-melanogenik. Kajian kami mendedahkan bahawa siRNA tyrosinase manusia boleh direka bentuk dengan cekap menggunakan pelbagai algoritma ramalan.

Dalam penyelidikan kami, didapati bahawa Cistanche deserticola mempunyai kesan pemutihan, kaedah penyediaan ekstrak tuberkulosis Cistanche deserticola dan kosmetik pemutihan dan anti-penuaan, kaedah penyediaan ekstrak Cistanche deserticola tuberculosis terdiri daripada penghancuran, pengekstrakan mentah, sentrifugasi, dan pengumpulan. ekstrak mentah, dan Selepas berdiri diam, mengelusi dan mengeringkan, ekstrak Cistanche cistanche diperolehi. Kaedah penyediaan adalah mudah dan bebas pencemaran, kandungan echinacoside dalam ekstrak adalah Lebih besar daripada atau sama dengan 25 peratus, kandungan verbascoside Lebih besar daripada atau sama dengan 55 peratus, dan kandungan jumlah glikosida adalah Lebih besar daripada atau sama dengan 80 peratus ; Selepas ujian aktiviti antioksidan, dan lain-lain, terbukti bahawa ekstrak Cistanche deserticola mempunyai kesan anti-pengoksidaan, pemutihan, dan anti-penuaan. Ia ditambah kepada kosmetik untuk menyediakan kosmetik pemutihan dan anti-penuaan, dan kosmetik diuji untuk sitotoksisiti dan keselamatan, dan disahkan bahawa kosmetik itu selamat dan tidak merengsakan, dan mempunyai kesan pemutihan yang baik.

Klik manfaat kesihatan cistanche

Kata kunci:

Tyrosinase, Melanin, siRNA, Melanocytes, Whitening.

PENGENALAN

Warna kulit manusia ditentukan terutamanya oleh pigmen melanin, yang dihasilkan oleh melanosit dalam epidermis. Pengeluaran melanin diinduksi apabila kulit terdedah kepada sinaran ultraungu, dan ia diangkut ke keratinosit dengan cara pengantaraan vesikel (Slominski et al., 2004). Dua jenis melanin, eumelanin, dan pheomelanin, dihasilkan daripada L-tirosin melalui proses pelbagai langkah. Eumelanin ialah polimer tidak larut gelap, coklat-hitam yang bertanggungjawab untuk warna kulit gelap (Slominski et al., 2004). Langkah mengehadkan kadar dalam melanogenesis ialah penukaran L-tirosin kepada L-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) oleh tyrosinase (Lerner dan Fitzpatrick, 1950; Hearing Tsukamoto, 1991). Untuk tujuan kosmetik dan farmaseutikal, banyak agen perencatan tyrosinase telah dibangunkan untuk menguruskan pigmentasi kulit, seperti hidrokuinon (1,{14}}dihydroxybenzene), arbutin, asid azelaik (1,7-asid dikarboksilik heptana), dan lain-lain (Gillbro dan Olsson, 2011). Walaupun kesan anti-pigmentasi mereka telah mantap, risiko kesan sampingan telah membawa keraguan untuk penggunaan berterusan perencat tyrosinase, seperti yang ditunjukkan oleh formulasi hidrokuinon dengan kepekatan lebih 1 peratus telah diharamkan di Eropah (Gillbro dan Olsson, 2011). ).

Gangguan RNA (RNAi) pertama kali ditemui sebagai mekanisme pertahanan antivirus dalam nematod Caenorhabditis elegans di mana RNA terkandas dua (dsRNA) mencetuskan pembungkaman gen bagi urutan mRNA pelengkap (Fire et al., 1998). Selepas itu, RNA interfering pendek (siRNA) yang disintesis secara buatan diperhatikan diproses dalam sel mamalia (Elbashir et al., 2001a). Pemprosesan RNAi terdiri daripada beberapa langkah; penjanaan siRNA oleh belahan dsRNA oleh Dicer, pemasangan siRNA dengan kompleks pembungkaman yang disebabkan oleh RNA (RISC), pemisahan helai siRNA (helai deria (penumpang) dan antisense (panduan), mengikat helai antisense kepada mRNA dengan pelengkap jujukan, dan degradasi mRNA oleh Argonaute 2 (Ago2) (Engels, 2013).

Ciri-ciri struktur siRNA telah dikaji selama beberapa dekad. Struktur klasik siRNA memerlukan panjang dupleks yang sesuai, 3' tidak terjual, dan struktur tidak simetri. Daripada kajian di Drosophila melanogaster, reka bentuk siRNA standard dicadangkan sebagai dsRNA daripada 21 nt sense/antisense strands membentuk 19 pasangan asas (bp) dsRNA stem dengan 2 nt 3' overhang di kedua-dua hujungnya (Elbashir et al., 2001b ). Walau bagaimanapun, dalam sel mamalia, kajian baru-baru ini menunjukkan bahawa siRNA bukan kanonik boleh sama berkesan dengan siRNA klasik atau bahkan boleh diperbaiki dengan variasi panjang, simetri, dan tidak terjual. siRNA tanpa 3 'tergantung(s) (Czauderna et al., 2003; Rose et al., 2005; Chang et al., 2007), dan yang lebih panjang (Kim et al., 2005) atau lebih pendek (Chu dan Rana, 2008 ) daripada 19 bp juga berkesan dalam pembungkaman gen dalam sel mamalia. Asimetri dalam struktur tidak terjual 3', hanya pada helai antisense, menghasilkan prestasi yang lebih baik daripada siRNA simetri (Sano et al., 2008).

Untuk mengetuk sasaran mRNA yang berkesan dan spesifik, reka bentuk rasional siRNA adalah kritikal. Algoritma generasi pertama untuk reka bentuk siRNA telah dibangunkan berdasarkan kestabilan termodinamik (Schwarz et al., 2003), keutamaan kedudukan (Amarzguioui dan Prydz, 2004; Reynolds et al., 2004; Ui-Tei et al., 2004), dan keunikan daripada jujukan sasaran (Pancoska et al., 2004). Kajian-kajian ini mencadangkan bahawa siRNA berfungsi adalah tidak simetri dalam kestabilan hujung dupleks seperti yang dilihat oleh 5' terminus untaian panduan yang tidak stabil, dan fakta bahawa 5' termini helai panduan lebih suka pangkalan A atau U. Selain itu, penilaian tapak sasaran kebolehcapaian antara siRNA dan mRNA adalah kritikal, dan dikira berdasarkan tenaga yang diperlukan untuk membuka tapak pengikatan dan membentuk hibridisasi (Muckstein et al., 2006; Tafer et al., 2008). Untuk meningkatkan ketepatan ramalan, algoritma generasi kedua menggunakan model baharu dengan sejumlah besar pemerhatian. Mereka menggunakan model rangkaian saraf tiruan (Huesken et al., 2005) atau model regresi linear (Shabalina et al., 2006; Vert et al., 2006; Ichihara et al., 2007).

Dalam kajian ini, kami mengambil kira pelbagai syarat untuk mereka bentuk siRNA tirosinase manusia yang cekap. Untuk memaksimumkan kecekapan dalam reka bentuk siRNA, kami menggabungkan kriteria yang diketahui untuk penilaian menggunakan berbilang algoritma reka bentuk siRNA (RNAxs, i-Score, dan skala siRNA): kebolehcapaian tapak sasaran, kandungan GC, kestabilan termodinamik relatif pada kedua-dua hujungnya, serta kriteria lain. Kami selanjutnya menunjukkan kesan perencatan siRNA terpilih pada pengeluaran melanin dalam sel melanoma manusia.

BAHAN DAN KAEDAH

Aplikasi gabungan algoritma reka bentuk siRNA dan sintesis

Untuk jujukan mRNA tirosinase manusia (TYR), jujukan rujukan (RefSeq id NM{{0}}) daripada pangkalan data nukleotida NCBI telah digunakan. Untuk menilai kebolehcapaian sasaran, alat reka bentuk RNAxs telah digunakan. RNAxs menggabungkan kriteria kefungsian siRNA yang diketahui (asimetri, lipatan sendiri, hujung bebas) dengan kebolehcapaian tapak sasaran RISC (Tafer et al., 2008). 272 siRNA diluluskan dengan parameter lalai (8 nt ambang kebolehaksesan; 0.01157, 16 nt ambang kebolehaksesan; 0.001002, tenaga lipat sendiri; 0.9022, asimetri jujukan; 0.5, asimetri tenaga; 0.4655, hujung bebas; 0.625) dalam semua kriteria dan disenaraikan mengikut skor. Skala i-Score dan siRNA adalah berdasarkan model regresi linear dan dilatih menggunakan dataset Huesken (Huesken et al., 2005). Algoritma i-Score (inhibitory–Score) mengira nilai ΔG bagi helai siRNA, dinukleotida pada hujung 5' dan 3', panjang regangan GC maksimum dan kandungan GC (Ichihara et al., 2007). Algoritma ini mengenal pasti asas pilihan untuk setiap kedudukan nukleotida dengan mengira skor perencatan (i-Score). Selain itu, untuk meningkatkan ketepatan reka bentuk skor, kami memilih siRNA yang kurang termostabil dengan nilai ΔG keseluruhan Lebih besar daripada atau sama dengan -34.6 kcal/mol (Ichihara et al., 2007). skala siRNA mengira kestabilan hujung 5' dan 3' dan jumlah kandungan GC (Matveeva et al., 2007). Kami menggunakan penapis untuk skor menjadi iScore Lebih besar daripada atau sama dengan 65 dan skala siRNA Kurang daripada atau sama dengan 30. Semua siRNA untuk TYR telah disintesis oleh Bioneer Inc. (Daejeon, Korea) sebagai 21-mer dengan 3 ' tergantung pada helai antisense. Lihat Jadual 1 untuk senarai penuh siRNA.

Kultur sel

Barisan sel melanoma manusia yang sangat berpigmen MNT{{0}} telah disediakan oleh Dr. Minsoo Noh (Universiti Kebangsaan Seoul, Sekolah Farmasi). Sel dikekalkan dalam Sederhana Penting Minimal (MEM) ditambah dengan 20 peratus serum lembu janin (FBS), 10 peratus Sederhana Helang Modified Dulbecco (DMEM), dan gentamicin (50 ug/mL). Trypsin (0.25 peratus ) dan asid ethylenediaminetetraacetic (EDTA) telah dibeli daripada Gigbco-BRL, dan 20 mM HEPES telah dibeli dari Sigma (St. Louis, MO, USA). Sel dikekalkan pada 37 darjah dalam suasana lembap sebanyak 5 peratus CO2 di udara.

pemindahan siRNA

Lipofectamine 2000 (11668-027, Invitrogen, Waltham, MA, USA) atau DharmaFECT (T-2001-02, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) telah digunakan untuk pemindahan sel mengikut protokol pengeluar. 34 siRNA anti-Tyrosinase dan siRNA bukan sasaran telah dibeli daripada Bioneer Inc. SiRNA kawalan positif telah dibeli dari Santa Cruz (#sc-36766, Santa Cruz, Dallas, TX, Amerika Syarikat). Sel MNT-1 telah dibesarkan kepada 60 peratus pertemuan dan ditransfeksi dengan sama ada Lipofectamine atau reagen DharmaFECT bergantung pada protokol pengeluar.

Analisis imunoblot

Analisis imunoblot sel MNT-1 telah dilisiskan dengan penimbal lisis (20 mM tris pH 7.5,5 mM EDTA, 10 mM Na4 P2 O7, 100 mM NaF, 2 mM Na3 VO4, 1 peratus NP-40, 1 mM PMSF, 10 ug/mL aprotinin, dan 10 ug/mL leupeptin) dan 15 ug protein telah tertakluk kepada SDS-PAGE dan dipindahkan ke membran nitroselulosa. Membran telah diinkubasi dengan antibodi anti-tirosinase (#sc-7834, Santa Cruz). Band telah divisualisasikan dengan sistem pengimejan ChemiDoc (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) dan dikira oleh perisian ImageJ (ver. 1.44p, NIH, USA).

Pengukuran kandungan melanin

Kandungan melanin diukur seperti yang diterangkan sebelum ini (Hosoi et al., 1985) dengan beberapa pengubahsuaian. Secara ringkas, sel MNT-1 telah disemai pada 6-plat perigi (6×105 sel/telaga) dan ditransfeksi dengan siRNA. Pada 48 jam dan 168 jam selepas pemindahan, sel-sel telah dibasuh dengan garam penampan fosfat (PBS) dan dituai. Selepas mencuci dengan PBS, pelet sel telah dibubarkan dalam 1 mL 1 N NaOH yang mengandungi 10 peratus DMSO dan diinkubasi selama 1 jam pada 80 darjah. Penyerapan larutan diukur pada 450 nm. Kandungan melanin dikira berdasarkan lengkung piawai yang diperoleh daripada melanin sintetik.

Ujian daya maju sel (ujian XTT)

Ujian XTT (cat# 11465015001, Roche, Pleasanton, CA, USA) telah dilakukan mengikut protokol Pengilang. Secara ringkas, 6×105 sel/telaga MNT1 disalut dalam 6-plat telaga. Pada keesokan harinya, sel telah ditransfeksi dengan siRNA individu. Selepas 24 jam, sel disalutkan dalam 96-plat mikro telaga dalam quintuplicate dan kemudian dikekalkan tambahan untuk bilangan hari yang dinyatakan. Untuk ujian XTT, 50 μL campuran pelabelan XTT (reagen pelabelan XTT:reagen gandingan elektron=50:1 untuk mencapai kepekatan akhir XTT 0.3 mg/mL) telah ditambahkan pada setiap telaga dan plat diinkubasi pada 37 darjah dalam suasana CO2 5 peratus selama 4 jam. Penyerapan diukur dengan pembaca plat ujian imunosorben berkaitan enzim pada 450 nm.

Pengasingan RNA dan analisis tindak balas rantai polimerase masa nyata (PCR) kuantitatif

Jumlah RNA telah diekstrak daripada sel menggunakan kit mudah BIRU (reagen TRIzol, iNtRON, Seongnam, Korea), mengikut protokol pengeluar. TRIzol telah dikeluarkan dengan penambahan kloroform dan mRNA telah dimendakkan dengan isopropanol. Mendakan RNA telah dibasuh dengan 75 peratus etanol. Ketumpatan optik pada 260 dan 280 nm diukur menggunakan spektrometer UV untuk menilai kuantiti dan ketulenan RNA, dan integriti RNA telah disahkan oleh elektroforesis gel agarose. Primer khusus gen telah direka bentuk untuk menguatkan human tyrosinase (TYR), Tumor necrosis factor (TNF), interleukin 6 (IL6), dan gen housekeeping glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) untuk kawalan dalaman. Pasangan primer berikut telah digunakan untuk TYR (F: 5′-GCCAACGATCCTAT CTTCCTTC-3′, R: 5′-GTGCATTGGCTTCTGGATAAAC-3′), TNF (F: 5′-GAGGCCAAGCCCTGGTATG-3 ′, R: 5′-CGGGCCGATTGATCTCAGC-3′), IL6 (F: 5′-CTGGATTCAATGAGGAGACTTG-3′ R: 5′-CACTACTCTCAAATCTGTTCTGG-3′) dan GAPDH (F: 5′ -GTGATGGCATGGACTGTGGT-3′, R: 5′-AAGGGTCATCATCTCTGCCC-3′). Semua amplifikasi dijalankan menggunakan pra-campuran (20 μL) yang mengandungi 500 nmol/L primer khusus gen dan 2 μL RNA templat di bawah keadaan berikut: denaturasi pada 95 darjah selama 1 minit, diikuti oleh 45 kitaran 95 darjah untuk 20 s, 58 darjah selama 20 s, dan 72 darjah selama 25 s, dengan lanjutan akhir pada 72 darjah selama 5 min.

Analisis statistik

Data grafik dibentangkan sebagai min ± SD. Kepentingan statistik antara tiga kali ganda dan antara kumpulan ditentukan menggunakan analisis varians satu atau dua hala (ANOVA) diikuti dengan ujian pasca perbandingan berbilang Bonferroni atau ujian-t Pelajar. Kepentingan diandaikan apabila p<0.05.

KEPUTUSAN

Reka bentuk siRNA tirosinase manusia

Untuk membina kumpulan siRNA yang cekap menyasarkan tyrosinase manusia, kami menggunakan alat bioinformatik yang menggabungkan beberapa model ramalan lanjutan. Kami memperoleh jujukan rujukan mRNA (RefSeq id NM_000372) daripada dataset nukleotida NCBI untuk tyrosinase manusia dan mengecualikan kawasan 5'UTR dan 3'UTR daripada ramalan kerana ia boleh mengganggu fungsi RISC (Elbashir et al., 2002). Pertama, urutan itu dinilai untuk kebolehcapaian RISC ke tapak sasaran menggunakan perisian RNAxs, yang dianggap sebagai faktor penting untuk menyekat aktiviti endonukleolitik RISC (Tafer et al., 2008). Selain kebolehcapaian sasaran, algoritma ini juga menilai tenaga lipatan sendiri dan asimetri jujukan untuk mengira markah.

Daripada algoritma ini, 272 19-jujukan untaian dua kali ganda (17 peratus daripada 1,572 jujukan) melepasi ambang lalai. Jujukan juga dinilai oleh dua algoritma generasi kedua berdasarkan model regresi linear: i-Score (inhibitory-Score) (Ichihara et al., 2007) dan skala siRNA (Matveeva et al., 2007). Kedua-dua algoritma skala i-Score dan siRNA menganggap keutamaan bergantung kepada kedudukan nukleotida. skala siRNA mengira kestabilan dupleks tempatan dan jumlah kandungan G / C untuk penilaian siRNA berfungsi. Kami menggunakan penapis untuk i-Score Lebih Besar daripada atau sama dengan 65 dan skala siRNA Kurang daripada atau sama dengan 30, dengan keseluruhan ΔG Lebih besar daripada atau sama dengan -34.6 kcal/mol. Kami mendapati bahawa i-Score lebih ketat, melepasi 191 jujukan (12 peratus ), manakala skala siRNA kurang ketat, melepasi 47 peratus jujukan. Akhirnya, 71 siRNA diperolehi yang memenuhi kriteria ketiga-tiga algoritma reka bentuk siRNA. Apabila keseluruhan had nilai ΔG digunakan, hanya 34 siRNA (2.2 peratus ) akhirnya lulus tanpa kesan luar sasaran, seperti yang ditentukan dengan menggunakan pangkalan data nukleotida NCBI (Rajah 1A, 1B). Untuk kajian ini, kami mereka bentuk 19-bp RNA dupleks dengan asimetri 2-nt overhang pada 3' hujung helai antisense untuk prestasi yang lebih baik seperti yang dicadangkan (Rajah 1C) (Rose et al., 2005 Sano et al., 2008). Urutan siRNA penuh disenaraikan dalam Jadual 1.

Penilaian keberkesanan tyrosinase siRNA dalam barisan sel melanoma manusia MNT-1

Untuk menilai keberkesanan siRNA yang dipilih oleh alat reka bentuk siRNA, kami mengalihkan sel MNT {{0}} dengan 34 siRNA individu dan mengukur ekspresi mRNA (TYR) tyrosinase oleh qRT-PCR. Seperti yang ditunjukkan dalam skema eksperimen yang diterangkan dalam Rajah 2A, tahap ekspresi mRNA tyrosinase diukur pada hari ke-2 selepas pemindahan. 34 siRNA mengurangkan tahap mRNA tyrosinase sebanyak purata 57.8 peratus (SD=0.141) dalam saringan pertama. 13 siRNA adalah lebih berkesan daripada siRNA yang tersedia secara komersial, yang digunakan sebagai kawalan positif (PC) dengan kepentingan (Rajah 2B, Jadual 2). Kami selanjutnya mengukur mRNA tyrosinase untuk mengesahkan keberkesanan 6 siRNA paling berkesan (# 16, 17, 23, 26, 28, dan 31) dan 3 siRNA paling kurang berkesan (# 2, 3, dan 5). Menjelang saringan pertama, 6 siRNA yang paling berkesan telah menjatuhkan ekspresi tyrosinase dengan cekap (0.294-lipat berbanding NC) dan juga lebih berkesan daripada kawalan positif (0.39-lipat berbanding NC), manakala 3 siRNA paling kurang berkesan menunjukkan keberkesanan yang sama atau lebih rendah (Rajah 3A, 3B).

Dalam saringan kedua, walaupun siRNA yang paling kurang berkesan menjatuhkan ekspresi tyrosinase lebih kurang 0.5-lipat ganda. Untuk melihat sama ada siRNA mengurangkan tahap protein tyrosinase, kami melakukan analisis imunoblot. Hasil daripada tahap mRNA, paras protein tyrosinase telah menurun dengan berkesan (Rajah 3C). Secara amnya, 6 siRNA yang paling berkesan menunjukkan prestasi yang lebih baik daripada 3 yang paling kurang berkesan. Memandangkan knockdown berkesan yang disediakan oleh siRNA kami yang berprestasi paling teruk, keputusan kami menyokong idea bahawa pengeluaran siRNA dengan menggabungkan berbilang algoritma reka bentuk siRNA adalah pendekatan yang cekap.

Kesan anti-melanogenik siRNA dalam sel MNT-1.

Keputusan di atas menunjukkan bahawa siRNA yang kami reka boleh mengecilkan sintesis melanin dalam sel penghasil melanin. Untuk menguji kesan siRNA kami (#16, 17, 26) pada sintesis melanin oleh tyrosinase, kami mengukur kandungan melanin dalam sel MNT-1 siRNA-transfected. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 4A (atas), kandungan melanin hanya diubah secara minimum pada hari ke-2 selepas pemindahan. Walau bagaimanapun, apabila kandungan melanin dianalisis pada hari ke-7, kesan anti-melanogenik siRNA ini telah dikesan (Rajah 4A, lebih rendah). Pengukuran kolorimetrik sampel ini (hari ke-7) menunjukkan bahawa semua siRNA mengurangkan kandungan melanin dengan ketara (p<0.001). siRNAs #16 and 17 were as effective as the positive control in reducing melanin content by approximately 0.55-fold (0.56-fold by P.C.) although siRNA #26 was less effective (~0.74-fold) (Fig. 4B). These data show that the siRNAs we designed are effective in reducing melanin synthesis in cells.

Kesan siRNA pada daya maju sel

Sesetengah siRNA mengakibatkan ketoksikan, menjejaskan daya maju sel oleh kesan luar sasaran yang berkaitan dengan pertumbuhan sel, kematian dan sifat lain. Untuk mengenal pasti sama ada siRNA ini mengakibatkan ketoksikan sel, kami menganalisis daya maju sel dengan memerhati perubahan dalam morfologi sel dan dengan ujian XTT dalam sel MNT-1 siRNA-transfected. Pada hari 1 atau 2 selepas pemindahan siRNA (# 16, 17, 26, dan PC), tiada perubahan ketara dalam morfologi sel diperhatikan (Rajah 5A). Selain itu, tiada perubahan ketara dalam daya maju sel dilihat seperti yang diukur oleh ujian XTT (Rajah 5B). Kami selanjutnya menguji sama ada siRNA ini boleh mendorong tindak balas imun dengan mengukur tahap mRNA TNF dan IL-6. siRNA #16 dan 17 tidak menjejaskan ekspresi mRNA TNF manakala #26 menunjukkan peningkatan sekitar 1.8-kali ganda dalam keadaan telanjang dan bantuan liposom (Rajah 5C).

Walau bagaimanapun, tahap itu tidak lebih tinggi daripada kawalan positif (PC). Sebaliknya, IL-6 dikawal oleh ketiga-tiga siRNA dalam keadaan bantuan liposom manakala kawalan positif tidak menunjukkan kesan berbahaya. Terutamanya, siRNA #26 dan PC mencetuskan tindak balas imun walaupun dalam keadaan telanjang, di mana tiada pengurangan mRNA tyrosinase dikesan. Secara keseluruhannya, data kami menunjukkan bahawa menggabungkan algoritma reka bentuk siRNA adalah pendekatan yang cekap untuk membangunkan urutan siRNA novel. Di samping itu, siRNA terpilih (# 16 dan 17) berkesan dalam menekan sintesis melanin manusia, menunjukkan bahawa siRNA ini boleh dikembangkan lagi sebagai urutan siRNA novel untuk digunakan dalam penyelidikan bioperubatan dan bidang kosmetik.

PERBINCANGAN

Agen pencerah kulit berguna untuk tujuan kosmetik dan banyak formulasi sedemikian telah dibangunkan selama beberapa dekad. Pada masa ini, pelbagai agen boleh didapati, dengan pelbagai mekanisme tindakan seperti perencatan tyrosinase (hydroquinone, asid azelaic, arbutin), rangsangan pusing ganti keratinosit dan pengurangan pemindahan melanosom (retinoid), co-per chelation (asid kojic dan asid askorbik), dan perencatan kematangan melanosom (arbutin) (Sheth dan Pandya, 2011). Tyrosinase ialah enzim pengehad kadar dalam pengeluaran melanin daripada melanosit (Lerner dan Fitzpatrick, 1950; Hearing dan Tsukamoto, 1991). Di sini, kami berusaha untuk mengurangkan ekspresi tyrosinase dengan menggunakan siRNA tyrosinase yang direka menggunakan pelbagai alat ramalan.

Reka bentuk siRNA yang cekap adalah penting, kerana perubahan jujukan yang halus mungkin mengubah fungsi dengan ketara. Pada masa ini, banyak algoritma reka bentuk siRNA telah dibangunkan dan algoritma ini menganggap pelbagai faktor penting untuk kefungsian, seperti kebolehcapaian sasaran, struktur mRNA sekunder, dan keutamaan kedudukan jujukan siRNA. Kajian awal tentang peraturan untuk corak urutan siRNA pilihan telah dicadangkan: N2SN17WN2 oleh peraturan Ui-Tei (Ui-Tei et al., 2004), N4AN6TN2HN5WN2 oleh Reynolds (Reynolds et al., 2004), dan sebagainya. Peraturan ini juga biasanya menunjukkan bahawa struktur siRNA yang tidak simetri adalah kritikal: lebih banyak asas A/U diperlukan pada hujung 5'-hujung antisense manakala lebih banyak asas G/C diperlukan pada 5'-hujung untai deria. Kandungan GC rendah dalam 5'-hujung helai antisense dianggap membantu dalam melonggarkan dan menggabungkan dupleks siRNA ke dalam kompleks RISC.

Algoritma skala i-Score dan siRNA mengira keutamaan nukleotida pada setiap kedudukan siRNA sebagai tambahan kepada faktor lain. Atas sebab itu, skor daripada algoritma skala i-Score dan siRNA menunjukkan korelasi ringan hingga sederhana (R2 =0.4309) (data tidak ditunjukkan), dan kebanyakan siRNA yang melepasi keperluan algoritma i-Score telah disertakan dalam skala siRNA. Keputusan kami juga menunjukkan bahawa ambang lalai yang disediakan oleh skala siRNA adalah kurang ketat daripada i-Score (47 peratus berbanding 12 peratus daripada jumlah keseluruhan).

Kajian terdahulu mencadangkan bahawa struktur sekunder siRNA keseluruhan nilai ΔG adalah penentu kritikal dalam kecekapan siRNA (Ichihara et al., 2007; Ladunga, 2007). Terutamanya, siRNA dengan nilai ΔG kurang daripada -34.6 kcal/mol, yang secara termodinamik stabil, menunjukkan kecekapan knockdown yang lemah (Ichihara et al., 2007). Apabila kami mengira pekali korelasi antara nilai ΔG dan tahap penindasan menggunakan data kami, tiada korelasi yang ketara diperhatikan (data tidak ditunjukkan). Walau bagaimanapun, kerana kami hanya memeriksa sebilangan kecil siRNA, kami tidak boleh membuat kesimpulan bahawa nilai ΔG secara statistik tidak berkaitan dengan kecekapan siRNA. Untuk menentukan kesan keseluruhan nilai ΔG pada aktiviti siRNA, sebilangan besar sampel diperlukan dan siRNA dengan nilai keseluruhan ΔG yang lebih rendah harus ditambah kepada ujian untuk perbandingan.

Secara kolektif, kami mereka bentuk siRNA tyrosinase manusia menggunakan pelbagai algoritma dan parameter dan mengenal pasti siRNA yang sangat cekap yang mungkin berguna dalam bidang kosmetik. Banyak siRNA sedang dipertimbangkan untuk digunakan dalam bidang bioperubatan dan kosmetik, dan telah diuji dalam ujian klinikal di seluruh dunia. Walau bagaimanapun, untuk penggunaan meluas aplikasi berasaskan siRNA, beberapa halangan masih perlu diselesaikan seperti isu keselamatan, kestabilan dan penghantaran.

PENGHARGAAN

Kajian ini disokong oleh geran daripada Leaders Cosmetics, Samsung L&S Co., Ltd (#2015/05/20-31) dan oleh Program Penyelidikan Sains Asas melalui Yayasan Penyelidikan Kebangsaan Korea (KRF) yang dibiayai oleh Kementerian Pendidikan (2016R1D1A1B01012515).

RUJUKAN

Amarzguioui, M. dan Prydz, H. (2004) Algoritma untuk pemilihan jujukan siRNA berfungsi. Biokim. Biophys. Res. Commun. 316, 1050-1058.

Chang, CI, Hong, SW, Kim, S. and Lee, DK (2007) Kajian hubungan struktur-aktiviti siRNA dengan variasi struktur. Biokim. Biophys. Res. Commun. 359, 997-1003.

Chu, CY and Rana, TM (2008) RNAi yang kuat oleh pencetus RNA pendek. RNA 14, 1714-1719.

Czauderna, F., Fechtner, M., Dames, S., Aygun, H., Klippel, A., Pronk, GJ, Giese, K. and Kaufmann, J. (2003) Variasi struktur dan penstabilan pengubahsuaian siRNA sintetik dalam sel mamalia. Asid Nukleik Res. 31, 2705-2716.

Elbashir, SM, Harborth, J., Lendeckel, W., Yalcin, A., Weber, K. dan Tuschl, T. (2001a) Dupleks 21-RNA nukleotida mengantara gangguan RNA dalam sel mamalia berbudaya. Alam Semula Jadi 411, 494-498.

Elbashir, SM, Harborth, J., Weber, K. dan Tuschl, T. (2002) Analisis fungsi gen dalam sel mamalia somatik menggunakan RNA kecil yang mengganggu. Kaedah 26, 199-213.

Elbashir, SM, Martinez, J., Patkaniowska, A., Lendeckel, W. dan Tuschl, T. (2001b) Anatomi fungsional siRNA untuk mengantarkan RNAi yang cekap dalam Drosophila melanogaster embrio lysate. EMBO J. 20, 6877-6888.

Engels, JW (2013) Membungkam gen oleh siRNA yang diubah suai secara kimia. N. Bioteknol. 30, 302-307.

Fire, A., Xu, S., Montgomery, MK, Kostas, SA, Driver, SE and Mello, CC (1998) Gangguan genetik yang kuat dan spesifik oleh RNA terkandas dua dalam Caenorhabditis elegans. Alam 391, 806-811.

Gillbro, JM and Olsson, MJ (2011) Melanogenesis dan mekanisme agen pencerah kulit--pendekatan sedia ada dan baharu. Int. J. Kosmet. Sci. 33, 210-221.

Pendengaran, VJ dan Tsukamoto, K. (1991) Kawalan enzimatik pigmentasi dalam mamalia. FASEB J. 5, 2902-2909.

Hosoi, J., Abe, E., Suda, T. and Kuroki, T. (1985) Peraturan sintesis melanin sel melanoma tikus B16 oleh 1 alfa, 25-dihydroxy vitamin D3, dan asid retinoik. Kanser Re. 45, 1474-1478.

Huesken, D., Lange, J., Mickanin, C., Weiler, J., Asselbergs, F., Warner, J., Meloon, B., Engel, S., Rosenberg, A., Cohen, D., Labow, M., Reinhardt, M., Natt, F. dan Hall, J. (2005) Reka bentuk perpustakaan siRNA seluruh genom menggunakan rangkaian saraf tiruan. Nat. Bioteknol. 23, 995-1001.

Ichihara, M., Murakumo, Y., Masuda, A., Matsuura, T., Asai, N., Jijiwa, M., Ishida, M., Shinmi, J., Yatsuya, H., Qiao, S., Takahashi, M. and Ohno, K. (2007) Ketidakstabilan termodinamik dupleks siRNA adalah prasyarat untuk ramalan aktiviti siRNA yang boleh dipercayai. Asid Nukleik Res. 35, e123.

Kim, DH, Behlke, MA, Rose, SD, Chang, MS, Choi, S. dan Rossi, JJ (2005) Substrat Dicer dsRNA sintetik meningkatkan potensi dan keberkesanan RNAi. Nat. Bioteknol. 23, 222-226.

Ladunga, I. (2007) Pendiaman gen yang lebih lengkap oleh siRNA yang lebih sedikit: reka bentuk yang dioptimumkan telus dan tandatangan biofizikal. Asid Nukleik Res. 35, 433-440.

Lerner, AB dan Fitzpatrick, TB (1950) Biokimia pembentukan melanin. Fisiol. Wahyu 30, 91-126.

Matveeva, O., Nechipurenko, Y., Rossi, L., Moore, B., Saetrom, P., Ogurtsov, AY, Atkins, JF and Shabalina, SA (2007) Perbandingan pendekatan untuk reka bentuk siRNA rasional yang membawa kepada yang baharu kaedah yang cekap dan telus. Asid Nukleik Res. 35, e63.

Muckstein, U., Tafer, H., Hackermuller, J., Bernhart, SH, Stadler, PF dan Hofacker, IL (2006) Termodinamik pengikatan RNA-RNA. Bioinformatik 22, 1177-1182.

Pancoska, P., Moravek, Z. and Moll, UM (2004) Gangguan RNA yang cekap bergantung pada konteks global jujukan sasaran: analisis kuantitatif kecekapan membungkam menggunakan perwakilan graf Eulerian siRNA. Asid Nukleik Res. 32, 1469-1479.

Reynolds, A., Leake, D., Boese, Q., Scaringe, S., Marshall, WS dan Khvorova, A. (2004) Reka bentuk siRNA rasional untuk gangguan RNA. Nat. Bioteknol. 22, 326-330.

Rose, SD, Kim, DH, Amarzguioui, M., Heidel, JD, Collingwood, MA, Davis, ME, Rossi, JJ dan Behlke, MA (2005) Kekutuban fungsian diperkenalkan oleh pemprosesan Dicer bagi RNA substrat pendek. Asid Nukleik Res. 33, 4140-4156.

Sano, M., Sierant, M., Miyagishi, M., Nakanishi, M., Takagi, Y. dan Sutou, S. (2008) Kesan struktur terminal asimetri dupleks RNA pendek pada aktiviti gangguan RNA dan pemilihan helai. Asid Nukleik Res. 36, 5812-5821.

Schwarz, DS, Hutvagner, G., Du, T., Xu, Z., Aronin, N. dan Zamore, PD (2003) Asimetri dalam pemasangan kompleks enzim RNAi. Sel 115, 199-208.

Shabalina, SA, Spiridonov, AN dan Ogurtsov, AY (2006) Model pengiraan dengan ciri termodinamik dan komposisi menambah baik reka bentuk siRNA. BMC Bioinformatics 7, 65.

Sheth, VM and Pandya, AG (2011) Melasma: kemas kini komprehensif: bahagian II. J. Am. Acad. Dermatol. 65, 699-714.

Slominski, A., Tobin, DJ, Shibahara, S. dan Wortsman, J. (2004) Pigmentasi melanin dalam kulit mamalia dan peraturan hormonnya. Fisiol. Wahyu 84, 1155-1228.

Tafer, H., Ameres, SL, Obernosterer, G., Gebeshuber, CA, Schroeder, R., Martinez, J. and Hofacker, IL (2008) Kesan kebolehcapaian tapak sasaran pada reka bentuk siRNA yang berkesan. Nat. Bioteknol. 26, 578-583.

Ui-Tei, K., Naito, Y., Takahashi, F., Haraguchi, T., Ohki-Hamazaki, H., Juni, A., Ueda, R. and Saigo, K. (2004) Garis Panduan untuk pemilihan urutan siRNA yang sangat berkesan untuk gangguan RNA mamalia dan anak ayam. Asid Nukleik Res. 32, 936-948.

Vert, JP, Foveau, N., Lajaunie, C. and Vandenbrouck, Y. (2006) Model yang tepat dan boleh ditafsir untuk ramalan keberkesanan siRNA. BMC Bioinformatics 7, 520.
Ok-Seon Kwon1,†, Soo-Jung Kwon1,†, Jin Sang Kim2 , Gunbong Lee2 , Han-Joo Maeng3 , Jeongmi Lee4 , Gwi Seo Hwang5 , Hyuk-Jin Cha1,* dan Kwang-Hoon Chun3,*.

Jabatan Sains Hayat, Universiti Sogang, Seoul 04107.

2 Leaders Cosmetics Co., Ltd., Anseong 17599.

3 Institut Sains Farmaseutikal Gachon, Kolej Farmasi, Universiti Gachon, Incheon 21936.

4 Pusat Pengajian Farmasi, Universiti Sungkyunkwan, Suwon 16419.

5 Makmal Penyelidikan Pembezaan Sel, Kolej Perubatan Korea, Universiti Gachon, Seongnam 13120, Republik Korea.

For more information:1950477648nn@gmail.com