Vaksin Adenovirus Mengandungi Sars-CoV Terpenggal-2 Subunit S1 Protein Spike Membawa Kepada Tindak Balas Imun Khusus pada Tikus

AbstraCT:Pembangunan vaksin penyakit coronavirus 2019 (COVID{1}}) yang cekap dan selamat ialah pendekatan penting untuk menguruskan wabak coronavirus 2 (SARS-CoV-2) yang teruk dan selamat berdasarkan keadaan semasa. Dalam kajian ini, kami menghasilkan segmen yang dipendekkan bagi gen spike SARS-CoV-2 yang dioptimumkan (2043 bp, dipanggil S1) yang dapat mengekod protein S1 yang dipotong. Protein telah diuji untuk menentukan sama ada ia boleh menimbulkan imunisasi yang cekap pada tikus terhadap SARS-CoV-2. Kehadiran protein S1 telah disahkan dengan immunofluorescence dan Western blotting. Vaksin adenovirus yang mengandungi serpihan gen S1 (Ad-S1) telah diberikan secara intramuskular kepada tikus empat kali dalam tempoh 4 minggu. Imuniti humoral protein SARS-CoV-2 S1 ditunjukkan dalam semua tikus yang diimunisasi. Serum daripada tikus yang diimunisasi menunjukkan aktiviti anti-jangkitan yang sangat baik secara in vitro. Tindak balas imun humoral yang teguh terhadap SARS-CoV-2 telah diperhatikan pada tikus selepas vaksinasi dengan Ad-S1, menunjukkan bahawa vaksin adenovirus boleh membantu pembangunan vaksin terhadap SARS-CoV-2 dan lain-lain yang berbeza secara genetik virus.

cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun

Kata kunci: SARS-CoV-2; vaksin-vaksin; vektor adenovirus; gen S1; imuniti

1. Pengenalan

Penyakit Coronavirus 2019 (COVID-19) sering dikaitkan dengan pelbagai kegagalan organ dan kadar kematian yang tinggi [1] dan menimbulkan ancaman besar kepada keselamatan awam di seluruh dunia. Sehingga 15 Julai 2022, wabak COVID-19 telah berterusan di seluruh dunia, dengan 557,917,904 kes yang disahkan, termasuk 6,358,899 kematian, dilaporkan kepada Pertubuhan Kesihatan Sedunia (WHO). Tambahan pula, sejumlah 12,130,881,147 dos vaksin telah diberikan setakat 11 Julai 2022. Oleh itu, mereka bentuk dan membangunkan vaksin coronavirus novel (nCoV) adalah sangat penting dan salah satu keutamaan kesihatan global teratas. Protein S ialah faktor utama kemasukan SARS-CoV{19}} coronavirus penyakit pernafasan akut teruk 2 (SARS-CoV-2) ke dalam sel perumah [2,3]. Protein mengikat kepada reseptor perumah dan membolehkan virus memasuki sel perumah dengan lancar [4]. Glikan berkait N menonjol dari permukaan trimer dan menghiasi protein S secara meluas, menjejaskan lipatan protein S, imuniti humoral, dan pemprosesan protease sel perumah [5]. Protein SARS-CoV-2 S mempunyai ketumpatan glycan berkaitan N yang lebih rendah berbanding protein S yang disebabkan oleh coronavirus patogen manusia yang lain [6]. Oleh itu, protein S mungkin sangat imunogenik dan merupakan sasaran utama untuk meneutralkan antibodi. Protein S mempunyai tiga domain struktur, antaranya domain S1 adalah antigen permukaan protein S yang paling penting [4]. Disebabkan oleh kesukaran menghasilkan protein rekombinan yang besar (domain ekstraselular protein S ialah kira-kira 1300 asid amino) dan risiko peningkatan bergantung kepada antibodi (ADE) jangkitan, S1 (kira-kira 700 asid amino) dan domain pengikat reseptornya. (RBD, kira-kira 200 asid amino) secara meluas dianggap sebagai sasaran berpotensi paling menarik untuk vaksin coronavirus [7,8]. Serotype 5 adenovirus manusia (HAdV-C5) digunakan secara meluas dalam virologi asas sebagai terapi gen dan vektor penghantaran vaksin [9]. HAdV-C5 mempunyai kepelbagaian semula jadi dan boleh memparasitkan kebanyakan perumah, yang menjadi asas untuk pembangunan eksperimen haiwan. Vektor adenovirus rekombinan dengan kebolehulangan dan kecacatan replikasi yang dibina daripada HAdV-C5 telah digunakan secara meluas dalam penghantaran vaksin dan terapi gen [9,10]. Pada masa ini, adenovirus telah diluluskan sebagai vaksin terhadap jangkitan pernafasan akut dan terdapat banyak ujian vaksin tersebut, seperti malaria dan HIV-1 [9]. Dalam kertas ini, kami menghuraikan vaksin vektor adenovirus kekurangan replikasi manusia-2 SARS-CoV dan penyediaan serta penggunaannya. Dalam kajian ini, vaksin adenovirus telah dibina seperti berikut: vektor adalah adenovirus yang cacat replikasi manusia HAdV-C5 dengan penghapusan E1 dan E3, plasmid rangka adalah adenovirus rekombinan dengan pBHGlox∆E1,3Cre, barisan sel pembungkusan ialah sel HEK293, dan gen sasaran ialah gen protein S1 terpenggal bagi SARS-CoV-2. Ekspresi protein S1 dalam vaksin telah dikenal pasti oleh ujian Western blot dan immunofluorescence. Untuk menentukan kualiti tindak balas imun yang disebabkan oleh calon vaksin berasaskan spike, tindak balas antibodi selepas vaksinasi telah diperiksa secara terperinci. Faedah imunisasi vaksin telah dinilai dengan ujian antibodi yang mengikat (ujian imunosorben berkaitan enzim [ELISA]) dan ujian antibodi peneutralan. Penemuan kami menyediakan asas untuk pembangunan dan penilaian{73}} vaksin dan rawatan COVID berdasarkan protein S1.

2. Bahan dan Kaedah

2.1. Sel dan Haiwan

Talian sel buah pinggang monyet HEK293 dan Vero E6 digunakan dalam kajian ini. Kedua-dua garisan sel telah ditanam dalam medium Eagle's modified Dulbecco (DMEM) ditambah dengan 2% serum lembu janin (FBS) dan 1% penisilin dan streptomycin pada suhu 37 ◦C dengan 5% CO2 dan kelembapan tepu. Dua puluh tikus betina C57BL/6 (6–8 minggu) telah dibeli dari Pusat Eksperimen Haiwan Zhejiang, Wilayah Zhejiang. Tikus telah dibahagikan secara rawak kepada dua kumpulan dengan 10 tikus dalam setiap kumpulan. Satu kumpulan telah diimunisasi (suntikan intraperitoneal 100 µL) dengan vektor Ad5 yang menyatakan protein spike SARS-CoV-2 (Ad5-S) dan satu lagi dengan PBS (suntikan intraperitoneal 100 µL) sebagai kawalan. Jumlah virus ialah 5 × 109 VP Semua tikus telah diimunisasi dengan suntikan intramuskular D0/D14 [11,12]. Pada D14, darah periferi sebanyak 100 µL diambil, serum diasingkan, dan suntikan kedua diberikan dua jam selepas pengumpulan darah. Pada D28, darah dikumpulkan melalui tusukan retro-orbital dan serum dipisahkan. Antibodi yang mengikat dikesan 3 hari selepas setiap pengumpulan darah, antibodi peneutralan dikesan 7 hari selepas setiap pengumpulan darah, dan sitokin dikesan 7 hari selepas pengumpulan darah kedua. Semua tikus telah dibunuh; semua ujian telah dijalankan mengikut ketat dengan "Garis Panduan Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Eksperimen Republik Rakyat China" dan diluluskan oleh Majlis Etika Universiti Zhejiang Shuren.

2.2. Vaksin-vaksin

Semua strain SARS-CoV-2 yang digunakan dalam kajian ini telah dikumpulkan daripada pesakit-19 COVID dengan persetujuan. Makmal Utama Negeri untuk Diagnosis dan Rawatan Penyakit Berjangkit membangunkan vaksin adenovirus (sel Vero, strain WuHan, nombor GISAID: EPI_ISL_415711) terhadap SARS-CoV-2 dan kemudian vaksin telah dihasilkan dalam tetapan mematuhi tahap biokeselamatan (BSL). Spesifikasi vaksin ialah 0.5 mL/dos dan mengandungi Tris, NaCl, gula tebu, MgCl2.6H2O, C6H9N3O2, etanol mutlak dan protein SARS-CoV-2 S1.

2.3. Pembinaan Adenovirus Rekombinan

Urutan protein SARS-CoV-2 S1 (no. QRU91950.1) diperoleh daripada PubMed. Mengikut kemerosotan gen, jujukan nukleotida kodon yang dioptimumkan sesuai untuk ekspresi sel mamalia telah direka bentuk berdasarkan premis bahawa jujukan asid amino bagi protein produk yang dikodkan oleh protein SARS-CoV-2 S1 kekal tidak berubah. Jumlah panjang ialah 2043 bp. Jujukan 50 prekursor telah disintesis dengan pengaktif plasminogen tisu (tPA) dan jujukan pengekodan asid amino SARS-CoV-2 S1 2–688 dan jujukan prekursor tPA telah diikat. Urutan Kozak dan tapak sekatan SpeI telah ditambah di hadapan kodon permulaan dan tapak sekatan XbaI telah ditambah selepas kodon penamatan. Urutan nukleotida gen di atas telah disintesis dan diklonkan ke pUC18 oleh Sangon Biotech untuk mendapatkan plasmid klon gen sintetik. Urutan gen S1 yang disintesis dan vektor pDC316 telah dicerna dengan endonuklease sekatan SpeI dan XbaI. Serpihan sasaran dan vektor telah diambil daripada gel dan disambungkan untuk membentuk plasmid ulang-alik. Plasmid ulang-alik SARS-CoV{19}} telah dibungkus dengan plasmid rangka sistem adenovirus AdMax pBHGloxd∆E1 dan 3Cre melalui pemindahan bersama sel HEK293. Penyelesaian virus utama diperolehi selepas pencairan beku dan sentrifugasi berulang, dan virus itu dikuatkan dan dibiakkan selepas pembersihan plak.

manfaat cistanche untuk lelaki-menguatkan sistem imun

Klik di sini untuk melihat produk Cistanche Enhance Immunity

【Minta lebih lanjut】 E-mel:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.4. Penentuan Titer Adenovirus

Sel HEK293 dalam keadaan sihat telah dipilih dan digantung semula untuk menyediakan 5.0 × 105 sel/mL penggantungan sel, yang disemai dalam 24-plat perigi (1 mL/telaga ) dan dikultur pada 37 ◦C dalam persekitaran 5% CO2. Sampel dicairkan secara bersiri sepuluh kali ganda dan sampel yang dicairkan (0.1 mL) daripada 10−5 hingga 10−8 sel telah diinokulasi pada 24-plat perigi . Kemudian, plat terdedah kepada jangkitan pada 37 ◦C dengan 5% CO2 selama 48 jam. Selepas itu, medium kultur dikeluarkan, metanol pra-disejukkan (0.5 mL) ditambah, dan sampel ditetapkan pada -20 ◦C selama 20 minit. Selepas penetapan, sampel telah dibasuh dengan garam penampan fosfat (PBS) dan disekat dengan 1% albumin serum lembu (BSA, 0.2 mL) pada 37 ◦C selama 1 jam. Seterusnya, antibodi primer (Mouse Anti-Adenovirus Hexon, AbD Serotec 04000079, 1:2000) dan sekunder (Goat pAb to MS IgG2a(HRP), Abcam ab97245, 1:1000) telah ditambah dan diinkubasi selama 1 jam, di mana PBS digunakan untuk mencuci. Selepas pengeraman, larutan kerja yang baru disediakan (0.2 mL) ditambah dan diinkubasi selama 5-10 minit pada suhu bilik. Kemudian, larutan yang berfungsi dibuang, sampel dibasuh dengan PBS, dan PBS (1 mL) ditambah lagi. Purata bilangan sel positif dalam medan mikroskopik (cat. CKX53, OLYMPUS Research Inverted System Microscope) telah dikira, di mana kecerunan dengan 5-50 sel positif dalam bidang pandangan telah dipilih dan sekurang-kurangnya lima kawasan dipilih secara rawak untuk mengira . Bilangan medan visual dalam setiap telaga 24-plat perigi telah dikira. Kemudian, titer virus dikira mengikut Formula (1) berikut:

2.5. PCR Masa Nyata

Untuk mengesan ekspresi mRNA sel HEK293 berikutan jangkitan virus, kami mengekstrak RNA perantaraan mengikut arahan pengendalian TRIzol (Invitrogen, Waltham, MA, USA). Jumlah RNA diekstrak menggunakan TRIzol dan diproses dengan DNase I bebas RQ1 RNase (Promega, Madison, WI, USA) untuk menghapuskan sisa DNA. DNA pelengkap (cDNA) diperoleh melalui transkripsi terbalik RNA yang diekstrak menggunakan Kit Reagen PrimerScript™ RT dengan Kit Pemadam gDNA (Takara, Kusatsu, Jepun). Serpihan DNA dijana dengan primer khusus P1 (50 -GGTGATTCTTCTTCAGGTTGGA-30 ) dan P2 (50 - GTTTTTGAGAGAGGGTCAAGTG-30 ) bagi gen sasaran (S1). Gen telah dikuatkan dengan primer P3 (50 -GTCTTCACCACCATGGAGAA-30 ) dan P4 (50 -TAAGCAGTTGGTGGTGCAG-30 ) sebagai kawalan dalaman (GAPHD).

2.6. Penghapusan Barat

Lisat sel dan supernatan diasingkan dengan elektroforesis gel sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE) dan kemudian dipindahkan ke membran polyvinylidene fluoride (PVDF). Blot telah divisualisasikan dengan peralatan pengimejan blot Barat (Bio-Rad, Hercules, CA, Amerika Syarikat). Secara ringkas, membran telah dipindahkan ke TBST (50 mL Tris-HCl, pH 7.5, 8 g NaCl [0.5 mL], 0.2 g KCl, 0.5 mL Tween -20) dengan 5% susu tepung kering tanpa lemak dan digoncang pada shaker penyahwarna pada suhu bilik selama 1 jam. Membran kumpulan eksperimen dan kawalan telah dikeluarkan daripada larutan pengedap dan diinkubasi dengan antibodi utama: [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:5000, kucing. #40591- T62, Sino Biological, Beijing, China)] pada suhu bilik. Antibodi utama digoncang dan diinkubasi semalaman pada penggoncang penyahwarna pada suhu 4 ◦C. Blot dibilas dengan larutan TBST dan diinkubasi selama 2 jam dengan antibodi sekunder [imunoglobulin anti-arnab kambing G (IgG) H&L (HRP) (1:10,000, kucing. #ab6721, Abcam, Cambridge, UK)]. Selepas dibilas, tompok itu diinkubasi selama 1 minit dengan kit penyelesaian Substrat ECL LumiBest (cat. #4AW011-100, 4A Biotech), dan kemudian diperhatikan dalam pengimejan.

2.7. Ujian Imunofluoresensi

Sel HEK293 (3 × 106/telaga) telah disemai ke dalam 12-plat perigi. Selepas 48 jam, sel telah dijangkiti adenovirus yang mengandungi gen S1 (Ad-S1). Selepas 48 jam, medium disedut, dan sel-sel dibasuh sekali dengan PBS yang mengandungi 2% BSA, dan ditetapkan selama 15 minit dengan metanol yang telah disejukkan terlebih dahulu selama 15 minit pada -20 ◦C. Selepas tiga kali cucian dengan 2% BSA dalam PBS, sel-sel telah dipermeabilkan dengan 0.5% Triton X-100 selama 10 minit. Kemudian, sel-sel telah disekat selama 1 jam dengan 2 mL 2% BSA, larutan penyekat dibuang, dan sel-sel telah dibasuh tiga kali dengan PBS. Selepas itu, 2 mL antibodi utama [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:2000, kucing. #40591-T62, Sino Biological)] telah ditambahkan pada setiap telaga dan diinkubasi pada suhu bilik selama 1 jam atau 4 ◦C semalaman. Kemudian, sampel dibilas tiga kali dengan 2% BSA selama 5 minit setiap bilas. Seterusnya, 2 mL antibodi sekunder [kambing anti-arnab IgG H&L (Alexa Fluor 488) (1:1000, kucing. #550037, ZenBio)] telah ditambah pada setiap perigi dan diinkubasi pada suhu bilik selama 1 jam. Selepas itu, sampel dibilas tiga kali dengan 2% BSA selama 5 minit setiap bilas. 40,6-diamidino-2-larutan phenylindole (DAPI) (2 mL, 1 mg/mL) (1:400, kucing. #S0001, Bioss, Woburn, MA, USA) telah ditambahkan pada setiap perigi dan bertindak balas selama 10 minit dalam gelap. Analisis telah diperhatikan dengan sistem pengimejan EVOS™ M7000 (kucing. #AMF7000, Invitrogen).

2.8. ELISA

Protein SARS-CoV-2 S (1 µg/mL) disalut semalaman dalam 96-plat perigi (100 µL/perigi) dengan 0. 0Penimbal bikarbonat 5 M. Selepas mencuci dengan PBST (0.2 g KH2PO4, 2.9 g Na2HPO4·12H2O, 8.0 g NaCl, 0.2 g KCl, 0.5 mL Tween-20, tambah air kepada 1000 mL) lima kali, larutan penyekat ditambah dan diinkubasi pada suhu 37 ◦C selama 1 jam. Sampel serum dicairkan dan ditambah kepada setiap telaga (100 µL/telaga). Selepas 1 jam pengeraman pada 37 ◦C, sampel telah dibasuh dengan PBST lima kali. Antibodi utama [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:2000, cat. #40591-T62, Sino Biological)] telah ditambah dan diinkubasi selama 1 jam, kemudian sampel dibasuh lima kali dengan PBST, diikuti dengan pengeraman selama 1 jam pada suhu 37 ◦C dengan antibodi sekunder terkonjugasi peroksidase lobak [kambing anti-arnab IgG H&L (HRP) (1:10,000, kucing. #ab6721, abcam)] dan lima mencuci dengan PBST. Selepas menambah 3, 30, 5, dan 50-tetramethyl biphenyl anhydride selama 5 minit, tindak balas dihentikan dengan asid sulfurik 2 M. Ketumpatan optik diukur pada 450 nm dan 630 nm oleh instrumen pelabelan enzim (Peranti Molekul, SpectraMax 190) dan kemudian dipasang pada lengkung standard.

Kebaikan cistanche tubulosa-menguatkan sistem imun

2.9. Penentuan Sitokin 

Plat (cat. #T-k15048D-1, MSD) telah dibasuh tiga kali dengan penimbal basuh 150 µL/telaga dan sampel yang disediakan 50 µL telah ditambah pada setiap telaga. Kemudian, plat telah dimeterai dengan pengedap plat pelekat dan diinkubasi pada suhu bilik dengan goncangan selama 2 jam. Seterusnya, plat dibasuh tiga kali dengan penimbal pencuci 150 µL/telaga dan larutan antibodi pengesanan 25 µL ditambahkan pada setiap telaga. Plat dimeterai semula dan diinkubasi pada suhu bilik dengan goncangan selama 2 jam. Seterusnya, plat dibasuh tiga kali dengan sekurang-kurangnya 150 µL/penampan basuh telaga; 150 µL 2× Read Buffer T (MSD) telah ditambahkan pada setiap telaga, dan plat dianalisis pada instrumen MSD.

2.10. Meneutralkan Antibodi

2.10.1. Ujian Peneutralan Pseudovirus

Aktiviti peneutralan serum tikus telah diuji menggunakan sistem pseudoviral virus stomatitis vesikular (VSV). Serum dinyahaktifkan dalam mandi air selama {{0}}.5 jam pada 56 ◦C, dan kemudian dicairkan secara bersiri kepada julat yang diperlukan. Sel HEK293 disalut dalam 96-plat perigi. Serum yang dicairkan dicampur dengan 200 CCID50 (dos virus yang boleh menjangkiti 50% kultur sel)/100 µL penggantungan virus dalam nisbah 1:1 dan diletakkan dalam inkubator CO2 (37 ± 1 ◦C) untuk 2 jam Seterusnya, 100 µL larutan penyelenggaraan virus yang mengandungi 0.5% penisilin-streptomisin antibodi berganda telah ditambahkan pada setiap telaga, dan campuran yang dineutralkan telah diinokulasi ke dalam 96-plat perigi yang mengandungi sel pada 100 µL setiap telaga, dengan dua telaga ulangan untuk setiap pencairan. Pada masa yang sama, kawalan sel normal telah ditetapkan, dan sel-sel telah diinkubasi dalam inkubator CO2 (37 ± 1 ◦C) selama 96 jam. Kemudian, 200 CCID50/100 µL larutan virus telah dicairkan kepada 10-1~10-3. Medium kultur sel dalam 96-plat perigi telah dibuang, 150 µL larutan penyenggaraan virus telah ditambahkan pada setiap telaga, dan pencairan larutan virus telah diinokulasi pada kepekatan 10-1~{{33} } ke dalam telaga 96-plat perigi (50 µL setiap telaga). Setiap pencairan diulang dalam 8 telaga; kawalan sel normal ditetapkan pada masa yang sama, diikuti dengan kultur selama 96 jam. Perubahan dalam CPE sel diperhatikan di bawah mikroskop terbalik. Kawalan sel normal sepatutnya tidak mempunyai perubahan sitopatik, dan kawalan positif harus mempunyai perubahan CPE. Titik akhir peneutralan (pencairan serum ditukar kepada logaritma) dikira dengan memerhatikan CPE. Kriteria seronegatif/positif ialah 1:12 sebagai kriteria positif/negatif,<1:12 was negative, and ≥1:12 was positive. 

2.10.2. Ujian Peneutralan Langsung

Aktiviti peneutralan serum tikus dinilai oleh ujian peneutralan langsung. Serum yang dicairkan dicampur dengan SARS-CoV-2 dan diinkubasi pada suhu 37 ◦C selama 1 jam. Campuran telah ditambahkan pada 96-plat perigi untuk menjangkiti sel Vero E6. Selepas 72-h pengeraman pada 37 ◦C, kesan sitopatik virus (CPE) diperhatikan di bawah pembesaran ×40 dan titer peneutralan (saling 50% pencairan serum yang diperlukan untuk meneutralkan jangkitan virus) telah dikira. Semua prosedur di atas telah dijalankan dalam persekitaran tahap biokeselamatan 3.

2.11. Analisis statistik

Analisis statistik telah dilakukan dengan ujian-t dua sampel menggunakan SPSS 26. nilai-p Kurang daripada atau sama dengan 0.05 dianggap penting. Kecenderungan memusat diukur dengan titer min geometri (GMT).

3. Keputusan

3.1. Pembinaan Adenovirus Rekombinan

Plasmid ulang-alik adenovirus rekombinan pAdeno-CMV-S1 dengan sisipan yang betul diperolehi; rajah strukturnya ditunjukkan dalam Rajah 1. Adenovirus rekombinan mengandungi genom HAdV-C5 yang tidak mempunyai rantau E1/E3. Gambarajah skematik vektor adenovirus rekombinan yang diperolehi oleh plasmid ulang-alik dan transfeksi plasmid sitoskeleton dalam sel HEK293 ditunjukkan dalam Rajah 1.

3.2. Pencirian Adenovirus Rekombinan

Plasmid rekombinan yang mengandungi gen sasaran telah dikenal pasti oleh PCR (lihat Rajah 2A untuk keputusan elektroforesis gel). Ini adalah percubaan berulang. Jujukan primer ialah MCMV-F ggtataagaggcgcgaccag dan S1-R acaataagtagggactgggtc, dan penjujukan mengesahkan bahawa jujukan itu konsisten dengan reka bentuk. Ekspresi SARS-CoV-2 S1 dalam sel telah dikesan dengan Western blotting (Rajah 2B) dan imunofluoresensi tidak langsung (Rajah 2C). Warna jalur (~ 75 kDa) telah dikesan oleh Western blotting dan konsisten dengan kedudukan jalur yang dijangkakan. Pada peringkat transkrip, ekspresi in vitro S1 dikesan oleh PT-PCR. Keputusan menunjukkan bahawa ekspresi mRNA S1 dalam sel HEK-293 adalah jauh lebih tinggi daripada ekspresi dalam kumpulan kawalan.

Rajah 1. Pembinaan vaksin adenovirus rekombinan dan strategi eksperimen. (A) pAdeno-CMV-S1 ialah plasmid ulang alik adenovirus rekombinan yang mengandungi gen sasaran S1. pBHGlox∆E1,3Cre ialah plasmid rangka adenovirus. pBHGlox∆E1,3Cre dan pAdeno-CMV-S1 telah diekstrak dengan kit pengekstrakan plasmid QIAGEN (Beijing North Yitao Trading Co., LTD., Beijing, China). Satu hari sebelum pemindahan, sel HEK293 telah dilalui dalam kelalang kultur sel 25 cm2. Medium kultur ialah DMEM yang mengandungi 5% FBS tanpa antibiotik. Pada hari kedua, 60-80% daripada sel telah dipilih dan penyelesaian pemindahan telah ditambah ke dalam sel. Selepas 7 hari pemindahan, sel-sel telah dikikis, disentrifugasi, supernatan dibuang, dan sel-sel telah dihidupkan semula dengan PBS. Sel-sel telah dicairkan beku berulang kali pada −80 ◦C dan 37 ◦C. Selepas sentrifugasi, supernatan mengandungi larutan virus utama. Strain adenovirus rekombinan telah disucikan, dikuatkan, dan diperolehi selepas pemprosesan selanjutnya dan ditetapkan Ad-S1. Vaksin itu disuntik secara intramuskular ke dalam tikus untuk kajian susulan. (B) Skala masa imunisasi dan pengeluaran darah yang digambarkan.

3.3. Titer Adenovirus

Dalam eksperimen ini, purata enam sel positif dikira dalam lima medan mikroskopik, dan virus dalam telaga telah dicairkan 108 kali. Berdasarkan formula yang diterangkan dalam bahagian Bahan dan Kaedah, titer adenovirus ialah 4.74 × 1011 unit pembentuk plak (pfu)/mL (Rajah 2D).

3.4. Kekebalan Selular Selepas Vaksinasi

Semasa tempoh ujian, terdapat perubahan ketara secara statistik dalam sitokin serum (p Kurang daripada atau sama dengan 0.05), yang menunjukkan terutamanya bahawa kepekatan kemoattraktan Keratinocyte/onkogen dikawal pertumbuhan manusia (KC/GRO) adalah berkurangan dan kepekatan IFN- , IL-10, IL-12p70, IL-1 , IL-2, IL-4, IL{{10} } dan TNF- telah meningkat, manakala kepekatan IL-6 tidak berubah dengan ketara (Rajah 3).

Rajah 2. Pengenalpastian protein HAdV-C5–SARS-CoV-2 S1 rekombinan dan penentuan titer adenovirus. (A) Pengesanan PCR plasmid rekombinan dengan gen sasaran S1. (B) Pengesanan Western blot bagi SARS-CoV-2. Sel HEK293 pertumbuhan eksponen telah dijangkiti SARS-CoV-2 selama 48 jam, kemudian protein selular diekstrak dan diasingkan oleh SDS-PAGE. Ekspresi SARS-CoV-2 telah disahkan oleh Western blotting dengan IgG anti-arnab kambing. (C) Mikroskopi imunofluoresensi sel HEK-293 yang dijangkiti Ad-S1 (hijau). Sel telah diwarnakan balas dengan 40, 6-diamidino- 2-phenylindole (DAPI) untuk mengotorkan nukleus. Bar skala 1000 µm. (D) Ujian plak digunakan untuk pengukuran. Mikrograf yang menggambarkan pencairan 10-5, 10-6, 10-7 dan 10-8 (dari kiri ke kanan).

Rajah 3. Paras plasma diubah disebabkan oleh Ad-S1 jenis 1/2 sitokin, interferon jenis 1 dan sitokin lain. Hasilnya dikesan dengan mengambil darah dari tikus 7 hari selepas imunisasi pertama. Data dipersembahkan sebagai petak serakan kotak dan misai. Setiap bulatan mewakili satu individu. nilai-p dikira menggunakan ujian-t dua sampel.

3.5. Pengesanan Anti-SARS-CoV-2 Antibodi S1 ​​Selepas Imunisasi

ELISA mendedahkan bahawa antibodi khusus SARS-CoV-2-hadir pada tikus yang disuntik dengan Ad-S1 pertama dan kedua, tetapi bukan antibodi yang disuntik dengan kapsid adenovirus kawalan atau penyelesaian PBS (Ad/PBS) (Rajah 4A). Titer IgG 1:210 dan 1:212 dikesan dalam{10}}tikus yang divaksin Ad-S dua minggu selepas imunisasi pertama dan kedua. Titer pencairan pada 28 hari selepas vaksinasi (D28, GMT 2297.4) ialah 6.1-kali ganda lebih tinggi daripada itu pada D14 (GMT 378.9).

Rajah 4. Ad-S1 menyebabkan titer tinggi antibodi (A) dan aktiviti peneutralan (B, C) dalam tikus. (A) ELISA IgG serum khusus SARS-CoV-2-dari Ad-S1-tikus yang diimunisasi. (B) Analisis aktiviti pseudovirus serum daripada tikus yang diimunisasi Ad-S1-. (C) Analisis aktiviti meneutralkan serum daripada tikus{10}}yang diimunisasi Ad-S

3.6. Ujian Antibodi Meneutralkan

Cabaran SARS-CoV-2 sel Vero E6 membolehkan pengesanan aktiviti meneutralkan dalam serum tikus yang diimunisasi (Rajah 4B, C). Titer peneutralan D14 dan D28 bagi Ad-S1-sel Vero E6 yang diimunisasi terhadap SARS-CoV{{10}} cabaran virus hidup secara in vitro ialah 1:24.3 dan 1:26.3, masing-masing. Ujian pseudovirus menghasilkan keputusan yang serupa dengan ujian virus hidup, dengan titer peneutralan masing-masing sehingga 1:28.1 dan 1:29.6 pada D14 dan D28. Titer peneutralan pseudovirus D28 (GMT 769.0) ialah 2.7-kali ganda lebih tinggi daripada D14 (GMT 283.7).

4. Perbincangan

We have been working to develop vaccines to stop the COVID-19 pandemic and its rapid spread. The hunt for an effective vaccination against SARS-CoV-2 continues and existing vaccine development strategies include whole virus particle vaccines, live attenuated virus vaccines, purified virus subunit vaccines, and genetic vaccines [13–17]. The epitopes on spike proteins detected in infected serum are highly antigenic, with the ability to induce a strong humoral immune response and neutralize antibodies in individuals infected with SARS-CoV-2 and recovered from COVID-19 [18,19]. The S protein appears to be an ideal target for vaccination against SARS-CoV-2 infection [20]. The S protein S1 subunit induced effective immunity against SARS-CoV-2 and protected against SARS-CoV-2 in animal models [21,22]. The SARS-CoV-2 truncated N protein has a better expression effect than the N protein [23]. Based on this, we selected the truncated S1 protein in this experiment. In other studies, more than 90% of the neutralization activity of the Moderna mRNA vaccine was caused by the RBD antibody, and the neutralization titer directly decreased from >1000 hingga<25 after the RBD antibody had been eliminated [24]. Higher levels of RBD-specific IgG were associated with increased serum neutralization [25]. Evidently, the S protein demonstrates a greater immune response to the RBD region, and the S1 protein containing RBD can induce neutralizing antibodies with a higher titer than the S protein [26]. Antigens delivered by adenovirus vectors induce strong cellular and humoral immunity after a single immunization, making them useful as an emergency prevention tool in a pandemic [27]. Adenovirus-based vaccine strategies are therefore an important part of the fight against SARS-CoV-2 infection.

Dalam kajian ini, kami membina vaksin adenovirus rekombinan SARS-CoV-2 yang mengandungi subunit SARS-CoV-2 S1 dan menamakannya Ad-S1. Seperti CanSinoBIO, yang telah diluluskan untuk pemasaran [28], kami menggunakan HAdV-C5 dalam vaksin ini. Adenovirus digunakan secara meluas dalam terapi gen rekombinan dan sebagai vektor vaksin. Walau bagaimanapun, kadar seropositif HAdV-C5 adalah setinggi 75-80% dalam populasi normal [29]. Ini menunjukkan bahawa imuniti prapenyimpanan terhadap vektor HAdV-C5 mengurangkan imuniti yang disebabkan oleh vaksin dengan ketara. Dibangunkan di Universiti Oxford di United Kingdom, ChAdOx1 nCoV-19 menggunakan vektor adenovirus cimpanzi yang, sebaliknya, mempunyai kadar seropositif yang lebih rendah pada manusia, dan apabila positif, biasanya menunjukkan titer antibodi serum yang lebih rendah [30] . Oleh itu, vektor adenovirus yang boleh mengelak imuniti sedia ada boleh diterokai untuk meningkatkan keberkesanan perlindungan vaksin adenovirus. Dalam kajian ini, status serum tikus sebelum dan selepas imunisasi ditentukan oleh ELISA dan ujian peneutralan dan menghasilkan bukti imuniti humoral untuk calon vaksin. Serum yang dihasilkan selepas suntikan intramuskular vaksin pada tikus secara berkesan melindungi sel Vero E6 daripada jangkitan SARS-CoV-2 secara in vitro (Rajah 4). Kami juga mengesan tindak balas imun yang lebih kuat dan perlindungan yang lebih baik pada tikus selepas imunisasi kedua (Rajah 4). Keputusan percubaan kami adalah serupa dengan keputusan percubaan arus perdana.

Semasa penyelidikan SARS-CoV-2 diteruskan, beberapa kajian telah menunjukkan bahawa ribut sitokin sekunder kepada jangkitan SARS-CoV-2 boleh menjejaskan pengeluaran sel T, menjadikannya sukar bagi pesakit untuk mengekalkan imuniti jangka panjang untuk SARS-CoV-2 [31]. Oleh itu, adalah perlu untuk menentukan sama ada Ad-S1 boleh mendorong imuniti pengantaraan sel T pada tikus. Keputusan kami menunjukkan bahawa kepekatan IFN- dan IL-12 meningkat, dan kepekatan IL-4 menurun dalam kumpulan Ad-S1, menunjukkan bahawa kemandirian dan pertumbuhan sel Th1 yang disebabkan oleh vaksin pada tikus. Rembesan IL-12, IL-10 dan TNF oleh sel Th1 meningkat sedikit dalam kumpulan eksperimen. Keputusan ini menunjukkan bahawa Ad-S1 berkesan mendorong respons sel T yang berat sebelah Th1-dalam tikus [32]. Peningkatan IL-5 menunjukkan bahawa sel Th2 turut mengambil bahagian dalam tindak balas imun dan menghasilkan kesan tertentu. Kepekatan KC/GRO dalam kumpulan eksperimen telah berkurangan dengan ketara berbanding kumpulan kawalan PBS, yang mungkin disebabkan oleh pengurangan kemotaksis neutrofil yang menindas tindak balas keradangan dan membenarkan kesan sampingan vaksin dikawal sedikit. Ini akan lebih bermanfaat kepada orang yang lemah imun, seperti orang tua atau pesakit yang menjalani kemoterapi. Li M., et al. [29] membangunkan vaksin adenovirus menggunakan Ad68 sebagai vektor. Keputusan menunjukkan bahawa aktiviti peneutralan in vivo SARS-CoV-2 boleh dikesan dalam masa dua minggu selepas imunisasi intramuskular BALB/c tikus dan kemudian terus meningkat, dan titer antibodi peneutralan (PRNT ID50) mencapai 957.3 pada lapan minggu. Sementara itu, dalam kajian Liu J., et al. [33], vaksin menggunakan AdC6 dan AdC68 sebagai vektor telah dibangunkan; kedua-dua tindak balas antibodi yang mengikat dan meneutralkan selepas imunisasi dijana 14 hari selepas dos, dengan titer IgG 7108 (titer min geometri, GMT; AdC6) dan 5489 (GMT, AdC68). Titer peneutralan 50 (NT50) ujian peneutralan pseudovirus ialah 125 (GMT, AdC6) dan 67 (GMT, AdC68).

cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun

Dalam kajian ini, tikus yang divaksinasi dengan Ad-S1 mempunyai titer IgG 1:1010 dan 1:122 yang dikesan oleh ELISA dua minggu selepas imunisasi pertama dan kedua. Titer pencairan ad-s1 ialah 378.9 (GMT) pada 14 hari selepas inokulasi dan 2297.4 (GMT) pada 28 hari selepas inokulasi. Dalam ujian antibodi peneutralan, sel Vero E6 yang diimunisasi dengan Ad-S1 masing-masing menunjukkan peneutralan 1:24.3 dan 1:26.3 pada D14 dan D28 terhadap cabaran virus SARS-CoV-2 hidup secara in vitro. Titer peneutralan pseudovirus pada D14 dan D28 masing-masing ialah 283.7 (GMT) dan 769.0 (GMT). Oleh itu, vaksin dalam kajian ini adalah lebih berkesan dari segi tindak balas imun dalam model tetikus.

Disebabkan oleh batasan keadaan eksperimen, kami tidak melakukan analisis tempat imunosorben berkaitan enzim (ELISpot) terhadap sel imun limpa tikus eksperimen. Selain itu, eksperimen perlindungan serangan SARS-CoV-2 pada tikus tidak dapat dilakukan kerana had makmal perlindungan fizikal. Walau bagaimanapun, kami menentukan bahawa vaksin itu mempunyai keberkesanan yang tinggi dalam model tetikus dan boleh digunakan sebagai strain vaksin simpanan yang ideal. Selain itu, imunogenisiti, keselamatan dan keberkesanan calon vaksin SARS-CoV-2 harus diperiksa dalam model haiwan tambahan (cth, arnab, primata, rakun, anjing), kerana model tetikus mungkin tidak menduplikasi imunologi manusia sepenuhnya. ciri-ciri.

sistem imun yang meningkatkan tumbuhan cistanche

5. Kesimpulan

Data yang diperoleh daripada kajian praklinikal kami tentang vaksin adenovirus menunjukkan bahawa vaksin itu mempunyai keselamatan dan keberkesanan yang mencukupi. Oleh itu, ia mungkin merupakan vaksin profilaksis yang menjanjikan dan boleh dilaksanakan terhadap jangkitan SARS-CoV-2.

Rujukan

1. Trougakos, IP; Stamatelopoulos, K.; Terpos, E.; Tsitsilonis, OE; Aivalioti, E.; Paraskevis, D.; Kastritis, E.; Pavlakis, GN; Dimopoulos, MA Insights to SARS-CoV-2 kitaran hayat, patofisiologi dan rawatan rasional yang menyasarkan-19 komplikasi klinikal COVID. J. Biomed. Sci. 2021, 28, 9. [CrossRef]

2. Pillay, TS Gene of the month: Protein lonjakan coronavirus novel 2019-nCoV/SARS-CoV-2. J. Clin. Pathol. 2020, 73, 366–369. [CrossRef]

3. Sheinin, M.; Jeong, B.; Paidi, RK; Pahan, K. Regresi Kanser Paru-paru dalam Tikus oleh Pentadbiran Intranasal SARS-CoV-2 Spike S1. Kanser 2022, 14, 5648. [CrossRef]

4. Kadam, SB; Sukhramani, GS; Bishnoi, P.; Pable, AA; Barvkar, VT SARS-CoV-2, pandemik coronavirus: Cerapan molekul dan struktur. J. Mikrobiol Asas. 2021, 61, 180–202. [CrossRef]

5. Sternberg, A.; Naujokat, C. Ciri struktur coronavirus SARS-CoV-2 spike protein: Sasaran untuk vaksinasi. Life Sci. 2020, 257, 118056. [CrossRef] [PubMed]

6. Dinding, AC; Tortorici, MA; Frenz, B.; Snijder, J.; Li, W.; Rey, FA; DiMaio, F.; Bosch, BJ; Veesler, D. Glycan perisai dan penutup epitope protein spike coronavirus yang diperhatikan oleh mikroskop cryo-elektron. Nat. Struktur. Mol. biol. 2016, 23, 899–905. [CrossRef] [PubMed]

7. Wang, Y.; Wang, L.; Cao, H.; Liu, C. SARS-CoV-2 S1 lebih unggul daripada RBD sebagai antigen vaksin subunit COVID-19. J. Med. Virol. 2021, 93, 892–898. [CrossRef]

8. Theoharides, TC; Conti, P. Berhati-hati dengan protein lonjakan SARS-CoV-2: Terdapat lebih daripada yang dapat dilihat. J. Biol. Regul. Homeost. Ejen 2021, 35, 833–838. [CrossRef] [PubMed]

9. Guo, X.; Deng, Y.; Chen, H.; Lan, J.; Wang, W.; Zou, X.; Hung, T.; Lu, Z.; Tan, W. Kekebalan sistemik dan mukosa pada tikus yang ditimbulkan oleh imunisasi tunggal dengan vaksin berasaskan vektor adenovirus manusia jenis 5 atau 41 yang membawa protein spike coronavirus sindrom pernafasan Timur Tengah. Imunologi 2015, 145, 476–484. [CrossRef] [PubMed]

10. Gao, J.; Mese, K.; Bunz, O.; Ehrhardt, A. Vektorologi adenovirus manusia terkini untuk pendekatan terapeutik. FEBS Lett. 2019, 593, 3609–3622. [CrossRef]

11. Xing, K.; Tu, XY; Liu, M.; Liang, ZW; Chen, JN; Li, JJ; Jiang, LG; Xing, FQ; Jiang, Y. Keberkesanan dan keselamatan vaksin COVID-19: Kajian sistematik. Zhongguo Dang Dai Er Ke Za Zhi 2021, 23, 221–228. [CrossRef]

12. Voysey, M.; Clemens, SAC; Madhi, SA; Weckx, LY; Folegatti, PM; Aley, PK; Angus, B.; Baillie, VL; Barnabas, SL; Bhorat, QE; et al. Keselamatan dan keberkesanan vaksin ChAdOx1 nCoV-19 (AZD1222) terhadap SARS-CoV-2: Analisis interim empat ujian terkawal rawak di Brazil, Afrika Selatan dan UK. Lancet 2021, 397, 99–111. [CrossRef] [PubMed]

13. Li, C.; Guo, Y.; Fang, Z.; Zhang, H.; Zhang, Y.; Chen, K. Analisis Keberkesanan Perlindungan Vaksin COVID{1}} Yang Diluluskan Terhadap Pelbagai Mutan. Depan. Immunol. 2022, 13, 804945. [CrossRef] [PubMed]

14. Tanriover, MD; Do ˘ganay, HL; Akova, M.; Güner, HR; Azap, A.; Akhan, S.; Köse, ¸S.; Erdinç, F.; Akalın, EH; Tabak, Ö.F.; et al. Keberkesanan dan keselamatan vaksin seluruh-virion SARS-CoV-2 (CoronaVac) yang tidak aktif (CoronaVac): Keputusan interim percubaan fasa 3 buta dua kali, rawak, terkawal plasebo, di Turki. Lancet 2021, 398, 213–222. [CrossRef]

15. Xia, S.; Zhang, Y.; Wang, Y.; Wang, H.; Yang, Y.; Gao, GF; Tan, W.; Wu, G.; Xu, M.; Lou, Z. Keselamatan dan imunogenisiti vaksin SARS-CoV-2 yang tidak diaktifkan, BBIBP-CorV: Percubaan fasa 1/2 secara rawak, rabun dua, terkawal plasebo. Jangkitan Lancet. Dis. 2021, 21, 39–51. [CrossRef] [PubMed]

16. Yang, S.; Li, Y.; Dai, L.; Wang, J.; Dia, P.; Li, C.; Fang, X.; Wang, C.; Zhao, X.; Huang, E.; et al. Keselamatan dan imunogenisiti vaksin subunit protein berasaskan RBD dimerik berulang-tandem rekombinan (ZF2001) terhadap COVID-19 pada orang dewasa: Dua percubaan rawak, dua buta, terkawal plasebo, fasa 1 dan 2. Jangkitan Lancet. Dis. 2021, 21, 1107–1119. [CrossRef]

17. Mallapaty, S. Vaksin COVID DNA India adalah yang pertama di dunia-lebih banyak lagi akan datang. Alam 2021, 597, 161–162. [CrossRef]

18. Grifoni, A.; Weiskopf, D.; Ramirez, SI; Mateus, J.; Dan, JM; Moderbacher, CR; Rawlings, SA; Sutherland, A.; Premkumar, L.; Jadi, RS; et al. Sasaran Tindak Balas Sel T kepada SARS-CoV-2 Coronavirus pada Manusia dengan Penyakit-19 COVID dan Individu Tidak Terdedah. Sel 2020, 181, 1489–1501.e1415. [CrossRef]

19. Cao, Y.; Su, B.; Guo, X.; Matahari, W.; Deng, Y.; Bao, L.; Zhu, Q.; Zhang, X.; Zheng, Y.; Geng, C.; et al. Antibodi Meneutralkan Mujarab terhadap SARS-CoV-2 Dikenal pasti melalui Penjujukan Sel Tunggal Berdaya Tinggi bagi Sel B Pesakit Sembuh. Sel 2020, 182, 73–84.e16. [CrossRef]

20. Amanat, F.; Krammer, F. SARS-CoV-2 Vaksin: Laporan Status. Kekebalan 2020, 52, 583–589. [CrossRef]

21. Li, Y.; Bi, Y.; Xiao, H.; Yao, Y.; Liu, X.; Hu, Z.; Duan, J.; Yang, Y.; Li, Z.; Li, Y.; et al. Perumusan vaksin COVID-19 gabungan DNA dan protein baharu memberikan perlindungan penuh terhadap SARS-CoV-2 dalam kera rhesus. Muncul. Jangkitan Mikrob. 2021, 10, 342–355. [CrossRef]

22. Du, L.; Hey.; Zhou, Y.; Liu, S.; Zheng, BJ; Jiang, S. Protein lonjakan SARS-CoV–sasaran untuk pembangunan vaksin dan terapeutik. Nat. Mikrobiol Rev. 2009, 7, 226–236. [CrossRef] [PubMed]

23. Yue, L.; Cao, H.; Xie, T.; Long, R.; Li, H.; Yang, T.; Yan, M.; Xie, Z. Protein nukleokapsid terpenggal N SARS-CoV-2 sebagai penanda serologi yang lebih baik daripada keseluruhan protein nukleokapsid dalam menilai keimunogenan SARS-CoV yang tidak diaktifkan-2. J. Med. Virol. 2021, 93, 1732–1738. [CrossRef] [PubMed]

24. Greaney, AJ; Loes, AN; Lembut, LE; Crawford, KHD; Starr, TN; Malone, KD; Chu, HY; Bloom, JD Vaksin SARS-CoV-2 mRNA-1273 menimbulkan lebih banyak peneutralan tertumpu RBD tetapi dengan pengikatan antibodi yang lebih luas dalam RBD. bioRxiv 2021. [CrossRef]

25. Mantus, G.; Nyhoff, LE; Kauffman, RC; Edara, VV; Lai, L.; Floyd, K.; Shi, PY; Menachery, VD; Edupuganti, S.; Scherer, EM; et al. Penilaian Respons Selular dan Serologi terhadap Jangkitan SARS-CoV-2 Akut Menunjukkan Kepentingan Fungsian Domain Pengikat Reseptor. J. Immunol. 2021, 206, 2605–2613. [CrossRef]

26. Dia, Y.; Zhou, Y.; Liu, S.; Kou, Z.; Li, W.; Farzan, M.; Jiang, S. Domain pengikat reseptor protein spike SARS-CoV mendorong antibodi peneutral yang sangat kuat: Implikasi untuk membangunkan vaksin subunit. Biokim. Biophys. Res. Commun. 2004, 324, 773–781. [CrossRef]

27. Deng, S.; Liang, H.; Chen, P.; Li, Y.; Li, Z.; Fan, S.; Wu, K.; Li, X.; Chen, W.; Qin, Y.; et al. Pembangunan dan Penggunaan Vaksin Vektor Viral semasa Pandemik-19 COVID. Mikroorganisma 2022, 10, 1450. [CrossRef]

28. Zhu, FC; Guan, XH; Li, YH; Huang, JY; Jiang, T.; Hou, LH; Li, JX; Yang, BF; Wang, L.; Wang, WJ; et al. Imunogenisiti dan keselamatan vaksin jenis adenovirus rekombinan-5-vektor COVID-19 pada orang dewasa yang sihat berumur 18 tahun ke atas: Percubaan fasa 2 rawak, rabun dua, terkawal plasebo. Lancet 2020, 396, 479–488. [CrossRef]

29. Li, M.; Guo, J.; Lu, S.; Zhou, R.; Shi, H.; Shi, X.; Cheng, L.; Liang, Q.; Liu, H.; Wang, P.; et al. Imunisasi Dos Tunggal Dengan Vaksin Berasaskan Adenovirus Cimpanzi Mendorong Imuniti Berkekalan dan Perlindungan Terhadap Jangkitan-2 SARS-CoV. Depan. Immunol. 2021, 12, 697074. [CrossRef]

30. Guo, J.; Mondal, M.; Zhou, D. Pembangunan vektor vaksin novel: Vektor adenoviral cimpanzi. Hum. Vaksin Immunother. 2018, 14, 1679–1685. [CrossRef]

31. Kaneko, N.; Kuo, HH; Boucau, J.; Petani, JR; Allard-Chamard, H.; Mahajan, VS; Piechocka-Trocha, A.; Lefteri, K.; Osborn, M.; Bals, J.; et al. Kehilangan Bcl-6-Menyatakan Sel Pembantu Folikular T dan Pusat Germinal dalam COVID-19. Sel 2020, 183, 143–157.e113. [CrossRef] [PubMed]

32. Lexberg, MH; Taubner, A.; Albrecht, I.; Lepenies, I.; Richter, A.; Kamradt, T.; Radbruch, A.; Chang, HD IFN- dan IL-12 bersinergi untuk menukar Th17 yang dijana dalam vivo kepada sel Th1/Th17. Eur. J. Immunol. 2010, 40, 3017–3027. [CrossRef] [PubMed]

33. Liu, J.; Xu, K.; Xing, M.; Zhuo, Y.; Guo, J.; Du, M.; Wang, Q.; An, Y.; Li, J.; Gao, P.; et al. Imunisasi pendorong utama heterolog dengan vektor adenoviral cimpanzi menimbulkan imuniti yang kuat dan pelindung terhadap jangkitan SARS-CoV-2. Discov Sel. 2021, 7, 123. [CrossRef] [PubMed]