Sel Dendritik Inflamasi Novel Yang Banyak Dan Bersebelahan Dengan Sel T Dalam Buah Pinggang Pesakit Lupus Nefritis
Feb 24, 2022
Mekanisme yang menggalakkan kecederaan keradangan tempatan semasa lupus nefritis (LN) flare sebahagian besarnya tidak diketahui. Memahami sel imun utama yang mendorong keradangan intrarenal akan memajukan pengetahuan kita tentang patogenesis penyakit dan memaklumkan pembangunan terapeutik baharu untuk pengurusan LN. Dalam kajian ini, kami menganalisisbuah pinggang biopsi daripada pesakit dengan LN proliferatif dan mengenal pasti populasi sel dendritik inflamasi novel (infDC) yang sangat dinyatakan dalam LNbuah pinggang, tetapi paling sedikit terdapat pada manusia yang sihatbuah pinggang.Semasa penilaian agnostik ekspresi transkrip imun dalambuah pinggangpesakit dengan LN proliferatif, transkrip yang paling banyak diekspresikan daripada glomeruli terpencil ialah FCER1G, yang mengekod rantai gama reseptor Fc (FcR ). Untuk mengenal pasti jenis sel yang menyatakan FcR yang menyusup ke dalambuah pinggangdi LN, kajian telah dilakukan padabuah pinggangbiopsi daripada pesakit dengan LN aktif menggunakan mikroskopi immunoflluorescence (IF) confocal. Ini menunjukkan bahawa FcR banyak terdapat di kawasan periglomerular (PG) dibuah pinggangdan pada tahap yang lebih rendah dalam tubulointerstitium (TI). Penyiasatan lanjut ke atas penanda permukaan sel ini menunjukkan bahawa ia adalah FcR plus , MHC II plus , CD11c plus , CD163 plus , CD5 , DC-SIGN plus , CD64 plus , CD14 plus , CD16 plus , SIRP plus , CD206 , CD68 , CD123 , CD3 dan CD11bV, menunjukkan sel-sel itu adalah infDC. Kuantifikasi bagi infDC menunjukkan purata 10-kali ganda tahap infDC yang lebih tinggi dalam LNbuah pinggangberbanding yang sihatbuah pinggang. Yang penting, IF mengenal pasti CD3 tambah sel T untuk bersebelahan dengan infDC ini dalam ruang PG LNbuah pinggang,manakala kedua-dua jenis sel hadir secara minimum dalam yang sihatbuah pinggang.Oleh itu, kami telah mengenal pasti DC yang tidak diterangkan sebelum ini dalam lupusbuah pinggangyang mungkin berinteraksi dengan sel T intrarenal dan memainkan peranan dalam patogenesiskecederaan buah pinggangsemasa LN flare.
Kata kunci:sel dendritik radang, nefritis lupus, buah pinggang, autoimun, tindak balas imun adaptif, sel T, SLE
PENGENALAN
Lupus nefritis (LN) adalah komplikasi teruk sistemik lupus erythematosus (SLE) yang dikaitkan dengan morbiditi dan kematian yang besar. Sehingga 30 peratus pesakit dengan LN maju ke peringkat akhirpenyakit buah pinggang(ESKD) (1). Tiada terapi khusus yang diluluskan oleh Pentadbiran Makanan dan Dadah Amerika Syarikat (FDA) untuk merawat LN, dan terapi semasa menghasilkan kadar tindak balas suboptimum dengan sitotoksisiti yang besar (2). Kami dan penyiasat lain telah meneroka patologi molekulbuah pinggangsemasa LN aktif untuk lebih memahami patogenesiskecederaan buah pinggangdalam LN dan laluan yang mungkin disasarkan secara khusus untuk merawat LN.
CISTANCHE AKAN MENINGKATKAN FUNGSI BUAH PINGGANG/BUAH PINGGANG
Semasa penilaian agnostik ekspresi transkrip dalam laser microdissectedbuah pinggangtisu daripada biopsi LN klinikal, kami mendapati bahawa transkrip yang paling banyak diekspresikan dalam petak glomerular ialah FCER1G, mengekod rantai gamma reseptor Fc (FcR ). Diandaikan bahawa transkrip ini mencerminkan sel imun yang menyusup ke dalambuah pinggangsemasa LN aktif, dan kerja ini dijalankan untuk mengenal pasti jenis sel yang diwakili oleh FcR yang terlalu tertekan. Oleh itu, dalam kajian ini, penyambungan transkriptomi telah digunakan untuk membimbing kajian immunoflluorescence (IF) confocal untuk mencirikan sel-sel imun infifiltrasi utama yang terdapat dalambuah pinggangsemasa LN flare. Kami mengenal pasti populasi unik FcR - mengekspresikan sel dendritik radang (infDC) yang berada dalam ruang periglomerular (PG) dan bersebelahan dengan sel CD3 ditambah T yang menandakan potensi perbincangan silang antara populasi sel infDC dan T.
BAHAN DAN KAEDAH
Reka bentuk eksperimenTujuan kerja ini adalah untuk melakukan analisis transkrip dan IF padabuah pinggangbiopsi yang dilakukan di flflare LN untuk mengenal pasti sel-sel imun infifiltrasi utama yang terdapat dalambuah pinggangpada masa LN flare. Analisis transkriptik dilakukan padabuah pinggangbiopsi yang diperolehi di LN flare daripada 58 pesakit dengan proliferatif (Kelas III/IV ± V) LN antara 2007 dan 2013. Biopsi arkib digunakan selepas ujian klinikal selesai. Laser capture microdissection (LCM) telah dilakukan, dan glomeruli dan tubulointerstitium (TI) diasingkan secara berasingan. Penderma hidup praimplantasibuah pinggangbiopsi (n=10) berfungsi sebagai kawalan sihat (HC) dan dianalisis selari dengan biopsi LN. Pakar nefrologi (AM) yang sama merawat semua pesakit, dan seorang pakar nefropatologi (VA) berpengalaman membacabuah pinggangbiopsi. Lembaga etika Hospital Fernandez (Buenos Aires) dan lembaga semakan institusi Universiti Ohio State meluluskan penyiasatanbuah pinggangbiopsi.
Pengekstrakan dan Analisis RNA
Biopsi yang digunakan untuk analisis transkriptik telah ditetapkan dalam formalin dan parafin-embedded (FFPE). Dari blok parafin, bahagian 10µm dipotong dari setiap biopsi. Selepas deparafinisasi, semua glomeruli dan TI yang ada dipisahkan oleh microdissection laser (PALM MicroBeam, Zeiss Labs, Bernried, Jerman), ditangkap, dan dicerna dengan proteinase K. DNA telah dikeluarkan dengan DNase. RNA telah dimendakan, diekstrak dengan lajur putaran RNeasy MinElute (Qiagen, Redwood City, CA, Amerika Syarikat), dan dielusi dalam air bebas RNase. Ekspresi transkrip dianalisis daripada 250 ng RNA yang diekstrak menggunakan platform NanoString nCounter dan panel transkrip imunologi manusia GX [NanoString Technologies, Seattle, WA, USA; (3–5)]. Panel imunologi manusia v2 terdiri daripada 579 gen tindak balas imun, 6 gen kawalan positif, dan 6 gen kawalan negatif. Senarai lengkap gen ini boleh didapati dalam penerbitan awal dari kumpulan kami (6). Untuk mikroskop IF confocal, bekubuah pinggangtisu biopsi daripada empat pesakit dengan Kelas IV LN aktif diperoleh daripada Biorepositori Nephropathology Ohio State. Tiga sampel nefrektomi beku digunakan sebagai HC. Nephrectomies dilakukan pada pesakit denganbuah pinggangkarsinoma sel. Tisu yang diperoleh untuk analisis telah dipisahkan dari tisu kanser. Tisu sekeliling yang digunakan untuk analisis kelihatan sihat dengan analisis histologi. Nephrectomies digunakan sebagai kawalan kerana sampel beku diperlukan, dan kami tidak mempunyai tisu penderma pemindahan beku yang disimpan dalam biorepositori kami.
Antibodi
Antibodi utama (Abs) yang digunakan untuk IF semuanya disenaraikan dalam Jadual Tambahan 1. Antibodi yang digunakan dalam kajian ini telah disahkan untuk IF dengan sama ada menggunakan nodus limfa manusia atau menggunakan hati manusia sebagai kawalan positif (data tidak ditunjukkan). Kawalan isotype yang digunakan ialah IgG arnab biasa ChromoPure, IgG tetikus biasa (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA), tetikus IgG1κ (BioLegend, San Diego, CA, USA) dan tetikus IgG2bκ (Jackson ImmunoResearch). Antibodi sekunder yang digunakan untuk IF ialah kambing F(ab′ )2 anti-tikus IgG 488 (Jackson ImmunoResearch) dan kambing anti-arnab IgG 568, kambing anti-arnab IgG 488, dan kambing anti-arnab IgG 647 daripada Invitrogen (Thermo Fisher Saintifik, Waltham, MA, Amerika Syarikat).
CISTANCHE AKAN MEMPERBAIKI PENYAKIT BUAH PINGGANG/PINGGANG
ImunofluoresensiNefrektomi beku dan LNbuah pinggangbiopsi telah dibelah (bahagian 5µm setiap slaid), fifixed dalam 4 peratus paraformaldehydephosphate buffered saline (PBS) selama 15 minit pada suhu bilik, dan dibasuh dengan PBS (dengan 0.02 peratus natrium azida). Bahagian itu disekat dengan 5 peratus susu dalam PBS, diikuti dengan pengeraman dengan Ab primer semalaman. Selepas tiga kali cucian dengan PBS selama 1 jam, bahagian tersebut diinkubasi dengan Abs sekunder bertanda pendarfluor selama satu jam lagi pada suhu bilik, dan nukleus telah diwarnai dengan DAPI (100 ng/ml) selama 10 minit. Bahagian itu kemudiannya dipasang dengan Prolong Gold (Invitrogen) di bawah slip penutup. Control Abs merujuk kepada senarai isotype Abs dengan Ab sekunder masing-masing. Imej-imej itu diperoleh menggunakan mikroskop Konfokal Pengimbasan Laser Olympus FluoView 1000 yang dilengkapi (Olympus Corp., Tokyo, Jepun) dengan sistem pengesanan spektrum untuk pemisahan fifiner bagi flfluorochromes (spektra FV1000) bersama-sama dengan kanta rendaman minyak ×60 pada suhu bilik.
Mikroskopi KuantitatifTahap ekspresi infDC dalam LN dan HCbuah pinggangtelah dikira daripada imej yang diwarnakan untuk infDC menggunakan anti CD163. Jumlah keamatan CD163 berdasarkan ekspresi infDC dikira menggunakan perisian ImageJ (Institut Kesihatan Kebangsaan, Bethesda, MD, Amerika Syarikat). Keamatan CD163 diperolehi selepas menolak pendarfluor latar belakang daripada isotip ditambah imej bernoda Ab sekunder dan dengan mengukur kawasan dan intensiti pendarfluor purata piksel hijau yang terpancar daripada infDC menggunakan antibodi CD163 seperti yang diterangkan sebelum ini (7).
Analisis statistikUntuk analisis transkriptik, statistik deskriptif dibentangkan sebagai min ± sisihan piawai atau sebagai peratusan. Untuk pembolehubah klinikal, ujian-t, ANOVA, atau ujian jumlah pangkat Wilcoxon digunakan mengikut kesesuaian. Untuk pembolehubah klinikal kategori, ujian tepat Fisher digunakan. Untuk data rentetan nano, kiraan mentah telah dinormalisasi kepada kawalan spike-in positif dan kemudian log2 diubah. Untuk mengurangkan berat sebelah teknikal, gen dengan tahap ekspresi di bawah min ditambah dua sisihan piawai kawalan negatif telah dipindahkan. Normalisasi kuantil digunakan pada transkrip yang tinggal (522 untuk glomeruli dan 502 untuk TI). Sampel glomerular dianalisis secara berasingan daripada sampel TI. Untuk menentukan ekspresi pembezaan, ekspresi transkrip glomerular dan TI daripada LNbuah pinggangdibandingkan dengan kawalan. Perubahan 1.5-lipatan dan p < 0.05="" diperlukan="" untuk="" transkrip="" dianggap="" dinyatakan="" secara="" berbeza.="" untuk="" analisis="" statistik="" mikroskop="" confocal,="" ujian="" t="" pelajar="" dua="" hujung="" digunakan="" untuk="" perbandingan="" dua="" kumpulan,="" dan="" p=""><0.05 dianggap="" penting.="" semua="" analisis="" dijalankan="" menggunakan="" origin="" pro="" versi="" 2020="" (originlab="" corp.,="" northampton,="" ma,="">
KEPUTUSAN
Analisis Transkripmik Biopsi Buah Pinggang di LN Flare Mendedahkan Ekspresi Ketara FCER1G dalam Glomeruli dan TI di LN FlareKami melakukan analisis transkriptik pada RNA yang diasingkan daripada glomeruli dan TI menggunakan LCM daripadabuah pinggangbiopsi yang diperolehi pada flflare LN proliferatif (n=58). Penderma hidup praimplantasipemindahan buah pinggangbiopsi digunakan sebagai HC (n {{0}}). Analisis transkrip untuk 579 transkrip imun menunjukkan FCER1G sebagai transkrip glomerular yang diekspresikan secara berlebihan [Fold Change (FC): 3.6, p-value (p): 1E-10] tetapi juga diekspresikan secara ketara dalam TI (FC: 1.7, p=0.001) pada flflare LN (Rajah 1 dan Jadual Tambahan 2) berbanding HC. Selain itu, ungkapan FCER1G berkorelasi dengan indeks aktiviti penyakit histologi NIH (r=-0.43, p=0.01).
FcR Buah Pinggang Sangat Dinyatakan pada LN Flare dan Terkurung di Wilayah PeriglomerularUntuk mencirikan sel imun yang menyatakan FCER1G, kami menganalisis protein yang dikodkan FCER1G, rantai gamma reseptor Fc [FcR ; (8)] dalam LN manusia, dan HCbuah pinggangtisu dengan analisis mikroskopik IF menggunakan antibodi tertentu. Analisis IF mendedahkan bahawa FcR dinyatakan secara minimum dalam glomeruli (dikenal pasti oleh penanda podocyte, synaptopodin), tetapi banyak dinyatakan dalam kawasan PG dan TI biopsi flflare LN. Sel-sel yang menyatakan FcR nampaknya mempunyai penampilan tipikal infifiltrat selular di rantau PG, secara mikroskopik (Rajah 2). Analisis IF menunjukkan bahawa semasa flflare LN, rantau PG diperluas kerana kehadiran infifiltrat selular, manakala rantau PG nipis dan tanpa infifiltrasi sel dalam HC seperti yang dilihat dalam imej gabungan Rajah 2
dan Rajah Tambahan 4. Paling penting, kami melihat ekspresi FcR yang lemah hingga nol dalam LN dan HCs menggunakan kawalan antibodi isotype yang diproses secara serentak (data tidak ditunjukkan). Data ini menyokong penyambungan transkriptik yang FCER1G mengodkan FcR dan banyak diekspresikan dalam flflare LN proliferatif.
Penanda Makrofaj CD11b dan CD68 Tidak Berkolokalisasi Dengan FcR dalam Buah Pinggang LN Manusia
Berdasarkan penerangan terdahulu leukosit interstisial dalam LN (9-11), kami meramalkan sel yang menyatakan FcR menjadi makrofaj. Kami dua bahagian biopsi diwarnakan dengan antibodi anti-FcR antibodi FcR terhadap penanda makrofaj CD68, CD206 dan CD11b. Tanpa diduga, pewarnaan untuk M2-penanda makrofaj khusus, CD11b dan CD206 [(12); data tidak ditunjukkan], menunjukkan ungkapan lemah-ke-nihil dalam LNbuah pinggang.Sementara itu, penanda panmakrofaj CD68 (13) menunjukkan ekspresi glomerular; Oleh itu, mencadangkan makrofaj M1 ditemui terutamanya dalam glomeruli. Walau bagaimanapun, pewarnaan CD68 tidak bertepatan dengan pewarnaan PG dan TI untuk FcR (Rajah 3). Data ini menunjukkan bahawa FcR mengekspresikan sel dalambuah pinggangbukan makrofaj. Walaupun antibodi terhadap CD206, CD68, dan CD11b memberikan isyarat yang lemah atau tiada dalam LNbuah pinggang, mereka mengotorkan sel Kupffffer dalam hati manusia yang sihat dengan kuat, mengesahkan kebolehpercayaan dan kekhususan antibodi [(14); data tidak ditunjukkan].
FcR Dikolokalkan Dengan Penanda Sel Dendritik Konvensional CD11c dan MHCII dalam Buah Pinggang LN
Untuk menentukan sama ada sel pengekspres FcR ialah sel dendritik (DC), mikroskop IF tiga warna dilakukan menggunakan penanda DC konvensional CD11c dan MHCII yang diketahui sangat dinyatakan dalam semua DC manusia (15, 16), sebagai tambahan kepada sel mieloid yang lain. Analisis kualitatif menunjukkan bahawa ungkapan FcR (dilabelkan menggunakan antibodi anti-FcR diikuti oleh antibodi sekunder terkonjugasi (Invitrogen) pewarna Alexa{5}} yang menunjukkan warna pancaran merah dalam mikroskop confocal) dikolokalisasikan dengan kedua-dua CD11c dan MHCII. CD11c/MHCII telah dilabelkan menggunakan antibodi CD11c/MHC II diikuti oleh antibodi sekunder konjugat pewarna Alexa-488 (Invitrogen) menunjukkan warna pancaran hijau dalam mikroskop confocal (Rajah 4). Kolokalisasi menghasilkan warna kuning yang mencerminkan kehadiran FcR flfluorescing (merah) dan CD11c/MHCII (hijau) untuk berlaku bersama di lokasi/sel yang sama dalam dimensi XY (Rajah 4). Corak pewarnaan CD11c dipadankan dengan FcR (Rajah 4) di rantau PG dan TI, dan tiada antibodi yang ternoda dalam glomeruli. Selaras dengan CD11c, MHCII (Rajah 4, baris bawah) juga diwarnakan dengan kuat dalam PG, berkolokalisasi dengan FcR . Tetapi, sebagai tambahan kepada pewarnaan PG yang kuat, MHCII juga menunjukkan pewarnaan lemah dalam glomerulus, mencadangkan kehadiran MHCII yang lemah mengekspresikan sel glomerular yang mungkin merupakan sel myeloid.
FcR Tidak Berkolokalisasi Dengan Penanda Sel Dendritik Plasmacytoid CD123, tetapi Dikolokalisasikan Dengan Penanda Sel Dendritik Terhasil Monosit DC-SIGN
Untuk mengenal pasti subset FcR -expressing DC yang ditemui di rantau PG semasa LN flare, tisu biopsi telah diwarnai untuk CD123, penanda khusus DC plasmacytoid (pDC) (16, 17). CD123 plus sel ditemui di rantau TI (Rajah 5, baris atas) tetapi tidak hadir dari glomeruli dan rantau PG LNbuah pinggang. Sel CD123 plus adalah jarang, dan pewarnaan CD123 dalam TI tidak sejajar dengan pewarnaan FcR. Ini menunjukkan bahawa FcR intrarenal -menyatakan DC dalam LN bukan pDC. Ungkapan protein pengawalseliaan isyarat alpha (SIRP) dikolokalisasikan dengan FcR (Rajah 5, baris tengah), menunjukkan bahawa DC PG bukan jenis konvensional myeloid 1 DC (cDC1) (16). Kemungkinan yang selebihnya ialah DC PG adalah DC jenis 2 konvensional myeloid (cDCs2) atau DC yang diperolehi monosit (moDCs). Untuk membezakan antara subset DC ini, ungkapan DC-SIGN, penanda khusus untuk moDC telah dinilai. DC-SIGN dikolokalkan dengan FcR di rantau PG (Rajah 5, panel bawah) menunjukkan bahawa PG DC ialah moDC.
FcR Dikolokalkan Dengan CD64, CD16 dan CD14 di Wilayah Periglomerular Buah Pinggang dan Disahkan bahawa DC
Ditemui di LNbuah pinggangdi Flare Adakah moDCs Untuk mengesahkan FcR yang menyatakan DC adalah moDC, mereka dicirikan lagi dengan menilai kehadiran tambahan penanda permukaan sel yang diketahui terdapat pada moDC termasuk CD64, CD16 dan CD14. Setiap penanda ini ditemui dalam LNbuah pinggangtisu dan dikolokalisasikan dengan FcR (Tambahan Rajah 1).
FcR Dikolokalkan Dengan Penanda InfDC Beredar Terdahulu, Ekspresi CD163 dan CD163 Diekspresikan Terlalu Banyak pada Suar LN
Selepas itu, analisis kolokalisasi CD163 dengan FcR dilakukan untuk menentukan sama ada populasi moDC yang dilihat di sini boleh menjadi infDC yang beredar baru-baru ini (18). Rajah 6 mengesahkan kolokalisasi CD163 (hijau) dengan FcR (merah) di rantau PG (Rajah 6A) dan TI (Rajah 6B) sangat mencadangkan bahawa subset moDC hadir dalambuah pinggangsemasa flflare LN sememangnya infDC. Memandangkan infDC tidak menyatakan CD5 (18), makabuah pinggangtisu telah diwarnakan untuk CD5. Walaupun CD5-sel ekspresi hadir dalambuah pinggang, mereka tidak terletak berdekatan dengan rantau PG dan tidak berkolokalisasi dengan FcR (Tambahan Rajah 2), menunjukkan bahawa infDC ini tidak mempunyai ekspresi CD5. Untuk mengukur perbezaan infDC dalam LN dan HCbuah pinggang, infDC dikira dengan mengukur luas ekspresi CD163 selepas pewarnaan dengan antibodi monoklonal anti-CD163, dan intensiti pendarfluor purata CD163. Menggunakan 16 imej glomerular daripada 4 LN flarebuah pinggang, dan 18 imej glomerular daripada tiga HCbuah pinggang, kami mendapati 9- hingga 21-kali ganda tahap infDC yang lebih tinggi dalam buah pinggang LN berbanding HC (Rajah 6C). Oleh kerana infDC sebelum ini telah ditunjukkan untuk menyatakan CD11b (19, 20), kami selanjutnya menganalisis LN manusiabuah pinggangdengan CD11b mAb anti-manusia tikus (klon M1/70) bersama-sama dengan antibodi anti-CD163. Selaras dengan penemuan sebelumnya dalam manuskrip ini (Rajah 3), klon M1/70 memberikan isyarat lemah-ke-nihil dalam infDC (Tambahan Rajah 3).
Sel Dendritik Radang Hadir Berdekatan Dengan Sel T di LN Flare
Lupus nefritisbuah pinggangbahagian telah diwarnai dengan penanda sel T CD3, dan antibodi kepada FcR dan CD163 untuk menyetempatkan sel T dan infDC secara spasial. Penanda CD3 dengan penanda infDC dilakukan dalam dua cara menggunakan dua klon berbeza antibodi anti-CD3 (mouse mAb UCHT1 dan arnab mAb SP7) dan 2 penanda infDC. Pewarnaan CD3 mAb UCHT1 dan anti-FcR menunjukkan kehadiran sel T CD3 ditambah yang hadir bersebelahan dengan FcR plus infDC di rantau PG LN.buah pinggang(Rajah 7A). Pewarnaan dengan anti-CD163 plus CD3 mAb SP7 (Rajah 7B) mengesahkan bahawa infDC hadir berdekatan dengan sel T CD3 plus dalam LN manusiabuah pinggang.Walaupun kostaining CD3 dengan penanda infDC menunjukkan terutamanya pewarnaan hijau dan merah diskret untuk kedua-dua jenis sel, di beberapa tempat pewarnaan merah dan hijau bertindih.
PERBINCANGAN Dalam kajian ini, kami mengenal pasti populasi infDC novel yang menyusup ke dalambuah pinggangdi flflare LN. InfDC ini menyusup, menyetempatkan ke ruang PG dan TI, dan ekspresinya 10-kali ganda lebih besar dalam suar LNbuah pinggangberbanding dengan HC. Bukti bahawa ini adalah novel adalah berdasarkan penanda permukaannya, iaitu FcR tambah , MHCII tambah , CD11c tambah , CD163 tambah , CD5 , DC-SIGN tambah , CD64 tambah , CD14 tambah , CD16 tambah , SIRP tambah , CD206 , CD68 , CD123 , CD3 dan CD11bV . Terutama, infDC ini hadir dalam anggaran hampir kepada sel T di rantau PGbuah pinggangsemasa suar LN. Pemerhatian daripada penyiasatan ini disokong oleh kajian terdahulu yang mengesan penyusupan PG DC dalam pelbagai model tetikus glomerulonephritis eksperimen (21, 22). Walau bagaimanapun, tidak jelas mengapa infDC menetap di ruang PG. Literatur sebelum ini mencadangkan bahawabuah pinggangDC bermula dalam glomerulus dan melintasi dari mesangium melalui jumbai glomerular dan limfatik untuk mengalirkan nodus limfa untuk membentangkan antigen kepada sel T dalam PG (23). Dalam kes ini,buah pinggangDC mungkin bermula di glomerulus tetapi pada masa LN menjadi jelas secara klinikal, DC ini telah pun bergerak keluar dari glomerulus dan menetap di ruang PG. Isyarat perencatan kemudiannya boleh dilepaskan dan menyekat sitokin/kemokin yang diperlukan untuk pembezaan monosit ke dalam infDC, menjelaskan ketiadaan infDC dari glomeruli LN pada masa biopsi. Sebagai alternatif, ada kemungkinan faktor kemotaktik DC dilepaskan terus daripadabuah pinggangsel tiub menarik DC yang menyusup (24). Kami membuat spekulasi bahawa kedua-duanya berlaku sebagai tindak balas kepada rangsangan keradangan yang mengakibatkan pengumpulan PG dan TI infDC semasa LN.
Penyiasatan ini membuktikan bahawa PG DC bukan plasmacytoid atau DC konvensional. Ekspresi penanda monosit CD14, CD64, dan CD16 yang dilaporkan sebelum ini, mengesahkan bahawa PG DC ini mewakili moDC (16, 25, 26). Dalam keadaan keradangan atau jangkitan aktif, moDCs dipanggil infDCs (27). Pencirian lanjut moDCs ini mendedahkan populasi infDC unik yang tidak diterangkan sebelum ini dalam LN manusia. Walau bagaimanapun, kajian transkriptik baru-baru ini mengenai sel imun darah periferal pada pesakit dengan SLE mengenal pasti tandatangan infDC iaitu CD163 plus, CD14 plus, dan CD5h, yang serupa dengan populasi infDC intrarenal yang dilaporkan di sini (18). Baru-baru ini, penilaian menyeluruh terhadap sel imun dilakukan menggunakan sel tunggal RNA-Seq daribuah pinggangbiopsi di LN flare (28). Beberapa kluster monosit telah dikenal pasti dalam kajian ini dengan satu kluster monosit yang menyatakan tandatangan CD163 tambah, CD14 tambah, CD16 tambah, CD64 tambah, dan tandatangan tambah DC-SIGN, serupa dengan infDC yang diterangkan di sini. Tambahan pula, keturunan monosit yang dicirikan dianggap sebagai subset monosit yang menyusup kerana ia dinyatakan secara minimum dalam sihat.buah pinggang. Walaupun kajian IF ini tidak memberikan ukuran yang tepat bagi tahap ekspresi penanda keturunan, dan ini boleh membuat pengenalpastian peringkat peralihan monosit kepada penukaran DC dDFOult, penemuan ini membenarkan pencirian dan orientasi spatial untuk memaklumkan kajian kuantitatif selanjutnya.
Populasi infDC novel ini juga menyerupai infDC yang dilaporkan sebelum ini, daripada nodus limfa tikus yang dijangkiti Listeria (CD64 tambah CD11c tambah MHCII tambah ) (27), dan mukosa usus penyakit seliak (29). InfDCs juga sebelum ini telah diterangkan dalam cecair sinovial artritis manusia daripada pesakit dengan arthritis rheumatoid (20). Walau bagaimanapun, infDC yang diterangkan dalam LNbuah pinggangberbeza daripada infDC cecair sinovial; dalam itu, mereka kekurangan penanda makrofaj CD11b dan CD206 yang terdapat pada infDC cecair sinovial. Ini menunjukkan bahawa populasi infDC yang diterangkan di sini berbeza daripada infDC yang dilihat dalam sekurang-kurangnya beberapa penyakit autoimun lain dan mungkin unik kepadabuah pinggangsemasa LN flare. Selain itu, kajian terdahulu telah mengenal pasti FcεRI [(19, 30); dikenal pasti menggunakan antibodi antiFcεRI (eBioscience, Inc., San Diego, CA, USA) untuk tapak pengikat antibodi] untuk menjadi penanda terbaik untuk membezakan infDC
RAJAH 6|Rantaian gamma reseptor Fc berkolokalisasi dengan penanda sel dendritik radang (infDC) beredar yang dikenal pasti sebelum ini CD163 dan ekspresi CD163 diekspresikan secara berlebihan dalam LN manusia berbanding HC. (A) Tiga imej IF warna yang mewakili 3 LN manusiabuah pinggangmenunjukkan kolokalisasi CD163 dalam warna hijau RAJAH 6|(pertama) dengan FcR berwarna merah (tengah) di rantau PG. Baris kedua menunjukkan bahagian zum imej bagi baris atas yang diserlahkan dalam segi empat sama bertitik. Lajur ketiga menunjukkan penggabungan fifirst 2 bersama pewarnaan nukleus DIC dan DAPI (biru). (B) Tiga imej IF warna yang mewakili 3 LN manusiabuah pinggangmenunjukkan kolokalisasi CD163 dalam warna hijau (pertama) dengan FcR dalam warna merah (tengah) di rantau tubulointerstitial (TI). (C) Graf bar menggambarkan kuantifikasi infDC berdasarkan ekspresi CD163 menggunakan warna hijau daripada pewarnaan anti-CD163 daripada 18 G imej 3 HC berbeza dan 16 imej glomeruli daripada 4 sampel LN berbeza menggunakan perisian ImageJ. Kawasan sahaja (graf di kiri) dan luas × min intensiti pendarfluor (graf di kiri) CD163 (hijau) diukur dan diplot dengan min ± SD. Data dianalisis dengan ujian-t tidak berpasangan (satu-ekor) menggunakan setiap ukuran, dan nilai-p ditunjukkan dalam graf bar. RAJAH 7|baris menggambarkan 3 imej IF warna yang mewakili tiga LN yang berbezabuah pinggangmenunjukkan kehadiran CD3 (penanda sel pan T berwarna merah) bersebelahan dengan CD163 (penanda infDC berwarna hijau) yang sangat dibesarkan dari rantau PG. Baris bawah menunjukkan imej gabungan 2 lajur pertama di sebelah kanan dan imej gabungan 2 lajur pertama ditambah pewarnaan nukleus DIC dan DAPI (biru) di sebelah kiri. daripada makrofaj dan cDC oleh flflow cytometry. Kajian kami mencadangkan bahawa FcR , subunit gamma sitoplasma yang melaluinya berbilang FcR berfungsi, termasuk FcεRI, Fc RI, Fc RIIIa, dan Fc RI, serta reseptor imun lain seperti GPVI, OSCAR, dan TREM (8), untuk menjadi yang boleh dipercayai. penanda untuk kajian IF pada sampel biopsi pesakit. Kemungkinan infDC dalam LNbuah pinggangmenyatakan FcεRI, serupa dengan Fc RI dan Fc RIIIa (Tambahan Rajah 1) kerana kehadiran FcR secara tidak langsung mencadangkan kehadiran pelbagai reseptor termasuk FcεRI.
CISTANCHE AKAN MEMPERBAIKI PENYAKIT BUAH PINGGANG/PINGGANG
Kepentingan mencirikan jenis sel intrarenal yang mengekspresikan CD163 dipertingkatkan oleh fifindings baru-baru ini daripada kumpulan kami, mendedahkan bahawa tahap CD163 air kencing adalah lebih tinggi dengan ketara dalam LN aktif berbanding dengan SLE ekstrarenal atau SLE tidak aktif (31). CD163 urin dikaitkan dengan keterukan penyakit dan indeks aktiviti histologi. Manakala kajian oleh Mejia et al (31). mencadangkan CD163 berasal daripada makrofaj M2, kami kini mencadangkan bahawa CD163 air kencing juga berasal daripada infDC, menyokong idea bahawa CD163 air kencing adalah biomarker yang mencerminkan aktiviti penyakit dalam LN.
Berkenaan dengan asal usul infDC ini, ungkapan penanda monosit menunjukkan bahawa infDCs mungkin dibezakan daripada monosit yang menyusup dalambuah pinggangsemasa keradangan yang disebabkan oleh pelbagai rangsangan autoimun termasuk kompleks imun. Sebaliknya, kehadiran CD163 ditambah CD14 ditambah infDC dalam pesakit dengan peredaran lupus (18) menunjukkan bahawa infDC dari peredaran periferi memasukibuah pinggangdalam LN. Ia juga mungkin bahawa kedua-dua mekanisme menyumbangbuah pingganginfDCs. Mekanisme yang mana infDC berinteraksi dengan sel T semasa LN manusia tidak diketahui. Walaupun kostaining CD3 bersama-sama dengan penanda infDC menunjukkan terutamanya populasi diskret kedua-dua jenis sel dalam jarak dekat (Rajah 7B), terdapat juga bukti beberapa pertindihan mencadangkan pembentukan sinaps imunologi dan interaksi antara infDC dan sel T dalam LN.buah pinggang.Walau bagaimanapun, sel T bersedia untuk berhijrah ke organ limfoid sekunder; laporan baru-baru ini telah menunjukkan kehadiran agregat imun yang dianjurkan sebagai struktur limfoid tertier (TLS) pada pesakit dengan LN dan murine LNbuah pinggangyang menyerupai nodus limfa dengan tandatangan gen dan komposisi sel (32). Ini konsisten dengan laporan sebelumnya yang mengenal pasti pusat germinal dengan agregat sel T dan B dalam LN.buah pinggang(33). Mempertimbangkan penemuan ini dalam konteks mengenal pasti infDC dalam LNbuah pinggangmencadangkan bahawa infDC dalam PG dan TI mungkin pemacu penting tindak balas imun adaptif tempatan dalam buah pinggang LN. Walaupun masih belum jelas sama ada sel T ini adalah sel T pemastautin atau sel T primed, infDCs diketahui di bawah pelbagai keadaan penyakit mempunyai kapasiti untuk mencetuskan pembangunan subset sel pembantu T utama, iaitu Th1, Th2, dan Th17 (20). , 34, 35). Walaupun, kajian in vitro mencadangkan infDC terlibat dalam permulaan dan penyelenggaraan tindak balas Th17 (19), kajian lanjut mengenai novel LNbuah pinggang infDCs diperlukan kerana rangsangan keradangan dan persekitaran mikro tisu menentukan fungsi infDC in situ (36).
KESIMPULAN
Sebagai kesimpulan, kami mengenal pasti populasi infDC novel yang belum pernah diterangkan dalam LNbuah pinggang.InfDC ini berada di rantau PG dan bersebelahan dengan sel T yang menyusup. Penemuan kami, ditambah pula dengan literatur terkini yang mengenal pasti CD163 yang beredar ditambah infDC dalam SLE dan air kencing CD163 sebagai penanda berharga aktiviti penyakit dalam LN, mencadangkan infDC dan rakan sel T mereka mungkin penyumbang utama untuk memacu tindak balas imun adaptif tempatan semasa LN aktif. Kajian lanjut adalah perlu untuk menentukan subset sel T yang berada di sebelah infDC dan memahami mekanisme yang mana PG infDC berkomunikasi dengan sel T untuk memacu keradangan tempatan di LN.
