Dab Homozigot1−// Merupakan Novel Berpotensi Punca Anomali Kongenital Autosomal Resesif Pada Buah Pinggang Dan Saluran Kencing Tikus
Feb 28, 2022
pengenalan
Tikus mutan Yotari, yang diperoleh melalui pemerolehan spontan mutasi dalam gen Dab1, mempamerkan keabnormalan histologi dalam sistem saraf pusat [1,2], sangat serupa dengan tikus reeler (reelin //), menunjukkan bahawa reelin dan DAB1 tergolong dalam laluan isyarat yang sama [1–4]. Penyimpangan dalam laluan reelin / DAB1 telah dilaporkan dikaitkan dengan pelbagai gangguan psikiatri [5-7]. Menariknya, selain sistem saraf pusat, kehadiran DAB1 dan protein reelin juga telah disahkan dalam sistem saraf periferi dan beberapa tisu luar. Kehadiran DAB1 telah ditemui dalam podosit tikus [8] dan janin manusiabuah pinggang[9] manakala ekspresi reelin telah dilaporkan semasa tetikus dan perkembangan janin manusia, serta dalam beberapa sel endothelial di sepanjang saluran darah dalam tetikus dewasa [9-11]. Laluan reelin/DAB1 kanonik boleh mencetuskan protein hiliran yang berbeza, termasuk reseptor NOTCH2, yang memainkan peranan penting dalam keputusan nasib sel dan pembezaan semasabuah pinggangpembangunan [12–14]. Reseptor NOTCH2 diperlukan untuk membentuk tubulus proksimal dan podosit [13], tetapi apabila kematangan nefron dicapai, laluan ini kebanyakannya disenyapkan [15]. Dalam keadaan akutpenyakit buah pinggang,peningkatan ekspresi NOTCH2 mungkin berpotensi menyumbang kepada penjanaan semula, manakala ekspresi yang berterusan dikaitkan dengan fifibrosis interstisial dan glomerulosklerosis [15]. Downregulation isyarat NOTCH boleh mengurangkan autophagy dan menyebabkan kerosakan pembezaan podosit semasa pembangunan [16].
Akibatnya, podosit yang tidak berfungsi memainkan peranan penting dalam penyakit glomerular, terutamanya dalam sindrom nefrotik idiopatik manusia [17,18] dan dalam sindrom nefrotik perubahan minimum (MCNS) [19]. Oleh itu, autophagy mengekalkan homeostasis selular di bawah keadaan fisiologi normal, manakala dalam keadaan patologi, ia boleh berkembang menjadi kematian autofagik [20]. Biomarker autophagy yang digunakan secara meluas ialah LC3B, protein struktur membran autophagosomal [21]. Crosstalk kompleks antara autophagy dan apoptosis juga menyumbang kepada pengekalan keseimbangan homeostatik sebagai tindak balas kepada persekitaran mikro sel. Telah diketahui umum bahawa kejadian apoptosis meningkat dalam bilangan semasabuah pinggangperkembangan [22] dan sangat berkurangan sebaik sahaja kematangan tamat, kecuali dalam keadaankecederaan buah pinggang[23]. Tidak dinafikan, apoptosis adalah mekanisme kompleks yang dikawal melalui interaksi beberapa laluan tetapi kebanyakannya berakhir dengan pengaktifan caspase3 (CASP3), yang pengaktifannya merupakan salah satu penanda yang paling kerap digunakan untuk pengesanan apoptosis [23].
Dalam laporan ini, kami bertujuan untuk menganalisis bagaimana pengaruh pembungkaman berfungsi gen Dab1buah pinggangmorfologi dan ekspresi dan penyetempatan reelin, NOTCH2, LC3B, dan protein CASP3 yang dibelah dalam tikus selepas bersalinbuah pinggang. Kami menganggap bahawa protein ini dinyatakan dalam tetikus selepas bersalinbuah pinggang,dan interaksi fungsional mereka menyumbang kepada penyelenggaraan struktur dan fungsi mereka. Di samping itu, kerana kehadiran DAB1 telah disahkan semasa janin manusiabuah pinggangperkembangan [9], ia boleh dianggap bahawa penyahaktifannya boleh menyebabkan gangguan dalam spektrum luas anomali kongenitalbuah pinggangdan saluran kencing (CAKUT).
Kata kunci:yotari; fungsi buah pinggang; perkembangan buah pinggang selepas bersalin; pewarnaan imunofluoresensi; mikroskop elektron penghantaran
CISTANCHE AKAN MENINGKATKAN FUNGSI BUAH PINGGANG/BUAH PINGGANG
Bahan dan Kaedah
Koleksi ContohSebagai mutan konvensional nol Dab1, kami menggunakan tikus yotari (Dab1/ ) yang diterangkan sebelum ini oleh Howell et al. [24]. Primer PCR yang digunakan untuk genotaip tikus ialah yotari: GCC CTTCAGCATCACCATGCT dan CAGTGAGTACATATTGTGTGAGTTCC, jenis liar lokus Dab1: GCCCTTCAGCATCACCATGCT dan CTTTGTTTCTTTGCTTTAA-GGCTGT [5]. Tikus C57BL/6 N dibesarkan dan ditempatkan dalam kumpulan dalam sangkar polikarbonat standard (termasuk sekurang-kurangnya satu daripada setiap genotip) dengan akses ad libitum kepada makanan dan air dalam bilik terkawal suhu (23 ± 2 ◦C) dengan cahaya 12 jam/ kitaran gelap. Pada hari 4, 11 dan 14 selepas bersalin (P4, P11, dan P14), tikus telah dibius secara mendalam dengan pentobarbital dan direndam secara transkardial selama 10 min dengan garam penampan fosfat (PBS, pH 7.2) dan 4 peratus paraformaldehid (PFA). ) dalam 0.1 M PBS.buah pinggangtelah dikeluarkan dan difiksasi dengan 4 peratus PFA dalam 0.1 M PBS semalaman untuk analisis histologi konvensional (hematoxylin–eosin (H&E), pewarnaan imunohistokimia dan imunofluoresensi) dan dalam 2 peratus PFA ditambah 2.5 peratus campuran glutaraldehid (GA) untuk pemeriksaan mikroskop elektron. Selepas fifixation, tisu disediakan untuk pemeriksaan histologi lanjut, seperti yang telah kami jelaskan sebelum ini [25,26].
Immunofluoresensi dan Pewarnaan ImunoperoksidaseSelepas penyahfikinan dan penghidratan semula, bahagian dipanaskan selama 20 min dalam 0.01 M sitrat penimbal (pH 6.0) dalam pengukus air dan, selepas itu, disejukkan ke suhu bilik. Penampan menyekat (ab 64226, Abcam, Cambridge, UK) telah digunakan selama 30 minit untuk mengecualikan pewarnaan yang tidak spesifik. Bahagian kemudian diinkubasi dalam ruang kelembapan semalaman dengan antibodi utama (Jadual 1). Selepas mencuci dalam PBS, antibodi sekunder (Jadual 1) digunakan selama satu jam dan dibasuh dalam PBS semula. Kemudian, nukleus diwarnakan dengan 4060 -diamidino-2-phenylindole (DAPI) selama 2 minit, dicuci dalam PBS dan ditutup. Kami melakukan ujian prapenjerapan supaya setiap antibodi utama digunakan dengan peptida yang sepadan dan menggunakan gabungannya pada bahagian. Keputusan menunjukkan tiada pewarnaan antibodi. Di samping itu, kawalan dengan peninggalan antibodi primer untuk menentukan tahap pengikatan tidak spesifik antibodi sekunder telah dilakukan.
Untuk pewarnaan immunoperoxidase, arnab polyclonal anti-CASP3 (1:100 pencairan, ab13847, Abcam, Cambridge, UK) digunakan sebagai antibodi utama selama satu jam dalam ruang kelembapan selepas rawatan bahagian dengan 0.1 peratus H2O2. Selepas mencuci dalam PBS, pengesanan sekunder dilakukan menggunakan pautan dan streptavidin peroksidase, setiap satu selama fififteen minit (DakoCytomation, CA 93013 USA, LOT 03477) dan diaminobenzidine (Dako, CA 93013 USA, LOT 10051369), dikawal dengan teliti untuk mengelakkan pewarnaan latar belakang. Nukleus telah diwarnakan dengan hematoxylin, dibilas dalam air paip selama 10 minit, didehidrasi sebentar dalam siri larutan etanol menaik, dan tergelincir.
Penyediaan Tisu untuk Mikroskop Elektron Penghantaran (TEM)Selepas fiksasi dengan campuran 2 peratus PFA dan 2.5 peratus GA dalam 0.1 M PBS selama 2 jam, sampel telah dibasuh dengan PBS dan postfixed dalam larutan akueus 2 peratus osmium tetroksida selama 2 jam. Semua sampel telah dibasuh dua kali dalam PBS, dehidrasi dalam gred etanol menaik dan tertanam dalam Epon 812 (TAAB Laboratories Equipment, Reading, UK). Bahagian bersiri (ketebalan 70 nm) dipotong pada ultramikrotom Ultracut UCT (Leica Microsystems, Wetzlar, Jerman) dan diwarnai dengan 1 peratus uranil asetat dan plumbum sitrat.
Pemerolehan dan Analisis DataAnalisis dilakukan dengan mikroskop epiflluoresensi (Olympus BX51, Tokyo, Jepun) dilengkapi dengan kamera digital DP71 (Olympus), mikroskop elektron penghantaran JEM 1400 (JEOL, Tokyo, Jepun) beroperasi pada 80 kV dan difoto dengan cas JEOL- sistem kamera peranti berganding (CCD) (Teknik Mikroskopi Lanjutan, Danvers, MA, Amerika Syarikat) dan terakhir, mikroskop terang-fifield (BX40, Olympus, Tokyo, Jepun). Semua imej yang dianalisis telah diproses dengan perisian ImageJ dan Adobe Photoshop (Adobe, San Jose, CA, Amerika Syarikat). Setiap kumpulan yang diperiksa, kami menggunakan tiga hingga empat haiwan. Semua dikumpulbuah pinggangdipotong pada bahagian tebal 5 µm, dan maksimumbuah pinggang length determined by using these samples was reported. Mean proximal convoluted tubules (PCT), distal convoluted tubules (DCT) and glomeruli diameters were determined by averaging 100 structure diameters per analyzed sample. As nephron segments have irregular shapes, we took the largest diameter of every examined segment as representative. The staining intensity was semiquantitatively evaluated at four degrees: the absence of any reactivity (( ), mild reactivity (+), moderate reactivity (++), and strong reactivity (+++) (Table 2). The number of DAB1, reelin, NOTCH2, LC3B, and cleaved CASP3 immunoreactive cells was counted and expressed as a percentage of total cells. For each sample, we analyzed twenty PCT, DCT, and G at ×40 objective magnifification. We averaged the number of positive cells per group. Any level of nuclear, cytoplasmic, or membrane staining was regarded as positive. Three investigators analyzed the images independently. Interrater agreement was tested with interclass correlation analysis, which yielded a coeffificient >0.75, menunjukkan persetujuan yang sangat baik [27].
Analisis statistikUjian-t dua ekor telah dilakukan untuk menganalisis perbezaan diameter purata antara PCT, DCT dan G haiwan jenis liar dan yotari. Diameter ditunjukkan sebagai min ± sisihan piawai (SD). Tahap keertian telah ditetapkan pada p < 0.05.="" ujian="" anova="" dua="" hala="" diikuti="" dengan="" ujian="" perbandingan="" berganda="" tukey="" digunakan="" untuk="" mengkaji="" perbezaan="" peratusan="" sel="" positif="" antara="" pct,="" dct,="" dan="" glomeruli="" pada="" titik="" sepanjang="" masa.="" peratusan="" sel="" positif="" dinyatakan="" sebagai="" min="" ±="" ralat="" piawai="" min="" (sem).="" tahap="" keertian="" ditetapkan="" pada="" p="">< 0.05.="" analisis="" dilakukan="" dalam="" perisian="" graphpad="" (graphpad="" software,="" la="" jolla,="" ca,="">
Keputusan
Pewarnaan Hematoxylin-Eosin (H&E) dan Pengukuran Diameter Buah PinggangPewarnaan H&E bahagian midsagital padabuah pinggangpada semua titik masa yang diperiksa menyerlahkan yang kecilbuah pinggangfenotip tikus yotari berbanding jenis liar (Rajah 1a). Pada min 4Pbuah pinggangdiameter haiwan yotari adalah sekitar 55 µm daripada sekitar 75 µm. Di samping itu, perbezaan ini dapat dilihat pada titik masa kemudian disebabkan oleh pertumbuhan yang lebih perlahanbuah pinggangdalam yotari berbanding dengan pertumbuhan progresifbuah pinggangdalam haiwan jenis liar. Untuk menentukan sama ada pengurangan dalam keseluruhanbuah pinggangsaiz disebabkan oleh penurunan saiz segmen nefron, kami purata diameter PCT, DCT dan G setiap kumpulan. Sesungguhnya, terdapat pengurangan purata diameter G, PCT dan DCT dalam kumpulan yotari berbanding jenis liar (Rajah 1b, p < 0.05).="" selain="" itu,="" pewarnaan="" h&e="" mendedahkan="" korteks="" yang="" lebih="" nipis="">buah pingganglanjutan pelvis dalam haiwan yotari dan DCT diluaskan sedikit pada 14P. Struktur asas dan corak pematangan glomerular adalah sama dalam kedua-dua kumpulan haiwan yang diperiksa.
Analisis Histologi Deskriptif Berdasarkan Mikrofotograf TEMPada mikrofotograf yang diperolehi oleh TEM, glomeruli tikus jenis liar menunjukkan penampilan tipikal semua bahagian penghalang fifiltrasi, yang biasanya dibangunkan dan boleh dikenali (Rajah 2a). Podosit, proses dan pedikel kaki podosit, celah fifiltrasi, membran bawah tanah glomerular, dan lumen kapilari dengan endothelium terfenestrasi mudah dibezakan (Rajah 2a). Sebaliknya, dalam glomeruli tikus yotari, kerosakan podosit yang progresif dengan pembersihan proses kaki dan kekurangan celah fifiltrasi boleh diperhatikan (Rajah 2b-d). Perubahan ultrastruktur ini diperhatikan dalam semuabuah pinggangdiperiksa dan melibatkan sebahagian besar glomeruli yang diperiksa. Tiada keabnormalan yang diperhatikan dalam PCT atau DCT tikus yotari daripada haiwan jenis liar (Rajah 2e-h). Dalam PCT, antara muka sel ditakrifkan dengan buruk kerana ketidakteraturan membran sel dan interdigitasi sel dengan jiran mereka. Sitoplasma adalah banyak, mengandungi nukleus yang jelas, mitokondria yang memanjang, infoldings basal, dan banyak lubang tiub antara mikrovili, yang membentuk sempadan berus pada membran apikal. Pembesaran yang lebih tinggi mendedahkan permukaan apikal sel epitelium PCT yang mengandungi mikrovili panjang untuk membentuk sempadan berus dan persimpangan ketat antara sempadan sel luminal sel epitelium tiub jiran (Rajah 2e, f). Sebaliknya, permukaan apikal sel epitelium DCT mengandungi beberapa mikrovili pendek dan banyak vesikel (Rajah 2g, h).
Rajah 2. Mikrofotograf mikroskop elektron penghantaran (TEM) jenis liar dan yotaribuah pinggang.Glomeruli haiwan jenis liar (a) menunjukkan halangan fifiltrasi yang biasa dibangunkan dengan endothelium (E) fenestrated kapilari (C), membran bawah tanah (BM), podosit (P) dengan pedikel (PE), dan celah fifiltrasi (FS). ). Di dalambuah pingganghaiwan yotari, penyingkiran pedikel dan kekurangan celah penapisan boleh diperhatikan (asteris, b–d). Tiada keabnormalan diperhatikan dalam tubul berbelit proksimal (PCT) atau tubul berbelit distal (DCT) tikus yotari berbanding haiwan jenis liar (e-h). Dalam PCT, sitoplasma adalah banyak, mengandungi nukleus (N), mitokondria yang memanjang (M), infoldings basal (BI), dan banyak lubang tiub (TP) antara mikrovili, yang membentuk sempadan berus (BB) di membran apikal (e, f). Pembesaran yang lebih tinggi mendedahkan permukaan apikal sel epitelium PCT yang mengandungi mikrovili panjang untuk membentuk sempadan berus dan persimpangan ketat (TJ) antara sempadan sel luminal sel epitelium tiub jiran (e, f). Sebaliknya, permukaan apikal sel epitelium DCT mengandungi sedikit mikrovili pendek dan banyak vesikel (g, h). Bar skala dalam imej (a–d) dan inset (e–h) ialah 1 µm; bar skala dalam imej (e–h) ialah 2 µm.
Penyetempatan dan Kolokalisasi Reelin dan DAB1Reelin dinyatakan lemah dengan kereaktifan ringan hingga sederhana (Jadual 2) dalam glomeruli dan DCT semua haiwan yang diperiksa pada semua titik masa yang diperhatikan (p < 0.05,="" rajah="" 3a).="" hanya="" dalam="" pct="" tikus="" yotari="" adalah="" peratusan="" sel="" positif="" jauh="" lebih="" tinggi="" daripada="" haiwan="" jenis="" liar="" (p=""><0.05, rajah="" 3a).="" dalam="" sel="" glomerular,="" penyetempatan="" pewarnaan="" adalah="" perinuklear,="" manakala="" dalam="" pct="" dan="" dct,="" ia="" tersebar="" di="" seluruh="" sitoplasma="" (rajah="" a,="">
igure 4. Pewarnaan imunofluoresensi yotari selepas bersalinbuah pinggangdengan penanda reelin (a) dan pewarnaan imunofluoresensi berganda jenis liar selepas bersalinbuah pinggangdengan DAB1 dan penanda gelendong (b). ( a, b ) Pewarnaan DNA nuklear DAPI digabungkan dengan DAB1, dan imunofluoresensi reelin ditunjukkan secara selari (gabung). Titik masa yang diperhatikan ialah P4, P11, P14. Ungkapan penanda yang diperiksa dalam glomeruli (G), tubul berbelit proksimal (PCT) dan tubul berbelit distal (DCT) ditandakan dengan anak panah, manakala asterisk menunjukkan ekspresi reelin dalam matriks ekstraselular (a). Sisipan menunjukkan ungkapan yang paling menonjol dalam imej. Pewarnaan nuklear DAPI mendedahkan kolokalisasi DAB1 dan reelin yang lemah, kebanyakannya dalam DCT (anak panah). Bar skala ialah 20 µm dan merujuk kepada semua imej.
Hampir tiada kereaktifan imun DAB1 dalam glomeruli dan PCT haiwan jenis liar pada P4, manakala peratusan sel positif dengan kereaktifan ringan (Jadual 2) meningkat dengan ketara pada P11 dan P14 (p < 0.05,="" rajah="" 3b).="" dalam="" dct,="" dab1="" dinyatakan="" kebanyakannya="" pada="" bahagian="" apikal="" dan="" sisi="" membran="" sel="" (rajah="" 4b)="" dengan="" kereaktifan="" yang="" kuat="" (jadual="" 2).="" peratusan="" sel="" positif="" adalah="" jauh="" lebih="" tinggi="" daripada="" struktur="" sebelumnya,="" sekitar="" 60="" peratus="" (rajah="" 3b),="" terutamanya="" dalam="" makula="" densa="" (rajah="" 4b).="" hampir="" tiada="" kolokalisasi="" dab1="" dan="" reelin="" kecuali="" dalam="" dct="" haiwan="" jenis="" liar="" di="" p14="" (anak="" panah,="" rajah="" 4b).="" biomolekul="" 2021,="" 11,="" 609="" 8="" daripada="" 14="" rajah="" 4.="" pewarnaan="" imunofluoresensi="" bagi="" yotari="" selepas="">buah pinggangdengan penanda reelin (a) dan pewarnaan imunofluoresensi ganda jenis liar selepas bersalinbuah pinggangdengan DAB1 dan penanda gelendong (b). ( a, b ) Pewarnaan DNA nuklear DAPI digabungkan dengan DAB1, dan imunofluoresensi reelin ditunjukkan secara selari (gabung). Titik masa yang diperhatikan ialah P4, P11, P14. Ungkapan penanda yang diperiksa dalam glomeruli (G), tubul berbelit proksimal (PCT) dan tubul berbelit distal (DCT) ditandakan dengan anak panah, manakala asterisk menunjukkan ekspresi reelin dalam matriks ekstraselular (a). Sisipan menunjukkan ungkapan yang paling menonjol dalam imej. Pewarnaan nuklear DAPI mendedahkan kolokalisasi DAB1 dan reelin yang lemah, kebanyakannya dalam DCT (anak panah). Bar skala ialah 20 µm dan merujuk kepada semua imej. Hampir tiada kereaktifan imun DAB1 dalam glomeruli dan PCT haiwan jenis liar pada P4, manakala peratusan sel positif dengan kereaktifan ringan (Jadual 2) meningkat dengan ketara pada P11 dan P14 (p <0.05, rajah="" 3b).="" dalam="" dct,="" dab1="" dinyatakan="" kebanyakannya="" pada="" bahagian="" apikal="" dan="" sisi="" membran="" sel="" (rajah="" 4b)="" dengan="" kereaktifan="" yang="" kuat="" (jadual="" 2).="" peratusan="" sel="" positif="" adalah="" jauh="" lebih="" tinggi="" daripada="" struktur="" sebelumnya,="" sekitar="" 60="" peratus="" (rajah="" 3b),="" terutamanya="" dalam="" makula="" densa="" (rajah="" 4b).="" hampir="" tiada="" kolokalisasi="" dab1="" dan="" reelin="" kecuali="" dalam="" dct="" haiwan="" jenis="" liar="" pada="" p14="" (anak="" panah,="" rajah="">
Corak Ekspresi Ruang dan Temporal NOTCH2 dan LC3BPeratusan NOCH{{0}}sel positif adalah kurang daripada 20 peratus dalam glomeruli kedua-dua genotip haiwan pada semua titik masa yang diperhatikan. Hanya pada peratusan P14 sel positif adalah lebih tinggi dalam glomeruli haiwan yotari daripada haiwan jenis liar (p <0.05, rajah="" 3c).="" keamatan="" pewarnaan="" adalah="" ringan="" hingga="" sederhana="" (jadual="" 2),="" kebanyakannya="" terletak="" secara="" perinuklear="" (rajah="" 5a-f).="" dalam="" pct="" dan="" dct="" kedua-dua="" genotip="" haiwan="" peratusan="" sel="" positif="" meningkat="" mengikut="" masa.="" pada="" p14,="" peratusan="" sel="" positif="" adalah="" lebih="" tinggi="" dalam="" pct="" dan="" dct="" haiwan="" yotari="" daripada="" pct="" dan="" dct="" haiwan="" jenis="" liar="" (p=""><0.05, rajah="" 3c).="" keamatan="" isyarat="" pada="" semua="" titik="" masa="" yang="" diperhatikan="" adalah="" ringan="" hingga="" sederhana="" (jadual="" 2)="" dan="" bertaburan="" di="" seluruh="" sitoplasma="" (rajah="" 5a-f).="" rajah="" 5.="" pewarnaan="" imunofluoresensi="" jenis="" liar="" selepas="" bersalin="" dan="">buah pinggangdengan penanda NOTCH2 dan LC3B dan pewarnaan imunoperoksidase dengan penanda caspase3 (CASP3) terbelah. (a-f) Pewarnaan DNA nuklear DAPI digabungkan dengan NOTCH2 dan LC3B. Titik masa yang diperhatikan ialah P4, P11, P14. Ungkapan penanda NOTCH2 dan LC3B dalam glomeruli (G), tubul berbelit proksimal (PCT) dan tubul berbelit distal (DCT) ditandakan dengan anak panah. Kereaktifan LC3B yang sangat kuat boleh diperhatikan dalam kapsul Bowman glomeruli yang mereput (asterisk, e). Sisipan menunjukkan ungkapan yang paling menonjol dalam imej. CASP3 kurang dinyatakan dalam semua titik masa yang diperhatikan. Satu-satunya ungkapan penting adalah dalam glomeruli tikus yotari pada P14 (anak panah). Bar skala ialah 20 µm dan merujuk kepada semua imej. Biomolekul 2021, 11, 609 9 daripada 14 3.4. Corak Ungkapan Ruang dan Temporal NOTCH2 dan LC3B Peratusan sel positif NOTCH2-adalah kurang daripada 20 peratus dalam glomeruli kedua-dua genotip haiwan pada semua titik masa yang diperhatikan. Hanya pada peratusan P14 sel positif adalah ketara lebih tinggi dalam glomeruli haiwan yotari daripada haiwan jenis liar (p <0.05, rajah="" 3c).="" keamatan="" pewarnaan="" adalah="" ringan="" hingga="" sederhana="" (jadual="" 2),="" kebanyakannya="" terletak="" secara="" perinuklear="" (rajah="" 5a-f).="" dalam="" pct="" dan="" dct="" kedua-dua="" genotip="" haiwan="" peratusan="" sel="" positif="" meningkat="" mengikut="" masa.="" pada="" p14,="" peratusan="" sel="" positif="" adalah="" lebih="" tinggi="" dalam="" pct="" dan="" dct="" haiwan="" yotari="" daripada="" pct="" dan="" dct="" haiwan="" jenis="" liar="" (p=""><0.05, rajah="" 3c).="" keamatan="" isyarat="" pada="" semua="" titik="" masa="" yang="" diperhatikan="" adalah="" ringan="" hingga="" sederhana="" (jadual="" 2)="" dan="" bertaburan="" di="" seluruh="" sitoplasma="" (rajah="">
Rajah 5. Pewarnaan imunofluoresensi jenis liar selepas bersalin dan yotaribuah pinggangdengan penanda NOTCH2 dan LC3B dan pewarnaan imunoperoksidase dengan penanda caspase3 (CASP3) terbelah. (a-f) Pewarnaan DNA nuklear DAPI digabungkan dengan NOTCH2 dan LC3B. Titik masa yang diperhatikan ialah P4, P11, P14. Ungkapan penanda NOTCH2 dan LC3B dalam glomeruli (G), tubul berbelit proksimal (PCT) dan tubul berbelit distal (DCT) ditandakan dengan anak panah. Kereaktifan LC3B yang sangat kuat boleh diperhatikan dalam kapsul Bowman glomeruli yang mereput (asterisk, e). Sisipan menunjukkan ungkapan yang paling menonjol dalam imej. CASP3 kurang dinyatakan dalam semua titik masa yang diperhatikan. Satu-satunya ungkapan yang penting adalah dalam glomeruli tikus yotari pada P14 (anak panah). Bar skala ialah 20 µm dan merujuk kepada semua imej.
Dalam glomeruli dan DCT kedua-dua genotip haiwan, peratusan sel positif LC3B meningkat mengikut masa (p < 0.05,="" rajah="" 3d).="" pada="" p11="" dan="" p14,="" peratusan="" sel="" positif="" adalah="" lebih="" tinggi="" dengan="" ketara="" dalam="" glomeruli="" haiwan="" yotari="" daripada="" glomeruli="" haiwan="" jenis="" liar="" (p="">< 0.05,="" rajah="" 3d).="" dalam="" glomeruli="" haiwan="" yotari,="" keamatan="" pewarnaan="" kebanyakannya="" sederhana="" hingga="" kuat="" (jadual="" 2)="" yang="" terletak="" di="" ruang="" perinuklear="" dan="" nuklear="" (rajah="" 5a-f),="" pada="" semua="" titik="" masa="" yang="" diperhatikan,="" manakala="" dalam="" glomeruli="" tikus="" jenis="" liar,="" keamatannya="" adalah="" kebanyakannya="" sederhana="" (jadual="" 2).="" pct="" yotari="" dan="" haiwan="" jenis="" liar="" mengandungi="" sekitar="" 20="" peratus="" sel="" positif="" pada="" semua="" titik="" masa="" yang="" diperhatikan="" (p=""><0.05, rajah="">
Ungkapan CASP{0}} yang dipotongHampir tiada ungkapan CASP yang diaktifkan-3 dalambuah pingganghaiwan jenis liar pada semua titik masa yang diperhatikan. Dalam PCT dan DCT tikus yotari, beberapa sel individu adalah CASP-3-positif (Rajah 3e). Hanya dalam glomeruli buah pinggang yotari pada P14 (Rajah 5e), peratusan sel positif meningkat dengan ketara berbanding denganbuah pinggangtikus jenis liar (p < 0.05, Rajah 3e).
Perbincangan
buah pinggangmorfogenesis dan pembangunan adalah proses kompleks yang diselaraskan dengan tepat melalui interaksi sebilangan besar gen. Anomali kongenital daripadabuah pinggangdan saluran kencing (CAKUT) adalah kecacatan kelahiran yang paling biasa yang membentuk 23 peratus daripada semua kecacatan tersebut dan mewakili punca utama peringkat akhir.penyakit buah pinggangpada kanak-kanak [28,29]. Gangguan gen tunggal mungkin merupakan sumber utama CAKUT, dan sehingga kini, mutasi dalam lebih daripada 20 gen telah dikenal pasti sebagai punca CAKUT [30]. Oleh kerana kerja kami sebelum ini menunjukkan ekspresi hebat DAB1 semasa manusia janin normalbuah pinggangpembangunan [9], kami mengandaikan bahawa DAB1 mungkin memainkan peranan penting semasa mamaliabuah pinggangpembangunan. Untuk membuktikan hipotesis kami, kami menyiasatbuah pinggangmorfologi dan corak ekspresi reelin, NOTCH2, LC3B, dan protein CASP3 diaktifkan dalam tikus kalah mati Dab1.
CISTANCHE AKAN MEMPERBAIKI SAKIT BUAH PINGGANG/PINGGANG
Membelah melalui tikus yotaribuah pinggangmendedahkan korteks yang lebih nipis dan min yang jauh lebih kecilbuah pinggangdan diameter PCT, DCT dan G berbanding haiwan jenis liar. Penurunan dalambuah pinggangsaiz yang disebabkan oleh endowmen nefron yang tidak mencukupi dikenali sebagaibuah pingganghipoplasia, salah satu gangguan CAKUT yang paling biasa, yang memberi predisposisi hipertensi onset dewasa dan penyakit buah pinggang kronik [31]. Di samping itu, gambar mikro yang dirakam dengan TEM mendedahkan bahawa tikus yotari mempamerkan kerosakan podosit yang ketara dengan penyingkiran proses kaki dan kekurangan celah fifiltrasi. Selepas kecederaan, podosit menjalani proses effacement di mana mereka kehilangan strukturnya, membawa kepada pengurangan dalam fungsi penghalang fifiltrasi mereka [32]. Semua bentuk sindrom nefrotik, serta glomerulosklerosis segmental fokus (FSGS), dicirikan oleh kecacatan dalam struktur atau fungsi podosit [33].
Kajian semasa kami menunjukkan ekspresi tertinggi DAB1 pada bahagian apikal dan sisi membran sel DCT, manakala REELIN kebanyakannya bertaburan di seluruh sitoplasma PCT. Pada titik masa yang disiasat, tiada perubahan morfologi diperhatikan dalam tubuli tikus yotari, tetapi siasatan lanjut diperlukan untuk menjelaskan peranan DAB1 dalam petak tubulointerstitial. Terdapat kolokalisasi sekali-sekala protein DAB1 dan REELIN, kebanyakannya dalam DCT. Findings ini mengikuti kerja kami sebelum ini mengenai ekspresi kedua-dua protein ini semasa janin manusiabuah pinggangpembangunan [9]. Ini mungkin mencadangkan bahawa DAB1 dan reelin mempunyai peranan yang sama dalam manusia dan tetikusbuah pinggangdengan mengaktifkan beberapa laluan hiliran, seperti lata isyarat Crk, MAPK dan PI3K/Akt/mTOR [34–36]. Data kami juga mendedahkan peningkatan ekspresi reelin dalam glomeruli tikus yotari. Menariknya, kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa fosforilasi DAB1 dan peningkatan ekspresi reelin dalam glomeruli disertai dengan hipertensi, proteinuria, dan kecederaan podosit dalam tikus Ang II-infused [10].
Di samping itu, pewarnaan imunofluoresensi mendedahkan peningkatan ekspresi reseptor NOTCH2 dalam glomeruli tikus P14 yotari. Telah diketahui umum bahawa ekspresi NOTCH2 dikurangkan apabila kematangan nefron dicapai, kecuali dalam keadaankecederaan buah pinggang,seperti nefropati diabetik dan FSGS [15,37]. Tikus dengan sindrom nefrotik yang disebabkan oleh Adriamycin juga menunjukkan peningkatan ekspresi NOTCH2 yang diaktifkan, yang memperbaiki fifibrosis [38]. Pada titik masa yang disiasat, kami tidak melihat peningkatan fifibrosis, tetapi ia masih untuk menjelaskan peranan tepat NOTCH2 yang dinyatakan dalam yotari selepas bersalin.buah pinggang.Pemerhatian lanjut tentang sama ada perubahan fibrotik berlaku pada peringkat kemudian adalah perlu. Walau bagaimanapun, sudah ada beberapa penemuan yang mencadangkan kesan jangka pendek peningkatan pengaktifan NOTCH2 dikaitkan dengan manfaat kelangsungan hidup yang kuat untuk podosit yang cedera, yang hilang dalam model jangka panjang, seperti nefropati diabetik [39].
Ekspresi LC3B yang lebih tinggi dalam glomeruli tikus P11 dan P14 yotari mungkin mencerminkan pengumpulan autofagosom dalam podosit. Untuk menunjukkan dengan jelas bahawa autophagy telah dipercepatkan. Ia adalah perlu untuk menganalisis nisbah ekspresi protein LC3-II dan LC3-I. Dalam keadaan biasa, autophagy diperlukan untuk normalfungsi buah pinggang[40], terutamanya dalam podosit. Kerana kapasiti terhad untuk pembahagian dan penggantian sel, mereka mempamerkan tahap autophagy asas yang tinggi [41]. Walaupun terdapat gangguan ini, peningkatan dalam ekspresi LC3B telah dilaporkan dalam beberapa penyakit glomerular [42-44], terutamanya berkaitan dengan penyingkiran proses kaki dan perkembangan sindrom nefrotik, seperti yang dilihat pada tikus kalah mati bersyarat reseptor prorenin [45,46]. Semua kajian ini mencadangkan peranan perlindungan autophagy yang dipertingkatkan dalam keadaan patologi, disokong lagi oleh penemuan nefropati yang disebabkan oleh Adriamycin, di mana autophagy diaktifkan untuk melindungi daripada kecederaan podocyte [43], serta dalam penyakit glomerular yang bergantung kepada usia di mana ia melambatkan. kemerosotan fungsi progresiffungsi buah pinggang[40]. Analisis manusiabuah pinggangbiopsi juga menunjukkan bukti peningkatan autophagy berkaitan dengan pembersihan proses kaki dalam beberapa penyakit glomerular, termasuk sindrom nefrotik perubahan minimum (MCNS), yang merupakan salah satu punca paling biasa sindrom nefrotik idiopatik [19]. Dalam keadaan nefropati diabetes dan akut yang disebabkan oleh lipopolysaccharidekecederaan buah pinggang,meningkatkan autophagy dengan beberapa terapeutik melalui perencatan laluan PI3K / AKT / mTOR memperbaiki fungsi buah pinggang [47, 48]. Semua penemuan ini membayangkan bahawa autophagy mempunyai peranan sitoprotektif yang sangat diperlukan untuk penyesuaian tekanan dalamkecederaan buah pinggang, dan modulasinya mungkin merupakan strategi terapeutik yang menjanjikan, walaupun, dalam beberapa keadaan, autophagy juga boleh merosakkan dan berkembang menjadi kematian sel.
CISTANCHE AKAN MEMPERBAIKI KEGAGALAN BUAH PINGGANG/BUAH PINGGANG
Kecuali untuk ketinggian dalam autophagy, peningkatan tahap apoptosis juga boleh diperhatikan dalam glomeruli tikus P14 yotari. Autophagy biasanya menghalang apoptosis, tetapi di bawah keadaan patologi tertentu, ia juga boleh memberi kesan yang bertentangan terhadap kelangsungan hidup sel dengan meningkatkan dan menggalakkan apoptosis [42]. Selepas kelahiran, apoptosis dalambuah pinggangsangat berkurangan, kecuali dalam keadaankecederaan buah pinggang,seperti sindrom nefrotik idiopatik yang menyumbang kepada perkembangan penyakit [23]. punca novel berpotensi anomali kongenital resesif autosomalbuah pinggangdan saluran kencing. Walau bagaimanapun, peranan utama DAB1 semasabuah pinggangpembangunan masih tidak jelas. Di samping itu, tikus ini menunjukkan keabnormalan proses kaki dan peningkatan tahap reelin, NOTCH2, LC3B dan protein CASP3 yang dibelah dalam glomeruli yang boleh membawa kepada kecederaan glomerular, seperti sindrom nefrotik, yang berkaitan dengan hipoplasia, mungkin menjadi punca kematian yang berpotensi. haiwan ini semasa tempoh menyapih. Untuk mengesahkan hipotesis ini, adalah perlu untuk memberikan maklumat tambahan mengenai tekanan darah dan parameter makmal klinik lain, seperti tahap kreatinin serum, albumin dan protein.
