Protokol Pembersihan dan Pembengkakan yang Pantas Dan Mudah Untuk Pengimejan In-situ 3D Buah Pinggang Merentasi Skala
Mar 23, 2022
Dalam beberapa tahun kebelakangan ini, banyak protokol mikroskop cahaya telah diterbitkan untuk visualisasi struktur skala nano dalambuah pinggang.Protokol ini memberikan penyelidik alat baharu untuk menilai kedua-dua anatomi proses kaki dan effacement, serta pengagihan protein dalam proses kaki, diafragma celah, dan dalam membran bawah tanah glomerular. Walau bagaimanapun, protokol ini sama ada melibatkan penggunaan mikroskop resolusi super rumit yang berbeza atau protokol penyediaan sampel yang panjang. Di sini, kami mempersembahkan prosedur lima jam yang cepat dan mudah untuk visualisasi tiga dimensibuah pinggangmorfologi pada semua skala panjang. Protokol ini menggabungkan konsep pembersihan optik dan pengembangan tisu untuk menghasilkan pembengkakan ringan, mencukupi untuk menyelesaikan struktur skala nano menggunakan mikroskop confocal konvensional. Kami menunjukkan bahawa protokol boleh digunakan untuk menggambarkan pelbagai jenis ciri patologi dalam kedua-dua tetikus dan manusiabuah pinggang. Oleh itu, protokol kami yang cepat dan mudah boleh memberi manfaat untuk penilaian mikroskopik konvensionalbuah pinggangintegriti tisu dalam penyelidikan dan mungkin dalam rutin klinikal masa hadapan.
CISTANCHE AKAN MENINGKATKAN FUNGSI BUAH PINGGANG/BUAH PINGGANG
Banyak protokol optik untuk pengimejan struktur skala nano dalambuah pinggangtelah dibentangkan dalam beberapa tahun kebelakangan ini.I- Kuasa teknik baharu ini sebagai alat untuk mengukur anatomi dan patologi halangan penapisan ditunjukkan dalam penerbitan baru-baru ini daripada kumpulan kami dan lain-lain.5, peratus ,10Walaupun berkuasa, semua protokol optik ini memerlukan penggunaan mikroskopi tanpa had pembelauan lanjutan atau melibatkan pengenalan kimia polimer kompleks ke dalam sampel untuk menyayangi dan/atau mengembangkannya secara fizikal. Kebanyakan protokol juga memakan masa dan memerlukan sejumlah besar kerja tangan. Lapisan kerumitan tambahan ini mungkin yang menghalang kaedah baharu ini daripada digunakan secara rutin oleh kedua-dua penyelidik dan ahli patologi klinikal. Tambahan pula, kebanyakan protokol tidak mempunyai akses kepada pengimejan 3-dimensi (3D) proses kaki (FP) yang mendalam melebihi 5-15 um secara mendalam.-1,7,8 Oleh itu, kami berhasrat untuk membangunkan protokol semua optik yang dipermudahkan secara drastik dan pantas yang membersihkan dan membengkak secara spatialbuah pinggangsampel tisu secukupnya untuk membolehkan analisis resolusi tinggi 3D in situ bagibuah pingganganatomi dan patologi menggunakan skop mikro terhad difraksi konvensional yang terdapat di hampir semua institusi sains hayat dan patologi.Penyederhanaan protokol sebelum ini telah menunjukkan bahawa pengenalan polimer akrilamida ke dalam sampel tetap paraformaldehid boleh ditinggalkan sepenuhnya sementara masih mengekalkan integriti tisu pada pelepasan sodium dodecyl sulfate(SDS). Satu lagi kajian telah menunjukkan bahawa sampel tisu boleh dikembangkan dengan lebih daripada faktor 2 menggunakan protokol bebas polimer ringkas berdasarkan rendaman dalam larutan akueus yang berbeza.2 Oleh itu, kami mengeluarkan infusi akrilamida daripada protokol diterbitkan kami yang lebih membosankan dan kompleks² dan menukar sampel medium benam untuk membenarkan pembengkakan ringan (1.3-lipatan linear).buah pinggangsampel tisu. Dengan turut mengoptimumkan parameter pengimejan, kami mencapai resolusi berkesan yang cukup tinggi untuk visualisasi 3D podocyte FPs dan membran bawah tanah glomerular(GBM) menggunakan mikroskop confocal konvensional.
Kata kunci:glomerulosklerosis segmental fokus; nefropati IgA; podosit; biopsi buah pinggang; patologi buah pinggang; buah pinggang
KEPUTUSAN
Pembersihan optik dan pembengkakan ringan pada tisu buah pinggangProtokol dearing/bengkak yang mudah digambarkan secara skematik dalam Rajah la. Ambil perhatian bahawa langkah penyahcairan SDS telah ditambahkan bukan terutamanya untuk ketelusan optik, tetapi sebaliknya untuk memastikan pembengkakan sampel yang mencukupi.7 Tambahan pula, apabila menghilangkan penyahcairan, kualiti pewarnaan adalah lemah (Rajah Tambahan SlA). Kami menunjukkan bahawa delipidasi pesat pada 70 darjah selama 1 jam menghasilkan keputusan yang baik tanpa degradasi sampel yang berlaku pada suhu yang lebih tinggi (Tambahan Rajah S1B). Seperti yang dilaporkan oleh Murakami et al., urea dan molekul seperti urea boleh membengkak dengan berkesan sampel tisu, mengakibatkan peningkatan resolusi spatial yang berkesan. Oleh itu, kami menambah 4 M urea dalam campuran dengan 80 peratus (berat/berat) fruktosa (digelar BUAH), yang menghasilkan faktor pembengkakan linear -1.3(Rajah lb).
Untuk memendekkan masa pelabelan, kami menggunakan antibodi primer terkonjugasi pewarna. Pada mulanya, apabila menggunakan antibodi nefrin konjugasi pewarna dalam penimbal pewarnaan standard (garam penampan fosfat dengan Tween 20), kecekapan isyarat dan pelabelan tidak cukup tinggi untuk menggariskan FP individu. Walau bagaimanapun, dengan menggunakan penampan pewarnaan alternatif, HEPES-TSC, kualiti pewarnaan meningkat ke tahap yang memuaskan (Rajah Tambahan S1C). Berbanding dengan protokol yang diterbitkan sebelum ini menggunakan mikroskop konvensional, protokol 5-jam kami yang pantas dan ringkas mengatasinya pada beberapa parameter penting (Rajah lc-f). Protokol yang dibentangkan oleh Pullman et al.' adalah lebih pantas sedikit secara keseluruhan tetapi mempunyai kelemahan yang memerlukan mikroskop pencahayaan berstruktur resolusi super dan menggunakan cryosections nipis, menghalang akses kepada kedalaman pengimejan yang besar. Nota, protokol kami adalah kurang kompleks daripada pembenaman parafin standard atau cryosectioning apabila semua parameter yang dinilai dipertimbangkan.
CISTANCHE AKAN MEMPERBAIKI KEGAGALAN BUAH PINGGANG/BUAH PINGGANG
Pengoptimuman dan pengesahan protokol kami untuk menyelesaikan proses kakiOleh kerana protokol kami hanya memberikan faktor pembengkakan sederhana sebanyak 1.3, parameter pengimejan confocal perlu dioptimumkan untuk mencapai kuasa penyelesaian yang mencukupi untuk pengimejan FP. tetikusbuah pinggangsampel telah dirawat mengikut protokol dan diwarnakan untuk nefrin menggunakan fluorofor yang berbeza. Peleraian mikroskop confocal bergantung pada kedua-dua saiz lubang jarum dan panjang gelombang cahaya pengujaan/pancaran.15 Oleh itu, kami menggunakan diameter lubang jarum yang lebih kecil iaitu 0.3 Unit lapang (AU)bersama-sama dengan pemancar hijau pewarna, Alexa Fluor 488, dan dengan cara ini mencapai resolusi yang mencukupi untuk menyelesaikan FP dalam tetikus jenis liar(WT)buah pinggang(Rajah 2a). Oleh itu, apabila FP tetikus ingin divisualisasikan, fluorofor dengan panjang gelombang pengujaan maksimum 488 nm digunakan. Di bawah keadaan pengimejan yang dioptimumkan ini, kami dapat memvisualisasikan keseluruhan glomeruli tetikus dalam 3D pada resolusi berkesan -115 nm, cukup baik untuk menyelesaikan FP individu (Rajah 2b-e). Selain itu, kami menunjukkan bahawa kedalaman penembusan antibodi sekurang-kurangnya 70 μm dicapai dengan pelabelan pantas （Rajah Tambahan S2A-C). Menggunakan objektif gliserol dengan kolar pembetulan, menyediakan akses kepada kedalaman Z yang lebih besar daripada mana-mana protokol yang dibangunkan sebelum ini, kecualiprotokol pengurangan pelepasan/dirangsang. Oleh kerana resolusi paksi mikroskop confocal adalah kira-kira 3 kali lebih teruk daripada resolusi sisi, kapilari harus diorientasikan pada satah xy untuk menyelesaikan FP secara optimum. Kami menunjukkan bahawa dengan protokol kami, kami boleh menemui banyak (sehingga 25) kawasan untuk pengimejan dalam setiap glomerulus (Rajah Tambahan S2D), membolehkan kami mengumpul sejumlah besar data untuk turut mengesan variasi halus dalam struktur halangan penyusupan. Ini menunjukkan kepentingan mempunyai akses kepada dimensi kedalaman apabila melakukan analisis kuantitatif tinggi tahap kesihatan glomerular. Yang penting, kami juga mengesahkan protokol untuk menyelesaikan FP dalam bahan pesakit manusia (Rajah 2f dan g), yang kurang mencabar berbanding dengan tikus, disebabkan oleh dimensi FP manusia yang lebih besar. Selain itu, menggunakan lektin agglutinin kuman gandum (WGA) dengan pertalian terhadap glikokaliks FP, kami juga dapat menyelesaikan FP secara keratan rentas dalam kedua-dua sampel tetikus dan manusia (Rajah 2h dan i). Di samping itu, kami mendapat nefrin, dengan penyetempatan yang dijangkakan dalam membran celah, menunjukkan bahawa kami boleh mendapatkan data mengenai penyetempatan protein sebagai tambahan kepada maklumat morfologi.
Patologi halangan penapisan dalam sampel tetikusSeperti yang dilaporkan sebelum ini,'-,5,6,9,10 en face FP pengimejan diafragma celah boleh digunakan dengan mudah untuk memvisualisasikan dan mengukur penyingkiran FP. Kami mengesahkan bahawa pendekatan ini juga boleh digunakan dengan protokol baharu kami menggunakan model tetikus yang diterbitkan baru-baru ini untuk glomerulosklerosis segmental fokus (FSGS) (Rajah 3). Dengan pewarnaan untuk nefrin, corak diafragma celah boleh divisualisasikan dalam 3 dimensi dalam keseluruhan glomeruli WT dan tikus bermutasi (Rajah 3a dan b). Seperti yang dilaporkan sebelum ini,5, panjang celah diafragma setiap kawasan boleh dikira secara separa automatik, dan analisis ini memberikan hasil yang konsisten dengan apa yang telah diterbitkan sebelum ini untuk garis tetikus ini'(Rajah 3c). Tambahan pula, kapilari glomerular diimej dalam keratan rentas yang menunjukkan kedua-dua penyingkiran FP serta perubahan kepada GBM (Rajah 3d-f); lihat Kaedah Tambahan dan Rajah S3 untuk butiran ukuran GBM.
Patologi halangan penapisan dalam sampel manusiaUntuk mengesahkan lagi protokol kami untuk kemungkinan penggunaan klinikal, kami menggunakannya pada tisu manusia daripada pesakit yang didiagnosis dengan pelbagai jenispenyakit buah pinggang. Dua pesakit dengan sindrom nefrotik kongenital, sama ada dengan mutasi homozigot dalam gen NPHS1 (pengekodan untuk nefrin), atau mutasi trans-berkaitan dalam gen TRPC6 dan NPHS2 (pengekodan untuk saluran TRPC6 dan podocin). Kami juga menganalisis 2 pesakit yang didiagnosis dengan FSGS dan penyakit perubahan minimum. Kita boleh menggambarkan dan mengukur ciri khaspenyakit buah pinggang, seperti penyingkiran FP, serta perubahan GBM (Rajah 4). Imej boleh diperolehi kedua-dua muka (Rajah 4a-e) dan dari sisi (Rajah 4g-k). Selain itu, kami memerhatikan jangkaan ketiadaan nefrin dalam diafragma celah pesakit dengan mutasi NPHS1 (Rajah 4b dan h). Bagi sampel tetikus
(Rajah 3), data pengimejan boleh dinilai secara kuantitatif (Rajah 4f dan l dan Rajah Tambahan S4A dan B).
Nota, penebalan GBM ringan yang tidak dijangka diperhatikan pada pesakit yang didiagnosis berbanding dengan kawalan. Kawalan nefrektomibuah pinggangdalam Rajah 4 diambil daripada pesakit yang lebih tua, manakala semua sampel lain adalah daripada bayi atau kanak-kanak. Oleh kerana ketebalan GBM meningkat dengan usia (Rajah Tambahan S5A-E), penebalan yang lebih ketara mungkin akan diperhatikan jika dibandingkan dengan pesakit kawalan yang dipadankan dengan umur. Kami juga mengesahkan bahawa tiada artifak bengkak bergantung kepada umur diperkenalkan oleh protokol kami (Rajah Tambahan S5F-H), dan juga bahawa strategi pengukuran GBM yang berbeza menghasilkan keputusan yang sama (Rajah Tambahan S5I dan D).
Patologi berskala besar dalam tetikus dan sampel manusiaKerana bukan sahaja skala penghalang penapisan, tetapi juga perubahan histologi kepadabuah pinggangmorfologi, adalah minat yang tinggi kepada kedua-dua penyelidik dan doktor, kami menyiasat kemungkinan menggunakan protokol kami untuk menilai morfologi berskala besar melalui analisis histologi berasaskan pendarfluor. Kami menunjukkan bahawa menggunakan objektif pembesaran yang lebih rendah, kami dapat mengesan patologi berskala besar dan perbezaan dalam ekspresi protein dalam kedua-dua sampel manusia (Tambahan Rajah S6) dan sampel tetikus (Tambahan Rajah S7).
Menggambarkan perubahan patologi pada pesakit yang didiagnosis dengan nefropati FSGS dan IgAUntuk memberi contoh lagi kemungkinan penggunaan protokol dalam sampel pesakit, kami menyiasat sama ada kami boleh mengesan ciri patologi FSGS daripada jenis selular. Kami dapat memvisualisasikan kebanyakan ciri patologi yang disebut dalam kenyataan daripada ahli patologi, termasuk stenosis total/segmental fokus, atrofi tiub, dan hiperselulariti endothelial dalam kapilari glomerular berbanding dengan kaedah standard emas sekarang (Rajah 5a-j). Perbandingan bersebelahan kualitatif dan kuantitatif dengan mikroskop elektron (EM) menunjukkan keputusan yang sama menggunakan kedua-dua kaedah (Rajah 5k dan l dan Rajah Tambahan S4; lihat Kaedah Tambahan untuk perbincangan tentang ukuran lebar FP).
CISTANCHE AKAN MEMPERBAIKI SAKIT BUAH PINGGANG/PINGGANG
Kami juga menggunakan protokol pada spesimen biopsi daripada pesakit yang didiagnosis dengan nefropati IgA (IgAN) (Rajah 6) dan dapat mengesahkan visualisasi banyak ciri diagnostik. Tiada patologi teruk terbukti dalam halangan penapisan (Rajah 6a dan b), dan analisis perbandingan tidak menghasilkan perbezaan yang jelas antara EM dan protokol kami (Rajah 6c dan d). Seterusnya, histologi buah pinggang pinjaman dinilai dengan kedua-dua histologi standard (Rajah 6e) dan "histologi pendarfluor" (Rajah 6f). Kita boleh memvisualisasikan perubahan (atau kekurangan perubahan) yang disebut dalam kenyataan daripada ahli patologi, seperti penyusupan interstisial sel (Rajah 6g dan h), kapilari glomerular normal (Rajah 6i), dan pengembangan mesangial/hiperselulariti (Rajah 6j). Imunostaining menggunakan antibodi IgA dengan jelas mendedahkan deposit kedua-duanya pada skala besar (Rajah 6k dan l) dan secara terperinci (Rajah 6m) dengan corak yang setara dengan yang dilihat pada imunofluoresensi standard (Rajah 6n dan o). Akhirnya, pengimejan FP menunjukkan penyingkiran ringan separa (Rajah 6p dan q). Ciri-ciri patologi yang kami dapat mengesan dengan protokol kami diringkaskan dalam Jadual Tambahan S1.
PERBINCANGAN
Di sini kami membentangkan protokol untuk visualisasi pemprosesan tinggi bagibuah pinggangstruktur pada semua skala panjang yang lebih cepat dan lebih mudah daripada protokol yang diterbitkan sebelum ini untuk analisis FP dan pengimejan halangan penapisan glomerular dalambuah pinggang, Kami menunjukkan bahawa resolusi yang kami capai adalah cukup tinggi untuk membuat kesimpulan tentang patologi dalam halangan penapisan menggunakan mikroskop confocal mudah, alat standard yang sudah tersedia di kebanyakan kemudahan penyelidikan dan makmal patologi. Keupayaan 3D protokol adalah penting semasa melaksanakan pengimejan FP kerana volum pengimejan yang besar boleh diakses, membolehkan pengecaman dan penyaringan kawasan yang sesuai bagi sampel untuk analisis kuantitatif.
Penemuan penting kajian kami ialah protokol kami bukan sahaja berfungsi sebagai pelengkap dan berfaedah berbanding dengan protokol standard yang kini digunakan untuk analisis standardbuah pinggangtisu. Ia juga boleh menggabungkan aliran kerja ini menjadi satu protokol, dengan penjimatan ketara dari segi waktu kerja dan bahan/reagen/peralatan yang diperlukan. Walau bagaimanapun, memandangkan analisis berdasarkan antibodi pada sebahagian besarnya, kos pelabelan reagen adalah agak tinggi (sekitar 20e setiap sampel), yang benar juga untuk protokol berasaskan pendarfluor lain yang dibentangkan dalam artikel ini (termasuk imunofluoresensi biasa).
Dalam versi terpantas protokol, kami menggunakan antibodi primer terkonjugasi pewarna yang menghasilkan kualiti pewarnaan yang mencukupi untuk menyelesaikan FP. Walau bagaimanapun, isyarat yang terhasil sentiasa lebih rendah berbanding dengan isyarat 2-langkah primer/sekunder. Selain itu, antibodi terkonjugasi utama yang digunakan dalam kajian ini tidak tersedia secara komersial dan mesti dikonjugasikan secara dalaman. Oleh itu, untuk sesetengah aplikasi, 2-protokol pewarnaan primer/sekunder langkah mungkin lebih baik, menambah 2 jam pada protokol. Kajian terbaru telah menggunakan mikroskop Airyscan padabuah pinggangtisu, yang menggunakan tetapan lubang jarum berubah-ubah pada pengesan tatasusunan kamera kecil dalam kombinasi dengan pemprosesan imej penyahkonvolusian dan penugasan semula isyarat.7,18 Dalam kajian ini, kami menunjukkan bahawa dengan pembengkakan ringan dan keadaan pewarnaan dan pengimejan yang hebat, pengimejan confocal konvensional dengan
Lubang jarum tertutup menyediakan resolusi yang mencukupi tanpa memerlukan pemprosesan pasca matematik imej. Dalam kerja ini, kami membentangkan data perbandingan untuk protokol dan kaedah standard kami untuk penilaian patologi dalam sampel pesakit. Walau bagaimanapun, analisis telah dijalankan ke atas sebilangan kecil pesakit dan kajian lanjut adalah penting untuk menyiasat sama ada protokol boleh digunakan untuk mengesan kebanyakan parameter patologi yang terdapat dalam jenis lain.penyakit buah pinggangjuga. Untuk mencapai matlamat ini, usaha kerjasama tertumpu yang melibatkan kedua-dua pakar patologi, pakar penyediaan sampel dan pakar pengimejan mesti dimulakan. Pengesahan menyeluruh ini tidak berada dalam skop kajian bukti prinsip ini, di mana matlamatnya adalah untuk membangunkan protokol optik yang pantas untuk pengimejan resolusi tinggi bagibuah pinggang.Ia juga harus ditekankan bahawa resolusi protokol kami adalah jauh daripada resolusi EM dan tidak dapat menyelesaikan deposit fibrillary, sebagai contoh, dan untuk beberapa kes, EM masih diperlukan untuk diagnosis yang tepat.
Dalam kajian ini, kami menggunakan ukuran panjang mentah tanpa membetulkan artifak pembahagian yang timbul daripada pembahagian optik atau fizikal bukan nonorthogon bagi struktur yang diukur (GBM atau FP). Terdapat 2 sebab utama untuk mewakili data dalam borang ini. Pertama, untuk membetulkan artifak pembahagian sambil mengekalkan maklumat mengenai perubahan skala nano (seperti GBM "bergelombang" yang tidak teratur) adalah tidak mudah. Kedua, dalam sampel lutsinar kami, kami sentiasa memilih satah pengimejan
di mana struktur yang sedang dikaji diselaraskan secara ortogon yang mungkin kepada satah pengimejan. Oleh itu, keratan tidak rawak, merumitkan lagi analisis artifak keratan. Akibatnya, nilai min yang dibentangkan dalam kajian ini mungkin dianggarkan sedikit berlebihan, dan artifak pembahagian menyumbang kepada penyebaran data dalam plot serakan. Untuk ukuran struktur pembetulan pembahagian masa hadapan tanpa kehilangan variasi data sebenar, versi diubah suai kaedah pembetulan artifak pembahagian yang sedia ada, seperti kaedah pintasan ortogonal, berpotensi boleh digunakan.!920
Keupayaan untuk mengekstrak parameter patologi daripada dibersihkanbuah pinggangtisu menggunakan kedua-dua sampel tidak berlabel (autofluoresensi) dan sampel berlabel pendarfluor telah ditunjukkan baru-baru ini.-Tambahan pula, kajian terbaru menunjukkan bahawa "histologi maya" boleh dilakukan menggunakan pembelajaran mendalam al-untuk item pada imej autofluoresensi, dan segmentasi berasaskan rangkaian saraf dan klasifikasi patologi buah pinggang juga telah ditunjukkan. Menggabungkan kaedah penyediaan sampel novel (seperti dilaporkan di sini) dengan alat analisis imej baharu menimbulkan banyak kemungkinan digital yang menarik pada masa hadapan, dan kami mungkin akan melihat perubahan dalam cara kami membayangkan dan menganalisis sampel buah pinggang dalam penyelidikan dan di klinik.
BAHAN DAN KAEDAH Tisu tikus dan buah pinggang manusiaSemua eksperimen tetikus telah diluluskan oleh Pejabat Negeri Jerman Rhine-Westphalia Utara, Jabatan Alam Semula Jadi, Alam Sekitar dan Perlindungan Pengguna, dan telah dilakukan mengikut garis panduan Eropah, kebangsaan dan institusi. Tikus dengan latar belakang C57BL/6N 100 peratus telah digunakan. Selepas induksi bius dengan ketamin dan xylazine, tikus telah disingkirkan dengan perfusi jantung dengan larutan garam seimbang Hank dan diikat seperti yang diterangkan di bawah.
Bahan pesakit diperoleh daripada 2 kanak-kanak yang mengalami sindrom nefrotik tahan steroid disebabkan oleh mutasi titik dalam NPHSI atau mutasi titik kompaun heterozigot dalam TRPC6 dan NPHS2, serta 3 pesakit yang didiagnosis dengan glomerulosklerosis segmental fokus, penyakit perubahan minimum, dan nefropati IgA. , masing-masing. Kawalan tisu manusia dikumpul daripada pesakit yang telah nefrektomi akibatbuah pinggangtumor. Sampel tisu dibedah dari kutub yang tidak bertumorbuah pinggangmenunjukkan gambaran histologi normal pada pemeriksaan histologi rutin. Semua prosedur telah diluluskan oleh Suruhanjaya Etika Cologne dan Jawatankuasa Etika serantau Stockholm dan dijalankan mengikut Deklarasi Helsinki. Apabila berkenaan, pesakit atau penjaga pesakit memberikan persetujuan termaklum.
Model tetikus untuk FSGSTikus dengan 2 mutasi titik kompaun-heterozigot, Pod8asicyAzv telah dijana seperti yang diterangkan sebelum ini." Tikus telah diperiksa pada umur 20 minggu seperti yang dinyatakan di atas.PenetapanManusia dan tikusbuah pinggangtelah ditetapkan dalam 4 peratus paraformaldehid dalam 1× garam penimbal fosfat pada suhu bilik selama 1-3 jam. Manusia yang nefrektomibuah pinggangtelah ditetapkan dalam larutan Dubosaq-Brasil selama 3 jam.PembahagianSampel telah dibenamkan dalam 3 peratus agarose dan dipotong hingga 300 μm ketebalan menggunakan vibratom.DelipidasiSampel diinkubasi dalam larutan penjelasan (200 mM asid borik dan 4 peratus SDS, pH 8.5) pada 70 darjah C selama 1 jam dengan goncangan pada 500 petang.MelabelkanProtokol pelabelan dan senarai antibodi/probe disediakan dalam Bahan Tambahan.MelekapSampel diinkubasi dalam 80 peratus fruktosa (1 ml dH,0 yang ditambah kepada 4g fruktosa) yang mengandungi 4 M urea pada 37 darjah dengan goncangan pada 500 rpm selama 15 minit, dan kemudian diletakkan dalam hidangan MatTek (MatTek , Ashland, MA) dengan slip penutup di atas(untuk mengelakkan penyejatan)sebelum pengimejan,PengimejanImej diperoleh menggunakan sistem confocal Leica SP8 (objektif yang dinyatakan dalam legenda angka) (Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL). Pengimejan dengan objektif 100× sentiasa membayangkan tetapan lubang jarum 03 AU(seperti yang dikira untuk cahaya 594-nm) jika tidak dinyatakan sebaliknya. Pengimejan histologi standard dilakukan menggunakan sistem Leica DM3000 (Rajah 5) atau sistem Olympus BX45 (Olympus, Tokyo, Jepun) (Rajah 6). Imunofluoresensi standard dilakukan menggunakan Nikon Microphot-FXA (Nikon, Tokyo, Jepun), dan EM dilakukan dengan mikroskop elektron penghantaran Zeiss 912 (Rajah 5) atau Hitachi 7700 (Hitachi, Tokyo, Jepun) (Rajah 6).Pemprosesan dan analisis imejMelainkan dinyatakan sebaliknya, imej telah dilicinkan dengan menggantikan setiap nilai piksel dengan purata kejiranan 3×3 menggunakan Fiji/ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD). Analisis morfometrik diterangkan dalam Kaedah Tambahan dan ditunjukkan dalam Rajah Tambahan S4.
