Taburan Tersendiri Faktor Aruh Hipoksia-1 dalam Sel Tubular Renal Terkultur Dengan Hipoperfusi Disimulasikan Oleh Peletakan Coverslip

Hubungi: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mel:audrey.hu@wecistanche.com

Tomoko Honda¹| Yosuke Hirakawa¹ | Kiichi Mizukami²| Toshitada Yoshihara²| Tetsuhiro Tanaka¹| Seiji Tobita²| Masaomi Nangaku

Abstrak

Hipoksia kronik dalam tubulointerstitium buah pinggang memainkan peranan penting dalam perkembangan kronikbuah pinggangpenyakit(CKD). Oleh itu, adalah penting untuk menyiasat hipoksia tiub dan aktiviti faktor boleh aruh hipoksia (HIF)-1 sebagai tindak balas kepada hipoksia. Rarefaction kapilari peritubular menyebabkan hipoperfusi dalam CKD; walau bagaimanapun, kesan hipoperfusi pada HIF jarang disiasat. Kami menyebabkan hipoperfusi yang disebabkan oleh peletakan penutup pada manusiabuah pinggang-2 sel dan memerhatikan kecerunan oksigen di bawah coverlip. Imunositokimia HIF-1 menunjukkan pembentukan berbentuk donat di pinggir kawasan positif pimonidazole, yang kami namakan "cincin HIF". Ketegangan oksigen cincin HIF dianggarkan antara kira-kira 4 mmHg dan 20 mmHg. Keputusan ini tidak serasi dengan kajian lepas yang menunjukkan pengumpulan HIF-1 dalam julat anoksik dengan ketegangan oksigen homogen. Kami selanjutnya memerhatikan kehadiran kecerunan pH di bawah penutup penutup, serta peralihan gelang HIF disebabkan oleh perubahan dalam pH medium kultur, menunjukkan bahawa gelang HIF telah terbentuk melalui penindasan HIF-1 berkaitan kepada pH rendah. Penyelidikan ini menunjukkan bahawa pengaktifan HIF{10}} meniru keadaan fisiologi dalam sel kultur dengan hipoperfusi.

KATA KUNCIhipoperfusi, hipoksia, faktor boleh diinduksi hipoksia, kecerunan oksigen, pH

herba cistanchemencegah penyakit buah pinggang, klik di sini untuk mendapatkan sampel

1|PENGENALAN

Kejadian kronikbuah pinggangpenyakit(CKD) semakin meningkat di seluruh dunia seiring dengan peningkatan usia masyarakat (Tonelli & Riella, 2014). Perkembangan CKD tidak dapat dipulihkan apabila kerosakan buah pinggang mencapai tahap tertentu dan akhirnya mengakibatkan penyakit buah pinggang peringkat akhir (ESRD), tanpa mengira penyakit yang mendasarinya. Hasil ini menunjukkan kewujudan "laluan bersama akhir." Menurut analisis patologi yang lalu, penurunan dalam fungsi buah pinggang lebih kuat berkorelasi dengan kerosakan tubulointerstitial berbanding dengan kerosakan glomerular. Terdapat beberapa laporan yang menunjukkan bahawa fibrosis buah pinggang mendorong hipoksia kronik dalam tubulointerstitium, dan hipoksia tubulointerstitial ini memburukkan CKD dan membawa kepada ESRD. Bukti ini menunjukkan bahawa hipoksia tubulointerstitial memainkan peranan dalam laluan biasa akhir CKD (Mimura & Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). Thebuah pinggangsangat terdedah kepada hipoksia kerana permintaan oksigen yang tinggi, dan kewujudan shunt oksigen antara arteri dan vena intrarenal (Nangaku, 2006; Welch et al., 2001; Zhang et al., 2014). Oleh itu, kami menganggap bahawa adalah penting untuk menyiasat hipoksia dan tindak balas kepada hipoksia dalam tubulointerstitium buah pinggang.

Tindak balas biologi utama kepada hipoksia dalam organisma hidup berlaku melalui laluan faktor hipoksia-inducible (HIF) (Hypoxia, 2011; Semenza & Wang, 1992; Zhou et al., 2003). HIF terdiri daripada - dan -subunit. Walaupun -subunit aktif secara konstitutif, -subunit terdegradasi dengan kehadiran oksigen. Di bawah keadaan normoksik, HIF- dihidroksilasi oleh domain prolyl hydroxylase (Ph.D.), menjadikannya dikenali oleh penindas tumor von Hippel-Lindau (VHL). Pengiktirafan ini menghasilkan ubiquitination dan degradasi HIF- terhidroksilasi dalam proteasome. Di bawah keadaan hipoksik, HIF- terkumpul dalam sitosol, kerana HIF yang tidak terhidroksilasi melarikan diri dari degradasi. HIF- terkumpul dialihkan daripada sitosol ke nukleus, di mana ia dimerisasi dengan HIF-, dan bertindak sebagai faktor transkrip, menggalakkan ekspresi gen hiliran. Daripada tiga isoform HIF- subunit yang dikenal pasti—HIF-1 , HIF-2 dan HIF-3 —sel epitelium tubular renal diketahui mengekspresikan HIF-1 (Tanaka et al ., 2016). Kajian terdahulu telah menunjukkan pengumpulan sementara atau serantau HIF dalambuah pinggangdengan CKD (Goldfarb et al., 2006; Yu et al., 2012), dan HIF ini diaktifkan dalam ketegangan oksigen yang berkurangan dalam lingkungan CKD. Maladaptasi kepada hipoksia dalam CKD mungkin disebabkan oleh kehadiran faktor yang menyekat laluan HIF (Asai et al., 2016; Tanaka et al., 2013; Thangarajah et al., 2009). Kesan perlindungan pengaktifan HIF telah dilaporkan dalam beberapa model haiwan, termasuk tikus diabetes yang disebabkan oleh streptozotocin dan tikus nefrectomy ke-5/6 (Deng et al., 2010; Nordquist et al., 2015). Ph.D. perencat baru-baru ini telah menarik perhatian sebagai pendekatan terapeutik baru untuk anemia buah pinggang pada pesakit dengan CKD (Akizawa et al., 2019; Chen et al., 2017, 2019; Coyne et al., 2017; Miyata et al., 2011; Pergola et al. ., 2016; Provenzano et al., 2016). Walau bagaimanapun, butiran mengenai perkembangan hipoksia buah pinggang, dan cara pengumpulan HIF berlaku dalambuah pinggangdengan CKD, kekal kabur. Hidroksilasi HIF- yang bergantung kepada oksigen berlaku dalam sitosol, dan oleh itu penting untuk mengukur ketegangan oksigen intrasel dan ekstraselular. Terdapat beberapa kaedah yang digunakan untuk mengukur ketegangan oksigen, termasuk penggunaan mikroelektrod atau pengimejan resonans magnetik bergantung paras oksigen darah (BOLD-MRI). Kami menggunakan mikroskop pengimejan seumur hidup phosphorescence (PLIM) untuk pengukuran kuantitatif status oksigen intraselular (Hirakawa et al., 2017; Yoshihara et al., 2015). BTPDM1 ialah pewarna pendarfluor berdasarkan BTP kompleks iridium (III), (bp)2Ir(acc) (bp=benzoate-pyridine, aac=acetylacetone) dengan kumpulan dimetilamino kationik, yang secara pasif diedarkan dalam lisosom intraselular. Ia telah disintesis sebagai probe fosfo terkini untuk mengukur tekanan oksigen intraselular (Yoshihara et al., 2015). PLIM dengan BTPDM1 membolehkan pemerolehan imej resolusi tinggi tekanan separa oksigen dalam sel tubular renal pada permukaan buah pinggang tikus normal, memberikan data yang menunjukkan kehadiran kecerunan oksigen, walaupun dalam buah pinggang normal (Hirakawa et al., 2018). ).

Terdapat kecerunan oksigen dalam organ hidup, termasukbuah pinggang, walaupun dalam keadaan biasa (Hirakawa et al., 2018; Kietzmann, 2017; Zhdanov et al., 2015), dan kecerunan sedemikian juga boleh dijangka dalam CKD. Hypoperfusion disebabkan oleh jarangnya mikrovaskulatur dalam CKD, di mana kecederaan glomerular progresif mengakibatkan penurunan aliran darah kapilari peritubular, memburukkan fibrosis interstisial. Fibrosis interstisial menjejaskan resapan dan bekalan oksigen ke sel-sel tiub, dan membawa kepada jarangnya mikrovaskular, seterusnya memburukkan lagi hipoksia tubulointerstitial (Mimura & Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). Kesan biologi hipoperfusi, walau bagaimanapun, kekal tidak jelas, kerana kebanyakan kajian telah menyiasat kesan hipoksia dan HIF-1 pada sel yang dikultur dalam keadaan perfusi homogen dan ketegangan oksigen (Rexius-Hall et al., 2017). Kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa sel kultur monolayer yang diliputi dengan penutup penutup memberikan model hipoperfusi yang baik yang disebabkan oleh penghalang kepada resapan dalam medium kultur. Hipoperfusi yang dimodelkan dikaitkan dengan kecerunan oksigen kerana slip penutup menghalang resapan oksigen dari bahagian atas medium ke sel (Pitts & Toombs, 2004; Takahashi & Sato, 2010; Yoshihara et al., 2015). Dalam satu lapisan sel kultur yang dilitupi dengan coverslip, ketegangan oksigen intraselular menurun dengan jarak dari pinggir coverslip kerana resapan oksigen yang terhad ke dalam sel-sel kultur. Akibatnya, kecerunan oksigen terbentuk dari tepi ke tengah penutup penutup, dan ketegangan oksigen intraselular mungkin menurun kepada julat anoksik di tengah penutup penutup (Takahashi & Sato, 2010; Yoshihara et al., 2015) . Dalam kajian semasa, kami memberi tumpuan kepada pengaktifan HIF dan menyiasat sama ada terdapat perubahan bebas oksigen dalam ekspresi HIF dengan kehadiran hipoperfusi dengan kecerunan oksigen. Oleh kerana hipoperfusi dengan kecerunan oksigen wujud dalam tubul renal in vivo, pemerhatian kesan bebas oksigen pada ekspresi HIF dalam model coverlip boleh memberikan gambaran tentang mekanisme yang mendasari ketidakcukupan pengumpulan HIF dalam CKD.

ekstrak cistancheuntuk buah pinggang

2|BAHAN S DAN KAEDAH

2.1|Kultur sel

Sel yang dikultur telah diinkubasi dalam inkubator yang dilembapkan dengan 5 peratus CO2. Pengeraman hipoksik dilakukan dalam inkubator CO2/multi-gas APM-30D (Astec) peribadi. Anoxia telah diinduksi dengan beg anoxia, AnaeroPack dan set penanaman Anaerobik #A-13 (Mitsubishi Gas Chemical).

HK-2 sel (Homo sapiens, manusiabuah pinggang, lelaki, CRL- 2190, ATCC, RRID: CVCL_0302), garisan sel epitelium tubul proksimal yang diabadikan daripada buah pinggang manusia dewasa normal, telah dikultur dalam campuran medium/nutrien Eagle's diubahsuai Dulbecco F{{2} } Ham (DMEM/F12) (D8062, Sigma Aldrich) mengandungi 10 peratus serum lembu janin (FBS) (F7524, Sigma Aldrich), dan larutan penicillin-streptomycin (15070063, Thermo Fisher Scientific) dalam hidangan kultur 10 cm. Untuk laluan, sel HK-2 dipisahkan dengan tripsin (204-16935, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) dan diempar pada 300 g selama 5 minit.

sel kanser serviks HeLa dan embrio manusiabuah pinggangsel 293 (HEK293) telah dibiakkan dalam DMEM dengan glukosa rendah (1000 mg/L) (D6046, Sigma Aldrich) yang mengandungi 5 peratus FBS dalam hidangan kultur 10 cm. Sel ini telah dilalui sebagai sel HK-2.

Sel epitelium tubul proksimal renal (RPTECs) (CC- 2553, Cambrex) dikekalkan menggunakan kit RenaLifeTM Comp (LRC-LL0025, Lonza Ltd.). Untuk laluan, RPTEC telah diasingkan menggunakan trypsin, dineutralkan dengan Penyelesaian Meneutralkan Trypsin (CC-5002, Lonza Ltd.), dan disentrifugasi pada 200 g selama 5 minit.

2.2|Penubuhan model hipoperfusi melalui peletakan coverslip

Slip penutup berbentuk bulat berdiameter 15 mm (C015001, Matsunami) telah dibersihkan menggunakan ultrasound dan disimpan dalam 99.5 peratus etanol sebelum digunakan. Dua kaedah telah digunakan, berdasarkan pemerhatian sel di luar coverlip.

Sel kultur monolayer diapit di antara penutup penutup dan bahagian bawah hidangan (Rajah S1a, b), atau kaedah alternatif (Rajah S1c), seperti yang diterangkan di bawah. Sama ada kaedah tradisional atau alternatif telah dipilih untuk mewujudkan model coverslip kami untuk pengimejan langsung, sama ada pengimejan oksigen atau pengimejan PH. Untuk imunositokimia (ICC), kaedah alternatif telah dipilih, kerana apabila menggunakan kaedah tradisional, majoriti sel sering tercabut dari bahagian bawah hidangan semasa penyingkiran penutup penutup untuk penetapan sel (Rajah S2a).

2.2.1|Kaedah tradisional

Pada Hari 1, sel diletakkan di bahagian bawah hidangan berasaskan kaca 27 mm (3910-035, Iwaki) pada pertemuan 100 peratus * (kira-kira 5.0 × 105/hidangan). Mereka dibiakkan dalam DMEM/ F12 yang mengandungi 10 peratus FBS tanpa larutan antibiotik semalaman. Pada Hari 2, slip penutup diletakkan di atas sel kultur untuk tempoh yang ditunjukkan (Rajah S1b).

2.2.2|Kaedah alternatif

Sel telah disemai pada coverslip dalam hidangan kultur 35 mm pada 100 peratus pertemuan (kira-kira 5.0 × 105/hidangan) pada Hari.

1. Mereka dibiakkan dalam DMEM/F12 yang mengandungi 10 peratus FBS tanpa larutan antibiotik semalaman. Pada Hari 2, gelincir penutup diterbalikkan, untuk melekatkan permukaan selnya ke bahagian bawah pinggan berasaskan kaca 27 mm baharu untuk tempoh tertentu (Rajah S1c).

Kami juga mencipta model coverslip menggunakan coverslip berbentuk bulat dengan diameter 10 mm (CS01005, Matsunami) (Rajah S2b).

2.3|Pengimejan oksigen hidup dengan BTPDM1

Sel yang dikultur telah disediakan pada Hari 1, seperti yang diterangkan di atas. Pada Hari 2, sel-sel telah dibilas dua kali dengan larutan Garam Seimbang Hanks (HBSS) (H8264, Sigma Aldrich) dan diinkubasi dengan 500 nM BTPDM1, pewarna lipofilik kationik berasaskan iridium yang digunakan sebagai probe pendarfluor intraselular (Yoshihara et al., 2015), dalam DMEM/F12 tanpa phenol red (21041-025, Thermo Fisher Scientific) selama 30 minit. Selepas sel dibasuh dua kali dengan HBSS, ia diapit di antara penutup penutup dan bahagian bawah pinggan, seperti yang diterangkan di atas. Keamatan phosphorescence dari BTPDM1 dalam sel kultur yang ditutup dengan coverslip diperhatikan menggunakan penapis pengujaan dan pelepasan, dan fosforesensi BTPDM1 (Hirakawa et al., 2015) dikesan menggunakan mikroskop pendarfluor, BZ-X710 (Keyence Corporation). Imej yang diperoleh daripada mikroskop pendarfluor terbalik telah dilaraskan untuk kecerahan dan kontras menggunakan perisian analisis BZ-X.

2.4|Imunositokimia

Sel-sel pada slip penutup telah dikultur dengan 200 µM pimonidazole HCl (HP3-100, Hypoxyprobe, Inc.) dalam DMEM/F12 tanpa merah fenol selama 1 jam, selepas itu slip penutup dipusing dan dilekatkan pada piring kaca penutup, sebagai diterangkan sebelum ini. Sel-sel itu kemudiannya dibiakkan dalam DMEM/F12 tanpa fenol merah untuk tempoh tertentu. Apabila pewarnaan balas pimonidazole tidak digunakan, prarawatan dengan pimonidazole telah ditinggalkan.

Selepas tamat tempoh kultur, setiap coverslip dikumpul, dan sel-sel segera difiksasi dengan metanol/acetone (1:1) di atas ais, di mana ia kekal selama 30 minit. Selepas mencuci dua kali dengan garam penimbal fosfat (PBS) Dulbecco (D5652, Sigma Aldrich), membran sel telah meresap selama 30 minit, diinkubasi dengan 5 peratus albumin serum lembu (BSA) (A3059, Sigma Aldrich) selama 30 minit, dan seterusnya dengan blok protein bebas serum (X0909, DAKO) selama 10 min. Sel-sel telah diwarnai dengan antibodi pertama dan seterusnya dengan antibodi kedua, pendarfluor. Senarai antibodi pertama diberikan dalam Jadual S1. Imunoglobulin anti-arnab poliklonal FITC (F0205, 1:20 pencairan, DAKO) telah digunakan sebagai antibodi pertama jika perumah adalah arnab. Antibodi pendarfluor Alexa Fluor 594 streptavidin (S11227, pencairan 1:500, Thermo Fisher Scientific) telah digunakan sebagai antibodi pertama jika hosnya ialah tetikus, diikuti oleh IgG anti-tikus terbiotinilasi (H tambah L) (BA{{23} }, pencairan 1:1000, Vector Laboratories), sebagai antibodi kedua. Pewarnaan nuklear dilakukan menggunakan bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (B2261, Sigma Aldrich) untuk setiap sampel.

Isyarat pendarfluor diperhatikan menggunakan mikroskop pendarfluor terbalik, BZ-X710 (Keyence Corporation) dengan penapis berikut: Texas Red dengan panjang gelombang pengujaan (Ex) 560/40 nm, panjang gelombang pelepasan (Em) 630/75 nm, GFP ( Cth: 470/40 nm, Em: 525/50 nm), dan DAPI (Cth: 360/40 nm, Em: 460/50 nm). Imej telah dilaraskan untuk kecerahan dan kontras menggunakan perisian analisis BZ-X.

2.5|ICC HIF sel HK-2 dirawat dengan kobalt klorida

Kaedah alternatif telah diubah suai untuk menghasilkan model coverslip sel HK-2 yang dirawat dengan kobalt klorida. Sel HK-2 telah disemai pada ketumpatan separuh konfluen (2.5 × 105/hidangan) pada penutup pada Hari 1 dan dirawat dengan 300 µM kobalt klorida heksahidrat (C 8661, Sigma Aldrich) selama 16 jam pada Hari 2. Pada Hari 3, penutup penutup diterbalikkan untuk melekatkan permukaan sel ke bahagian bawah pinggan berasaskan kaca 27 mm baharu selama 3 jam, dan ICC HIF telah dilakukan.

2.6|Western blotting

Untuk menyiasat pengumpulan HIF{{0}} di bawah ketegangan oksigen yang berbeza dan pada tahap pH yang berbeza, 1.0 × 106 sel HK-2 setiap hidangan kultur 10 cm telah diinkubasi sama ada di bawah normoxia, 2 peratus oksigen, 1 peratus oksigen, atau anoxia, selama 5 jam, atau dalam DMEM/F12 pada pH 7.4, pH 6.0, atau pH 5.0 selama 5 jam.

Sel-sel ini telah disaring dalam penimbal RIPA yang mengandungi 50 mM Tris-buffer (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 w/v peratus natrium deoxy- cholate, 0.1 w/v peratus SDS, dan 1.0 w/v peratus NP40.

Untuk western blotting, penimbal sampel SDS yang mengandungi {{0}}.35 M Tris-HCl (pH 6.8), 10 peratus SDS, 36 peratus gliserol, 0.012 peratus bromofenol biru dan 0.1 M dithiothreitol (DTT) telah ditambah kepada protein. Protein yang mengandungi penimbal sampel SDS telah dielusi dengan mendidih pada 95 darjah selama 5 minit.

Protein dipisahkan dengan elektroforesis pada 10 peratus gel poliakrilamida SDS. Protein kemudiannya dipindahkan ke membran AmershamTM HybondTM PVDF (10600023, GE Healthcare) dalam penimbal pemindahan (penampan asas Tris 48 mM, 39 mM glisin, 0.04 peratus SDS dan 20 v/v peratus metanol) menggunakan Trans-Blot® Sistem Pemindahan TurboTM (Bio-Rad). Membran telah diinkubasi pada suhu bilik dengan antibodi primer, anti-badan anti-HIF1 (NB100-134, pencairan 1:500, Novus Biologicals, RRID: AB_350071), dan antibodi anti-aktin (A2066 , pencairan 1:2000, Sigma Aldrich, RRID: AB_476693), dan seterusnya dalam antibodi sekunder, imunoglobulin anti-arnab kambing poliklonal/HRP (P0448, pencairan 1:10000, DAKO, RRID: AB{{26 }}). PierceTM ECL Plus Western Blotting Substrate (32132, ThermoFisher Scientific) telah digunakan untuk pengesanan. Chemiluminescence telah diperhatikan menggunakan Luminoimage Analyzer ImageQuantLAS4000mini (GE Healthcare). Kebolehulangan telah disahkan dengan melakukan sekurang-kurangnya tiga eksperimen bebas. Keamatan jalur dikira menggunakan perisian National Institutes of Health ImageJ (Schneider et al., 2012).

2.7|Ujian wartawan Luciferase

Ujian wartawan luciferase dilakukan untuk mengukur pengumpulan HIF1 dalam inkubasi budaya hipoksik homogen. Kami sebelum ini membina gen luciferase yang ditandakan didorong oleh unsur responsif hipoksia (HRE) dan membangunkan Vektor Pelapor Hypoxia-Responsif (Pembinaan Transgene). Ini dibina daripada salinan tandem HRE daripada gen faktor pertumbuhan endothelial vaskular tikus yang diklonkan ke kawasan 5' unit transkripsi am CMV-promoter-luciferase (pra-Luc) (Chiang et al., 2011; Tanaka et al., 2004).

Sel HK{{{0}} pada kepekatan 1.0 × 105 setiap telaga telah disediakan dalam 12-plat kultur telaga (150628, Thermo Fisher Scientific). Sel telah ditransfeksi bersama dengan 500 ng pGL3-vektor HRE-luciferase Asas dan 30 ng pRL-SV40 Renilla luciferase vektor kawalan (Promega), menggunakan 2 µl FuGENE® HD Transfection Reagent (E2311, Promega) setiap baiklah. Sel HK-2 yang ditransfeksi bersama dengan 500 ng ofpGL3-vektor luciferase kelip-kelip asas dan 30 ng ofpRL-SV40 Renilla luciferase vektor kawalan (Promega) telah digunakan sebagai kawalan negatif.

Sel yang ditransfeksi diinkubasi di bawah normoxia, 2 peratus hipoksia, 1 peratus hipoksia, atau beg anoksia, selama 5 jam. Sel-sel itu kemudiannya dituai menggunakan 100 µl penimbal lisis protein pasif, untuk ujian luciferase dwi. Luminometer LB9507 (EG dan Berthold) digunakan untuk pengukuran. Untuk membetulkan kecekapan pemindahan, nilai relatif unit cahaya luciferase kelip-kelip dibahagikan dengan nilai Renilla luciferase.

cistanche untuk ed

2.8|Analisis apoptosis

Sel yang dikultur ditutup dengan coverslip selama 0 min, 15 min, 30 min, 1 h, 3 h, 6 h, dan 24 h, dan kemudian dikumpulkan menggunakan trypsin. Sel yang dirawat dengan 3 peratus hidrogen peroksida (081- 04215, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) selama 30 minit telah disediakan sebagai kawalan apoptosis. Analisis kuantitatif apoptosis dilakukan menggunakan Muse Annexin V dan Kit Sel Mati (MCH100105, Millipore) dalam Penganalisis Sel Muse™ (Millipore), mengikut arahan pengilang.

2.9|PCR masa nyata kuantitatif (qRT-PCR)

Jumlah pengekstrakan RNA dan sintesis cDNA telah dijalankan mengikut arahan pengilang untuk RNAiso Plus (9109, Takara) dan PrimeScript™ RT Master Mix (RR036B, Perfect Real Time) (Takara) masing-masing. PCR masa nyata dilakukan menggunakan Campuran qPCR THUNDERBIRD SYBR (QPS- 201, Toyobo) dalam Sistem Pengesanan PCR Masa Nyata CFX Connect (Bio-Rad). Tahap transkrip telah dinormalisasi kepada tahap ekspresi mRNA -actin. qRT-PCR dilakukan dalam tiga kali ganda menggunakan primer khusus gen. HIF-1 telah dikuatkan menggunakan primer, 5′-CCATTAGAAAGCAGTTCCGC-3′ dan terbalik, 5′-TGGGTAGGAGATGGAGATGC-3′. -aktin telah dikuatkan menggunakan primer, 5′-TCCCCCAACTTGA GATGTATGAAG-3′ dan membalikkan primer 5′-AACTGGTCTCAAG TCAGTGTACAGG-3′.

2.10|Transfeksi dengan siRNA

Untuk menyiasat ketukan HIF-1 akibat RNAi dalam sel HK-2, 5.0 × 104 HK-2 sel setiap telaga telah disediakan dalam plat enam telaga. Dua jenis RNAi—HIF-1 siRNA (siHIF-1 #1 [HSS104774, Thermo Fisher Scientific] dan siHIF-1 #2 [HSS104775, ThermoFisher Scientific])—digunakan dengan Lipofectamine RNAiMAX Reagen Transfeksi (Thermo Fisher Scientific). Sebagai kawalan negatif, Stealth RNAi™ siRNA Negative Control Med GC Duplex #3 (12935-113) telah digunakan; 1.5 µl setiap siRNA dan 5 µl RNAiMAX dicampur. Sel yang ditransfeksi siRNA telah diinkubasi di bawah keadaan normoksik atau hipoksik (1 peratus O2) selama 48 jam dan RNA telah diekstrak. Kecekapan knockdown-HIF-1 telah diperiksa menggunakan qRT-PCR.

2.11|Pengimejan langsung kesan kecerunan PH

Kami menggambarkan kecerunan pH intraselular sel hidup di bawah slip penutup. Sel telah dirawat dengan pHrodo Green AM Intracellular pH Indicator (p35373, ThermoFisher Scientific) mengikut arahan pengilang, sebelum melaksanakan model coverlip. Mikroskop pendarfluor terbalik, BZ-X710 (Keyence Corporation) dengan penapis GFP telah digunakan untuk memerhati peralihan masa kecerunan intensiti pendarfluor di bawah slip penutup.

2.12|Analisis kuantitatif cincin HIF

2.12.1|Tapak gelang HIF

Kami mengukur jarak cincin HIF dan kawasan positif pimonidazole dari tepi coverlip menggunakan ImageJ, seperti berikut. Kawasan bulatan luar dan dalam cincin HIF dan bulatan positif pimonidazole telah ditentukan, dan jejari setiap bulatan dikira. Setiap nilai telah ditolak daripada 7.5 mm, iaitu jejari bagi 15 mm penutup, untuk mengira jaraknya dari tepi penutup. Tiga eksperimen bebas ICC HIF dalam setiap keadaan telah dilakukan.

2.12.2|Definisi cincin HIF

Kami menggunakan imej pendarfluor yang diperoleh daripada model coverlip yang diinkubasi di bawah normoxia dan pH neutral. Kami mentakrifkan tapak gelang HIF dan bahagian luar dan dalamnya sebagai 2.5–3.0 skala (0.22–0.45 mm), 0.5 –1.0 skala (1.12– 1.35 mm) dan 5.0–5.5 skala (2.24–2.47 mm) masing-masing dari tepi gelincir, menggunakan ImageJ. Kami mengukur lima tapak isyarat HIF-1 bagi setiap sampel dan mengira purata. Tiga eksperimen bebas ICC HIF telah dilakukan.

serbuk ekstrak cistanche

2.13|Pengukuran tekanan oksigen dengan imej PLIM

2.13.1|Pembinaan garisan penentukuran untuk mengukur tekanan oksigen

Lengkung penentukuran sel HK-2 telah dibuat, berdasarkan kaedah yang diterangkan dalam laporan kami sebelum ini (Yoshihara et al., 2015). Sel HK-2 yang dimuatkan dengan 500 nM BTPDM1 selama 30 minit telah dikultur dalam inkubator berbilang gas yang boleh ditukar kepekatan oksigen yang dilengkapi dengan mikroskop pendarfluor terbalik yang disambungkan kepada sistem pengukuran seumur hidup. Talian penentukuran berdasarkan analisis Stern-Volmer telah dibina menggunakan jangka hayat (PL) phosphorescence lifetime (PL) sel HK-2 di bawah beberapa ketegangan oksigen berbeza menggunakan

Persamaan (1)

di mana τp mewakili PL dalam pO2, τ0 mewakili PL dalam penyahoksigenan, kq mewakili pemalar kadar pelindapkejutan, dan pO2 mewakili tekanan separa oksigen. Menggunakan talian penentukuran ini, tekanan oksigen boleh dikira daripada PL.

2.13.2|Imej PLIM model slip penutup

Sel HK-2 yang dimuatkan dengan 500 nM BTPDM1 selama 30 minit telah disediakan. Model coverslip telah dibina dan dikultur dalam inkubator berbilang gas yang boleh ditukar kepekatan O2 dilengkapi dengan mikroskop pendarfluor terbalik, disambungkan kepada sistem pengukuran seumur hidup.

Imej mikroskop pengimejan seumur hidup fosforus (PLIM) telah dirakam menggunakan mikroskop pendarfluor terbalik yang dilengkapi dengan sistem pengimbasan confocal (Hirakawa et al., 2018). Imej PLIM diperolehi selepas 30 minit pengeraman dalam 21 peratus O2 atau 4 peratus O2. Empat imej PLIM bagi setiap sampel, dari kawasan atas, bawah, kiri dan kanan berhampiran tepi coverslip, telah diambil, untuk menentukan purata PL, dengan mengambil kira variasi dalam PLs dalam coverslip.

2.13.3|Pengenalpastian gelang HIF dalam imej PLIM

Pimonidazole positif di bawah 10 mmHg tekanan oksigen. PL bersamaan dengan 10 mmHg tekanan oksigen ialah 4034.6 ns, mengikut garisan penentukuran, jadi garisan luar bulatan pimonidazole dalam imej PLIM dapat dikenal pasti. Selepas itu, tapak gelang HIF luar dan dalam dalam imej PLIM boleh didapati dengan menggunakan analisis kuantitatif jarak. Kami mengukur julat purata PL bersamaan dengan cincin HIF dalam 21 peratus O2 dan 4 peratus O2.

2.13.4|Pengukuran tekanan oksigen cincin HIF

Kami mengira julat tekanan oksigen cincin HIF dari PL, menggunakan garisan penentukuran. Imej PLIM dianalisis menggunakan SPCImage 5.0 (Becker & Hickl GmbH).

2.14|Analisis statistik

Ujian Dunnett digunakan untuk membandingkan kumpulan eksperimen dan kawalan, dan nilai <.05 dianggap="" menunjukkan="" perbezaan="" yang="" signifikan="" secara="" statistik.="" ujian-t="" pelajar="" digunakan="" untuk="" membandingkan="" tiga="" atau="" lebih="" kumpulan,="" dan="" nilai="" p="" terlaras="" bonferroni="" digunakan.="" semua="" analisis="" statistik="" dilakukan="" menggunakan="" jmp="" pro="" ver13.2.1="" (sas).="" nilai="" diandaikan="" berasal="" daripada="" populasi="" taburan="" normal,="" dan="" ditunjukkan="" sebagai="" min="" ±="" sisihan="" piawai="">

apa itu cistanche

3|KEPUTUSAN

3.1|Pembentukan kecerunan oksigen dalam model hipoperfusi

Kami mengesahkan kewujudan kecerunan oksigen dalam model hipoperfusi yang disebabkan oleh peletakan coverslip dengan menilai secara langsung ketegangan oksigen, menggunakan pendarfluor. Pengukuran keamatan fosforus boleh meramalkan trend anggaran dalam tekanan oksigen (Hirakawa et al., 2015; Yoshihara et al., 2015). Kami memerhatikan keamatan phosphorescence model coverslip sel HK-2 yang dirawat dengan BTPDM1. Imej keamatan phosphorescence menunjukkan hipoksia di kebanyakan kawasan di dalam coverlip, tetapi tiada hipoksia berhampiran tepi, pemerhatian yang mencadangkan kewujudan kecerunan oksigen di sekeliling tepi coverlip dalam sel HK-2 yang diliputi dengan slip penutup (Rajah 1a). Memandangkan keamatan phosphorescence bergantung pada kepekatan probe, dan pada masa pengujaan, pengukuran seumur hidup phosphorescence (PL) berguna untuk analisis kuantitatif tekanan oksigen (Yoshihara et al., 2015). Oleh itu, untuk pengukuran kuantitatif ketegangan oksigen sel-sel kultur di sekeliling tepi penutup penutup, kami memperoleh imej PLIM sel HK-2 yang ditutup dengan penutup penutup selama 30 minit (Rajah 1b). PL dilanjutkan apabila jarak dari tepi penutup penutup meningkat. Kami mengesahkan bahawa ketegangan oksigen, dikira menggunakan garisan penentukuran (Rajah S3), berkurangan apabila jarak dari tepi penutup penutup meningkat, memberikan bukti kewujudan kecerunan oksigen di sekitar pinggir penutup penutup (Rajah 1c). Pemeriksaan profil temporal keamatan phosphorescence menunjukkan bahawa kecerunan oksigen mula terbentuk 10 minit selepas peletakan coverslip

(Rajah 1d).

3.2|Taburan HIF-1 unik dalam model hipoperfusi,"gelang HIF"

Kami memeriksa taburan HIF-1 dalam model hipoperfusi dengan kecerunan oksigen. ICC HIF-1 dalam sel HK-2 menunjukkan peningkatan berbentuk donat pada pinggir kawasan positif pimonidazole, yang kami panggil "gelang HIF" (Rajah 2a). Keamatan isyarat HIF-1 adalah jauh lebih tinggi pada gelang HIF berbanding kawasan dalam atau luarnya (Rajah 2b). Fenomena ini telah disahkan menggunakan ICC dengan antibodi HIF-1 lain (Rajah S4a) atau garisan sel tiub lain (Rajah S4b,c). Kami juga melakukan analisis ICC HIF{11}} dalam jenis sel kultur lain, seperti sel kanser serviks HeLa. Walaupun lekatan sel-sel ini yang lemah pada slip penutup menyukarkan penilaian terperinci pengedaran HIF{12}}, kami melihat peningkatan HIF berbentuk donat{14}} dalam sel HeLa (Rajah S4d).

Cincin HIF dan kawasan positif pimonidazole mula terbentuk beberapa jam selepas peletakan coverslip, dan cincin HIF kelihatan statik sebanyak 3 jam (Rajah 2c). HIF-1 knockdown mengakibatkan hilangnya isyarat HIF-1 , termasuk gelang HIF (Rajah 2d, Rajah S4e), menunjukkan bahawa gelang HIF bergantung pada HIF-1 .

Untuk menyiasat kemungkinan pembentukan gelang HIF bergantung kepada oksigen, kami telah menyiasat taburan HIF-1 dalam model coverlip di bawah pengeraman dengan ketegangan oksigen yang berbeza. Kami meletakkan hidangan ke dalam kebuk hipoksik dengan ketegangan oksigen yang berbeza serta-merta selepas membuat model coverslip. Semasa pengeraman hipoksik, kami mendapati bahawa kedua-dua cincin HIF dan kawasan positif pimonidazole kelihatan mengembang ke luar (Rajah 3a). Kami mengukur jarak setiap cincin HIF dan kawasan positif pimonidazole dari tepi penutup di bawah normoxia, 4 peratus O2, dan 1 peratus pengeraman O2. Kedua-dua cincin HIF dan kawasan positif pimonidazole mengembang ke luar apabila ketegangan oksigen di sekeliling berkurangan (Rajah 3b). Keputusan ini menunjukkan bahawa gelang HIF bergantung pada HIF-1 dan ketegangan oksigen.

Untuk mengesahkan bahawa pengumpulan berbentuk donat ialah fenomena khusus HIF, kami melakukan ICC dengan gen pengemasan dalam model coverslip. Isyarat GAPDH dan aktin dikekalkan di seluruh kawasan penutup penutup dan boleh dibandingkan antara kawasan gelang HIF dan kawasan lain (Rajah S5a, b).

3.3|Pengukuran julat tekanan oksigen cincin HIF

Kami mengesahkan peningkatan berbentuk gelang bagi pengumpulan HIF-1 dalam sel kultur yang ditutup dengan penutup, fenomena yang bergantung pada ketegangan oksigen. Untuk menentukan julat ketegangan oksigen yang terlibat, kami menganalisis tekanan oksigen cincin HIF menggunakan teknik seumur hidup phosphorescence. Kami memperoleh imej PLIM bagi model kulit muka selepas pengeraman 30 min dalam 21 peratus O2 atau 4 peratus O2 (Rajah 4a). Cincin HIF terbentuk di pinggir bulatan pimonidazole dalam ICC HIF (Rajah 3b). Kami mengenal pasti tapak dalam imej PLIM yang bersamaan dengan kawasan positif pimonidazole dalam ICC HIF dan kemudiannya mengenal pasti tapak yang sepadan dengan cincin HIF (Rajah 4b), menggunakan analisis kuantitatif data jarak dari cincin HIF dan kawasan positif pimonidazole (Rajah 3b). Kami juga mengukur julat PL bagi cincin HIF dan kemudian menggunakan garisan penentukuran (Rajah S3) untuk mengira tekanan oksigen cincin HIF dalam 21 peratus O2 (4.20 [3.46-4.97] ~35.9 [28.5-44.9] mmHg) , dan 4 peratus O2 (2.19 [0.21–4.32] ~20.4 [17.1–24.1] mmHg) (Rajah 4c).

3.4|HIF-1 pengumpulan di bawah ketegangan oksigen homogen

Walaupun isyarat lemah HIF-1 di luar gelang HIF dalam model slip penutup boleh dikaitkan dengan hipoksia yang tidak mencukupi, isyarat di dalam gelang, di mana HIF-1 sepatutnya lebih kuat diaktifkan oleh ketegangan oksigen yang lebih rendah, mesti dikawal oleh fenomena bebas oksigen. Untuk mengkaji fenomena yang menyebabkan kekurangan pengumpulan maksimum HIF-1 dalam kawasan anoksik yang berlaku hanya dalam model hipoperfusi, kami memeriksa sama ada terdapat hubungan songsang antara ketegangan oksigen dan pengumpulan HIF-1 di bawah pengeraman dengan ketegangan oksigen homogen. Analisis Western blot bagi lisat sel di bawah ketegangan oksigen homogen berbeza menunjukkan peningkatan dalam pengumpulan HIF-1 semasa pengeraman anoksik (Rajah 5a). Ujian wartawan HRE-luciferase juga menunjukkan bahawa pengumpulan HIF-1 telah meningkat dengan ketegangan oksigen yang lebih rendah di bawah keadaan ketegangan oksigen homogen (Rajah 5b). Keputusan ini menunjukkan bahawa pengumpulan HIF-1 adalah bergantung kepada ketegangan oksigen, dengan pengumpulan maksimum diperhatikan dalam julat anoksik. Ciri HIF-1 hendaklah berbeza antara model hipoperfusi dan model dengan ketegangan oksigen homogen. Kami membuat spekulasi bahawa fenomena unik pengumpulan HIF{13}} dalam model hipoperfusi ini mungkin ditentukan oleh faktor selain daripada ketegangan oksigen.

3.5|Pembentukan cincin HIF adalah bebas daripada PhD

Kami meneliti sama ada degradasi HIF-1, mekanisme pembentukan cincin HIF yang mungkin, telah dikawal selia di dalam gelang HIF. Idea ini nampaknya tidak sah, kerana hidroksilasi oleh Ph.D., proses menghadkan kadar degradasi HIF, memerlukan oksigen sebagai substrat. Kobalt klorida digunakan secara meluas sebagai penstabil kimia HIF. Kami membina model kulit penutup sel HK-2 yang dirawat dengan kobalt klorida dan melakukan analisis ICC HIF. Isyarat HIF-1 tidak meningkat di dalam gelang HIF, yang menjadi tidak jelas kerana peningkatan isyarat HIF-1 di luar gelang (Rajah 6c). ICC sel HK-2 dengan ketukan PHD2, yang dipercayai sebagai prolil hidroksilase HIF utama dalam eksperimen kultur sel (Strowitzki et al., 2019), menghasilkan keputusan yang serupa (Rajah S6). Keputusan ini menunjukkan bahawa paksi PHD-VHL degradasi HIF tidak berkaitan dengan pembentukan cincin HIF.

3.6|Kesan pH pada pengumpulan HIF-1.

Laporan sebelumnya menerangkan penggunaan model kulit muka miosit jantung yang mengalami penurunan pH di dalam kulit muka (Pitts & Toombs, 2004). Kami menyiasat pH di bawah slip penutup dan kesannya terhadap pembentukan cincin HIF. Kami merawat sel HK-2 dengan penunjuk pH intraselular, keamatan pendarfluor yang membolehkan penilaian pH dalam sel. Pengimejan langsung menunjukkan bahawa pH menurun di kebanyakan kawasan dalam, tetapi tidak berhampiran tepi penutup penutup, mencadangkan kewujudan kecerunan pH di sekeliling tepi dalam model penutup penutup (Rajah 6a). Analisis kuantitatif korelasi antara keamatan pendarfluor dan jarak dari tepi penutup gelincir menunjukkan bahawa bekas itu dinaikkan apabila jarak bertambah, pemerhatian yang menyokong kewujudan kecerunan pH dan oksigen di sekeliling tepi gelincir (Rajah 6b). Analisis Western blot bagi lisat sel di bawah kepekatan oksigen homogen mendapati bahawa pengeraman dengan medium pH 5.0 menindas pengumpulan HIF-1 dalam keadaan hipoksik (Rajah S7a–d). Kami juga mengesahkan bahawa pengumpulan HIF-1 di bawah hipoksia di bawah keadaan pH berbeza menurun di bawah pH 6.0 (Rajah S8a–c).

Satu laporan menekankan kepentingan keadaan berasid sederhana, pada pH sekitar 6.0. Menurut kajian ini, reoksigenasi selepas hipoksia mengasidkan media, yang menyebabkan penyerapan nukleolar VHL. Sebaliknya, kemerosotan HIF telah dihalang dalam myotubes C2C12, neuron PC12 dan 786-0 sel kanser buah pinggang (Mekhail et al., 2004). Dalam kajian kami, tiada perubahan dalam taburan VHL dalam sel tubular antara kawasan dengan pengumpulan HIF-1 dan kawasan yang mana ia ditindas, dalam model coverslip dengan nilai pH daripada 5.0 hingga 7.4 (Rajah S9a–c). Sel tubular terdedah kepada pelbagai keadaan pH (Burke et al., 1999; Pavuluri et al., 2019; Raghunand et al., 2003), jadi kami menyiasat variasi cincin HIF dalam media pH yang berbeza. nilai antara 5.0 dan 8.5. Cincin HIF diperhatikan dengan jelas dalam media dengan pH 8.5 dan 7.4 (Rajah 6c). Cincin HIF juga wujud pada pH 6.5 tetapi dikaburkan (Rajah 6c). Isyarat HIF-1 telah dilemahkan di seluruh kawasan slip penutup pada pH 5.0. (Rajah 6c). Kami melakukan analisis kuantitatif selanjutnya tentang hubungan kedudukan antara cincin HIF dan pinggir kawasan positif pimonidazole (Rajah 7a) dan mendapati bahawa kedudukan cincin berbeza-beza bergantung pada pH. Bulatan dalam cenderung mengembang ke luar pada pH 6.5, berbanding dengan pH 7.4, manakala bulatan luar mengecut dengan ketara ke dalam pada pH 8.5, berdasarkan pinggir kawasan positif pimonidazole (Rajah 7b, c). Kami juga mengesahkan bahawa aktiviti gen pengemasan dikekalkan dalam model coverslip di bawah pengeraman berasid (Rajah S10). Oleh itu, pH nampaknya memainkan peranan penting dalam mekanisme yang mendasari pembentukan cincin HIF.

4|PERBINCANGAN

Dalam kajian ini, kami mengenal pasti taburan unik HIF-1 dalam sel tubular renal, menggunakan model hipoperfusi yang disebabkan oleh peletakan coverslip. Kami mendapati bahawa pembentukan dan penyelenggaraan cincin HIF dikawal oleh tekanan oksigen dan pH, kedua-duanya wujud dalam kecerunan dalam tepi penutup penutup model penutup. Berdasarkan keputusan ini, kami mencadangkan mekanisme yang mungkin untuk pembentukan cincin HIF, yang melibatkan HIF-1 terkumpul dengan ketegangan oksigen yang berkurangan, dan pengumpulan ditindas kerana pH rendah dalam jarak tertentu dari tepi penutup (Rajah 8). ).

Hipoperfusi disebabkan oleh jarang berlakunya mikrovaskular dalam CKD (Mimura & Nangaku, 2{{20}}10; Nangaku, 2006). Dalam kerja kami sebelum ini, kami menggunakan pengimejan vivo untuk menunjukkan kehadiran kecerunan oksigen dalam sel tubular renal buah pinggang tikus normal (Hirakawa et al., 2018). Ketegangan oksigen juga dijangka menjadi heterogen dalam sel tiub dalam CKD. Walau bagaimanapun, masih tidak jelas sama ada kewujudan hipoperfusi dengan kecerunan oksigen menjejaskan sistem pertahanan terhadap hipoksia, HIF. Dalam kajian ini, kami menyiasat taburan HIF dalam sel tubul proksimal berbudaya di bawah model hipoperfusi dan mendapati bahawa kecerunan oksigen dalam sel tubular renal berbudaya telah berjaya dimodelkan menggunakan penutup kaca bulat. Bukti daripada eksperimen menggunakan ketegangan oksigen homogen menunjukkan bahawa HIF-1 , yang hidroksilasinya dan degradasi seterusnya kebanyakannya bergantung kepada oksigen, terkumpul. Itulah jumlah HIF-1 meningkat apabila ketegangan oksigen berkurangan. Walau bagaimanapun, dalam model coverslip kami, HIF-1 telah ditindas di kawasan anoksik dan mempunyai pengumpulan tertinggi pada jarak tertentu dari tepi coverslip. Pengumpulan HIF berbentuk donat ini tidak pernah ditunjukkan sebelum ini. Kami menunjukkan bahawa gerakan cincin HIF boleh diperhatikan tanpa mengira ketegangan oksigen atmosfera pengeraman, tetapi lokasinya bergantung kepada ketegangan oksigen. Julat ketegangan oksigen pada cincin HIF diukur pada kira-kira 4-20 mmHg menggunakan PLIM dengan BTPDM1. Kebanyakan kajian terdahulu, yang tertumpu pada sel-sel kultur dalam suasana dengan ketegangan oksigen homogen, mendapati bahawa jumlah protein HIF{12}} meningkat dalam julat hipoksik atau anoksik (Ameri et al., 2002; Carrera et al. , 2014). Oleh itu, dalam model kami, pembentukan cincin HIF mestilah dipengaruhi oleh faktor selain daripada ketegangan oksigen; ia bebas daripada Ph.D., proses pengehadan kadar kemerosotan HIF. Satu kejayaan dalam penjelasan mekanisme pembentukan cincin HIF ialah penemuan kami tentang peranan kecerunan pH, serta kecerunan oksigen, dalam model penutup bibir, yang mengehadkan aliran masuk media yang serupa dengan hipoperfusi in vivo. model. Dalam model hipoperfusi ini, pH intraselular menurun apabila jarak dari tepi gelincir penutup meningkat, dan kecerunan pH diperhatikan di sekeliling tepi gelincir. Kami menunjukkan bahawa pengumpulan HIF{18}} telah ditindas pada pH rendah, sekitar pH 5.0, berbanding dengan pengeraman pada sekitar pH neutral di bawah ketegangan oksigen homogen. Tepi luar gelang HIF mengembang ke luar pada pH 6.5, dan pinggir dalam gelang HIF mengecut ke dalam pada pH 8.5, berdasarkan tepi kawasan positif pimonidazole. Cincin HIF dikaburkan dalam keadaan berasid dan isyarat HIF-1 hilang pada pH 5.0. Oleh itu, kami menjelaskan kepentingan pH untuk pembentukan cincin HIF dalam model coverlip. Kami menunjukkan kemungkinan bahawa gelang HIF dibentuk oleh penindasan pengumpulan HIF-1 oleh pH rendah di dalam gelang.

Beberapa kajian lepas menggunakan kaedah coverslip telah menggunakan sel kanser. Menurut satu laporan menggunakan garisan sel hepatoma manusia Hep3B, yang menyatakan anjakan merah yang bergantung kepada oksigen bagi protein pendarfluor hijau (AcGFP1), pengimejan hidup sel yang ditutup dengan penutup penutup segi empat tepat menunjukkan anjakan merah apabila jarak dari tepi penutup penutup meningkat (Takahashi & Sato, 2010). Spektrum pelepasan sel hepatoma beralih daripada panjang gelombang pendarfluor protein pendarfluor hijau (GFP) kepada merah apabila ketegangan oksigen berkurangan. Dalam kajian lain, ketegangan oksigen sel SCC-7 dengan penutup penutup 15-mm bulat telah diukur menggunakan teknik seumur hidup phosphorescence. Ketegangan oksigen ialah 6.9 mmHg dan 166 mmHg, dikira daripada PL, iaitu 3.89 µs dan 893 µs, 0–2 mm di dalam, dan 0–1 mm di luar tepi penutup, masing-masing (Yoshihara et al., 2015). Kaedah coverslip juga telah digunakan dengan myocytes jantung, sistem yang telah menarik perhatian sebagai model iskemia-reperfusi in vivo yang menjanjikan. Kelly et al menunjukkan bahawa miosit yang ditutup dengan penutup penutup mengalami perubahan morfologi yang ketara dari masa ke masa, disertai dengan perubahan dalam potensi membran mitokondria dan dinamik membran plasma, akhirnya mengakibatkan kematian miosit. Mereka juga menunjukkan bahawa pH intraselular miosit yang dilitupi dengan coverslip turun dengan cepat kepada kira-kira pH 4 di tengah coverslip (Pitts & Toombs, 2004). Model gelincir penutup, menghalang oksigen atau resapan pemakanan kepada sel kultur di bawah slip penutup, boleh meniru model in vivo zon iskemia, normal dan marginal di bahagian tengah, luar dan tepi kulit penutup masing-masing. Beberapa kajian telah menggunakan model ini sebagai model iskemia-reperfusi myocytes in vitro (Chun et al., 2015; Pitts et al., 2008; Solhjoo & O'Rourke, 2015; Wang et al., 2012). Untuk pengetahuan terbaik kami, kajian kami adalah yang pertama menggunakan kaedah coverslip pada sel tiub. Dalam sistem kami, jarak dari tepi coverslip ke kawasan yang bersamaan dengan 10 mmHg ketegangan oksigen, di mana pimonidazole sepatutnya bertukar positif, ialah 1.22 mm, dan ketegangan oksigen menurun kepada serendah sifar dalam jarak 2 mm dari tepi coverslip. . Keputusan ini mungkin serasi dengan laporan terdahulu yang menggunakan slip penutup 15 mm, menunjukkan kewujudan kecerunan oksigen sekurang-kurangnya dalam 2 mm dari tepi (Akiyama et al., 2018; Yoshihara et al., 2015). Kami memeriksa kadar apoptosis sel di bawah coverlips (Rajah S11) dan mendapati bahawa GAPDH dan aktin dikekalkan walaupun di dalam cincin HIF, menunjukkan bahawa cincin HIF bukan disebabkan hanya oleh apoptosis sel atau kematian di dalam cincin HIF.

Beberapa kajian telah mengukur ketegangan oksigen dalam buah pinggang menggunakan kaedah yang berbeza. Beberapa contoh pengukuran ketegangan oksigen buah pinggang normal adalah seperti berikut: 50 mmHg dan 30 mmHg dalam korteks dan medula menggunakan mikroelektrod; dan 49 mmHg dan 41 mmHg dalam segmen S1 dan S2 sel tubular korteks menggunakan PLIM (Hirakawa et al., 2017, 2018; Zhang et al., 2014). Ketegangan oksigen buah pinggang yang sakit akan menjadi lebih rendah. Menurut laporan sebelumnya menggunakan mikroelektrod oksigen, tikus diabetes mempunyai ketegangan oksigen parenkim buah pinggang yang lebih rendah: 36 mmHg dan 11 mmHg dalam korteks dan medula masing-masing (Heyman et al., 2013; Palm et al., 2003). Oleh kerana mikroelektrod oksigen mengukur ketegangan oksigen parenkim purata, julat yang lebih luas dijangkakan pada buah pinggang yang sakit. Ketegangan oksigen intraselular menurun kepada sifar mmHg dalam model buah pinggang iskemia yang arteri dan vena renal sisi diapit (Hirakawa et al., 2015). Memandangkan penemuan ini, julat ketegangan oksigen pada cincin HIF, kira-kira 4-20 mmHg, nampaknya munasabah dalam vivo.

Kami selanjutnya mendapati bahawa pH mempengaruhi pembentukan cincin HIF serta ketegangan oksigen. Oleh kerana sel epitelium tiub dalam buah pinggang sentiasa terdedah kepada cecair kencing, pH sel tiub harus dipengaruhi oleh air kencing. Memandangkan julat pH yang luas dalam air kencing, kami memutuskan untuk mengkaji sel yang diinkubasi pada julat pH 5.0–8.5. Terdapat kajian tentang julat pH dalam buah pinggang normal. Satu kajian mendapati bahawa pH korteks ialah 7.39 ± 0.{{10}}8, dan medula ialah 7.20 ± {{2{{39} }}}.09, seperti yang diukur menggunakan mikroelektrod (Burke et al., 1999). Satu lagi kajian, menggunakan pengimejan pH berasaskan MRI, menunjukkan nilai pH 7.3 ± 0.13 dan 7.0 ± 0.29 masing-masing (Raghunand et al., 2003). Telah dilaporkan bahawa pH buah pinggang menurun daripada 6.5 kepada 6.32, dan serendah 5.83 dalam kes yang teruk, dalam model tikus CKD dengan asidosis (Pavuluri et al., 2019). Pemerhatian ini telah memberikan bukti penurunan pH dan variasi dalam CKD. Walau bagaimanapun, kesan pH pada HIF-1 yang disebabkan oleh hipoksia kronik dalam CKD belum cukup diteliti dengan baik. Dalam kajian ini, peralihan cincin HIF telah diperhatikan antara pH 6.5 dan pH 7.4, julat pH yang munasabah dalam CKD. Keputusan ini menyokong hipotesis bahawa penurunan sederhana dalam pH mempengaruhi pengumpulan HIF{37}} dalam CKD. Berdasarkan bukti penurunan pH di bawah 6.0 dalam kes CKD yang teruk, adalah perlu juga untuk menilai keadaan fisiologi HIF{40}} pada pH yang lebih rendah. Walaupun terdapat laporan bahawa persekitaran berasid, walaupun dalam normoxia, menstabilkan HIF-1 , kebanyakan laporan ini menyiasat keadaan keasidan ringan, melebihi pH 6.0 (Filatova et al., 2016; Mekhail et al., 2004) . Dalam kerja ini, kami menunjukkan penindasan pengumpulan HIF-1 dalam sel tiub pada pH 5.0 dan pengecilan isyarat HIF-1 dalam model kulit muka yang diinkubasi pada pH 5.0. Oleh itu, penurunan pH buah pinggang dalam CKD in vivo mungkin dikaitkan dengan pengaktifan HIF yang tidak mencukupi, serta dengan toksin uremik dalam buah pinggang hipoksik, memburukkan lagi perkembangan CKD (Tanaka et al., 2013).

Kajian kami mempunyai beberapa batasan. Pertama, dalam kawasan hipoperfusi, media kultur harus kekurangan nutrien, di samping kehadiran kekurangan oksigen dan penurunan pH. Walau bagaimanapun, adalah sukar untuk menggambarkan kesan pH, ketegangan oksigen, dan faktor lain yang disebabkan oleh hipoperfusi. Di dalam badan, iskemia, hipoperfusi patologi darah yang disebabkan oleh gabungan oksigen yang rendah dan nutrien yang rendah, berlaku dalam organ dan sel. Adalah penting untuk memahami perbezaan antara penderiaan hipoksia dan penderiaan iskemia. Walaupun kesukaran untuk menjelaskan kesan biologi setiap faktor, model hipoperfusi kami adalah munasabah dari segi fisiologi, meniru status patologi dalam vivo. Kedua, membuat model coverslip memerlukan kemahiran dan latihan, memandangkan majoriti sel kadangkala menjadi tertanggal semasa mengeluarkan coverslip, terutamanya apabila menggunakan kaedah tradisional (Rajah S2a). Isu ini bergantung pada talian sel yang digunakan. Sebagai contoh, sukar bagi kami untuk menggunakan model kulit muka pada sel HEK 293 kerana lekatannya pada kulit muka adalah agak lemah. Ketiga, adalah wajar untuk meminimumkan kerosakan pada sel kultur di bawah slip penutup. Bilangan sel yang rosak meningkat apabila tempoh di mana ia dilindungi meningkat, seperti yang ditunjukkan oleh analisis apoptosis. Kami menentukan bahawa 3 jam adalah sesuai untuk menganggarkan cincin HIF apabila ia kelihatan statik, dan kira-kira sekurang-kurangnya 10 peratus sel menjadi apoptosis (Rajah S11). Batasan keempat ialah kesukaran untuk melampirkan sel-sel kultur ke slip penutup dengan cara yang seragam dalam setiap sampel (Rajah S2b, c). Perbezaan dalam lampiran antara kaedah tradisional dan kaedah alternatif untuk membuat model penutup bibir juga boleh menjejaskan kajian. Kami mengukur julat ketegangan oksigen yang bersamaan dengan gelang HIF dengan teknik seumur hidup phosphorescence, di mana kami mencipta model coverslip menggunakan kaedah tradisional. Oleh kerana cincin HIF semasa imunositokimia divisualisasikan menggunakan kaedah alternatif, ketegangan oksigen sebenar mungkin berbeza. Kami meminimumkan kesilapan ini dengan menggunakan bukti bahawa pimonidazole adalah positif pada 10 mmHg atau kurang daripada ketegangan oksigen. Batasan kelima ialah pH intraselular tidak semestinya sama dengan pH medium kultur. Beberapa laporan lepas telah menunjukkan bahawa pH intraselular adalah konsisten dengan pH sederhana pada tahap tertentu dalam sel berbudaya (Michl et al., 2019), kita boleh menilai hanya trend dalam pH intraselular dengan menukar pH sederhana. Dalam vivo, hubungan antara pH kawasan intrasel dan ekstrasel, seperti air kencing atau cecair badan, adalah lebih rumit daripada sel yang dikultur. Oleh itu, kajian lanjut tentang cara peralihan pH mengawal pengumpulan protein HIF-1 dalam vivo akan diperlukan untuk masa hadapan.

Faedah cistanche: bertambah baik buah pinggangfungsi

Batasan lain ialah pH harus mempunyai kesan pada penanda hipoksia, pimonidazole. Kami membandingkan jarak pinggir kawasan positif-pimonidazole dari pusat slip penutup di bawah keadaan pH yang berbeza dalam model kulit penutup kami. Tepi kawasan positif pimonidazole adalah setanding antara pH 6.5, 7.4, dan 8.5 (Rajah S12a, b). Kajian terdahulu juga menunjukkan pengekalan pengikatan pimonidazole pada nilai pH yang berbeza (Kleiter et al., 2006). Berdasarkan bukti ini, kami membuat kesimpulan bahawa pimonidazole ialah penanda hipoksia yang sesuai untuk eksperimen coverslip kami. Batasan terakhir ialah diberikan julat ketegangan oksigen antara kira-kira 4 mmHg dan 20 mmHg (0.52 peratus O2 hingga 2.6 peratus O2) cincin HIF, Pt(II)- dan Pd(II)-porphyrin, yang digunakan secara meluas sebagai biologi. probe oksigen, mempunyai kelebihan untuk mengukur kepekatan oksigen yang sangat rendah kerana jangka hayat phosphoresensinya yang jauh lebih lama berbanding dengan yang menggunakan kompleks Ir(III) (Yoshihara et al., 2017). Walau bagaimanapun, secara amnya, pengukuran oksigen kuantitatif berdasarkan pendarfluor, dikira menggunakan persamaan Stern-Volmer, mempunyai prestasi yang lebih baik pada julat O2 yang rendah (Papkovsky & Zhdanov, 2016). Beberapa kajian terdahulu telah menunjukkan pengukuran ketegangan oksigen berasaskan kompleks Ir(III) serendah kira-kira 10 mmHg (Akiyama et al., 2018; Yoshihara et al., 2015). Oleh itu, kami percaya bahawa julat ketegangan oksigen cincin HIF haruslah hasil yang tepat.

5|KESIMPULAN

Ringkasnya, kami mendapati bahawa memahami peranan kedua-dua oksigen dan pH adalah penting untuk memahami keadaan fisiologi HIF-1 dalam CKD dan boleh diperoleh dengan menyiasat sel tiub dengan hipoperfusi. Model coverlip, dengan batasan aliran masuk media, adalah model hipoperfusi yang baik dalam vivo, terutamanya dalam tubul dalam CKD, kerana jarang kapilari peritubular adalah ciri utama CKD (Mimura & Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). Model hipoperfusi ini juga boleh meniru oksigen dan kecerunan pH dalam vivo, seperti tumor dan lesi iskemia. Model ini menyediakan pendekatan yang menjanjikan untuk penjelasan mekanisme biologi ini.

KONFLIK KEPENTINGAN

Semua pengarang tidak mempunyai konflik kepentingan untuk diisytiharkan.

SUMBANGAN PENULIS

Semua pengarang menyumbang kepada pembentukan konsep keseluruhan. TH melakukan eksperimen keseluruhan. TH dan YH menganalisis keputusan dan membuat angka. TH menulis manuskrip asal. KM, TY, dan ST melakukan eksperimen menggunakan teknik seumur hidup phosphorescence dan menyunting bahagian manuskrip. YH, TT, dan MN menyunting keseluruhan manuskrip. Semua penulis telah membaca dan meluluskan manuskrip akhir.

RUJUKAN

Akiyama, H., Takahashi, I., Shimoda, Y., Mukai, R., Yoshihara, T., & Tobita, S. (2018). Ir(iii) pengimejan oksigen berasaskan kompleks sel hidup dan fundus okular dengan kamera ICCD berpagar. Sains Fotokimia dan Fotobiologi, 17(6), 846–853.

Akizawa, T., Nangaku, M., Yamaguchi, T., Arai, M., Koretomo, R., Maeda, K., Miyazawa, Y., & Hirakata, H. (2019). Enarodustat, terapi penukaran dan penyelenggaraan untuk anemia dalam pesakit hemodialisis: Percubaan fasa 2b terkawal plasebo secara rawak diikuti dengan percubaan jangka panjang. Nephron, 143(2), 77–85.

Ameri, K., Burke, B., Lewis, CE, & Harris, AL (2002). Kawal selia unsur VL30 tikus dalam sel kanser payudara manusia dalam hipoksia dan anoksia: Peranan HIF-1. British Journal of Cancer, 87(10), 1173– 1181.

Asai, H., Hirata, J., Hirano, A., Hirai, K., Seki, S., & Watanabe- Akanuma, M. (2016). Pengaktifan reseptor aril hidrokarbon mengantara penindasan ekspresi erythropoietin yang bergantung kepada faktor hipoksia oleh indoxyl sulfate. Jurnal Fisiologi Amerika. Fisiologi Sel, 310(2), C142–C150.

Burke, TJ, Malhotra, D., & Shapiro, JI (1999). Faktor mengekalkan kecerunan pH dalam buah pinggang: peranan seni bina vaskular. Antarabangsa Buah Pinggang, 56(5), 1826–1837.

Carrera, S., Senra, J., Acosta, MI, Althubiti, M., Hammond, EM, de Verdier, PJ, & Macip, S. (2014). Peranan faktor transkripsi alfa-1HIF dalam peningkatan pembahagian sel pada ketegangan oksigen fisiologi. PLoS One, 9(5), e97938.

Chen, N., Hao, C., Peng, X., Lin, H., Yin, A., Hao, L., Tao, Y., Liang, X., Liu, Z., Xing, C., Chen, J., Luo, L., Zuo, L., Liao, Y., Liu, BC, Leong, R., Wang, C., Liu, C., Neff, T., … Yu, KHP (2019 ).

Roxadustat untuk anemia pada pesakit dengan penyakit buah pinggang yang tidak menerima dialisis. New England Journal of Medicine, 381(11), 1001– 1010.

Chen, N., Qian, J., Chen, J., Yu, X., Mei, C., Hao, C., Jiang, G., Lin, H., Zhang, X., Zuo, L., He, Q., Fu, P., Li, X., Ni, D., Hemmerich,S., Liu, C., Szczech, L., Besarab, A., Neff, TB, … Valone, F.

H. (2017). Kajian fasa 2 tentang faktor prolyl hydroxylase inhibitor oral hypoxia-inducible inhibitor FG-4592 untuk rawatan anemia di China. Nefrologi, Dialisis, Pemindahan, 32(8), 1373–1386.

Chiang, CK, Tanaka, T., Inagi, R., Fujita, T., & Nangaku, M. (2011). Indoxyl sulfate, toksin uremik yang mewakili, menyekat pengeluaran erythropoietin dengan cara yang bergantung kepada HIF. Penyiasatan Makmal, 91(11), 1564–1571.

Chun, WJ, Nah, DY, Bae, JH, Chung, JW, Lee, H., & Moon, IS(2015). Larutan glukosa-insulin-potassium melindungi miosit ventrikel tikus neonatal dalam model iskemia/reperfusi in vitro coverslip. Korean Circulation Journal, 45(3), 234–241.

Coyne, DW, Goldsmith, D., & Macdougall, IC (2017). Pilihan baru untuk anemia penyakit buah pinggang kronik. Suplemen Antarabangsa Buah Pinggang, 7(3), 157–163. ciuman.2017.09.002

Deng, A., Arndt, MA, Satriano, J., Singh, P., Rieg, T., Thomson,S. et al (2010). Perlindungan buah pinggang dalam penyakit buah pinggang kronik: pengaktifan faktor yang boleh disebabkan oleh hipoksia vs. sekatan angiotensin II. Jurnal Fisiologi Amerika. Fisiologi Renal, 299(6), F1365–F1373.

Filatova, A., Seidel, S., Bogurcu, N., Graf, S., Garvalov, BK, & Acker, T. (2016). Asidosis bertindak melalui HSP90 secara bebas Ph.D./VHL untuk menggalakkan fungsi HIF dan penyelenggaraan sel stem dalam glioma. Penyelidikan Kanser, 76(19), 5845–5856. BOLEH-15-2630

Goldfarb, M., Rosenberger, C., Abassi, Z., Shina, A., Zilbersat, F., Eckardt, KU, Rosen, S., & Heyman, SN (2006). Kegagalan buah pinggang akut dan kronik pada tikus: pampasan berfungsi dan toleransi hipoksia. Jurnal Nefrologi Amerika, 26(1), 22–33.

Heyman, SN, Rosenberger, C., Rosen, S., & Khamaisi, M. (2013). Mengapakah diabetes mellitus merupakan faktor risiko untuk nefropati yang disebabkan oleh kontras? BioMed Research International, 2013, 123589.

Hirakawa, Y., Mizukami, K., Yoshihara, T., Takahashi, I., Khulan, P.,Honda, T., Mimura, I., Tanaka, T., Tobita, S., & Nangaku, M. (2018). Pengimejan seumur hidup phosphorescence intravital bagi korteks buah pinggang dengan tepat mengukur hipoksia buah pinggang. Buah Pinggang Antarabangsa, 93(6), 1483–1489.

Hirakawa, Y., Tanaka, T., & Nangaku, M. (2017). Hipoksia buah pinggang dalam CKD; Patofisiologi dan kaedah pengesanan. Sempadan dalam Fisiologi, 8, 99.