Organoid Buah Pinggang 3D Untuk Terjemahan Bangku ke sisi katil

Kenalan: emily.li@wecistanche.com

Navin Gupta, et al

Abstrak

Buah pinggang adalah organ penting yang menapis darah, mengeluarkan sisa kencing sambil mengekalkan homeostasis cecair dan elektrolit. Model penyelidikan konvensional semasa seperti kultur sel statik dan model haiwan tidak mencukupi untuk memahami situasi in vivo manusia yang kompleks atau kekurangan nilai translasi. Untuk mempercepatkanbuah pinggangpenyelidikan, alat penyelidikan baru diperlukan. Perkembangan terkini telah membenarkan pembezaan terarah sel stem pluripoten teraruh untuk menjana organoid buah pinggang.buah pinggangorganoid menyerupai buah pinggang manusia secara in vitro dan boleh digunakan dalam perubatan regeneratif dan sebagai model perkembangan, ketoksikan dan penyakit. Walaupun kajian semasa telah menunjukkan janji yang besar, cabaran kekal termasuk ketidakmatangan, kebolehulangan terhad, dan kekurangan sistem vaskular dan saluran pengumpul yang boleh meresap. Kajian ini memberikan gambaran keseluruhan pemahaman semasa kami tentang nefrogenesis yang membolehkan penjanaan organoid buah pinggang. Seterusnya, aplikasi yang berpotensi bagibuah pinggangorganoid dibincangkan diikuti dengan perspektif masa depan. Kajian ini mencadangkan bahawa kemajuan dalam penyelidikan organoid buah pinggang akan dipermudahkan melalui peningkatan pengetahuan kami tentang nefrogenesis dan menggabungkan teknik yang menjanjikan seperti model organ-on-a-chip.

Kata kunci Organoid buah pinggang. Sel stem. Kejuruteraan bio.Nefron

Klik di sini untuk mendapatkan maklumat lanjut tentang Cistanche untuk buah pinggang

pengenalan

Buah pinggang adalah organ penting yang menapis darah untuk menghasilkan sisa metabolik, yang ditakdirkan untuk pembuangan air kencing. Buah pinggang mempunyai keplastikan yang luar biasa dalam menyesuaikan komposisi air kencing, memadankan pengambilan dengan perkumuhan untuk mengekalkan homeostasis terlarut dan keseimbangan cecair. Oleh kerana buah pinggang mamalia adalah organ bukan regeneratif, kehilangan unit berfungsi, atau nefron, terkumpul dari semasa ke semasa dalam semua individu [1]. Penyakit sistemik prevalens tinggi, iaitu hipertensi dan diabetes mellitus, ubat-ubatan atau akut yang disebabkan oleh hemodinamikbuah pinggangkecederaan(AKI), dan penyakit utama buah pinggang, adalah punca biasa untuk kehilangan fungsi buah pinggang yang cepat dan terdiri daripada etiologi utama untuk penyakit buah pinggang kronik (CKD) [2]. CKD dibahagikan kepada peringkat berdasarkanbuah pinggang disfungsi, yang menyebabkan gangguan terlarut dan ketidakseimbangan cecair yang bertanggungjawab untuk morbiditi dan kematian yang meluas. Di Amerika Syarikat, CKD mempunyai prevalens yang dilaporkan sebanyak 14 peratus [3], mempunyai kos rawatan tahunan sebanyak $120 bilion [4], memberi kesan negatif kepada kualiti hidup [5], dan pada peringkat lanjut memuncak pada penyakit buah pinggang peringkat akhir ( ESRD), yang memerlukan keperluan untuk terapi penggantian buah pinggang (RRT). Bentuk RRT termasuk dialisis dan pemindahan, yang pertama menyumbang 7 peratus daripada bajet Medicare [6] dan yang terakhir dihadkan oleh bekalan organ yang sesuai [7]. CKD dan ESRD memberikan beban utama kepada sumber dan kos penjagaan kesihatan, serta pesakit yang menghidap penyakit ini [8].

Untuk menangani beban ini, penyelidikan asas dan translasi telah dijalankan dalam bidangbuah pinggang pembangunan, ujian nefrotoksisiti, pemodelan penyakit, dan ubat regeneratif buah pinggang. Alat penyelidikan tradisional terdiri daripada kultur sel in vitro, daripada kedua-dua sel buah pinggang primer yang terpencil dan garisan sel diabadikan yang diubah secara virus, dan model haiwan in vivo. Walaupun model biasa ini telah digunakan untuk mengkaji fisiologi dan patologi buah pinggang dengan beberapa kejayaan, mereka mempunyai batasan yang wujud yang mungkin menyumbang kepada terjemahan kajian makmal yang lemah kepada terapi klinikal [9]. Model in vitro sebahagian besarnya terhad kepada analisis jenis sel tunggal, mengabaikan kesan interaksi antara sel dan persekitaran dalam tisu heterogen kompleks, seperti buah pinggang. Model haiwan, manakala integratif sistem badan, dihadkan oleh perbezaan antara spesies, mengakibatkan kesimpulan tidak setia yang datang dengan perbelanjaan masa dan kos yang tinggi [10]. Kaedah eksperimen baru dalam sel dan tisu manusia adalah satu keperluan untuk mengatasi batasan teknik penyelidikan tradisional [11].

Memandangkan keperluan adalah ibu kepada inovasi, kemajuan dalam protokol menggunakan sel stem pluripotent manusia (hPSCs) telah menghasilkan tisu tiga dimensi, multiselular dan khusus organ yang kompleks, yang dipanggil organoid. Hati, paru-paru, jantung, usus, dan organoid buah pinggang membenarkan eksperimen dalam tisu manusia secara in vitro [12]. Secara teori, tisu yang merangkumi keseluruhan soma manusia boleh dihasilkan semula pada skala, berdasarkan hPSC yang menentukan ciri pluripotensi dan pembaharuan diri. Dua jenis hPSC ialah sel stem embrionik manusia (ESCs) dan sel stem pluripotent yang disebabkan oleh manusia (iPSCs). Pada tahun 1998, Thomson et al. pertama kali menerangkan penjanaan garis ESC yang diperoleh daripada blastokista manusia. Untuk mengelakkan kontroversi yang berkaitan dengan asal embrio ESC, pada tahun 2006, Takahashi et al. menerangkan kaedah revolusioner untuk mendorong pluripotensi dalam sel somatik yang dibezakan secara terminal. Disebut iPSC, sel-sel ini dibentuk oleh pengaktifan transkrip faktor Yamanaka (Oct4, Sox2, Klf4, dan c-Myc) [13]. Selain daripada mengelakkan isu etika, iPSC membenarkan lagi pendekatan perubatan yang diperibadikan. iPSC mewakili bekalan sel tanpa had yang isogenik kepada sel somatik ibu bapa mereka [13]. iPSC khusus pesakit dengan mutasi yang berlaku secara semula jadi boleh digunakan untuk menjana model penyakit yang berkaitan secara klinikal dalam tisu manusia, terutamanya dalam keadaan yang tiada model haiwan wujud. Dalam model penyakit yang boleh diwarisi, kawalan yang diperbetulkan genom boleh mewujudkan hubungan langsung antara genotip dan fenotip [14]. Pendekatan perubatan regeneratif imunokompeten mungkin menggunakan pukal, tisu khusus organ yang dihasilkan daripada iPSC pesakit, menafikan keperluan untuk imunosupresi dan memintas kekurangan organ transplanable [15]. Memanfaatkan utiliti translasi hPSC, terutamanya iPSC, boleh merevolusikan bidang pembangunan ubat dan pemindahan organ yang membawa kepada hasil yang dramatik untuk kesihatan dan penyakit manusia.

Keupayaan hPSC untuk menyusun semula semua sel badan menimbulkan cabaran besar, khususnya, cara mengawal pembezaan terhadap jenis sel dan tisu tertentu yang diminati. Organogenesis mamalia berfungsi sebagai archetype untuk pembezaan terarah, induksi urutan yang cekap bagi jenis sel perantaraan yang berlaku semasa perkembangan organ [16]. Sebaliknya, pengaturcaraan semula langsung melibatkan induksi faktor transkripsi khusus jenis sel, memintas jenis sel perantaraan semasa penukaran sel somatik ke arah populasi sasaran yang ditentukan. Walaupun mendapat manfaat daripada metodologi yang lebih mudah, pengaturcaraan semula langsung sering mengakibatkan penukaran yang tidak lengkap kepada sel sasaran disebabkan oleh profil metilasi DNA dan epigenetik sel ibu bapa [17]. Walaupun pengaturcaraan semula langsung berlaku dengan penukaran lengkap, hasilnya mungkin menjadi populasi selular yang seragam [18]. Berkenaan dengan buah pinggang, lebih daripada sedozen jenis sel berbeza menyumbang kepada struktur dan fungsi nefron dalam vivo. Penyusunan semula nefron akan memerlukan pengaturcaraan semula terus kepada nenek moyang yang sama bagi semua jenis sel yang menyumbang, iaitu, sel progenitor nefron, sel progenitor endothelial, dan sel progenitor stromal [19]. Pendekatan yang diperlukan semula untuk membangunkan tisu yang serupa dengan buah pinggang asli adalah diarahkan pembezaan, kaedah yang didasarkan pada pengetahuan mendalam tentang perkembangan buah pinggang. Dalam ulasan ini, kami menyerlahkan peranan penting yang dimainkan oleh biologi perkembangan buah pinggang dalam penjanaan organoid buah pinggang yang berasal dari hPSC, mengulas secara ringkas tentang aplikasi teknologi organoid buah pinggang, dan membincangkan arah masa depan yang menangani batasan dan cabaran semasa kepada terjemahan klinikal.

Perkembangan buah pinggang

Pembangunan buah pinggang berfungsi sebagai piawai emas untuk pembezaan terarah, untuk menghasilkan tisu in vitro yang paling biosimilar dengan rakan sejawatnya dalam vivo. Dekad kajian perkembangan dalam model mamalia mendedahkan bahawa laluan Wnt, FGF, asid retinoik, dan TGF-/BMP mengawal morfogenesis, corak tisu, dan induksi primordia organ [12]. Laluan ini penting untuk perkembangan berulang tisu merentasi 3 lapisan kuman, termasuk buah pinggang yang berasal dari mesoderm. Mesoderm, diapit di antara lapisan endodermal dan ektodermal, dicorakkan oleh gastrulasi hPSCs (epiblast anterior) melalui coretan primitif, struktur sementara yang mentakrifkan paksi anterior-posterior dan medial-lateral embrio yang sedang berkembang [12]. Paksi anterior-posterior mesoderm ditentukan oleh tempoh involusi melalui coretan primitif dengan pendedahan temporal kepada isyarat Wnt, kerana hPSC yang terlibat melalui coretan primitif berhijrah ke anterior untuk mula menyumbang kepada struktur anterior, mengisi posterior selepas itu [1]. Paksi medial-lateral mesoderm ditentukan oleh kecerunan BMP rostrocaudal dalam coretan primitif, kerana hPSC yang mengalami gastrulasi melalui coretan primitif rostral (aktiviti BMP rendah) menjadi mesoderm paraxial, melalui coretan pertengahan primitif (aktiviti BMP sederhana) menjadi mesoderm perantaraan (IM), dan melalui coretan primitif ekor (aktiviti BMP tinggi) menjadi mesoderm plat sisi [20, 21]. Dalam coretan primitif, tempoh isyarat Wnt dan darjah isyarat BMP adalah penentu utama corak di seluruh lapisan kuman mesodermal.

Dalam perkembangan buah pinggang mamalia, terdapat 3 peringkat nephric, pronephros, mesonephros, dan metanephros, yang semuanya berasal dari mesoderm. Kajian pada tikus mendedahkan bahawa metanephros, yang berterusan sebagai buah pinggang dewasa, berasal daripada induksi timbal balik dua tisu yang diperolehi IM, mesenchyme metanephric (MM) dan putik ureter (UB) [22]. MM terdiri daripada sel progenitor nefron (NPC) yang diselingi dengan sel stromal, manakala UB terbentuk sebagai sisa outpouching dari saluran Wolffian, struktur degeneratif yang mengalirkan mesonephros primitif ke kloaka [23]. NPC pekat mesenkim topi MM menjalani morfogenesis progresif daripada badan berbentuk koma kepada berbentuk S, yang secara segmennya membezakan ke dalam struktur epitelium bersebelahan yang terdiri daripada nefron, iaitu, podosit, tubul proksimal, gelung Henle, tubul distal, dan tubul penghubung [ 24–27]. Tubul penghubung nefron individu berkumpul dalam sistem pengumpulan bercabang yang diperoleh daripada UB, berikutan induksi timbal balik antara kedua-dua tisu [28]. Isyarat Wnt terbitan UB memangkinkan peralihan mesenchymal-to-epithelial (MET) NPC kepada epithelia nefron [29], manakala isyarat GDNF yang diperolehi MM melalui kompleks Ret/GFRA1 mengawal morfogenesis percabangan [30] (Rajah 1).

Rajah 1 Perkembangan buah pinggang manusia daripada coretan primitif kepada nefron matang. [1] Jalur primitif (PS) menimbulkan mesoderm dan seterusnya mesoderm perantaraan (IM) dari mana IM posterior (PIM) dan IM anterior (aIM) boleh dibezakan semasa gastrulasi awal. [2] Mesenchyme metanephric (MM) yang merangkumi sel progenitor nefron (NPC) dan sel stromal terbentuk daripada PIM manakala aIM membentuk saluran Wolffian dari mana tunas ureter (UB) berkembang. UB mula bercabang dengan NPC, sel progenitor stromal (SPC), dan sel progenitor endothelial (EPC). Pada peringkat ini, vasculature tidak menyusup ke dalam populasi NPC. [3] Seterusnya, NPC membina vesikel buah pinggang yang membentuk badan berbentuk koma diikuti oleh badan berbentuk s. Akhirnya, struktur ini bersambung dengan UB dan menjadi nefron matang. Darah ditapis dalam glomerulus (kelabu) yang menggerakkan ultrafiltrat ke tubul pengumpul (kuning) melalui tubul proksimal (oren), gelung Henle (biru), dan tubul distal (hijau). Penanda yang sepadan dengan setiap struktur diberikan.

Satu kejayaan besar dalam pemahaman kami tentang perkembangan buah pinggang berlaku pada tahun 2014 apabila Taguchi et al. secara tidak dijangka mendapati bahawa prekursor T plus MM berbeza dari segi perkembangan daripada Osr1 plus progenitor UB [31], menggunakan teknik pengesanan keturunan, dengan menyatakan bahawa kerja terdahulu mencadangkan keturunan yang sama dalam Osr1 ditambah IM tanpa persempadanan lanjut [22]. Dalam kajian yang dinyatakan di atas, tetikus Osr1-GFP telah digunakan untuk menentukan bahawa Osr1 dinyatakan pada masa yang berbeza dan lokasi yang berbeza dalam zon nefrik IM. Dengan analisis histologi dan menyusun/mengagregatkan semula sel OSR1-GFP pada peringkat pembangunan yang berbeza, penulis dapat menunjukkan bahawa IM anterior menyumbang kepada mesonephros, duktus mesonephric (saluran Wolffian) dan tunas ureterik (outpouching of the Saluran Wolffian), manakala IM posterior mengandungi Enam2 ditambah Sall1 ditambah NPC MM yang membezakan ke dalam sel epitelium nefron. Penentuan bahawa MM berasal dari IM posterior, dan UB dari IM anterior, bersama-sama dengan ekspresi penanda ciri, menyediakan peta jalan untuk induksi khusus garis keturunan khusus buah pinggang dan telah membolehkan protokol pembezaan terarah untuk mendorong nefron yang diperolehi MM dengan cekap. epithelia tanpa pencemaran derivatif IM lain. Yang penting, kajian sejarah menganggap perkembangan buah pinggang tikus mencerminkan nefrogenesis manusia. Membandingkan pembangunan buah pinggang manusia dan tetikus, kajian baru-baru ini telah menjelaskan kedua-dua ciri konvergen dan berbeza, termasuk pembentukan lobus, organisasi niche progenitor, dan ekspresi penanda penentu jenis sel anggapan [32]. Dalam kajian sedemikian, data buah pinggang manusia telah diperolehi daripada tisu embrio selepas kematian, membolehkan pandangan yang bertentangan dengan eksperimen. Kemunculan organoid buah pinggang yang berasal dari hPSC membenarkan hipotesis yang boleh diuji dalam pembangunan buah pinggang manusia, antara aplikasi translasi.

organoid buah pinggang 3D

Perkembangan terkini telah membolehkan pembentukan organoid buah pinggang daripada sel stem pluripotent yang disebabkan oleh manusia (hiPCS) melalui pembezaan terarah [33], menjana platform translasi novel untuk pembangunan ubat dan teknik perubatan regeneratif. Organoid ialah organ in vitro mini yang menyusun sendiri daripada sel (stem) dalam persekitaran mikro 3D. Mereka mempamerkan persamaan yang tinggi dengan rakan in vivo mereka dari segi morfologi tisu, kiraan sel, percambahan, dan pembezaan [34].

Selepas menggambarkan asal-usul MM dan UB yang berbeza semasa perkembangan buah pinggang mamalia dan bekerja ke belakang dalam pendekatan langkah demi langkah untuk mengenal pasti peringkat pertengahan dan ekspresi penanda ciri mereka, Taguchi et al. menetapkan protokol pembezaan terarah untuk MM dalam kedua-dua tetikus dan PSC manusia [31]. Khususnya, badan embrioid yang terbentuk daripada OCT3/4 ditambah SOX2 ditambah hPSC tertakluk kepada isyarat Wnt dan BMP4 yang dilanjutkan untuk mendorong T ditambah CDX2 ditambah mesoderm yang baru lahir, yang ditakdirkan untuk menyumbang kepada sel-sel mesoderm yang baru lahir posterior. Paksi medial-lateral mesoderm diarahkan ke WT1 ditambah HOXD11 ditambah OSR1 ditambah IM posterior dengan rawatan serentak dengan BMP4, Activin, dan asid retinoik. Seterusnya, Wnt dan FGF9 rendah digunakan untuk menyokong pembangunan OSR1 campur ENAM ditambah SALL1 ditambah WT1 ditambah NPC, dengan kecekapan aruhan yang dilaporkan sebanyak ~62 peratus . Walaupun NPC dihasilkan daripada kedua-dua tetikus dan PSC manusia, kultur dengan saraf tunjang embrio tetikus diperlukan untuk membezakannya lagi ke dalam tubul proksimal, tubul distal, dan kelompok podosit.

Menggunakan kedua-dua hESC dan hiPSC dalam budaya monolayer, Morizane et al. menerangkan protokol pembezaan terarah yang mendorong ENAM ditambah SALL1 ditambah WT1 ditambah NPC dengan kecekapan sehingga 90 peratus mengikut hari pembezaan 8–9. Secara ringkasnya, isyarat Wnt yang dilanjutkan menyebabkan coretan primitif lewat yang tertakluk kepada aktivin untuk membentuk PIM, yang dibezakan kepada NPC sebagai tindak balas kepada FGF9. NPC kemudiannya diagregatkan dalam budaya suspensi tiga dimensi melalui sentrifugasi, tertakluk kepada denyutan sementara CHIR99021 (CHIR) untuk mensimulasikan isyarat Wnt terbitan UB untuk memangkinkan MET dalam NPC, dan terus tertakluk kepada FGF9 untuk mengembangkan dan mengekalkan kekukuhan Niche NPC [35]. Berikutan denyutan CHIR, MM beralih kepada PAX8 ditambah LHX1 ditambah agregat peritubular, yang seterusnya dibezakan menjadi LAM1 ditambah vesikel buah pinggang mengikut hari pembezaan 14. Dalam pembezaan stokastik (iaitu, tiada faktor lanjut), vesikel buah pinggang bercorak sendiri menjadi seperti nefron. struktur yang terdiri daripada epithelia bersebelahan yang mempunyai pelbagai penanda untuk setiap podosit (NPHS1 tambah PODXL tambah ), tubul proksimal (LTL tambah ), gelung Henle (CDH1 tambah UMOD tambah ), tubul distal (CDH1 tambah UMOD− ), dan tubul penyambung ( CDH1 campur AQP2 tambah ) [36].

Freedman et al. telah menggunakan pendekatan yang berbeza untuk mencipta protokol yang dipermudahkan untuk mendapatkan organoid buah pinggang. Di sini, penulis telah menggunakan kaedah Matrigel sandwic untuk menyediakan persekitaran mikro 3D untuk hPSC untuk membentuk spheroid yang mengelilingi rongga seperti amniotik yang berongga [37]. Melalui pembezaan terarah, spheroid ini dirangsang untuk menjadi organoid buah pinggang dengan protokol dua langkah. Sfera yang terbentuk dirawat dengan CHIR selama 1.5 hari diikuti dengan pendedahan kepada27-media tambahan B. Pada hari ke-10, organoid berbelit, lut sinar, tiub terbentuk selepas peralihan mesenchymal-to-epithelial. Takato et al. telah mengenal pasti ciri-ciri perkembangan kedua-dua saluran pengumpul dan progenitor mesenkim buah pinggang [38]. Di sini, penulis menggunakan maklumat ini untuk mendorong kedua-dua mesenkim metanephric (vs mesonephric) dan epitelium uretik sebanyak 4 hari pendedahan CHIR diikuti dengan pendedahan FGF9 selama 3 hari. Agregat kemudian dibiakkan selama 20 hari, membolehkan organoid terbentuk yang sepadan dengan buah pinggang trimester pertama. Penulis telah mendakwa kehadiran saluran pengumpul dengan kehadiran penanda GATA3 dan ECAD. Walau bagaimanapun, ini kemudiannya dinilai sebagai tidak boleh dipercayai kerana tubul distal dan pengumpulan yang diperoleh daripada MM boleh menyatakan penanda ini juga [39, 40] (Rajah 2).

Rajah 2 Mengarahkan protokol pembezaan untuk menjana organoid buah pinggang yang berasal dari sel stem pluripoten manusia. Persamaan dan perbezaan antara empat protokol untuk menjana organoid buah pinggang manusia divisualisasikan. Setiap protokol yang divisualisasikan termasuk skala masa dalam hari, peringkat perkembangan organoid, dan faktor tambahan untuk memacu pembezaan terarah dan kematangan organoid. Protokol Taguchi et al. dan Takasato et al. menghasilkan organoid pada membran Transwell. Morizane et al. membolehkan penjanaan organoid buah pinggang dalam 96-plat perigi dan Freedman et al. dalam pendekatan sandwic Matrigel

Selepas empat protokol pembezaan terarah di atas diterbitkan pada tahun 2015, beberapa kumpulan telah mengikuti pendekatan yang sama untuk secara berurutan menukar hPSC kepada coretan primitif lewat, PIM, MM, agregat peritubular, vesikel buah pinggang, dan akhirnya organoid buah pinggang [41-44]. Wu et al. melakukan transkriptom sel tunggal sebagai analisis perbandingan antara protokol Morizane dan Takasato, kedua-duanya terhadap satu sama lain dan terhadap buah pinggang janin manusia (kehamilan 16 minggu) dan buah pinggang manusia dewasa (62-lelaki berusia tahun dengan normalbuah pinggangfungsi). Apabila dinilai di bawah keadaan statik pada hari pembezaan ke-26, kedua-dua protokol menghasilkan tisu tidak matang, masing-masing menyatakan ~ 20 peratus faktor transkripsi tubul proksimal dewasa dan podosit [41]. Walau bagaimanapun, Tran et al. menggunakan transkriptomi sel tunggal pada organoid buah pinggang yang dibangunkan menggunakan protokol Morizane untuk menyokong aplikasi podosit yang diperolehi organoid untuk pemodelan penyakit dan pemulihan fungsi penapisan. Podosit daripada organoid berkongsi profil transkrip progresif yang sangat serupa dengan buah pinggang janin manusia dan merekrut vaskular hos pada pemindahan untuk memupuk kematangan selanjutnya [42]. Garreta et al. mendapati bahawa profil transkrip organoid buah pinggang telah diperluaskan kepada buah pinggang janin manusia trimester kedua pada hari ke-16 pembezaan dengan menggunakan hidrogel lembut untuk memanjangkan tempoh persekitaran mikro 3D untuk memudahkan interaksi sel-sel dan sel-matriks [44] . Mengikuti protokol pembezaan yang sama, Low et al. melakukan penjujukan RNA sel tunggal (RNAseq) yang mengenal pasti subset sel progenitor nefron sebagai sumber berpotensi vaskular buah pinggang, yang berbeza daripada kajian dalam pembangunan tetikus yang menunjukkan sumber sebagai FLK1 ditambah sel progenitor endothelial, yang berbeza daripada NPCs MM [45] dan sebahagiannya berasal daripada sel progenitor stromal FOXD1 [46]. Namun, penemuan utama lain termasuk bahawa isyarat Wnt mengawal vaskularisasi dan perkadaran segmen nefron proksimal berbanding distal, pematangan fungsi organoid selepas implantasi, dan pemodelan penyakit buah pinggang polikistik resesif autosomal (ARPKD) menggunakan iPSC yang diperolehi oleh pesakit [43].

Utiliti translasi organoid buah pinggang

Secara amnya, model penyelidikan semasa untuk mengkaji penyakit atau sebatian selalunya terhad kepada kajian sel dan model haiwan. Model sel mudah digunakan dan boleh digunakan dalam jumlah yang tinggi. Walau bagaimanapun, ini selalunya termasuk garisan sel tunggal dan tidak dapat memahami kerumitan buah pinggang in vivo manusia seperti persekitaran mikro 3D dan berbilang sel yang ada. Oleh itu, model sel tidak dapat meniru morfologi tisu 3D in vivo dan persekitaran mikro heterogen dan kompleks. Untuk mengambil kira persekitaran in vivo yang kompleks, model haiwan seperti tikus telah menjadi model penyelidikan konvensional. Walau bagaimanapun, model ini kurang diterjemahkan kepada keadaan manusia [47, 48]. Juga, kebimbangan etika tentang penggunaan haiwan untuk tujuan penyelidikan telah meningkat [49, 50]

Oleh itu, model baru yang boleh meniru secara khusus situasi in vivo manusia dengan lebih tepat diperlukan [51].

Organoid mempunyai potensi untuk mengatasi batasan ini kerana keupayaan uniknya untuk meniru situasi in vivo manusia. Dan kerana organoid berasal daripada hiPSC, ia juga boleh digunakan untuk perubatan peribadi. Contohnya, sebatian tertentu (gabungan) boleh diuji dengan organoid yang diperoleh daripada sel orang tertentu untuk menguji ketoksikan atau keberkesanan. Selain itu, aplikasi berskala besar boleh dilakukan. Sebagai contoh, organoid boleh digunakan sebagai model pra-klinikal untuk menentukan ciri-ciri sebatian tertentu. Selain itu, model penyakit manusia yang boleh dipercayai boleh digunakan dalam ujian klinikal untuk mempercepatkan pembangunan rawatan untuk penyakit yang jarang berlaku yang jarang dialami pesakit.

Walaupun lebih banyak kemajuan diperlukan untuk mencipta buah pinggang yang berfungsi sepenuhnya secara in vitro, kajian sehingga kini menunjukkan janji yang besar. Beberapa kajian telah pun menunjukkan penggunaan organoid buah pinggang seperti sekarang. Kemajuan dalam organoid buah pinggang ini membolehkan aplikasi (masa hadapan) untuk perubatan regeneratif dan sebagai model pembangunan, ketoksikan dan penyakit. Di antara aplikasi translasi ini, organoid juga dianggap sebagai kaedah yang berpotensi untuk aplikasi ubat regeneratif untuk mencipta buah pinggang bioengineered untuk memperkenalkan terapi alternatif kepada dialisis dan pemindahan buah pinggang (Rajah 3). Oleh kerana banyak ulasan telah melaporkan aplikasi translasi yang diterbitkan bagi organoid buah pinggang [1, 52-59], ulasan ini memfokuskan pada generasi masa depan tisu buah pinggang yang berasal dari sel stem yang secara histologi biosimilar dengan buah pinggang manusia asli untuk memudahkan terjemahan penyelidikan organoid buah pinggang. ke arah memberi kesan kepada penjagaan klinikal.

Cabaran semasa dan perspektif masa depan

Buah pinggang adalah organ yang sangat vaskular yang secara kolektif menerima 20 peratus daripada keluaran jantung, menapis sehingga 180 l darah setiap hari [60]. Sembilan belas kilometer kapilari glomerular, dengan luas permukaan ~ 6000 cm2, menyumbang kepada halangan penapisan glomerular (GFB) [61]. Konstituen GFB ialah kapilari glomerulus terfenestrasi, membran bawah tanah glomerular bercas negatif, dan podosit yang mempamerkan diafragma celah antara proses kaki [61]. Struktur GFB menghasilkan fungsinya, penapisan darah berdasarkan saiz dan caj bahan terlarut. Air kencing primitif yang terbentuk daripada penapisan glomerular memasuki tubul nefron, di mana ia diproses oleh mekanisme penyerapan dan rembesan. Daripada sehingga 180 l turasan, ~ 99 peratus diserap dengan hanya 1–2 l yang ditakdirkan untuk pembuangan air kencing dalam keadaan normal. Memandangkan resorpsi volum yang besar dalam kapilari peritubular, adalah tidak menghairankan bahawa beberapa nefron mengalir ke saluran pengumpul berkongsi yang bertumpu di pelvis buah pinggang untuk membentuk ureter tunggal. Struktur keseluruhan, daripada vaskularisasi nefron proksimal yang meluas kepada komunikasi katil kapilari epitelium-peritubular tiub yang meluas kepada saliran nefron distal arborized, memainkan peranan penting dalam fungsi buah pinggang. Buah pinggang mengekalkan fungsi yang agak perlu walaupun kapasiti berkurangan kepada 20 peratus , dengan kebanyakan pesakit ini kekal tanpa gejala. Walau bagaimanapun, pengurangan kepada di bawah 15 peratus sering diterjemahkan kepada keperluan untuk RRT [62, 63]. NPC dengan kebolehan regeneratif hilang pada manusia sebelum dilahirkan, dan oleh itu, nefron tidak boleh diperbaharui semula. Pada masa ini, tiada terapi tersedia untuk menambah fungsi buah pinggang yang hilang, jadi terdapat permintaan yang tinggi untuk aplikasi ubat regeneratif. Selain itu, GFB diperlukan untuk memodelkan penyakit yang menjejaskan penapisan, pengangkutan tiub berfungsi yang diperlukan untuk pelbagai jenis ujian ketoksikan dan pemodelan penyakit, dan gabungan nefron terbitan MM dengan saluran pengumpul terbitan UB yang diperlukan untuk memodelkan kebanyakan anomali kongenital buah pinggang. dan saluran kencing (CAKUT) [64]. Pembangunan vaskular buah pinggang yang teratur dan sistem pengumpulan bercabang akan mewakili lonjakan translasi yang ketara dalam teknologi organoid buah pinggang.

Vaskularisasi organoid buah pinggang

Vaskularisasi buah pinggang melibatkan dua proses yang berbeza: vasculogenesis dan angiogenesis [65]. Dalam vasculogenesis, pemasangan vaskular berlaku secara de novo, manakala angiogenesis melibatkan percabangan atau lanjutan pembuluh yang sedia ada. Interaksi antara kedua-dua proses ini semasa nefrogenesis masih tidak diketahui, namun mikrovessel buah pinggang vaskulogenik mungkin mendahului perkembangan arteri renal angiogenik [65]. Pada tikus, MM tidak mempunyai vasculature semasa pencerobohan tunas uretik tetapi membangunkan rangkaian kapilari yang kaya pada hari berikutnya dengan pembentukan glomeruli vascularized berikutnya. Yang terakhir ini direalisasikan oleh sel endothelial yang menyerang celah vaskular untuk membentuk glomeruli peringkat gelung kapilari tunggal [66-68]. Sementara itu, FLK1 vaskulogenik ditambah sel progenitor endothelial yang berselang-seli dalam MM menyumbang kepada rangkaian kapilari glomerular yang kaya [69]. Sama seperti pendekatan pembezaan terarah untuk membentuk MM ex vivo, vaskularisasi tisu buah pinggang yang berasal dari hPSC harus mengikut asal-usul embrionya untuk membangunkan rangkaian vaskular buah pinggang bercorak dan hierarki.

Organoid buah pinggang 3D yang dibangunkan daripada protokol awal untuk MM yang diperolehi oleh PIM didapati mengandungi sel vaskular; Walau bagaimanapun, glomeruli kekal sebahagian besarnya avaskular, dan jumlah keseluruhan saluran darah adalah lemah jika dibandingkan dengan tisu buah pinggang asli [70]. Yang penting, himpunan saluran darah vaskulogenik ini meniru pembentukan saluran mikro awal dalam pembangunanbuah pinggangtisu, berlaku sebelum pencerobohan arteri renal angiogenik [65]. Dalam kerja mani mereka, Taguchi et al. memindahkan MM tikus teraruh mereka ke dalam tikus, dengan vaskular yang berasal dari hos angiogenik mengakibatkan peningkatan kapilari glomerular. Kluster podosit WT1 ditambah dengan penyetempatan dengan saluran PECAM1 ditambah, yang didapati mengandungi sel darah merah perumah pada pengimejan [31]. Pemindahan subkapsular serupa organoid buah pinggang telah diulang, menunjukkan vasculature dalam glomeruli organoid secara berterusan berasal dari perumah dan pembentukan membran bawah tanah glomerular awal yang terdiri daripada sel endothelial fenestrated dan proses kaki podocyte [71]. Tahap kecil penapisan glomerular telah dituntut pada pemindahan subkutaneus organoid buah pinggang, berdasarkan pengesanan intraselular dalam tubul dekstrans pendarfluor yang ditadbir secara sistemik yang diambil untuk menandakan pengambilan daripada turasan glomerular [72]; bagaimanapun, pengambilan apikal yang didayakan oleh kekurangan persimpangan ketat di seluruh kapsul Bowman ke tubul proksimal atau pengambilan basolateral melalui mekanisme fagositik tiub tidak boleh dikecualikan [73]. Membina berdasarkan kerja mereka di mana organoid buah pinggang yang dipindahkan di bawah kapsul buah pinggang menjadi vaskular oleh perumah dan menunjukkan kematangan glomerular dan tiub [71], baru-baru ini, van den Berg et al. membangunkan sistem in vivo yang elegan menggunakan pengimejan multifoton resolusi tinggi untuk menunjukkan penyaringan glomerular selektif saiz [74]. Terutama, glomeruli vaskularisasi yang terbentuk daripada tisu chimeric interspesies gagal mengatasi batasan yang berkaitan dengan pergantungan berterusan terhadap sistem haiwan, termasuk perbezaan perkembangan dan fisiologi antara spesies, kerugian yang ketara kepada pendekatan perubatan yang diperibadikan, daya pengeluaran yang rendah, dan kos yang tinggi.

Vaskularisasi organoid buah pinggang telah dicapai secara in vitro, dengan hasil yang sama seperti yang dilaporkan dalam eksperimen pemindahan. Dengan mengahwini teknologi organoid dan buah pinggang pada cip untuk menyusun semula persekitaran mikro bendalir dalam vivo, Homan dan Gupta et al. mendapati bahawa tegasan ricih bendalir yang digunakan pada organoid buah pinggang tertanam pada cip memudahkan pembentukan rangkaian vaskular perfusable yang dibangunkan daripada pengembangan dan pembezaan sel progenitor endothelial yang disebabkan bersama. Di samping itu, pengarang menunjukkan peningkatan kekutuban dan kematangan sel epitelium tiub dan podosit, yang menunjukkan proses kaki yang bersempadan dengan kapilari glomerular untuk membentuk GBM primitif [70, 75]. Walaupun organoid buah pinggang dileburkan, berbanding dengan aliran terhad kepada dalam vaskular, penggunaan tegasan ricih bendalir pada keseluruhan organoid mensimulasikan aliran interstisial yang dihasilkan daripada peralihan bendalir petak semasa penyerapan semula ~ 99 peratus daripada turasan glomerular. Dalam erti kata lain, ~ 99 peratus daripada isipadu dalam lumen tiub dihantar merentasi interstitium dan diserap semula oleh kapilari peritubular dalam vivo. Walaupun vasculature perfusable ditunjukkan menggunakan probe pendarfluor, penapisan glomerular tidak disokong oleh pengesanan pendarfluor dalam lumen tiub kerana penggunaan manik yang berdiameter 500 nm, sambil mencatatkan diameter purata fenestrasi dalam kapilari glomerular ialah ~ 70 nm [ 76]. Terutama, semua vaskular dalam sistem berasal dari organoid buah pinggang tanpa pencerobohan angiogenik.

Kaedah untuk mengatasi cabaran semasa termasuk menggandingkan rangkaian vaskular angiogenik secara in vitro dengan organoid buah pinggang vaskulogenik untuk membenarkan kematangan GBM dengan penapisan glomerular berfungsi. Terdapat banyak sebab yang munasabah untuk penapisan glomerular yang muktamad belum berlaku dalam pendekatan organoid-on-cip buah pinggang, termasuk kekurangan eksperimen membujur, tekanan hidrostatik terhad yang dihantar dalam kapilari glomerular, ketidakmatangan epitelium nefron, dan potensi untuk peredaran penting. faktor yang memudahkan perkembangan buah pinggang embrio. Rangkaian vaskular angiogenik yang boleh diserap secara langsung secara in vitro telah diterangkan sebelum ini, yang mampu menyokong tisu tebal atau menyerang binaan selular terbenam pada cip [77, 78]. Pembuluh darah sedemikian mungkin beranastomosis dengan mikrovessel yang berasal dari organoid untuk menghadkan perfusi ke petak vaskular, membolehkan penghantaran tekanan hidrostatik yang besar kepada kapilari glomerular. Had lain boleh ditangani dengan menggunakan kajian membujur, perfusi dengan serum embrio, dan menggunakan organoid hari pembezaan optimum (mempengaruhi kematangan) dalam peranti sedemikian. Jika rangkaian vaskular angiogenik terdiri daripada sel manusia, maka batasan yang berkaitan dengan perbezaan antara spesies akan dielakkan. Begitu juga, penggunaan saluran darah yang berasal dari hPSC, seperti yang telah diterangkan [79], akan memudahkan pendekatan perubatan yang diperibadikan untuk kedua-dua strategi pembangunan ubat dan ubat regeneratif.

Pembentukan tunas ureter

Pengeluaran ultrafiltrat glomerular ex vivo akan mewakili penemuan penting untuk memudahkan aplikasi translasi tisu buah pinggang yang berasal dari sel stem, namun sistem pengumpulan akan diperlukan untuk saliran berikutnya. Rangkaian saluran pengumpul yang bercabang secara dikotomi menumpu keluaran ~ 1 juta nefron buah pinggang individu kepada satu ureter [60]. Saluran pengumpul bukan sahaja mengangkut filtrat tetapi juga terlibat dalam penyerapan semula air dan keseimbangan elektrolit melalui pelbagai pengangkut dan saluran dalam pelbagai jenis sel epitelium tiubnya. Saluran pengumpul adalah produk morfogenesis percabangan putik ureterik yang dikawal oleh pelbagai isyarat molekul yang boleh dieksploitasi secara in vitro untuk meniru proses ini, termasuk laluan isyarat FGF, GDNF/RET, dan Wnt [68].

Kajian perkembangan buah pinggang menggunakan tetikus microdissected MM dan UB memberikan gambaran yang signifikan tentang pembentukan awal apa yang akan membentuk buah pinggang manusia dewasa. MM yang tidak diinduksi, dipisahkan daripada struktur epitelium UB, menghalang kematangan mana-mana tisu. Walau bagaimanapun, kultur MM dan UB ex vivo dapat menyusun semula buah pinggang tikus, menunjukkan bahawa populasi prekursor buah pinggang ini mempunyai program autonomi diri yang mencukupi untuk memacu organogenesis buah pinggang [80]. Dari perspektif perkembangan, kaedah optimum untuk membangunkan tisu buah pinggang berfungsi daripada hPSC secara in vitro berkemungkinan melibatkan dorongan MM dan UB secara berasingan dengan kecekapan tinggi dan kultur kedua-dua populasi yang berbeza.

Protokol pembezaan yang diterangkan sebelum ini kebanyakannya menjana MM, yang ditakdirkan untuk menjadi struktur nefron. Pembezaan terarah ke arah mengumpul sel progenitor saluran UB mula-mula diterbitkan pada tahun 2013, sebelum Taguchi menggambarkan asal-usul IM yang berbeza bagi MM dan UB. Xia et al. menukar hPSC kepada tisu komited mesodermal menggunakan FGF2 dan BMP4 selama 2 hari, kemudian menginduksi sel progenitor UB menggunakan gabungan activin, BMP2, dan asid retinoik selama 2 hari tambahan dalam protokol pembezaan dua langkah [81, 82]. Sel-sel progenitor UB yang berasal dari hPSC dipasang sendiri menjadi tisu chimeric antara spesies apabila digabungkan dengan MM tikus embrio. Pada tahun 2017, dengan menganalisis profil ekspresi gen semasa perkembangan tunas ureter dalam embrio tikus, Taguchi et al. telah menubuhkan protokol untuk memasukkan kedua-dua tisu MM dan UB ke dalam organoid buah pinggang menggunakan ESC tetikus (mESCs) [83]. Protokol ini didasarkan pada pengisihan FACS CXCR4 ditambah KIT serta progenitor saluran Wolffian. Kokultur progenitor saluran Wolffian dengan MM yang berasal dari mESC memerlukan kehadiran sel progenitor stroma untuk membentuk organoid yang dipasang semula yang menjalani organogenesis peringkat lebih tinggi untuk membentuk nefron yang saling berkaitan oleh epitelium ureterik yang bercabang. Akhirnya, penemuan itu tidak direplikasi dalam MM dan UB yang berasal dari hPSC kerana pemberhentian pramatang cawangan UB, yang penulis percaya mungkin disebabkan oleh kekurangan kumpulan progenitor stromal [83]. Penubuhan pembezaan terarah kepada progenitor stroma buah pinggang manusia dan peningkatan akses kepada tisu buah pinggang janin manusia primer boleh membezakan punca morfogenesis cawangan tidak lengkap yang dilaporkan. Namun, mungkin terdapat batasan dalam kecekapan induksi jenis sel yang diperlukan, iaitu, sel-sel hujung Ret ditambah UB yang membiak, yang bertanggungjawab untuk bercabang dan membentuk hubungan struktur dengan tubul penghubung nefron distal [84].

Terdapat kekurangan protokol pembezaan terarah hPSC terhadap UB dan terbitannya, dengan protokol yang diterbitkan menunjukkan batasan. Protokol yang lebih baik diperlukan untuk membenarkan penambahan rangkaian saluran pengumpul menjangkau keseluruhan organoid buah pinggang yang mengandungi nefron. Sama seperti memaksimumkan kecekapan induksi untuk NPC berdasarkan ekspresi SIX2, memaksimumkan kecekapan induksi untuk sel hujung UB berdasarkan ekspresi Ret ialah satu strategi sedemikian. Untuk tujuan ini, pemahaman tentang perkembangan buah pinggang diperlukan. Terutama, UB terbentuk sebagai kantung saluran Wolffian (alias saluran mesonephric), yang dihasilkan daripada penghijrahan ekor sel IM anterior ke bawah sinus urogenital ke kloaka, dengan menyatakan sel-sel ini menjalani MET di sepanjang jalan. Asal usul UB yang litar menimbulkan cabaran kepada penubuhan protokol pembezaan terarah yang teguh. Walau bagaimanapun, sel mesenchymal yang mengekspresikan Ret yang terdapat dalam aIM mampu menyumbang kepada UB [84], dengan itu 3-protokol langkah boleh menukar hPSC kepada coretan primitif awal (langkah 1), kemudian aIM (langkah 2) , kemudian Ret tambah sel hujung UB (langkah 3). Terutama, repositori selular konsortium Membina Semula Buah Pinggang (RBK) NIH termasuk barisan wartawan Ret

Kesimpulan

Buah pinggang adalah organ yang luar biasa yang antara lain mengawal homeostasis air dan elektrolit badan. Disregulasi proses ini boleh membawa kepada komplikasi kesihatan yang serius dengan beban masyarakat dan ekonomi yang tinggi. Melalui pemahaman kami tentang nefrogenesis manusia dalam vivo, kami memberi penerangan tentang memodalkan semula proses ini secara in vitro. Kemajuan semasa telah membolehkan penjanaan organoid buah pinggang yang berasal dari hiPSC. Organoid buah pinggang ini menyerupai buah pinggang manusia dan memberikan kelebihan tambahan berbanding dengan model penyelidikan konvensional. Aplikasi organoid buah pinggang termasuk ubat regeneratif dan model perkembangan, ketoksikan, dan penyakit. Walaupun terdapat kemajuan dalam beberapa tahun kebelakangan ini, organoid buah pinggang memerlukan protokol dan pengubahsuaian yang lebih baik ke arah pematangan tisu, vaskular yang boleh meresap dan integrasi sistem pengumpulan. Seterusnya, sistem ini perlu sesuai untuk memberikan nilai tambahan kepada model penyelidikan sel dan haiwan konvensional atau bahkan menggantikannya. Menambah baik protokol penjanaan organoid melalui peningkatan pengetahuan kami tentang pembangunan buah pinggang, digabungkan dengan penggunaan teknologi organ-on-a-chip, boleh memudahkan dan mempercepatkan terjemahan organoid buah pinggang 3D ke arah penggunaan klinikal.

Daripada: 'organoid buah pinggang 3D untuk terjemahan bangku ke tepi katil' olehNavin Gupta, et al

---J Mol Med (2021) 99:477–487