Aktiviti Xanthine Oxidoreductase dalam Plateletpoor Dan Rich Plasma Sebagai Penunjuk Tekanan Oksidatif dalam Pesakit yang Diperlukan Terapi Penggantian Buah Pinggang

Latar Belakang Abstrak: Xanthine oksidoreduktase(XOR) ialah enzim hidroksilase yang terlibat dalam metabolisme purin. Aktiviti XOR boleh berbeza-beza: protein homodimer boleh ditukar kepada dua isoform berbeza XD (antioksidan) dan XO (prooksidan). Tekanan oksidatif dan keradangan yang mengiringipenyakit buah pinggang yang kronik(CKD), dialisis, dan pemindahan buah pinggang, mengakibatkan pengaktifan platelet. Kajian ini bertujuan untuk menentukan pengaruh terapi penggantian buah pinggang yang digunakan pada xanthine oxidoreductase dan aktiviti isoformnya.

Bahan dan Kaedah: Kumpulan kajian terdiri daripada 117 pesakit, dibahagikan kepada 4 kumpulan: pesakit hemodialisis - 30, pesakit dialisis peritoneal - 30, pesakit pemindahan buah pinggang - 27, dan rawatan konservatif {{5} } pesakit. Kumpulan kawalan terdiri daripada 30 sukarelawan yang sihat. Keputusan: Perbezaan ketara ditemui dalam aktiviti XOR dalam plasma miskin platelet (PPP) dalam kumpulan yang dikaji (p=0.001). Terdapat hubungan antara jenis terapi penggantian buah pinggang semua isoform oksidoreduktase dalam PPP (p<0.001 all isoforms) and XD (p=0.008), XO (p<0.001) in platelet-rich plasma (PRP). A relationship was observed between the activity of all oxidoreductase isoforms in PPP and PRP, the type of renal replacement therapy the duration of dialysis, and the age of patients. Thepunca penyakit buah pinggang kronikjuga ditunjukkan dalam perbezaan dalam aktiviti XD dan XO dalam PPP.

Kesimpulan: Jenis terapi penggantian buah pinggang yang digunakan dalam pesakit CKD, umur pesakit, tempoh dialisis, punca CKD, dan peringkat perkembangan ketara mempengaruhi aktiviti XOR dan isoformnya.

Kata kunci: Xanthine oxidoreductase, Platelet, Terapi penggantian buah pinggang,Penyakit buah pinggang yang kronik, Enzim antioksidan

BERAPA LAMA YANG DIPERLUKAN UNTUK CISTANCHE BERFUNGSI?

Latar belakang

Xanthine oxidoreductase (XOR) ialah enzim hidroksilase yang terlibat dalam metabolisme purin. Ia memangkinkan pengoksidaan hypoxanthine kepada xanthine dan xanthine kepada asid urik (UA). Aktiviti XOR boleh berbeza-beza: protein homodimer boleh ditukar kepada dua isoform yang berbeza. Xanthine dehydrogenase (XD) diekspresikan terutamanya dalam tisu yang sihat, dan xanthine oxidase (XO) dihasilkan oleh pengubahsuaian XD pasca translasi, residu sistein pengoksidaan serta proteolisis terhad, memainkan peranan dominan dalam sel dan tisu semasa kecederaan [1-3 ]. Aktiviti isoform yang disebutkan bertentangan antara satu sama lain [4]. XOR bertindak dengan kehadiran NAD+ sebagai dehidrogenase, dan dengan oksigen molekul sebagai oksidase. Keupayaan XOR untuk menukar dengan cepat daripada antioksidan kepada oksidan, dalam pelbagai jenis kerosakan tisu, adalah elemen penting untuk tindak balas imun semula jadi yang cepat, bermanfaat dalam, contohnya, jangkitan bakteria atau kulat [5].

Perantaraan tindak balas xanthine dehydrogenase (XDO) dan oksigen boleh bertindak balas dengan kedua-dua NAD+ dan O2 tetapi menunjukkan pertalian yang lebih tinggi untuk NAD+ [6]. Isoform perantaraan ini tidak diasingkan, tetapi penentuan aktivitinya memudahkan pengesanan transformasi XD kepada XO [7].

Aktiviti XOR serum dalam pelbagai penyakit telah disiasat secara meluas. Sebab minat enzim ini adalah dualisme tindakannya: keupayaan untuk menghasilkan antioksidan, dan sebaliknya, penciptaan spesies oksigen reaktif. Peningkatan aktiviti XOR berlaku dalam keadaan patologi seperti hepatitis virus, mononukleosis berjangkit, penyakit autoimun, radang paru-paru, skizofrenia, dan diabetes jenis II. Peningkatan aktiviti XOR juga diperhatikan dalam serum pesakit selepas pemindahan buah pinggang atau hati [8]. Telah ditunjukkan bahawa pengekodan gen untuk XOR mungkin bertanggungjawab untuk pematangan buah pinggang, dan adipogenesis dalam buah pinggang, dan boleh menghalang transformasi sel epitelium menjadi tisu mesenchymal [9]. Walau bagaimanapun, disebabkan pengetahuan terbaik kami, tiada laporan diterbitkan yang menyiasat aktiviti XOR dalam plasma miskin platelet (PPP) dan plasma kaya platelet (PRP) pada pesakit yang menjalani terapi penggantian buah pinggang. Kepentingan aktiviti XOR dalam kumpulan pesakit ini adalah berkaitan dengan peningkatan pengaktifan platelet, yang disebabkan oleh tekanan oksidatif dan keradangan yang mengiringi penyakit buah pinggang kronik (CKD), dialisis, dan pemindahan buah pinggang. Selain itu, semasa dialisis dan pemindahan organ, tisu dan saluran darah rosak, dan platelet adalah sel pertama untuk mencapai tapak kerosakan tisu, secara aktif mengambil bahagian dalam peringkat awal proses keradangan dan penyembuhan [10].

PRP dan PPP adalah pecahan plasma darah dengan kepekatan platelet yang berbeza. Kandungan platelet PRP dan PPP ialah platelet/ml dan platelet/ml, masing-masing. PPP dan PRP diperolehi dengan mengempar berulang kali dan membasuh seluruh darah manusia pada kelajuan emparan yang berbeza [11, 12].

PPP, sebagai hasil sampingan sentrifugasi darah antikoagulasi, mempunyai kepekatan platelet yang lebih rendah daripada darah biasa. Komponen utama PPP ialah fibrinogen, fibronektin, dan trombin. Kesan biologi PPP mengambil bahagian dalam hemostasis dan pembekuan, bertindak sebagai vektor lampiran sel, dan menggalakkan mitosis fibroblas dan sel epitelium [13]. Walaupun PPP tidak tertumpu dalam platelet sebagai PRP, ia telah ditunjukkan bahawa PPP juga boleh mengekalkan pertumbuhan dan kelangsungan hidup sel. PPP menggalakkan fungsi sel yang berkaitan dengan penyembuhan luka dan mempercepatkan penghijrahan sel dan percambahan fibroblas [14, 15]. Plasma yang kaya dengan platelet mempunyai lebih banyak platelet pekat daripada plasma biasa (kira-kira 150–400× 103 sel/dL). Ia adalah salah satu definisi PRP yang paling biasa dalam kesusasteraan [16]. Sehingga kini, kajian terhad mencirikan XOR dan aktiviti isoformnya dalam plasma kaya platelet atau miskin pada pesakit yang menghidap penyakit buah pinggang kronik. Tan et al. menunjukkan sel yang rosak oleh spesies oksigen reaktif (ROS) (dalam kes terapi penggantian buah pinggang kronik) "bocor" isoform XOR, yang membawa kepada peningkatan tahap enzim dalam plasma [17]. Mekanisme ini menerangkan aktiviti XOR dan isoformnya yang lebih rendah dalam platelet berbanding PPP. Oleh itu, keaktifan oksidoreduktase dalam PPP dan PRP sangat menarik, kerana ia boleh membantu untuk mendedahkan proses selular yang berlaku setiap hari, kak. Penyiasatan sedemikian juga secara tidak langsung boleh menyerlahkan keterukan tekanan oksidatif dalam kumpulan pesakit ini.

Berry et al. terangkan juga bahawa xanthine oxidoreductase diedarkan dalam hati, usus kecil, kelenjar susu, dan sel endothelial. Kaedah penyetempatan subselular telah menunjukkan kehadiran xanthine oxidoreductase kedua-dua dalam sitoplasma dan pada membran sel. Mereka juga menunjukkan bahawa plasma xanthine oxidasereductase mungkin disebabkan oleh xanthine oxidoreductase teduhan daripada membran sel atau bocor dari sitoplasma. Ini adalah salah satu sebab kami menguji aktiviti XOR dalam PPP dan PRP untuk membezakan aktiviti enzim dalam platelet dan sel darah lain yang terkandung dalam plasma [18]. Berdasarkan aktiviti enzim antioksidan, kita juga boleh menentukan jenis terapi penggantian buah pinggang yang kurang berkemungkinan mendedahkan pesakit kepada tekanan oksidatif. Disebabkan oleh sifat dwi XOR, pemahaman tentang hubungan antara jenis terapi penggantian buah pinggang dan aktiviti isoform XOR boleh menjadi sangat menarik dan membantu dalam pemilihan jenis terapi penggantian buah pinggang.

Bahan dan kaedah

Kelulusan dan persetujuan etika

Suruhanjaya Bioetika di Universiti Perubatan Pomeranian di Szczecin meluluskan penyelidikan yang dijalankan (tiada KB−0012/36/11). Semua peserta, termasuk sukarelawan yang sihat dalam kumpulan kawalan, telah dimaklumkan tentang tujuan dan skop kajian dan memberikan persetujuan mereka untuk menderma sampel dan penerbitan data yang terhasil.

Kumpulan belajar

Terdapat 147 peserta: kumpulan kawalan 30 sukarelawan sihat (NK), dan 117 pesakit dengan penyakit buah pinggang kronik (CKD) menghadiri Klinik Nefrologi, Transplanetologi dan Penyakit Dalaman Universiti Perubatan Pomeranian di Szczecin. Pesakit dibahagikan kepada 4 kumpulan berdasarkan rawatan yang mereka terima: 30 pesakit sebelum dan selepas hemodialisis (HD A dan HD B): 30 pesakit menerima dialisis peritoneal (PD); 27 pesakit sebelum dan selepas pemindahan buah pinggang (5-7 hari selepas pembedahan) (TE, TE A); 30 pesakit menerima rawatan konservatif (CT) (CKD peringkat 2-5). Jantina, umur, tempoh dialisis, punca dan peringkat penyakit buah pinggang kronik, dan kepekatan kreatinin dalam kumpulan ujian dan kawalan diberikan dalam Jadual 1 dan 2.

Sampel

Sampel darah (K2EDTA (8 ml), 3.8% trisodium sitrat (9: 1; v / v), dan serum (8 ml)) diambil daripada semua peserta kajian. Darah pesakit hemodialisis diambil dari fistula arteriovenous mereka; venipuncture periferal digunakan untuk semua peserta lain. Sampel diambil daripada pesakit hemodialisis sebelum (HD A) dan kira-kira 10 minit selepas pam dihentikan (HD B). Darah pesakit pemindahan dikumpul sebelum pemindahan (TE) dan 5-7 hari selepas pembedahan (TE A). Pesakit yang diambil untuk kumpulan TE tidak tergolong dalam kumpulan pesakit hemodialisis atau dialisis peritoneal dalam kajian ini. Mereka adalah pesakit yang layak untuk pemindahan dari seluruh Poland. Sebilangan besar pesakit dengan pemindahan buah pinggang mempunyai analisis mod terlebih dahulu. K2EDTA dan sampel darah beku telah disentrifugasi pada 2600 rpm selama 10 minit pada 20 darjah untuk mendapatkan plasma dan serum, masing-masing. Untuk mendapatkan plasma kaya platelet (PRP) dan plasma miskin platelet (PPP), darah yang dikumpul dengan sitrat disentrifugasi di bawah keadaan pada 1100 rpm selama 10 minit pada 20 darjah . PRP yang terhasil dipindahkan ke tiub baru dan disentrifugasi pada 6000 rpm selama 10 minit pada 20 darjah: plasma miskin platelet (PPP) dipindahkan ke tiub berasingan; pelet platelet dibilas dua kali dan digantung dalam penimbal Tyroda (pH7.4). Plasma, serum, PPP, dan PRP dibekukan pada -80 darjah sehingga ujian dilakukan. Dalam pesakit hemodialisis, darah dikumpul sebelum pemberian heparin dan selepas dialisis selama 4-5 jam secara purata (separuh hayat heparin - 4 h) untuk menghapuskan sebarang kemungkinan pengaruh heparin pada aktiviti XOR.

Aktiviti xanthine oxidoreductase dalam plasma dan platelet yang lemah platelet

Penentuan telah dilakukan dengan spektrofotometer Perkin Elmer UV/VIS Lambda 40P. Perubahan kepupusan direkodkan pada 340nm (XD) dan 302nm (XDO, XO) selama 5 minit pada 30 darjah . Aktiviti enzimatik diukur sebagai pembentukan asid urik dan NADH (peningkatan dalam A340 dan A302) dan dinyatakan dalam mU × mL−1 (miliunit per mililiter). Aktiviti enzimatik dikira, dengan mengambil kira kadar tindak balas awal. Pembentukan asid urik diukur pada 302nm (isoform XDO dan XO) kerana penyerapannya masih tinggi di sana, manakala perubahan dalam kepekatan NAD+ tidak menyumbang. Pekali kepupusan untuk NADH+ H+ ε340=6.22× 103 [L∙mol−1 cm−1 ] telah digunakan untuk mengira aktiviti isoform xanthine oxidoreductase NADH+ H+: ε302=2.30× 103 [ L∙mol−1 cm−1 ] [7, 19–22].

Jadual 1 Ciri-ciri umum pesakit hemodialisis (HD), dialisis peritoneal (PD) yang dirawat secara konservatif (CKD), pemindahan buah pinggang (TE), dan kumpulan kawalan (C) yang mengambil bahagian dalam kajian (min±SD)

P * - kepentingan statistik untuk perbezaan antara kumpulan HD, PD dan CKD, ujian Fisher tepat TE dan C untuk pembolehubah kualitatif; untuk pembolehubah kuantitatif - ANOVA sehala dan; P ** - kepentingan statistik untuk perbezaan antara kumpulan HD, PD dan CKD dan ujian Fisher tepat TE untuk pembolehubah kualitatif untuk pembolehubah kuantitatif ANOVA sehala atau; DM - nefropati diabetik; HA - hipertensi; GIK - buah pinggang keradangan glomerular; ADPKD - penyakit buah pinggang polikistik yang diwarisi dominan autosomal; NS - tiada perbezaan yang signifikan secara statistik.

Jadual 2 Ciri-ciri umum pesakit hemodialisis (B - sebelum HD, A - selepas), dialisis peritoneal (PD) dirawat secara konservatif (CKD) sebelum dan selepas pemindahan buah pinggang (TE B dan TE A) dan kumpulan kawalan (NK) mengambil bahagian dalam belajar (min±SD)

P * - kepentingan statistik untuk perbezaan antara kumpulan HD A, HD B, PD dan CKD, TE dan C untuk pembolehubah kuantitatif - Kruskal Wallis ANOVA, ANOVA sehala atau ujian-t Pelajar P ** - kepentingan statistik untuk perbezaan antara HD A Kumpulan , HD B, PD dan CKD dan TE untuk pembolehubah kuantitatif ANOVA Kruskal Wallis atau analisis sehala ANOVA Kt / V - indeks dialisis (pecahan volum V disucikan dengan kelegaan K pada masa t) NS tiada hubungan signifikan secara statistik ditemui

Analisis statistik Untuk menilai taburan, ujian KS (Kolmogorov-Smirnov) telah digunakan, yang dalam kes beberapa pembolehubah (aktiviti isoform XD dan XDO dalam PRP) menunjukkan taburan parameter yang tidak normal. Ujian Exact Fisher dan Chi-square telah digunakan untuk menganalisis data kuantitatif. Menggunakan ujian-t Pelajar dan analisis ANOVA untuk sistem univariat, perbezaan antara pembolehubah yang berkaitan (berpasangan) dan tidak berkaitan (tidak berpasangan) telah dinilai dalam kes pembolehubah dengan taburan normal. Dalam kes pembolehubah dengan taburan bukan normal, analisis ANOVA Kruskal-Wallis dilakukan untuk menilai perbezaan antara parameter, serta ujian bukan parametrik Mann-Whitney U untuk data tidak berpasangan atau Wilcoxon untuk data berpasangan. Model regresi berbilang linear digunakan untuk menentukan penilaian pelbagai faktor hubungan antara parameter yang dikaji. Analisis statistik keputusan dilakukan menggunakan Statistica 12 (StatSoft).