Aktiviti Pemutihan Konstituen Diasingkan Daripada Pulpa Trichosanthes

Hubungi:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Rongchao Zhang ,1,2Xiuqin Hu ,1Bo Zhang,1ZhenWang,1Chunxiang Hao,1 Jie Xin ,1dan Qingmei Guo 2

Abstrak: Pemutihanpasaran kosmetik mempunyai masa depan yang cerah, dan produk pemutihan semula jadi tulen perubatan tradisional Cina sentiasa menjadi tumpuan penyelidikan. Dalam penyelidikan ini, bahan aktif pemutihan pulpa Trichosanthes perubatan Cina telah diasingkan dan disucikan buat kali pertama, danpemutihanmekanisme telah dijelaskan. Kaedah kromatografi seperti gel silika, ODS, danHPLC digunakan untuk mengasingkan dan memurnikannya. Sel B16 digunakan untuk mengukur aktiviti antioksidan,tyrosinaseaktiviti, dan aktiviti penyingkiran melanin. Sebanyak 20 sebatian telah diasingkan, termasuk p-hydroxybenzaldehyde (1), asid salisilik (2), asid vanillik (3), asid isovanillic (4), protocatechuate (5), asid trans-cinnamic (6), {{9 }}asid kuumarik (7), asid trans-ferulik (8), drechslerol-B (9), sikloheksanol 3-palmitat (10), 5-acetoxymethyl-2-furaldehid (11), 5-hydroxymethylfurfural (12), diosmetin (13), apigenin (14), chrysoberyl (15), luteolin (16), 4′-hydroxyscutellarin (17), quercetin (18), 3′,{{31} }dihydroxy-7-( -D-glucopyranosyloxy)-4′-methoxy flavone (19), dan ciprofloxacin-7-O- -D-glucoside (20). Antaranya, sebatian 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, dan 20 mempunyai kesan pembaikan antioksidan yang baik; sebatian 3, 4, 5, 6, dan 7 mempunyai perencatan hitam yang tinggi; sebatian 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 11, 12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19, dan 20 mempunyai aktiviti perencatan tyrosine oxidase yang jelas. 1e keputusan meletakkan asas untuk pembangunan dan penggunaan lebih lanjut sumber pulpa Trichosanthes dan juga menyediakan asas untuk pembangunan semula jadi.pemutihankosmetik.

herba cistancheialahbahan pemutih semulajadi.

1. Pengenalan

Trichosanthes kirilowii Maxim. adalah herba memanjat saka dari keluarga Cucurbitaceae. Buah, biji, kulit dan akarnya yang biasa digunakan sebagai ubat tradisional Cina. Untuk masa yang lama, pulpa Trichosanthes sering dibuang dalam pengeluaran dan pemprosesan Semen Trichosanthis dan Pericarpium Trichosanthis, mengakibatkan sisa yang ketara. Pada masa ini, laporan mengenai pulpa Trichosanthes tertumpu terutamanya pada perbandingan kandungan gula, asid amino, vitamin, dan nutrien lain [1–4]. Tiada laporan mengenai komposisi kimia pulpa Trichosanthes. 1oleh itu, adalah perlu untuk mengkaji juzuk kimia pulpa secara sistematik.

Pada masa yang sama, dengan perkembangan pesat ekonomi, kosmetik bukan sahaja produk gaya hidup penggunaan tinggi tetapi juga menjadi "keperluan" paling popular untuk wanita. Banyak buku perubatan Cina klasik atau materiamedica telah merekodkan bahawa pulpa Trichosanthes mempunyai fungsipemutihandan kesan menghilangkan kedutan [5–7]. 1e keputusan terdahulu kumpulan penyelidikan kami menunjukkan bahawa ekstrak air pulpa Trichosanthes mempunyai lebih tinggityrosinaseaktiviti perencatan, dan kadar perencatan tyrosinase adalah kira-kira 70 peratus . 1ecommonpemutihanagen vitamin C (VC) dan arbutin digunakan sebagai bahan kawalan [8]. Telah dibuktikan secara awal bahawa ekstrak pulpa Trichosanthes mempunyai kesan pemutihan tertentu dengan menghalang aktiviti tyrosinase. Oleh itu, adalah sangat penting untuk mengkaji konstituen kimia dan mekanisme pemutihan pulpa Trichosanthes.

Thepemutihanmekanisme boleh diringkaskan sebagai menghalang sintesis melanin dan mempercepatkan pemindahan melanin. 1e proses pembentukan melanin dalam melanosit adalah seperti berikut:tyrosinasemengoksidakan tirosin kepada polimorf BA (DOPA); kemudian ia dioksidakan kepada dopaquinone.Selepas satu siri tindak balas metabolik, melanin dihasilkan.Tirosinase ialah satu-satunya enzim yang mengehadkan kadar dalam proses tindak balas, dan aktivitinya menentukan jumlah melanin yang disintesis. Apabila aktiviti tyrosinase dipertingkatkan, melaninsintesis meningkat; apabila aktiviti tyrosinase dihalang, sintesis melanin dikurangkan [9]. 1e pusat aktif tyrosinase mempunyai tapak aktif kuprum berganda, dan setiap ion kuprum bergabung dengan 3 sisa histidin dengan 1 atau 2 valens masing-masing. Oleh itu, pengurangan dengan kesan antioksidan boleh berinteraksi dengan atom kuprum pada tapak aktif tirosinase atau mengurangkan perantaraan dalam proses sintesis melanin untuk menghalang pembentukan melanin[10, 11]. Di samping itu, menghalang pemindahan melanosit matang kepada keratinosit juga boleh memainkan peranan dalam pemutihan.

Teknologi kultur sel digunakan untuk menentukan kesan daripadapemutihanbahan aktif padatyrosinaseaktiviti dan pengeluaran melanin dalam melanosit secara in vitro. 1e garisan sel mousemelanoma (sel B16) berasal daripada sel skinmelanoma tikus, dan struktur asasnya, terutamanya berkenaan sintesis melanin, pada asasnya adalah sama dengan sel melanoma normal manusia. Oleh kerana sangat sukar untuk menkultur sel melanoma kulit primer manusia, model tetikus boleh digunakan sebagai sel ujian untuk penentuanpemutihanbahan-bahan aktif. Oleh itu, sel B16 digunakan untuk mengukur aktiviti antioksidan, aktiviti tyrosinase, dan aktiviti penyingkiran melanin, dan komponen aktif pemutihan dan mekanisme yang berkaitan ditentukan secara awal. Hasilnya meletakkan asas untuk pembangunan dan penggunaan sumber pulpa Trichosanthes dan juga menyediakan asas untuk pembangunan kosmetik pemutihan semula jadi.

2. Eksperimen

2.1. Bahan.

Trichosanthes trichosanthis dikumpul dari pangkalan tanaman ubat herba Hebao di Pinyin, Jinan. 1e sampel telah dikenal pasti oleh Profesor QingmeiGuo dari Universiti Perubatan Tradisional Cina Shandong. Selepas mengeluarkan kulit dan biji, bahagian pulpa buah diperolehi. Selepas pengeringan beku, pulpa dihancurkan, dicampur, dan akhirnya dimasukkan ke dalam desikator untuk kegunaan selanjutnya.

cistanche segardenganechinacosidekesan

2.2. Daya Tahan Sel.

B-16 sel (sel melanoma tetikus) telah dibeli daripada KeyGEN dan dikekalkan dalam medium DMEM ditambah dengan 10 peratus serum lembu janin (FBS), pada 37 darjah dalam suasana lembap dengan 5 peratus CO2. 1en, B-16sel telah disemai dalam 96-plat perigi (10 ×104 sel/telaga) selama 24 jam pengeraman.

2.3. Penyediaan Ekstrak Berbeza.

Bahan mentah pulpa Trichosanthes kirilowii ialah 4.5 kg. 1e pulpa direndam dalam 10 kali ganda jumlah etanol 95 peratus sebanyak 3 kali. 1eekstrak telah digabungkan dan dipekatkan kepada kira-kira 3.0 L. Ekstrak anetil asetat diperoleh dengan menyebarkan etanolekstrak ke dalam 15 L air, mengekstraknya dengan etil asetat sehingga ekstrak tidak berwarna. 1e ekstrak telah digabungkan dan tertumpu di bawah tekanan yang dikurangkan.

Ekstrak etil asetat dicampur dengan gel silika(100–200 mesh) pada nisbah 1: 2 (ekstrak: gel silika, v/ v). 1esolvent telah disejat, dan gel telah dikhaskan. 1e lajur kromatografi kaca (8{{30}} mm × 1200 mm) telah dibungkus dengan 200–300 mesh silika gel dan D101 resin makroporous, dan kemudian lajur diencerkan dengan etil asetat, eter petroleum (10 peratus, 25 peratus, 50 peratus, 75 peratus, dan 100 peratus), dan metanol, etil asetat (5 peratus, 10 peratus, 25 peratus, 50 peratus , 75 peratus dan 100 peratus ), untuk mengumpul setiap aliran. Akhir sekali, setiap pecahan dikumpul dan dikonfigurasikan kepada kepekatan berikut: 0.003125 mg/mL, 0.00625 mg/mL, 0.0125 mg/mL, 0.025 mg/mL, 0.05 mg/mL, 0.1 mg/mL, 0.25 mg/mL, 0.25 mg/mL, 0.25 mg/mL mL, 1.0 mg/mL, dan 2.0 mg/mL, dan kemudian digunakan untuk memproses sel yang dikultur. Pada akhir rawatan, 20 μL larutan MTT (5 mg/mL) telah ditambah dengan baik. Sel 1e diinkubasi selama 20 minit pada 37 darjah. 1esupernatant telah dibuang, dan 100 μL DMSO telah ditambah pada setiap telaga. Penyerapan 1e diukur pada 490 nm. 1eeksperimen diulang 3 kali. 1e kadar kelangsungan hidup dikira seperti berikut:

peratus kadar kelangsungan hidup=(kumpulan kosong kumpulan eksperimen)/(kumpulan kawalan -kumpulan kosong) × 100 peratus .

Kepekatan optimum (C1) bagi setiap pecahan dikira mengikut hubungan fungsi antara kadar kemandirian dan setiap kepekatan pecahan. C1 telah dicairkan 2, 4, 6, dan 8 kali untuk mendapatkan kepekatan C2, C3, C4, dan C5, masing-masing. 1e ekstrak berbeza pulpa ditunjukkan dalam Jadual 1.

Jadual 1: Ekstrak polar pulpa Trichosanthes dan kepekatan optimum.

2.4. Eksperimen Pemutihan

2.4.1. Ujian Antioksidan.

Ujian MTT digunakan untuk menentukan daya maju sel (MTT Kit, Kaiji Biology). 1en, B-16 sel telah disemai dalam 96-plat perigi (10 ×104 sel/perigi) selama 24 jam dan dirawat dengan ekstrak atau sebatian berbeza selama 24 jam. Selepas rawatan, medium kultur dibuang dan dibasuh dua kali dengan PBS. 1en, 0.05 peratus H2O2 telah ditambah, dan sel telah dibiakkan selama 4 jam. Selepas itu, sel B{13}} diinkubasi dalam 20 µL larutan MTT (5 mg/mL) pada 37 darjah selama 4 jam. 1en, supernatan kultur telah dikeluarkan, dan sisa telah dilarutkan dalam 100 µL DMSO. Penyerapan 1e dikesan pada 490 nm menggunakan pembaca plat mikro (Tecan Trading AG). 1eeksperimen dilakukan secara selari 3 kali.

2.4.2. Perencatan Pengeluaran Melanin.

Pengeluaran melanin ditentukan dengan mengesan insel kandungan melanin oleh pirolisis NaOH [12]. Sel telah disemai dalam 96-plat kultur telaga selama 24 jam pada ketumpatan sel 10 ×104 sel/telaga.1en, sel telah dirawat dengan ekstrak atau kompaun berbeza selama 24 jam. Selepas itu, supernatan kultur sel (300 µL) dikeluarkan, dan sisanya dibubarkan dalam NaOH (1 mL, 1.0 mol/L) selama 24 jam pada suhu bilik. 1eabsorbansi diukur pada 475 nm, menggunakan microplatereader (Tecan Trading AG). 1e eksperimen dilakukan selari dengan 3 ulangan. 1e IC50 ditentukan oleh perisian GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc., San Diego, California) dan arbutin digunakan sebagai kawalan positif (IC50 =15.6 µL).

2.4.3. Penentuan Aktiviti Tirosinase.

Supernatan kultur sel telah dikeluarkan, dan sisanya dilarutkan dalam Tritonx-100 (90 µL) dantyrosinase(10 µL, 1.0 mg/mL, Sigma, T3824 25ku). Selepas sebati, adunan diinkubasi pada suhu 37 darjah selama 30 minit. Penyerapan 1e diukur pada 475 nm menggunakan pembaca plat mikro (Tecan Trading AG). 1eeksperimen dilakukan secara selari 3 kali. 1e IC50 telah ditentukan oleh perisian GraphPad Prism 5 (GraphPadSoftware, Inc., San Diego, California) dan arbutin digunakan sebagai kawalan positif (IC50 =15.6 µL).

2.5. Pengekstrakan dan Pengasingan. Ekstrak etil asetat telah dilarutkan dalam metanol, dan lajur itu dibungkus dengan gel silika 200–300 mesh, yang diseimbangkan oleh eter petroleum. 1en, elusi kecerunan yang terdiri daripada petroleumeter dan etil asetat dalam nisbah 2:1, 1:1, dan 1: 2; ethylacetate; etil asetat dan metanol dalam nisbah 2:1, 1:1, dan1: 2; dan metanol digunakan bersama-sama dengan TLC untuk mendapatkan sebatian A (11.5 g), B (10.4 g), C (12.1 g), D (5.2 g), dan E (6.1 g).

A dipisahkan dengan kromatografi lajur poliamida, menggunakan diklorometana dan metanol dalam nisbah 2:1, 1:1, dan 1: 2 sebagai pelarut elusi. 1e eluate dipantau oleh TLC. Bintik-bintik dengan faktor pengekalan yang sama (rf ) telah digabungkan, dan A1 dan A2 diperolehi. 1en, A1 telah disediakan oleh TLC, menggunakan nisbah diklorometana dan metanol dalam 1:1 sebagai agen pembangun, dan disucikan beberapa kali oleh lajur gel. Akhirnya, kompaun 1 (17 mg) dan kompaun 2 (27 mg) diperolehi. A2 telah ditulenkan kromatografi lajur gel bysilika, menggunakan diklorometana dan metanol sebagai eluen dalam nisbah 1:1 dan 1: 2. Kompaun 3 (11 mg), kompaun 4 (12 mg), dan kompaun 5 (23 mg) diperolehi. B diasingkan dengan kromatografi tekanan sederhana C18 fasa terbalik (RP-C18), menggunakan metanol, air dalam elusi kecerunan seperti berikut: 0 peratus ,10 peratus, 15 peratus, 20 peratus, 25 peratus, 30 peratus, 35 peratus , 40 peratus , 50 peratus , 75 peratus ,90 peratus dan 100 peratus . Kadar alir 1e ialah 10 mL·min−1. 1e pecahan alir dengan rf yang sama telah digabungkan, dan B1 dan B2 diperolehi. B1 telah dimurnikan berulang kali oleh lajur gel, dengan metanol sebagai pelarut elusi. Kompaun (24 mg), 7 (21 mg), dan 8 (18 mg) diperoleh selepas elusi berulang. B2 telah ditulenkan oleh lajur gel dan metanol, dan sebatian 9 (11 mg) diperolehi. C diasingkan oleh RP-C18 dan dicairkan oleh metanol dan air dengan kadar alir 10 mL·min−1. Pecahan aliran 1e dengan rf yang sama telah digabungkan, dan C1, C2, dan C3 diperolehi. C1 disediakan oleh lajur gel dan dielusi oleh metanol, dan sebatian 10 (13 mg) diperolehi. C2 dipisahkan oleh lajur gel silika dan dicairkan oleh etil asetat dan metanol, dengan elusi kecerunan dalam nisbah 2:1, 1:1, dan1: 2. C2 telah ditulenkan dengan pengekstrakan fasa cecair persediaan, dan sebatian 11 (15 mg) dan 12 (14 mg) diperolehi.C3 dipisahkan oleh lajur poliamida, dicairkan oleh metanol dan air, dan disucikan oleh HPLC. Sebatian 13(34 mg), 14 (42 mg), dan 15 (38 mg) telah diperolehi. D diasingkan oleh RP-C18 dan dicairkan dengan metanol dan air.1e kadar alir ialah 10 mL·min−1. Sebatian 16 (36 mg), 17 (19 mg), dan 18 (37 mg) diperolehi oleh HPLC. Sebatian 19 (29 mg) dan 20 (34 mg) telah diperolehi elusi kecerunan menggunakan etil asetat dan metanol dalam nisbah 1:1 dan 1: 2, diikuti dengan 100 peratus metanol pada lajur gel silika.

herba epimedium sagittatum pada kulit

3. Keputusan dan perbincangan

3.1. Penentuan Ekstrak Aktif (E1–E11).

1e kepekatan optimum (iaitu, C1) setiap ekstrak telah dikira dan ditunjukkan dalam Jadual 1. 1e eksperimen antioksidan menunjukkan bahawa semua ekstrak mempunyai kesan pembaikan antioksidan, tetapi berbanding dengan VC, kesan antioksidan setiap kumpulan adalah lemah. Aktiviti 1eantioksidan E1, E3, E4, E7, dan E11 menurun dalam kepekatan yang meningkat, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1. 1e ujian perencatan melaninin menunjukkan bahawa semua komponen kutub dalam pulpa Trichosanthes kirilowii menghalang sintesis melanin. Secara khusus, kadar perencatan melanin adalah lebih tinggi dengan ketara untuk E2, E3, dan E4 daripada arbutin kawalan positif, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2. 1e keputusantyrosinaseAktiviti menunjukkan bahawa semua komponen kutub dalam pulpa Trichosanthes kirilowiii menghalang aktiviti tyrosinase, dan trend perencatan adalah serupa dengan perencatan melanin. 1e perencatan aktiviti tyrosinase adalah jauh lebih tinggi untuk E2, E3, E4, dan E8 daripada kawalan positif. Secara amnya, ekstrak daripada petroleum eter mempunyai kesan perencatan yang rendah pada tyrosinase.1e ekstrak daripada etil asetat mempunyai kesan perencatan yang tinggi pada tyrosinase, terutamanya komponen kutub daripada etil asetat. Ekstrak 1e daripada n-butanol juga mempunyai kesan perencatan yang tinggi pada tyrosinase, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3.

3.2. Pengasingan dan Pengenalpastian Komponen Monomer.

20 sebatian diasingkan oleh gel silika dan lajur kromatogram ODS serta HPLC persediaan. Berdasarkan analisis data NMR dan MS, strukturnya telah dijelaskan.1e 20 sebatian ditunjukkan dalam Jadual 2, dan data analisis khusus monomer ditunjukkan dalam Lampiran 1.

3.3. Analisis Pengesahan Sebatian Berkesan

3.3.1. Analisis Pengesahan Sebatian Antioksidan.

E1, E2, E3, E4, dan E5 mempunyai kesan antioksidan. 1e sebatian utama yang diasingkan daripada komponen di atas ialahdrechslerol-B (sebatian 9), sikloheksanol 3-palmitat(sebatian 10), 5-acetoxymethyl-2-furaldehid (kompaun11), 5-hidroksimetilfurfural ( sebatian 12), diosmetin(sebatian 13), apigenin (sebatian 14), krisoberil(sebatian 15), luteolin (sebatian 16), 4′-hydroxy-scutellarin (sebatian 17), quercetin (sebatian 18), 3′,{{ 25}}sebatian utama ialah glikosida, menunjukkan bahawa glikosida mempunyai aktiviti antioksidan yang baik. Asid fenolik, seperti 5-acetoxymethyl-2-furaldehyde (sebatian 11), 5-hydroxymethylfurfural (sebatian 12), diosmetin (sebatian 13),apigenin (sebatian 14), chrysoberyl (sebatian 15) ,luteolin (sebatian 16), 4′-hydroxyscutellarin (kompaun17), quercetin (sebatian 18), dan 3′,5-dihydroxy-7-( -Dglucopyranosyloxy)-4′-methoxy flavone, juga mempunyai aktiviti antioksidan yang baik, disebabkan oleh kumpulan hidroksil fenolik dan ikatan berganda tak tepu [26, 27]. Keputusan 1e ditunjukkan dalam Rajah 4.

Rajah 4: Kadar kemandirian sel ( peratus ) daripada eksperimen antioksidan bagi sebatian berbeza daripada ekstrak Trichosanthes

3.3.2. Analisis Pengesahan Sebatian Perencatan Melanin.

E11, E12, E13, E16, E17, dan E18 mempunyai kesan perencatan yang baik terhadap sintesis melanin. 1e sebatian utama yang diasingkan daripada komponen di atas ditunjukkan dalam Jadual 2. Mengikut kaedah dalam Bahagian 2.4.2, kesan setiap sebatian ke atas sintesis melanin telah ditentukan. Setiap sebatian telah dinilai pada kepekatan berikut: 1000 µg/mL, 800 µg/mL, 400 µg/mL, 200 µg/mL, dan 100 µg/mL. Setiap pengukuran dilakukan dalam tiga kali ganda, dan kadar perencatan sintesis melanin dikira.

Protocatechuate (sebatian 5), 5-acetoxymethyl-2-furaldehyde (sebatian 11), 5-hydroxymethylfurfural(sebatian 12), diosmetin (sebatian 13), p-hydroxybenzaldehyde (kompaun 1), asid salisilik (sebatian 2),asid vanillik (sebatian 3), asid isovanilik (sebatian 4),asid trans-sinamik (sebatian 6), 4-asid kuumarik(sebatian 7), apigenin (sebatian 14), krisoberil(sebatian 15 ), luteolin (sebatian 16), 4′-hidroksi scutellarin (sebatian 17), quercetin (sebatian 18), 3′,5-dihydroxy-7-( -D-glucopyranosyloxy)-4′ -methoxy flavone (kompaun 19), ofloxacin-7-O- -D-glucoside (kompaun 20) boleh menghalang pengeluaran melanin [28]. Khususnya, asid vanillik (sebatian 3), asid isovanilik (sebatian 4), protocatechuate (sebatian 5), asid trans-sinamik (sebatian 6), dan 4-asid kuumarik (sebatian 7) mempunyai perencatan melanin yang tinggi. Keputusan 1e ditunjukkan dalam Rajah 5.

3.3.3. Pengesahan dan Analisis Sebatian Menghalang Aktiviti Tirosinase.

E2, E3, E4, E7, E8, dan E9 mempunyai kesan perencatan yang baik padatyrosinaseaktiviti. 1e sebatian utama yang diasingkan daripada komponen di atas ditunjukkan dalam Jadual 2. Mengikut kaedah yang dibentangkan dalam Bahagian 2.4.3, arbutin digunakan sebagai kawalan, dan kepekatan sebatian ialah 1000 µg/mL, 800 µg/mL, 400 µg/mL , 200 µg/mL, dan 100 µg/mL. Setiap pengukuran dilakukan 5 kali, dan kadar perencatan tyrosinase dikira. 1e keputusan ditunjukkan dalam Rajah 6.

Keputusan 1e menunjukkan diosmetin (sebatian 13), apigenin(sebatian 14), krisoberil (sebatian 15), luteolin (sebatian 16), 4′-hydroxyscutellarin (sebatian 17), quercetin(sebatian 18), 3′,{{10} }dihydroxy-7-( -D-glucopyranosyloxy)-4′-methoxy flavone (compound 19), ciprofloxacin-7-O- -D-glucoside (compound 20), p-hydroxybenzaldehyde (sebatian1), asid salisilik (sebatian 2), asid vanillik (sebatian 3), asid isovanilik (sebatian 4), protocatechuate (sebatian 5), asid trans-sinamik (sebatian 6), 4-asid kumarik (sebatian 7 ), dan asid trans-ferulik (sebatian 8) semuanya jelastyrosinaseaktiviti menghalang.

Tumbuhan cistanche menghalang aktiviti tyrosinase.

Klik gambar dan dapatkan butiran lanjut.

Sebatian tersubstitusi hidroksil pada cincin benzena, seperti p-hidroksibenzaldehid (sebatian 1), asid salisilik (sebatian 2), asid vanillik (sebatian 3), asid isovanilik (sebatian 4), protocatechuate (sebatian 5), asid trans-sinamik ( sebatian 6), 4-asid kuumarik (sebatian 7), asid trans-ferulik (sebatian 8), dan flavonoid, mempamerkan perencatan tyrosinase yang tinggi, dan kadar perencatan sebatian digantikan para adalah jauh lebih tinggi daripada sebatian digantikan sebelumnya. . Sebagai contoh, keaktifan perencatan p-hidroksibenzaldehid adalah jauh lebih tinggi daripada asid salisilik, dan aktiviti perencatan asid vanillik adalah jauh lebih tinggi daripada asid isovanilikasi. Selain itu, aktiviti perencatan p-hidroksibenzaldehid adalah lebih tinggi daripada asid salisilikat, asid vanillik, asid isovanilik, dan protocatechuate. 1alasannya mungkin kumpulan nukleofilik di sekeliling pusat aktiftyrosinase, seperti –SH, −NH2, dan –OH, menempati ruang di sekeliling pusat aktif dan dengan itu menghalang tirosin daripada menyerang pusat aktif. Akhirnya, sintesis melanin telah dihalang [28]. 1e aktiviti perencatan sebatian yang mengandungi o-dihidroksi adalah lebih kuat daripada sebatian para hidroksi, dan aktiviti perencatan protocatechuate adalah jauh lebih tinggi daripada vanilikasid. 1e fenomena di atas juga wujud dalam flavonoid. 1ekadar perencatan flavonoid yang mengandungi 7 dan 4' kumpulan hidroksil adalah jauh lebih tinggi daripada jika 7 dan 4' kumpulan hidroksil diganti. Sebagai contoh, aktiviti perencatan chrysoberyl adalah jauh lebih tinggi daripada diosmetin, manakala aktiviti perencatan diosmetin lebih tinggi daripada 3′,5-dihydroxy-7-( -D-glucopyranosyloxy)-4 '- methoxy flavone dan ciprofloxacin-7-O- -D-glucoside. 1kadar perencatan flavonoid yang mengandungi 3-hidroksi adalah lebih tinggi dengan ketara berbanding sebatian tanpa 3-hidroksi atau jika 3-hidroksi telah diganti. Sebagai contoh, aktiviti perencatan kuersetin adalah jauh lebih tinggi daripada aktiviti perencatan 4'-hydroxyscutellarin, tetapi aktiviti perencatan 4'-hydroxyscutellarin adalah lebih tinggi daripada aktiviti quercetin-3-o glukosida. Selain itu, aktiviti perencatan koellin adalah lebih tinggi daripada apigenin tetapi lebih rendah daripada luteolin. Itis mencadangkan bahawa substituen cincin B, terutamanya kumpulan hidroksil, boleh meningkatkantyrosinaseaktiviti perencatan, dan kumpulan ortodihidroksi cincin B mempunyai aktiviti perencatan yang lebih besar [29].