Hubungi:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Faktor transkripsi mitokondria sasaran epitelium buah pinggang Kekurangan A mengakibatkan pengurangan mitokondria progresif yang dikaitkan dengan penyakit sista yang teruk--Bahagian I

Ken Ishii^1,2,11 et al

Fungsi mitokondria yang tidak normal adalah ciri akut dan kronik yang diiktiraf dengan baikbuah pinggang penyakit. Untuk mendapatkan gambaran tentang peranan mitokondria dalambuah pingganghomeostasis dan patogenesis, kami menyasarkan faktor transkripsi mitokondria A (TFAM), protein yang diperlukan untuk replikasi dan transkripsi DNA mitokondria yang memainkan peranan penting dalam penyelenggaraan jisim dan fungsi mitokondria. Untuk mengkaji akibat gangguan fungsi mitokondria dalambuah pinggangsel epitelium, kami menyahaktifkan TFAM dalam homeobox 2-berkaitan sinus oculis yang menyatakanbuah pinggangsel progenitor. Kekurangan TFAM mengakibatkan penurunan ekspresi gen mitokondria dengan ketara, pengurangan mitokondria, perencatan pematangan nefron, dan perkembangan penyakit sista selepas bersalin yang teruk, yang mengakibatkan kematian pramatang. Ini dikaitkan dengan morfologi mitokondria yang tidak normal, pengurangan penggunaan oksigen, dan peningkatan fluks glikolitik. Tambahan pula, kami mendapati bahawa ekspresi TFAM dikurangkan dalam murine dan manusiabuah pinggang polikistik, yang disertai dengan pengurangan mitokondria. Oleh itu, data kami mencadangkan bahawa disregulasi ekspresi TFAM dan pengurangan mitokondria adalah ciri molekulbuah pinggangpenyakit sista yang boleh menyumbang kepada patogenesisnya.

KATA KUNCI: glikolisis; perkembangan buah pinggang; mitokondria;penyakit buah pinggang polikistik; TFAM

cistancheadalah baik untukpenyakit buah pinggang polikistik

Pernyataan Terjemahan

Kami telah menggunakan genetik tetikus untuk memahami peranan disfungsi mitokondria dalambuah pingganghomeostasis. Penyahaktifan faktor transkripsi mitokondria A (TFAM) dalam sel progenitor epitelium homeobox 2 berkaitan oculis sinus mengakibatkanbuah pinggangkegagalandisebabkan terukbuah pinggang polikistik penyakit. Penemuan kami menunjukkan bahawa disfungsi mitokondria progresif dikaitkan dengan pembezaan epitelium yang rosak danbuah pinggangsisogenesis. Tambahan pula, kami menetapkan bahawa ekspresi TFAM dan nombor mitokondria dikurangkan pada manusiabuah pinggang polikistiktisu. Kajian kami mencadangkan bahawa strategi terapeutik, yang bertujuan untuk meningkatkan kesihatan mitokondria, mungkin bermanfaat dalam rawatan pesakit dengan autosomal dominan.buah pinggang polikistikpenyakit.

Disfungsi mitokondria (mt) adalah ciri patologi yang terkenalbuah pinggang penyakitdan boleh mencetuskan kecederaan selular, keradangan, dan fibrosis.1 Dalambuah pinggang, sel epitelium tiub sangat bergantung kepada adenosin trifosfat (ATP) yang dihasilkan daripada fosforilasi oksidatif (OXPHOS) kerana ia melakukan pelbagai fungsi pengangkutan epitelium yang memakan tenaga. Oleh itu, rezeki pengeluaran mt ATP yang cekap adalah penting untuk fungsi buah pinggang yang normal dan homeostasis elektrolit sistemik. Di samping itu, bukti terkini menunjukkan bahawa mitokondria mempunyai peranan utama dalam pengawalseliaan gen, isyarat selular, dan pembezaan sel melalui penjanaan metabolit perantara dan spesies oksigen reaktif (ROS).2 Walaupun terdapat kemajuan ini, peranan isyarat mt dalam patogenesis penyakit biasa.buah pinggangpenyakittidak difahami dengan baik.

Untuk menyiasat fungsi mt dalambuah pingganghomeostasis dan patogenesis, kami menyasarkan faktor transkripsi mitokondria A (TFAM). TFAM ialah faktor berkod nuklear yang penting untuk fungsi mt, penyelenggaraan nombor salinan mt, dan kestabilan struktur DNA mt kerana ia mengawal replikasi dan transkripsi genom mt dengan membengkokkan DNA promoter.3,4 DNA mt mamalia mengandungi 37 gen, 13 daripadanya mengekod subunit protein kompleks rantai pernafasan, 22 mengekod RNA pemindahan, dan 2 RNA ribosom.3 Oleh itu, TFAM terlibat secara langsung dalam pengawalan pengangkutan elektron mt dan sintesis ATP melalui transkripsi gen seperti sitokrom b yang dikodkan mitokondria ( MT-CYB), subunit cytochrome c oxidase 1 (MT-CO1) yang dikodkan secara mitokondria dan subunit membran sintase ATP 6 (MTATP6) yang dikodkan secara mitokondria.3,5Tanpa TFAM, sel kehilangan keupayaan untuk menghasilkan ATP melalui OXPHOS, tidak dapat menjana sejumlah besar mt. ROS, dan menjadi semakin berkurangan mitokondria.6–9 Kajian genetik telah menunjukkan bahawa TFAM adalah penting untuk embriogenesis normal kerana ketidakaktifan Tfam homozigot global mengakibatkan intrauterin kematian pada hari 10.5 embrio, manakala kekurangan heterozigot, walaupun ia mengurangkan bilangan salinan mt sebanyak ~40 peratus dan membawa kepada kekurangan rantai pernafasan, tidak membawa kepada kematian embrio.6 Oleh itu, penyasaran genetik TFAM adalah strategi eksperimen yang berguna untuk mengkaji peranan disfungsi mt progresif dalam pembezaan selular dan homeostasis tisu. Penyahaktifan bersyarat khusus jenis sel bagi Tfam mencadangkan bahawa penjanaan OXPHOS dan/atau mt ROS adalah penting untuk pembezaan selular, fungsi dan fisiologi normal.6–10

Gangguan mt utama akibat mutasi gen nuklear atau mt mungkin hadir denganbuah pinggang penyakitpaling biasa dimanifestasikan sebagai kecederaan tubulointerstitial atau disfungsi tubular terpencil.11,12 Walaupun terlibat dalam patogenesis penyakit manusia tertentu seperti gangguan neurodegeneratif,13 mutasi khusus dalam TFAM menyebabkanbuah pinggangpenyakit belum dilaporkan. Baru-baru ini, ungkapan TFAM yang dikurangkan telah dikaitkan dengan kronikbuah pinggangpenyakit. Kehilangan integriti mt akibat ketidakaktifan Tfam menyebabkan penyakit tubulointerstitial danbuah pinggang kegagalanpada tikus, yang sebahagiannya disebabkan oleh pengaktifan mt DNA yang disebabkan oleh tekanan GMP-AMP synthase (cGAS)-stimulator gen interferon (STING) yang bergantung kepada tindak balas keradangan.14

Di sini kami melaporkan bahawa tikus dengan ketidakaktifan Tfam bersyarat dalam homeobox 2 (SIX2) berkaitan sinus oculis-mengekspresikan sel-sel progenitor nefron15 mengalami penyakit sista yang teruk dan mati lebih awal daripadabuah pinggangkegagalansebagai tikus juvana muda.Tfam^-/- tikus dicirikan oleh kecacatan dalam pematangan nefron, yang dikaitkan dengan pengurangan mt, pengurangan OXPHOS, dan anjakan metabolik ke arah glikolisis dalamTfam^-/- buah pinggangepitelium. Memandangkan keterukan penyakit sista diTfam^-/- tikus, kami menganalisis 2 model tetikusbuah pinggang polikistikpenyakit(PKD), yang terhasil daripada mutasi sama ada dalam polycystin-1 (PKD(penyakit buah pinggang polikistik)1) atau cystin-1 (Cys1), serta tisu manusia daripada pesakit dengan penyakit buah pinggang polikistik dominan autosomal (ADPKD). Kami menetapkan ituTfam^-/- diselaraskan dalam sista daripada kedua-dua murine dan PKD manusia(penyakit buah pinggang polikistik), tisu. Diambil bersama, kajian kami mencadangkan bahawa disregulasi TFAM dan pengurangan mt adalah ciri ciribuah pinggangpenyakit sista dan mungkin mempunyai peranan penyumbang dalam patogenesisnya.

cistancheadalah baik untukpenyakit buah pinggang polikistik

KEPUTUSAN

Penyahaktifan Tfam dalam sel keturunan ENAM menyebabkan penyakit sista yang teruk mengakibatkanbuah pinggangkegagalanUntuk menyiasat fungsi mt dalambuah pinggangepitelium, kami menyahaktifkan Tfam dalam ENAM2-mengekspresikan sel progenitor, yang menimbulkan semua segmen nefron, kecuali saluran pengumpul (CD).15 Untuk ini, kami melintasi alel floks Tfam dengan tikus transgenik kromosom tiruan bakteria yang menyatakan protein pendarfluor hijau/Cre recombinase fusion protein yang dipertingkatkan (eGFP/Cre) di bawah kawalan transkrip promoter Six2 (Rajah 1a).16 Tikus homozigot untuk alel flox Tfam dan heterozigot untuk transgen eGFP/Cre (Enam2-eGFP/Cretg/^{tg tambah}; Tfam^fl/fl) dari sini dirujuk sebagai Enam2-Tfam^-/- mutan. Enam2-Tfam^-/- tikus dilahirkan pada nisbah Mendelian yang dijangkakan dan tidak dapat dibezakan daripada kawalan Cre littermate melalui pemeriksaan visual semasa lahir. Walau bagaimanapun, perbezaan berat badan antara Enam2-Tfam^-/- kawalan mutan dan Cre littermate menjadi jelas menjelang hari selepas bersalin (P) 14 (5.7 tambah -0.3 g untuk mutan berbanding 7.5 tambah -0.3 g untuk kawalan, n=4 setiap satu, P =0.004; Jadual Tambahan S1). Enam{13}}Tfam^-/- tikus mutan dicirikan oleh pembesaranbuah pinggangberbanding dengan kawalan (buah pinggang/nisbah berat badan sebanyak 1.45 peratus campur -0.19 peratus untuk mutan lwn. 0.60 peratus tambah - 0.02 peratus untuk kawalan, n {{8} } setiap satu, P <0.001; rajah="" 1b,="" jadual="" tambahan="" s1)="" dan="" meninggal="" dunia="" antara="" umur="" p20="" dan="" p30="" (rajah="" 1b).="" kematian="" juvana="" dalam="" kohort="" mutan="" dikaitkan="">buah pinggangkegagalandaripada penyakit sista yang teruk dengan paras nitrogen urea darah 68.40 ditambah -5.32 mg/dl untuk tikus mutan berbanding 16.8 2.0 mg/ dl untuk kawalan ( n= 6 dan 7, masing-masing; P < 0.0001;="" rajah="" 1b="" dan="" c).="" tambahan="" pula,="" enam2-tfam="" mutan="" membangunkan="" albuminuria="" yang="" ketara="" (nisbah="" albumin/kreatinin="" air="" kencing="" 43.58="" campur="" -362.475.18="" mg/g="" dalam="" enam2-tfam="" mutan="" berbanding="" 3.39="" mg/g="" dalam="" kawalan="" masing-masing="" pada="" p14,="" n="6" dan="" 10;="" p=""><0.0001). ini="" selaras="" dengan="" corak="" ekspresi="" cre="" recombinase="" dalam="" sel="" progenitor="" nefron="" six2,="" yang="" menimbulkan="" cap="">buah pinggangtubul dan podosit.15 Berbeza dengan Enam2-Tfam^-/- mutan, tikus dengan kekurangan Tfam heterozigot dalam sel progenitor ENAM2 berkembang secara normal, subur, dan tidak berkembang secara terang-teranganbuah pinggangpenyakit(Tambahan Rajah S1).

Rajah 1|Penyahaktifan Tfam dalam sel keturunan SIX2 mengakibatkan penyakit sista yang teruk dan kegagalan buah pinggang. (a) Skema yang menggambarkan pendekatan eksperimen dan lokasi jujukan yang disasarkan dalam alel flox Tfam. Analisis tindak balas rantai polimerase bagi jumlah DNA genomik buah pinggang yang diasingkan daripada kawalan rakan sampah (Cre ) dan Enam2-Tfam^-/-tikus pada umur hari selepas bersalin (P) 7; alel floks Tfam yang tidak bergabung ditandakan dengan 2-lox (2); alel gabungan semula oleh 1-lox, alel jenis liar mengikut wt; þ atau - menunjukkan kehadiran atau ketiadaan Enam2-eGFP/Cre transgen. (b) Panel kiri, gambar buah pinggang dari kawalan Cre dan Enam2-Tfam^-/- tikus pada umur P20. Berat buah pinggang (KW) dinyatakan sebagai peratusan berat badan (BW) (n= 4–14). Panel kanan, paras nitrogen urea darah (BUN) dalam kawalan sampah Cre (co) dan Enam2-Tfam^-/-tikus pada umur P7 (masing-masing n=7 dan 6) dan lengkung kelangsungan hidup Kaplan-Meier untuk kawalan Cre dan Enam2-Tfam^-/- tikus berbanding dengan ujian peringkat log (n=10–13). (c) Imej perwakilan bahagian buah pinggang tertanam formalin, parafin daripada kawalan Cre dan Enam2-Tfam^-/-tikus pada umur P7 dan P29 diwarnai dengan hematoxylin dan eosin (H&E) dan dianalisis oleh imunohistokimia untuk aktin otot licin a (ACTA2) dan antigen pembezaan kelompok (CD) 31. Tanda nombor menggambarkan struktur sista dan asterisk menggambarkan glomeruli. Bar ¼ 1 mm untuk keseluruhan keratan rentas buah pinggang, 100 mm untuk imej H&E berkuasa tinggi dan 50 mm untuk imej IHC. Data dinyatakan sebagai min tambah - SEM dan dianalisis oleh 2-ujian-t Pelajar berekor. ***P < 0.001.="" untuk="" mengoptimumkan="" paparan="" imej="" ini,="" sila="" lihat="" versi="" dalam="" talian="" artikel="" ini="" di="">

Analisis Enam2-Tfam^-/- tikus, yang turut menyatakan alel wartawan ROSA26-ACTB-tdTomato,-eGFP Cre, di sini dirujuk sebagai Enam2-mT/mG;Tfam^-/- tikus, menunjukkan bahawa sebahagian besar struktur sista dalamTfam^-/- buah pinggang diperolehi daripada sel dengan sejarah Enam2-ekspresi eGFP/Cre (Tambahan Rajah S2). Sista dalam Enam2-Tfam^-/- buah pinggangmenunjukkan bukti percambahan seperti yang ditunjukkan oleh kehadiran Ki67-sel epitelium lapisan sista positif (secara purata w40 peratus daripada semua sel epitelium lapisan sista), manakala sel positif untuk caspase 3 yang terbelah tidak dikesan dalam sista (Tambahan Rajah S3 ). Penemuan ini konsisten dengan peningkatan tahap kinase terkawal isyarat ekstraselular terfosforilasi (p-ERK) dan b-catenin dalam Enam2-Tfam^-/- tisu buah pinggang (Tambahan Rajah S3). Secara keseluruhan, data kami menunjukkan bahawa Enam2-Tfam^-/- buah pinggang mempamerkan ciri molekul yang sering dikaitkan denganbuah pinggangpenyakit sista.

Rajah 3 |Tfam^-/-sista tidak menyatakan penanda khusus segmen nefron biasa. (a) Imej perwakilan bahagian buah pinggang tertanam formalin, parafin daripada Enam2-mT/mG;Tfam^-/-mice at age postnatal day (P) 14 stained for enhanced green fluorescent protein (eGFP), megalin, uromodulin, thiazide-sensitive sodium chloride cotransporter (NCC), and aquaporin 2 (AQP2) by immunofluorescence (IF). 4',6-diamidino-2-phenylindole was used for nuclear staining (blue fluorescence). Arrows depict tubular structures expressing respective nephron segment-specific markers. Nephron segment marker expression was assessed in cysts with a maximal diameter of >50 mm. (b) Imej perwakilan bahagian buah pinggang tertanam formalin, parafin daripada Enam2-mT/mG;Tfam^-/-tikus pada umur P14 diwarnai untuk eGFP dan uromodulin oleh IF. Asterisk menggambarkan sista dengan uromodulin intraluminal. Kehadiran uromodulin intraluminal diperiksa dalam sista dengan diameter maksimum sama ada 50-100μm atau dalam sista yang lebih besar daripada 100 mm diameter maksimum. Bar=(a,b) 100 mm. Untuk mengoptimumkan paparan imej ini, sila lihat versi dalam talian artikel ini diwww.kidney-international.org.

cistancheadalah baik untukbuah pinggang

Kematangan nefron rosak dalam Six2-Tfam^-/-tikus

Kerana ia boleh mengambil masa sehingga beberapa minggu sebelum tikus dengan ketidakaktifan Tfam khusus tisu mengembangkan patologi,17 kami seterusnya memeriksa perjalanan masabuah pinggangperkembangan penyakit di Six2-Tfam^-/-tikus. Kami mengumpul buah pinggang daripada tikus kawalan dan mutan pada umur P0, P7 dan P14 dan menggunakan kaedah histologi, pewarnaan imunofluoresensi (IF) dan analisis ekspresi gen secara keseluruhan.buah pinggangekstrak untuk penilaian. JIKA pewarnaan untuk SIX2 dan E-cadherin pada umur P0 menunjukkan bahawa buah pinggang daripada kawalan dan Enam2-Tfam^-/-adalah serupa secara histologi. Pembentukan struktur zon nefrogenik kortikal, seperti SIX2þ cap mesenchyme, E-cadherin– mengekspresikan hujung ureter, dan struktur nefron yang baru lahir sepertibuah pinggangvesikel dan badan berbentuk koma dan berbentuk S tidak disekat dalam Enam2-Tfam^-/-buah pinggang (Rajah 2a). Penemuan histologi ini konsisten dengan tahap ekspresi gen yang mengekodkan penanda nefrogenik. Six2, kotak 2 berpasangan (Pax2), protein homeobox LIM 1 (Lhx1) dan tahap mRNA faktor transkripsi seperti spalt 1 (Sall1) tidak jauh berbeza antara kawalan dan Enam2-Tfam^-/- tikus secara keseluruhanbuah pingganghomogenat daripada P0buah pinggang(Rajah 2b). Ini mencadangkan bahawa penyahaktifan TFAM dalam ENAM nefron progenitor tidak memberi kesan ketara kepada pembentukan struktur nefrogenik.

Walaupun pembentukan struktur nefron yang baru lahir tidak dihalang, pewarnaan dengan alcian blue/asid berkala–Schiff dan lotus tetragonolobus lectin menunjukkan kematangan nefron terminal yang rosak dalam Enam2-Tfam^-/-tikus pada umur P{{0}}. Alcian blue/periodic acid–Schiff, yang mengotorkan membran bawah tanah tiub dan sempadan berus, dan lotus tetragonolobus lectin, yang mengenal pasti oligosakarida tertentu dalam sempadan berus sel tubul proksimal, kedua-duanya berkurangan dalam buah pinggang mutan. Rajah 2c menunjukkan alcian blue/asid berkala– pewarnaan Schiff pada titik masa P0, P7 dan P14. Lotus tetragonolobus lectin histochemistry dan pewarnaan IF untuk protein Wilms tumor 1 pada titik masa P{{10}}, P7 dan P14 ditunjukkan dalam Rajah Tambahan S4. Pada umur P0, kawasan relatif yang bernoda positif dengan lotus tetragonolobus lectin ialah 2.10 peratus , 0.51 peratus dan {{30}}.39 peratus 0.1 peratus pada umur P7 berbanding 6.25 peratus 0.28 peratus dan 6.2 peratus 1.1 peratus untuk kawalan, masing-masing (n ¼ 3–4, P ¼ 0.0004 dan 0.0007, masing-masing; Rajah Tambahan S4). Selaras dengan penemuan histologi ini adalah penurunan ketara dalam ekspresi gen yang mengekodkan penanda khusus segmen glomerular dan nefron podocin, nephrin, aquaporin 1 (Aqp1), natrium-fosfat kotransporter 2a (NaPi2a), uromodulin, natrium-kalium klorida kotransporter 2 ( Nkcc2), dan cotransporter (Ncc) natrium klorida sensitif thiazide dalam Enam2-Tfam^-/-tikus (Rajah 2b). Secara keseluruhan, data ini mencadangkan bahawa Enam2-Tfam^-/- buah pinggangmempamerkan pengurangan progresif dalam bilangan segmen nefron proksimal matang dan glomeruli.

Oleh kerana aktiviti Enam2-eGFP/Cre menghasilkan segmen nefron yang berasal dari cap mesenchyme yang kekurangan TFAM, kami meramalkan bahawa kematangan sel epitelium CD, yang berasal dari tunas ureteri, tidak akan terjejas dalam Enam{{2} }Tfam^-/-buah pinggang. Selaras dengan tanggapan ini ialah pewarnaan dengan Dolichos biflorus agglutinin, yang bertindak balas dengan N-asetil-D-galaktosa dalam tubul distal dan CD, menunjukkan gambaran berlebihan relatif struktur Dolichos biflorus agglutinin-positif dalam Enam2-Tfam^-/-buah pinggang. Pada umur P7, kawasan bernoda positif untuk Dolichos biflorus agglutinin terdiri daripada 13.91 peratus 0.9 peratus daripada jumlah kawasan untuk mutan berbanding 1.93 peratus 0.1 peratus untuk kawalan (n ¼ 3, P ¼ { {10}}.0002; Rajah Tambahan S4). Ekspresi mRNA saluran natrium epitelium 1 alpha subunit (Scnn1a) atau aquaporin 2 (Aqp2), yang kedua-duanya dinyatakan dalam sel epitelium CD, tidak berkurangan dengan ketara berbanding dengan kawalan (Rajah 2b). Berbeza dengan Enam2-Tfam^-/-buah pinggang, ketidakaktifan Tfam dalam sel progenitor homeobox B7 (HOXB7), yang menimbulkan sel epitelium CD, mengakibatkan kehilangan ekspresi penanda nefron CD dan dilatasi tiub ringan tetapi bukan cystogenesis (Tambahan Rajah S5). Diambil bersama, data kami menunjukkan bahawa kehilangan fungsi TFAM dalam sel progenitor SIX2 tidak menghalang perkembangan struktur nefron yang baru lahir tetapi menghalang pematangan nefron terminal.

Tfam^-/-sista kekurangan penanda segmen nefron biasa

Untuk mencirikan asal histogenetikTfam^-/- buah pinggangsista, kami melakukan analisis JIKA bagiTfam^-/- buah pinggangat age P14 and examined the expression of nephron segment markers megalin (proximal tubule), uromodulin (medullary thick ascending limb of Henle), thiazide sensitive sodium chloride cotransporter (distal tubule), and aquaporin 2 (CD). The majority of cysts with a maximal diameter of >50 mm did not express these segment-specific markers, indicating a lack of cellular differentiation (Figure 3a, Supplementary Figure S6). Furthermore, approximately 50% of cysts with a maximal diameter of >50 mm dicirikan oleh deposit intraluminal uromodulin, yang mencadangkan asal dari segmen nefron distal ke tubul proksimal dan gelung menurun Henle (Rajah 3b).

Keabnormalan progresif dalam fungsi mt dan morfologi dalamTfam^-/- sel epitelium

Untuk mencirikan perjalanan masa akibat metabolik penghapusan Tfam, kami mula-mula memeriksa tahap mRNA Tfam dan mt-Co1, mt-Cyb, dan mt-Atp6 yang dikawal oleh TFAM dalamTfam^-/- buah pinggangpada umur P0, P7 dan P14. Seperti yang dijangkakan, tahap mRNA Tfam, mt-Co1, mt-Cyb, dan mt-Atp6 telah dikurangkan dengan ketara (Rajah 4a).Tfam^-/-sel epitelium yang ditandakan dengan eGFP (Enam {{0}}mT/mG; Tfam / tikus) menunjukkan pengurangan ketara dalam ekspresi protein MT-CO1 (Tambahan Rajah S7). Nombor salinan mt DNA dikurangkan sebanyak 63 peratus , yang konsisten dengan pengurangan mt, ciri kekurangan TFAM (Rajah 4a). Sebaliknya, ekspresi gen nuklear yang mengekod nicotinamide adenine dinucleotide: ubiquinone oxidoreductase core subunit 3 (Ndufs3) dan succinate dehydrogenase complex flavoprotein subunit A (Sdha) tidak terjejas pada umur P0 tetapi dikurangkan pada umur P7 dan P14 (Rajah 4a). Penemuan daripada analisis gen dan protein mt ini konsisten dengan kehilangan progresif nombor salinan mt dalam Tfam / epitelium.

Kami seterusnya menyiasat kesan metabolik ketidakaktifan Tfam dalam sel epitelium tubul proksimal primer (PTEC) yang diasingkan pada umur P7.Tfam^-/- PTEC mempamerkan pengurangan ketara dalam kadar penggunaan oksigen basal (40.77 4.10 untuk mutan berbanding 61.75 5.18 pmol/min/104 sel untuk kawalan, n=3 setiap satu, P =0.034), respirasi berkaitan ATP (33.11 3.91 untuk mutan lwn. 46.92 4.91 pmol/min/104 sel untuk kawalan, n{{18} } setiap satu, P=0.093), respirasi maksimum (116.8 14.19 untuk mutan lwn. 225.5 13.55 pmol/min/104 sel untuk kawalan, n{{ 28}} setiap satu, P=0.005), dan kapasiti pernafasan ganti (76.05 10.18 untuk mutan berbanding 163.7 8.61 pmol/min/104 sel untuk kawalan , n =3 setiap satu, P=0.003; Rajah 4b).

Untuk mencirikan lagi tahap penyusutan dan kerosakan mt, kami telah memeriksaTfam^-/- buah pinggangmelalui mikroskop elektron penghantaran dan {{0}}mikroskop pencahayaan berstruktur dimensi (SIM 3D). Pada usia P7, mitokondria mempamerkan bentuk yang tidak teratur dan belon, yang konsisten dengan penemuan sebelumnya dalam tikus kalah mati Tfam. Analisis mikroskopik elektron penghantaran menunjukkan bahawa keabnormalan struktur mitokondria, seperti peningkatan saiz dan krista yang tidak normal, berkembang selepas bersalin kerana perbezaan morfologi antara mutan dan kawalan kurang jelas pada umur P0 dan menjadi lebih teruk dengan usia (Rajah 4c ). SIM 3D digunakan untuk memeriksa volum mt dan saiz rangkaian dalam Enam2-mT/mG; Tfam / mutan berbanding dengan Enam2-mT/mG tikus kawalan pada umur P7; isipadu mt diukur dalam keratan rentas 5 hingga 8 tubul setiap bahagian, memeriksa 25 hingga 40 sel epitelium kortikal eGFP-positif yang diwarnai untuk saluran selektif anion bergantung voltan 1 oleh pewarnaan IF. Kami mendapati bahawa jumlah volum mt setiap sel positif eGFP telah berkurangan dengan ketara (62.66 16.46 mm3/ sel untuk mutan berbanding 177.4 30.17 mm3 /sel untuk kawalan, n ¼ 3 setiap satu , P ¼ 0.0289) dan dikaitkan dengan perubahan dalam nisbah jumlah mt volum setiap jumlah volum sel daripada 0.230 0.01 dalam kawalan kepada 0.{{ 33}}.016 dalam Enam2-Tfam / mutan (n ¼ 3 setiap satu, P ¼ 0.0017; Rajah 4c). Saiz rangkaian mt maksimum, yang mengukur rangkaian mt terbesar yang ditemui dalam semua sel positif eGFP yang diperiksa, telah dikurangkan dalam Enam2-Tfam^-/- buah pinggang(143.2 23.2 mm3 untuk mutan lwn. 318.3 49.45 mm3 untuk kawalan, n ¼ 3 setiap satu, P ¼ 0.0327). Secara keseluruhan, penemuan ultrastruktur dan SIM dan penemuan daripada analisis gen dan protein mt adalah konsisten dengan kehilangan progresif nombor salinan mt dalamTfam^-/- epitelium.

Cistancheadalah baik untukpenyakit buah pinggang polikistik

Kekurangan TFAM mengalihkan metabolisme epitelium buah pinggang ke arah glikolisis

PTEC dalambuah pinggangmenggunakan asid lemak b-pengoksidaan dan OXPHOS untuk penjanaan ATP dan adalah glukoneogenetik.18 Untuk mendapatkan pandangan tambahan tentang perubahan metabolik yang berkaitan dengan penyahaktifan Tfam, kami melakukan analisis penjujukan RNA bagibuah pinggangdaripada Enam2-Tfam^-/-dan tikus kawalan Cremate littermate pada umur P7. Kami mendapati bahawa gen pengawalseliaan utama yang terlibat dalam glikolisis, seperti hexokinase 2 (Hk2) dan enolase 2 (Eno2), telah dikawal selia. Sebaliknya, ekspresi kebanyakan gen yang terlibat dalam kitaran asid trikarboksilik telah berkurangan (cth, isocitrate dehydrogenase 1 [Idh1]), seperti juga ungkapan gen yang terlibat dalam asid lemak b-pengoksidaan, seperti asetil-koenzim A acyltransferase 1B ( Acaa1b), asil-koenzim A dehidrogenase (Acadm) rantai sederhana (Rajah 5a dan b, Rajah Tambahan S8). Selaras dengan penurunan ekspresi gen yang terlibat dalam kitaran asid trikarboksilik -gen pengoksidaan ialah pengumpulan lipid neutral seperti yang dikesan oleh pewarnaan O merah minyak dalam bekubuah pinggangbahagian pada umur P14 (Rajah 5c).

Ekspresi TFAM yang dikurangkan dalam tisu murine dan PKD manusia dikaitkan dengan pengurangan mt

Kerana Enam2-Tfam^-/- buah pinggangmempunyai persamaan yang kuat dengan PKD(penyakit buah pinggang polikistik) buah pinggang, kami seterusnya menilai sama ada TFAM telah diselaraskan dalam PKD(penyakit buah pinggang polikistik)tisu. Kami mula-mula memeriksa ekspresi gen terkawal TFAM dan TFAM dalam 2 model tetikus PKD genetik yang mantap. Tahap mRNA Tfam telah dikurangkan dengan ketara dalam homogenat seluruh buah pinggang daripada Pkd^-/- dan Cys^cpk/cpktikus, yang membawa mutasi sama ada dalam PKD1(penyakit buah pinggang polikistik)atau Cys1. Ini dikaitkan dengan penurunan dalam ekspresi gen mt yang dikodkan secara mitokondria dan nuklear serta ekspresi gen glikolitik yang tidak dikawal. Sama dengan Enam2-Tfam^-/-buah pinggang, PKD(penyakit buah pinggang polikistik)^-/- dan Cys^cpk/cpk buah pinggangdicirikan oleh Eno2 dan Hk2 yang dinaikkan dan paras transkrip fosfogliserat (Pgk) 1, piruvat dehidrogenase kinase (Pdk) 1 dan Pdk4 menurun dengan ketara (Rajah 6a). Ekspresi protein TFAM, seperti yang dinilai oleh pewarnaan IF, telah dikurangkan dalam sel epitelium lapisan sista berbanding dengan sel epitelium dari tubul noncystic bersebelahan (Rajah 6b). Ini dikaitkan dengan ekspresi mt-Co1 dan mt-Atp6 yang dikurangkan oleh pendarfluor RNA in situ hibridisasi (Rajah 6b, Rajah Tambahan S9); volum mt, seperti yang ditentukan oleh SIM 3D, telah dikurangkan sebanyak 55 peratus berbanding dengan sama ada sel epitelium daripada tubul noncystic bersebelahan atau PTEC daripada kawalan biasabuah pinggang. Perbezaan dalam isipadu mt antara PTEC kawalan biasa dan PTEC daripada tubul noncystic tidak dijumpai (Rajah 6c).

Untuk mengkaji sama ada kehilangan ekspresi TFAM adalah ciri molekul biasa PKD manusia(penyakit buah pinggang polikistik), kami menganalisis spesimen nefrektomi daripada 5 pesakit ADPKD dengan imunohistokimia, pewarnaan IF, hibridisasi in situ pendarfluor RNA, dan SIM 3D. Ekspresi TFAM yang berkurangan diperhatikan dalam 75.2 peratus ditambah -7.5 peratus daripadabuah pinggangsista dianalisis oleh imunohistokimia. Ini dikaitkan dengan ekspresi penurunan MT-CO1 dan MT-ATP6 oleh RNA pendarfluor in situ hibridisasi (Rajah 7a, Rajah Tambahan S10); Jumlah mt dalam sel epitelium lapisan sista telah berkurangan sebanyak kira-kira 70 peratus seperti yang dinilai oleh SIM 3D (Rajah 7b). Diambil bersama, analisis 2 PKD(penyakit buah pinggang polikistik)model tetikus dan tisu ADPKD manusia mencadangkan bahawa kekurangan TFAM dan pengurangan mt adalah penemuan biasa dalam PKD(penyakit buah pinggang polikistik)tisu dan berkemungkinan memberi kesan kepada patogenesisbuah pinggangpenyakit sista.

cistanche adalah baik untukpenyakit buah pinggang polikistik

Perbincangan

Klik di sini untuk mendapatkan maklumat tentang Bahagian II (Perbincangan) artikel ini.

Dipetik daripada:'buah pinggangFaktor transkripsi mitokondria sasaran epitelium Kekurangan A mengakibatkan pengurangan mitokondria progresif yang dikaitkan dengan penyakit sista yang teruk 'oleh Ken Ishii1,2,11 et al.

---buah pinggangAntarabangsa (2021) 99, 657–670