Thrombomodulin Memperbaiki Mengubah Pertumbuhan Faktor-b1-pengantara Penyakit Ginjal Kronik Melalui Laluan Isyarat Reseptor G-protein 15/Akt
Mar 11, 2022
Hubungi:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Atsuro Takeshita1,2,8 , Taro Yasuma1,2,8 , Kota Nishihama1 , Corina N. D'Alessandro-Gabazza2, Masaaki Toda2 , Toshiaki Totoki4 , Yuko Okano1,2 , Akihiro Uchida1 , Ryo Inoue6 , Valjiang Qin7 , Liqiang Shuia Wang Fridman D'Alessandro2 , Tetsu Kobayashi3 , Yoshiyuki Takei4 , Akira Mizoguchi5 , Yutaka Yano1,9 dan Esteban C. Gabazza2,9
1 Jabatan Diabetes, Metabolisme dan Endokrinologi, Pusat Pengajian Siswazah Perubatan Universiti Mie, Tsu-city, Mie, Jepun; 2 Jabatan Imunologi, Pusat Pengajian Siswazah Perubatan Universiti Mie, Tsu-city, Mie, Jepun; 3 Jabatan Perubatan Pulmonari dan Penjagaan Kritikal, Pusat Pengajian Perubatan Siswazah Universiti Mie, Tsu-city, Mie, Jepun; 4 Jabatan Gastroenterologi dan Hepatologi, Pusat Pengajian Perubatan Siswazah Universiti Mie, Tsu-city, Mie, Jepun; 5 Jabatan Penjanaan Semula Neural dan Komunikasi Sel, Pusat Pengajian Perubatan Siswazah Universiti Mie, Tsu-city, Mie, Jepun; 6 Institut Pusat Haiwan Eksperimen, Kawasaki-ku, Kawasaki, Kanawaga, Jepun; dan 7 Jabatan Nefrologi, Hospital Taizhou, Universiti Perubatan Wenzhou, Lihai, Wilayah Zhejiang, Republik Rakyat China.
Buah Pinggang Antarabangsa (2020) 98, 1179–1192; https://doi.org/10.1016/ j.kint.2020.05.041
Hak Cipta ª 2020, International Society of Nephrology. Diterbitkan oleh Elsevier Inc. Ini ialah artikel akses terbuka di bawah lesen CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).
Surat-menyurat: Esteban C. Gabazza, Jabatan Imunologi, Sekolah Perubatan Universiti Mie, Edobashi 2-174, Tsu-city, Mie 514-8507, Jepun. E-mel: gabazza@doc.medic.mie-u.ac.jp; atau Yutaka Yano, Diabetes, Metabolisme dan Endokrinologi, Pusat Pengajian Perubatan Siswazah Universiti Mie, Edobashi 2-174, Tsu-city, Mie 514-8507, Jepun. E-mel: yanoyuta@clin.medic.mie-u.ac.jp 8 AT dan TY menyumbang sama kepada kerja ini. 9 YY dan ECG adalah pengarang kanan bersama. Diterima 1 September 2019; disemak pada 24 April 2020; diterima pada 7 Mei 2020
KATA KUNCI: apoptosis; penyakit buah pinggang yang kronik; Reseptor berganding protein G; trombomodulin manusia rekombinan; mengubah faktor pertumbuhan-b1
Fifibrosis buah pinggang adalah akibat biasa penyakit buah pinggang kronik yang tidak dapat dielakkan berkembang kepada penyakit buah pinggang peringkat akhir dengan kegagalan organ boleh dirawat hanya dengan terapi penggantian. Memandangkan mengubah faktor pertumbuhan-b1 adalah pemain utama dalam patogenesis fifibrosis buah pinggang, kami mengemukakan hipotesis bahawa trombomodulin rekombinan boleh memperbaiki perubahan fifibrosis dan kegagalan buah pinggang progresif faktor pertumbuhan-b1-pengantara. Untuk menyoal hipotesis kami, kami menghasilkan tetikus transgenik faktor pertumbuhan transformasi manusia khusus glomerulus-b1 untuk menilai kesan terapeutik trombomodulin rekombinan. Tikus transgenik ini mengembangkan sklerosis glomerular progresif dan fifibrosis tubulointerstitial dengan kegagalan buah pinggang. Terapi dengan trombomodulin rekombinan selama empat minggu secara signifikan menghalang fifibrosis buah pinggang dan meningkatkan fungsi organ berbanding tikus transgenik yang tidak dirawat. Rawatan dengan trombomodulin rekombinan dengan ketara menghalang apoptosis dan pembezaan mesenchymal podosit dengan berinteraksi dengan reseptor G-protein yang digabungkan 15 untuk mengaktifkan laluan isyarat Akt dan untuk mengawal selia ekspresi protein anti-apoptosis termasuk survivin. Oleh itu, kajian kami sangat mencadangkan potensi keberkesanan terapeutik trombomodulin rekombinan untuk rawatanpenyakit buah pinggang yang kronikdan kegagalan organ seterusnya.
cistanchebolehmerawat penyakit buah pinggangmeningkatkan fungsi buah pinggang
Pernyataan Terjemahan
Fibrosis dan disfungsi padabuah pinggangkini merupakan masalah kesihatan utama di seluruh dunia. Pada masa ini tiada ubat antifibrotik yang diluluskan untuk rawatan fibrosis buah pinggang. Mengubah faktor pertumbuhan-b1 adalah pemacu utama dan biasa bagi fibrogenesis buah pinggang dalam penyakit buah pinggang kronik yang disebabkan oleh banyak gangguan. Kami mendapati di sini bahawa trombomodulin rekombinan, ubat yang diluluskan di Jepun untuk merawat pembekuan intravaskular yang disebarkan, menyekat perkembangan sklerosis glomerular, fifibrosis tubulointerstitial, dan kegagalan buah pinggang yang disebabkan oleh overexpression faktor pertumbuhan mengubah manusia-b1, mencadangkan nilai terapeutik yang berpotensi untuk rawatan. daripadapenyakit buah pinggang kronik.
Penyakit buah pinggang kronikadalah masalah kesihatan awam utama yang dikaitkan dengan morbiditi dan kematian yang tinggi yang menjejaskan kira-kira 13 peratus daripada populasi dewasa di negara maju.1 Pertubuhan Kesihatan Sedunia melaporkan bahawapenyakit buah pinggang yang kronik(CKD) adalah punca 1.5 peratus kematian di seluruh dunia pada 2012.1 Tambahan pula, data epidemiologi terkini menunjukkan peningkatan global yang stabil dalam bilangan pesakit dengan CKD.2,3 Dalam kebanyakan kes, proses patologi berkembang secara progresif, yang akhirnya membawa kepada akhir- kegagalan buah pinggang peringkat, yang boleh dirawat semata-mata dengan dialisis seumur hidup atau pemindahan buah pinggang.4,5 Diabetes mellitus (DM) dan hipertensi arteri adalah penyebab CKD yang paling kerap diikuti oleh iskemia, glomerulosklerosis yang tidak diketahui etiologinya, halangan urologi, dan jangkitan kronik.6 Terlepas dari gangguan yang mendasari, akibat patologi akhir dan biasa CKD adalah fifibrosis buah pinggang.7 Fifibrosis buah pinggang ialah penyembuhan yang menyimpang dan pembentukan semula struktur parenkim buah pinggang yang mengalami kecederaan yang berpanjangan atau berulang yang dicirikan oleh kehadiran fifibrosis tubulointerstitial, glomerulosclerosis, dan atrofi tiub.8 Pemacu utama fifibrogenesis buah pinggang adalah mengubah fakta pertumbuhan atau (TGF)-b1.8,9 TGFb1 boleh menggalakkan fifibrosis dengan merangsang rembesan protein matriks ekstraselular dan faktor kemotaktik atau faktor pembiakan fibroblas, dengan menghalang metalloproteinase, dan dengan menggalakkan peralihan epitelium-mesenchymal.10 Selain daripada merawat penyakit yang mendasari , ubat yang diluluskan yang menyasarkan secara khusus fifibrosis buah pinggang tidak tersedia pada masa ini.6
Thrombomodulin (TM) ialah glikoprotein transmembran dengan pelbagai fungsi biologi termasuk modulasi sistem pembekuan, tindak balas imun, tindak balas keradangan, dan kemandirian sel.11 Struktur molekul TM mengandungi domain seperti lektin, 6 domain seperti faktor pertumbuhan epidermis. , domain yang kaya dengan serine/treonine, bahagian transmembran dan ekor sitoplasma.12 Thrombin, faktor prokoagulan yang dihasilkan semasa pengaktifan sistem pembekuan, menjadi faktor antikoagulan dan antifibrinolitik selepas mengikat TM.13 Kompleks TM-trombin meningkatkan penjanaan protein teraktif C (APC), antikoagulan dengan aktiviti anti-radang dan sitoprotektif, dengan mengaktifkan protein C. Di samping itu, TM sahaja boleh secara langsung mengurangkan tindak balas keradangan dengan menghalang aktiviti protein kumpulan mobiliti tinggi B-1 (HMGB1), dengan menekan sel dendritik imunogenik, eosinofil, sel mast, dan sistem pelengkap.13–18
Terdapat keputusan yang diterbitkan menunjukkan kesan pencegahan TM dalam renopati diabetik dan kecederaan buah pinggang reperfusi iskemia.19-21 Walau bagaimanapun, tiada kajian telah menilai kesan TM rekombinan pada fifibrosis buah pinggang progresif yang disebabkan oleh TGFb1, pemacu biasa fifibrosis buah pinggang dalam beberapa penyakit yang menyebabkan CKD. Kami mengemukakan hipotesis bahawa TM boleh memperbaiki TGFb1-fifibrosis buah pinggang pengantara dan kegagalan buah pinggang. Untuk menyoal hipotesis ini, kami menilai kesan terapeutik TM rekombinan dalam tetikus transgenik TGFb1 (TG) khusus glomerulus yang baru dibangunkan yang berkembang secara progresif.fifibrosis buah pinggang dan kegagalan buah pinggang.
cistanche untuk buah pinggang
KEPUTUSAN
Peningkatan serpihan TM yang beredar berkorelasi dengan disfungsi buah pinggang
TM, glikoprotein terikat membran sel endothelial, dipecahkan dalam serpihan, kehilangan fungsi perlindungannya semasa kecederaan endothelial.22 Nefropati diabetik dikaitkan dengan kecederaan endothelial.23,24 Pesakit DM dengan nefropati, berbanding pesakit tanpa nefropati, menunjukkan tinggi yang ketara. tahap pengedaran TM (4.4 lwn. 3.3 pg/ml) dan TGFb1 aktif (0.28 lwn. 0.24 ng/ml) (Jadual Tambahan S1, Rajah Tambahan S1A). TM berkait rapat dengan kreatinin, TGFb1 aktif, dan podocin larut (Rajah Tambahan S1B). Pemerhatian ini menunjukkan bahawa kehilangan TM terikat membran berfungsi dikaitkan dengan peningkatan pelepasan TGFb1 aktif dan disfungsi buah pinggang.
Tikus TG dengan ekspresi khusus glomerulus gen TGFb1 manusia penuh
Kami membangunkan tetikus TG yang mengekspresikan gen TGFb1 manusia penuh dalam podosit. Tetikus dihasilkan dengan meletakkan TGFb1 manusia di bawah kawalan promoter podocin pada binaan kromosom buatan bakteria (BAC) (Supplementary Figure S2; Supplementary Figure S3). Kami memperoleh 5 tikus pengasas yang menyatakan 3 salinan dan 3 tikus pengasas menyatakan 1 salinan transgen TGFb1 manusia. Ekspresi transgen adalah khusus buah pinggang, dan keturunan pengasas berdaya maju (Tambahan Rajah S3). Tikus mempunyai kehamilan jangka penuh dan sampah bersaiz normal. Tikus dilahirkan dalam nisbah Mendelian yang dijangkakan.
Untuk mencirikan tikus TG, kami mengukur beberapaparameter buah pinggangsetiap 4 minggu untuk tempoh 16 minggu (Tambahan Rajah S4). Kepekatan plasma dan air kencing TGFb1 telah meningkat dengan ketara dalam tikus TGFb1- TG berbanding tikus jenis liar (WT) dari minggu awal selepas kelahiran dan kemudian kekal stabil pada tahap tinggi (Rajah 1a). Tikus TGFb1-TG menunjukkan peningkatan ketara dalam kandungan tisu buah pinggang hidroksiprolin pada minggu ke-20(190.5 berbanding 96.0 mg/buah pinggang ), pengembangan mesangial dari minggu ke-4 (skor 1.9 lwn. 1.1), dan dalam pemendapan kolagen dari minggu ke-12 (0.9 peratus lwn. 0.1 peratus ) selepas kelahiran berbanding rakan WT mereka (Rajah 1a–f ). Mikroskopi optik konvensional menunjukkan pelebaran membran bawah tanah kapsul Bowman, penebalan membran bawah tanah glomerular, peningkatan pemendapan kolagen dalam ruang mesangial dan interstisial, dan atrofi tiub (Rajah 1bd). Mikroskopi elektron penghantaran menunjukkan glomerulosklerosis termasuk transformasi mikrovillous dan pembuangan proses kaki podosit, penurunan fenestrasi endothelial kapilari glomerular, penebalan membran bawah tanah glomerulus, dan peningkatan pemendapan matriks mesangial (Rajah 2a–i). Kepekatan urin bagi penanda awal nefropati Protein pengikat asid lemak (185.1 berbanding 87.0 pg/ml) dankecederaan buah pinggangmolekul 1 (441.9 lwn. 256.9 pg/ml) telah dipertingkatkan dengan ketara dalam tikus TGFb1-TG dari minggu ke-4 dan ke-8, masing-masing, berbanding dengan tikus WT yang dipadankan dengan umur mereka (Rajah Tambahan S5). Jumlah proteinuria dan jumlah nisbah protein-kreatinin dalam air kencing telah meningkat dengan ketara pada minggu ke-4, ke-8, ke-12, ke-16 dan ke-20dalam TGFb1-TG tikus berbanding dengan rakan WT mereka (Rajah 3a) . Paras plasma nitrogen urea darah telah meningkat dengan ketara daripada minggu ke-4 (5.1 lwn. 4.1 mg/dl) dan kepekatan kreatinin dari minggu ke-8 (1.1 lwn. 0.4 mg/dl) dalam tikus TGFb1-TG berbanding dengan rakan WT mereka (Rajah 3b).
rhTM menghalang glomerulosklerosis dan fifibrosis tubulointerstitial
Apabila dibandingkan dengan tikus TGFb{{0}}TG yang dirawat dengan salin (SAL) dan tikus WT yang dirawat dengan manusia rekombinan (RH) TM atau SAL, tikus TGFb1-TG yang dirawat dengan irama menunjukkan penurunan mesangial dengan ketara pengembangan/selulariti (skor 1.3 lwn. 3.{{30}}) dan pemendapan kolagen tubulointerstitial dan glomerulosklerosis yang ketara rendah (121.3 peratus lwn. 139.7 peratus ) (Rajah 4a–e). Selaras dengan pemerhatian ini, kandungan hidroksiprolin (11.7 lwn. 19.9 mg/g), kepekatan tisu buah pinggang kolagen I (101.3 lwn. 196.7 ng/mg protein) dan periostin (21.7 lwn. 40.8 ng/ mg protein), dan ekspresi mRNA relatif kolagen I telah berkurangan dengan ketara dalam tisu buah pinggang daripada tikus TGFb1-TG yang dirawat dengan rhTM berbanding dengan tisu buah pinggang daripada tikus kawalan (Rajah 4f, Jadual Tambahan S2 dan S3). Mikroskopi elektron penghantaran menunjukkan pengurangan ketara proses kaki podosit dan penebalan membran bawah tanah glomerular pada tikus yang dirawat dengan rhTM berbanding dengan tikus yang dirawat dengan SAL sahaja (Tambahan Rajah S6AB dan B). Selain itu, kepekatan tisu buah pinggang sitokin profibrotik monocyte chemoattractant protein-1 (45.0 lwn. 76.1 pg/mg protein), interleukin-13 (612.1 lwn. 1002.0 pg/mg protein), dan TGFb1 aktif (131.0 lwn. 151.5 pg/mg protein) telah dikurangkan dengan ketara dalam tikus TGFb1-TG yang dirawat dengan rhTM berbanding dengan tikus kawalan (Tambahan Rajah S7). Kepekatan tisu buah pinggang HMGB1 juga telah berkurangan dengan ketara dalam tisu buah pinggang daripada tikus TGFb1-TG yang dirawat dengan rhTM berbanding dengantisu buah pinggangdaripada tikus kawalan (Tambahan Rajah S7). Kepekatan plasma kompleks antitrombin thrombin telah meningkat dengan ketara dalam kumpulan TGFb1-TG/SAL berbanding kumpulan WT/SAL tetapi tiada perbezaan ditemui antara kumpulan TGFb1-TG/rhTM dan WT/rhTM (Rajah Tambahan S8A). Seperti yang dijangkakan, terdapat kepekatan TM yang tinggi dalam plasma tikus TGFb1-TG dan WT yang dirawat dengan rhTM. Kepekatan plasma kompleks APC/antitrypsin telah menurun dengan ketara dalam kumpulan TGFb1-TG/SAL berbanding kumpulan WT/SAL dan TGFb1-TG/rhTM (280.5 lwn. 384.6 pg/ml) , dan tidak terdapat perbezaan yang ketara dalam tahap perencat pengaktif plasminogen-1 (Rajah Tambahan S8A). Tahap C5a dalam plasma, air kencing, dantisu buah pinggang(630.1 lwn. 1075.0 pg/mg protein) dan podocin larut plasma telah menurun dengan ketara dalam TGFb1-tikus TG yang dirawat dengan rhTM berbanding dengan TGFb1-tikus TG yang dirawat dengan SAL (Rajah Tambahan S8B). Tahap podocin dalam air kencing adalah lebih tinggi dalam kumpulan TGFb1-TG/SAL berbanding kumpulan WT/SAL dan TGFb1-TG/rhTM (Supplementary Figure S9A–C).
Rajah 1|Tetikus transgenik (TG) faktor pertumbuhan mengubah manusia b1 (TGFb1) membina fifibrosis buah pinggang yang progresif. (a) Kepekatan protein TGFb1 dalam plasma dan air kencing diukur dengan ujian imun enzim dan kandungan hidroksiprolin tisu oleh ujian kolorimetrik. (b–d) Bahagian tisu buah pinggang diwarnai dengan (b) asid berkala–Schiff (bar ¼ 20 mm) dan dengan (c,d) Masson trichrome (bar ¼ 10{{ 40}} mm) dan kemudian (e,f) dikira menggunakan sistem pemarkahan atau perisian pengimejan WinROOF (Mitani Corporation, Tokyo, Jepun). Bilangan tikus untuk penilaian tisu buah pinggang: untuk tikus jenis liar (WT), n ¼ 4 pada 4, 12, dan 20 minggu; untuk tikus TG, n ¼ 7 pada 4 minggu, n ¼ 8 pada 16 minggu, dan n ¼ 9 pada umur 20 minggu. Bilangan tikus untuk penilaian plasma dan air kencing: untuk tikus WT, n ¼ 12 pada 4 minggu, n ¼ 8 pada 8 minggu, n ¼ 7 pada 12 minggu, dan n ¼ 4 pada 16 dan 20 minggu; untuk tikus TG, n ¼ 24 pada 4 minggu, n ¼ 17 pada 8 dan 12 minggu, dan n ¼ 9 pada 16 dan 20 minggu. Data dinyatakan sebagai julat antara kuartil median. Analisis statistik oleh ujian Mann-Whitney U. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ****p="">< 0.0001.="" ns,="" tidak="" penting.="" untuk="" mengoptimumkan="" paparan="" imej="" ini,="" sila="" lihat="" versi="" dalam="" talian="" artikel="" ini="" di="">
Rajah 2|Penemuan mikroskopik elektron penghantaran dalam model fibrosis buah pinggang yang disebabkan faktor pertumbuhan berubah b1. Penetapan, pengendalian, dan penyingkiran buah pinggang daripada tikus telah dilakukan seperti yang diterangkan dalam Kaedah. (a,b) Transformasi mikrovillous dan (a,b,d,e,g) proses kaki penyingkiran (mata anak panah putih) podosit, (c-e) penurunan fenestrasi endothelial kapilari glomerular (mata anak panah kuning), (f) penebalan membran bawah tanah glomerular (asteris), dan (h,i) peningkatan pemendapan matriks mesangial (anak panah putih) hadir. CL, lumen kapilari. Untuk mengoptimumkan paparan imej ini, sila lihat versi dalam talian artikel ini di www.kidney-international.org.
rhTM memperbaiki fungsi buah pinggang
Tahap protein pengikat asid lemak L (197.0 lwn. 313.4 pg/ml),molekul kecederaan buah pinggang1 (299.9 lwn. 596.2 pg/ml), nitrogen urea darah (12.9 lwn 34.8 mg/dl), kreatinin (0.5 lwn. 1.4 mg/dl), dan nisbah albumin-kreatinin telah menurun dengan ketara dalam Tikus TGFb1-TG dengan fifibrosis buah pinggang dirawat dengan rhTM berbanding dengan TG yang tidak dirawat (Rajah 5). Jumlah protein air kencing dan jumlah nisbah kreatinin protein juga berkurangan dalam tikus TGFb1-TG yang dirawat dengan rhTM berbanding dengan tikus yang tidak dirawat (Rajah 5).
rhTM mengurangkan apoptosis sel glomerular
Pewarnaan pelabelan akhir dUTP pengantaraan terminal deoxynucleotidyl transferase menunjukkan bilangan sel apoptosis yang berkurangan dengan ketara dalam glomeruli daripada TGFb1-Tikus TG yang dirawat dengan rhTM berbanding dengan glomeruli daripada TGFb1- tikus TG yang dirawat dengan SAL (Tambahan Rajah S10A dan B). Pembelahan caspase-3 juga dikurangkan dengan ketara dalam tisu buah pinggang daripada tikus TGFb1-TG yang dirawat dengan rhTM berbanding dengan tisu buah pinggang daripada TGFb1-tikus TG yang dirawat dengan SAL (Rajah Tambahan S10C). Thetisu buah pinggangdaripada TGFb1-Tikus TG yang dirawat dengan rhTM, berbanding dengan tikus dari TGFb1-TG yang dirawat dengan SAL, menunjukkan peningkatan yang ketara dalam tahap mRNA limfoma sel B 2 (Bcl-2), B -limfoma sel-lebih besar (Bcl-XL), perencat baculoviral apoptosis yang mengandungi ulangan 5 (BIRC5, juga dikenali sebagai survivin), dan BIRC6 (Apollon) dengan peningkatan nisbah Bcl-2–Bax (Tambahan Rajah S11 ).
Rajah 3|Tikus transgenik (TG) faktor pertumbuhan mengubah manusia b1 (TGFb1) mempunyai disfungsi buah pinggang. (a) Jumlah protein dan (b) nitrogen urea darah (BUN) diukur dengan kaedah kolorimetrik dan kreatinin dengan kaedah enzimatik. Bilangan tikus untuk penilaian plasma dan air kencing: untuk tikus jenis liar (WT), n ¼ 12 pada 4 minggu, n=7 pada 8 dan 12 minggu, dan n=4 pada 16 dan 2{ {21}} minggu; untuk tikus TG, n =24 pada 4 minggu, n=17 pada 8 dan 12 minggu dan n=9 pada 16 dan 20 minggu. Data dinyatakan sebagai median ± julat antara kuartil. Analisis statistik oleh ujian Mann-Whitney U. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ****="" p=""><>
rhTM menghalang apoptosis podosit
Prarawatan podosit dengan rhTM secara ketara menurunkan apoptosis podosit yang dibiakkan dengan kehadiran TGFb1 seperti yang dinilai oleh bilangan sel dalam fasa subG1 (3.2 peratus berbanding 5.2 peratus ), terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end-labeling sel-positif ( 1.0 lwn. 5.4 sel/Fifield) dan tahap belahan caspase-3 (0.9 lwn. 1.1 nisbah) (Rajah 6a–e). Pemeriksaan faktor antiapoptosis dalam podosit kultur menunjukkan bahawa rhTM meningkatkan dengan ketara ekspresi mRNA faktor antiapoptosis Bcl-2 berbanding dengan ekspresi dalam sel yang tidak dirawat (Rajah Tambahan S12). Ekspresi mRNA faktor antiapoptotik BIRC5 juga meningkat dalam sel yang dirawat dengan rhTM berbanding dengan ekspresi dalam sel yang tidak dirawat (Tambahan Rajah S12). Ekspresi mRNA faktor proapoptotik Bax telah dikurangkan dengan ketara oleh rawatan rhTM berbanding tanpa rawatan (Rajah Tambahan S12). Rawatan dengan rhTM juga secara signifikan menghalang ekspresi annexin V dan pengantaraan terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end-labeling staining dalam podosit yang dikultur dengan kehadiran hidrogen peroksida (Tambahan Rajah S13A–E) dan di bawah keadaan glukosa tinggi (Tambahan Rajah S14A–E ) seterusnya mengesahkan sifat antiapoptosis rhTM pada podosit. Penerokaan laluan protein kinase B (Akt) antiapoptotik25 menunjukkan bahawa rhTM meningkatkan fosforilasi Akt dalam podosit utama manusia yang dibiakkan dengan kehadiran hidrogen peroksida atau TGFb1 (Rajah Tambahan S15A dan B). Kami kemudiannya mengasingkan podosit daripada setiap kumpulan tikus dan menilai fosforilasi Akt oleh penghapusan Barat. Terdapat fosforilasi Akt yang dipertingkatkan dengan ketara dalam podosit yang diasingkan daripada kumpulan TGFb1TG/rhTM berbanding dengan podosit daripada kumpulan yang tidak dirawat (nisbah 1.1 berbanding 0.7) (Rajah Tambahan S16A dan B).
Pengantaraan GPR15
Kajian terdahulu melaporkan bahawa TM mengaktifkan laluan intraselular dengan berinteraksi dengan reseptor faktor pertumbuhan fibroblast 1 (FGFR1) danReseptor berganding protein G15 (GPR15).26,27 Podosit menyatakan FGFR128 tetapi sama ada ia menyatakan GPR15 tidak jelas. Di sini kami mengasingkan podosit daripada setiap kumpulan tikus dan menunjukkan bahawa podosit juga menyatakan GPR15 (Rajah Tambahan S17A-E). Kami mendapati bahawa podosit daripada kawalan sihat dan pesakit dengan glomerulosklerosis juga menyatakan GPR15 (Rajah Tambahan S18). Untuk menjelaskan sama ada FGFR1 atau GPR15 mengantara aktiviti perencatan rhTM pada apoptosis podosit, kami menilai aktiviti antiapoptosis rhTM dalam podosit1-yang dirawat TGFb dengan kehadiran perencat FGFR1 atau selepas memindahkan sel dengan RNA kecil yang mengganggu (siRNA) terhadap FGFR1 atau GPR15. Prarawatan podosit dengan perencat FGFR1 (Rajah Tambahan S19A dan B) atau FGFR1 siRNA (13.2 peratus vs. 7.9 peratus) (Rajah 7a dan b) tidak dapat menghapuskan aktiviti perencatan rhTM pada apoptosis podosit. Walau bagaimanapun, pemindahan sel dengan GPR15 siRNA memansuhkan sepenuhnya aktiviti perencatan rhTM (14.6 peratus berbanding 13.8 peratus ) padaapoptosis podosit(Rajah 7a–c).
Rajah 4|Trombomodulin manusia rekombinan (rhTM) menghalang glomerulosklerosis dan fifibrosis tubulointerstitial. Bahagian tisu buah pinggang telah diwarnai (a, b) dengan asid berkala-Schiff dan (c, d) dengan Masson trichrome dan (e) kemudian dikira menggunakan sistem pemarkahan atau perisian pengimejan WinROOF. (e) Nilai min bagi kumpulan jenis liar (WT)/saline (SAL) diambil sebagai 100 peratus . Analisis statistik oleh ujian Mann-Whitney U. (f) Kandungan hidroksiprolin tisu diukur dengan kaedah kolorimetrik, kepekatan kolagen I-a1 (Col1a1) dan periostin oleh enzim immunoassay, dan ekspresi mRNA oleh tindak balas rantai transkripase-polimerase terbalik. Analisis statistik oleh Kruskal Wallis analisis varians dan ujian Dunn diperbetulkan. n=8 dalam setiap kumpulan. Bar {{10}} (a,c) 50 mm dan (d) 20 mm. Data dinyatakan sebagai median ± julat antara kuartil. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0.001,="" ****p="">< 0.0001.="" tg,="" transgenik;="" tgfb1,="" mengubah="" faktor="" pertumbuhan="" b1.="" untuk="" mengoptimumkan="" paparan="" imej="" ini,="" sila="" lihat="" versi="" dalam="" talian="" artikel="" ini="" di="">
rhTM menghalang EMT podosit
Terdapat kawasan yang meningkat dengan ketara dengan pewarnaan positif untuk podocin dan a-smooth muscle actin (a-SMA) (1.4 peratus berbanding 11.2 peratus ) dalam tikus TGFb1-TG/SAL berbanding dengan TGFb1-TG / rhTM tikus (Rajah 8a dan b). Kami kemudiannya membiakkan podosit manusia primer in vitro, dirawat terlebih dahulu dengan rhTM sebelum menambahkan protein TGFb1 ke dalam medium kultur. Morfologi seperti fibroblast dan ekspresi dipertingkatkan a-SMA telah ditindas dalam podosit yang dirawat dengan rhTM berbanding dengan sel yang tidak dirawat (Supplementary Figure S20A). Di samping itu, rhTM menghalang ekspresi mRNA fibronektin dan vimentin, walaupun ia meningkatkan ekspresi mRNA E-cadherin dalam podosit berbanding dengan ekspresi dalam sel yang tidak dirawat (Supplementary Figure S20B). Ahli keluarga SMAD 2 (Smad2) dan Smad3 memainkan peranan penting dalam TGFb1-mediated epithelial-mesenchymal transition (EMT).29 Rawatan dengan rhTM telah menyekat pengaktifan Smad2 dan Smad3 dalam TGFb1-TG tikus dengan ketara. berbanding dengan tikus TG yang tidak dirawat (Rajah 8c) dan dalam podosit manusia yang dibiakkan dengan kehadiran TGFb1 (Rajah Tambahan S20C).29 Tikus TG yang dirawat dengan rhTM (TGFb1-TG/rhTM) juga menunjukkan kurang ekspresi a-SMA (3.7 peratus vs. 17.2 peratus ) dalam sel epitelium tiub berbanding dengan rakan sejawat mereka yang tidak dirawat (Rajah Tambahan S21A dan B).
Rajah 5|Trombomodulin manusia rekombinan (rhTM) memperbaiki kecederaan buah pinggang dan disfungsi buah pinggang. Kreatinin diukur dengan kaedah enzimatik; jumlah protein dengan kaedah kolorimetrik; dan nitrogen urea darah (BUN) dan albumin, molekul kecederaan buah pinggang 1 (KIM-1), protein pengikat asid lemak L (L-FABP) dan faktor pertumbuhan mengubah total b1 (TGFb1) oleh ujian imun enzim. n=8 dalam setiap kumpulan. Data dinyatakan sebagai median±julat antara kuartil. Analisis statistik oleh analisis Kruskal-Wallis bagi varians dan ujian Dunn yang tidak diperbetulkan. * P < {{10}}.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0.001,="" ****="" p="">< 0.0001,="" #p="0.06." ns,="" tidak="" ketara;="" sal,="" garam;="" tg,="" transgenik;="" wt,="" jenis="">
GPR15 mengantara aktiviti perencatan rhTM pada EMT
Transfeksi podosit dengan siRNA FGFR1 tidak dapat menghapuskan aktiviti perencatan rhTM pada ekspresi mRNA relatif kedua-dua kolagen I-a1 dan a-SMA dalam podosit yang dirawat TGFb1- (Tambahan Rajah S22). Walau bagaimanapun, pemindahan sel dengan GPR15 siRNA secara signifikan menghapuskan aktiviti perencatan rhTM pada ekspresi mRNA relatif kedua-dua kolagen I-a1 dan a-SMA dalam podosit yang dirawat TGFb{10}}(Rajah Tambahan S22).
PERBINCANGAN
TGFb1 dan kecederaan sel glomerular
Akibat biasa gangguan yang menyebabkan CKD ialah fifibrosis buah pinggang.8,30,31 TGFb1 ialah pemacu biasa fibrogenesis dalam buah pinggang yang dikaitkan dengan CKD yang disebabkan oleh penyakit termasuk DM, hipertensi arteri, dan gangguan autoimun.10 Sel dari ruang glomerulus dan tubulointerstitial boleh merembeskan bentuk terpendam TGFb1 yang, apabila diaktifkan secara berlebihan semasa kecederaan tisu, boleh menyebabkan parut buah pinggang.32 Memandangkan TGFb1 boleh merangsang rembesannya sendiri, proses fibrotik secara amnya menjadi kitaran ganas.8 Kejadian awal dalam proses patogenik TGFb 1- ditengahkanfibrosis buah pinggangadalah kecederaan podosit dan sel endothelial glomerular.33–35 Tahap plasma TM terlarut adalah penanda kecederaan endothelial. Selaras dengan peranan TGFb1 dalam kecederaan sel buah pinggang, di sini kami mendapati korelasi ketara TGFb1 aktif dengan TM larut, podocin larut, dan kreatinin dalam plasma daripada pesakit dengan DM. Crosstalk antara sel endothelial glomerular dan podosit semasa akecederaan buah pinggangmembawa kepada ekspresi tempatan protease yang menyebabkan degradasi membran bawah tanah glomerular.34–36 Ini mungkin menjelaskan pengesanan podocin larut dan korelasi ketaranya dengan TM terlarut dalam pesakit kami dengan DM.
Rajah 6|Trombomodulin manusia rekombinan (rhTM) menindas apoptosis podosit yang disebabkan oleh mengubah faktor pertumbuhan b1 (TGFb1). (a) rhTM telah ditambahkan pada medium kultur podosit 1 jam sebelum mendorong apoptosis dengan 10 ng/ml TGFb1 selama 48 jam. (b) Peratusan sel dalam fasa subG1 dikesan oleh rakan sitometri. (a,b) n=3 dalam setiap kumpulan. (c,d) Bilangan sel dengan pemecahan DNA diukur dengan analisis pelabelan akhir (TUNEL) pengantaraan deoxynucleotidyl transferase terminal deoxynucleotidyl transferase (TUNEL) (n=3 dalam kumpulan salin [SAL]/SAL dan rhTM/SAL; n=6 dalam kumpulan SAL/TGFb1 dan rhTM/TGFb1), dan (e) tahap belahan caspase-3 diukur dengan Western blotting (n=4 dalam setiap kumpulan). Bar=100 mm. Data dinyatakan sebagai median ± julat antara kuartil. Analisis statistik oleh ujian Mann-Whitney U. *P < 0.05.="" dapi,="" 40="" ,6-diamidino-2-phenylindole;="" hpf,="" medan="" berkuasa="" tinggi;="" ns,="" tidak="" penting.="" histogram="" dipaparkan="" sebagai="" peratus="" maks="" (="" peratus="" nilai="" maksimum),="" menskalakan="" setiap="" lengkung="" kepada="" mod="100" peratus="" .="" untuk="" mengoptimumkan="" paparan="" imej="" ini,="" sila="" lihat="" versi="" dalam="" talian="" artikel="" ini="" di="">
Fifibrosis buah pinggang yang berkaitan dengan ekspresi berlebihan TGFb1 khusus podocyte
Ubat yang boleh mengatasi kesan TGFb1 adalah ideal untuk menyekat fifibrosis buah pinggang. Di sini kami telah menghasilkan tetikus TG yang terlalu mengekspresikan gen TGFb1 manusia dalam glomerulus yang membangunkan sklerosis glomerular spontan dan progresif dan fifibrosis tubulointerstitial dengan kegagalan buah pinggang seawal 4 minggu selepas kelahiran. Model menunjukkan glomerulopati lanjutan dengan kecederaan podosit dan sel endothelial glomerular; penebalan membran bawah tanah glomerular dan pengembangan mesangial dengan parut interstisial; peningkatan penanda kecederaan tisu buah pinggang dan disfungsi buah pinggang; dan peningkatan TGFb1 dalam plasma,tisu buah pinggang, dan air kencing. Peningkatan dalam perkumuhan protein dalam air kencing, TGFb1, dan pengaktifan sistem pelengkap mungkin menjelaskan perkembangan serentak parut interstisial dalam model kami sekarang.37–40 Eksperimen selanjutnya mendedahkan peningkatan sel apoptosis dan pengaktifan protein Smad dalam tisu buah pinggang daripada TGFb yang tidak dirawat{ {3}}Tikus TG berbanding dengan tikus WT. Secara keseluruhan, penemuan ini menunjukkan novel TGFb1-TG ini sebagai model yang sesuai untuk penemuan dadah difibrosis buah pinggang.
Rajah 7|Reseptor berganding protein G (GPR15) mengantara perencatan trombomodulin manusia rekombinan apoptosis (rhTM) dalam podosit. Sel podosit primer manusia telah ditransfeksi dengan reseptor faktor pertumbuhan fibroblas 1 (FGFR1) RNA gangguan kecil (siRNA), GPR15 siRNA, atau siRNA hancur selama 48 jam, dan kemudian rhTM telah ditambahkan pada kultur sel 1 jam sebelum dirawat dengan mengubah faktor pertumbuhan b1 (TGFb1). Sel apoptosis telah (a) dinilai oleh sesama sitometri dan (b) kemudian dikira. (c) Lisat sel telah disediakan untuk penghapusan Barat. n{{10}} dalam setiap kumpulan. Data dinyatakan sebagai median ± julat antara kuartil. Analisis statistik oleh ujian Mann-Whitney U. *P < 0.05,="" #p="0.1." sal,="">
Rajah 8|Perencatan peralihan epitelium-mesenchymal oleh trombomodulin manusia rekombinan (rhTM). (a) Podocin dan aktin otot licin (a-SMA) telah diwarnakan seperti yang diterangkan dalam Kaedah. (b) Kawasan positif untuk pewarnaan a-SMA dikira oleh perisian pemprosesan imej WinROOF. n=3 dalam kumpulan jenis liar (WT)/saline (SAL) dan WT/rhTM dan n=5 dalammengubah faktor pertumbuhan-b1-transgenik(TGFb{{0}}TG)/SAL dan kumpulan TGFb1-TG/rhTM. (c) Jumlah (t) dan terfosforilasi (p) protein ahli keluarga SMAD (Smad) dinilai oleh Western blotting. n=8 dalam setiap kumpulan. Data dinyatakan sebagai median ± julat antara kuartil. Analisis statistik oleh Kruskal-Wallis analisis varians dan ujian Dunn diperbetulkan. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0.001,="" #p="0.08." untuk="" mengoptimumkan="" paparan="" imej="" ini,="" sila="" lihat="" versi="" dalam="" talian="" artikel="" ini="" di="">
rhTM memperbaiki fifibrosis buah pinggang
Kami telah menunjukkan bahawa rhTM memperbaiki fifibrosis pulmonari yang dibangunkan pada tikus yang mengekspresikan TGFb1 manusia secara berlebihan dalam paru-paru dengan menekan apoptosis sel epitelium alveolar.41 Ujian klinikal juga telah menunjukkan pemulihan fifibrosis pulmonari idiopatik selepas rawatan rhTM.42,43 Pemerhatian rhTM ini mencadangkan potensi rhTM sebelum ini. untuk terapi fibrosis organ. Kami membuat hipotesis bahawa rhTM akan berkesan dalam TGFb1- fifibrosis buah pinggang yang berkaitan. Untuk menguji hipotesis ini, kami merawat tikus TGFb1-TG khusus buah pinggang dengan rhTM.44 Pentadbiran rhTM selama 4 minggu melemahkan kecederaan, disfungsi dan fifibrosis buah pinggang dengan ketara. Tikus yang dirawat dengan rhTM menunjukkan tahap air kencing yang rendah bagi jumlah protein, albumin, TGFb1, C5a, dan paras buah pinggang sitokin profibrotik yang berkurangan, C5a dan HMGB1.45 Terapi dengan rhTM juga menghalang kedua-dua apoptosis dan EMT podosit. Walau bagaimanapun, rhTM tidak memberi kesan pada kompleks antitrombin trombin, penanda pengaktifan pembekuan, walaupun ia meningkatkan penjanaan APC, faktor antikoagulan dengan aktiviti anti-radang dan anti-apoptosis.23 Perlu diingat bahawa trombin, enzim prokoagulan, mungkin secara paradoks menggalakkan anti-pembekuan di bawah keadaan protrombotik gred rendah dengan membentuk kompleks TM/trombin, yang meningkatkan penjanaan APC antikoagulan. Walau bagaimanapun, trombin berfungsi terutamanya sebagai prokoagulan di bawah keadaan protrombotik yang berlebihan (cth, sepsis).46 Kesan dwi dan paradoks trombin ini mungkin menjelaskan ketidakberkesanan ketara rhTM untuk menghalang pengaktifan pembekuan dalam model kami, yang berada dalam keadaan protrombotik gred rendah. . Secara keseluruhannya, pemerhatian ini mencadangkan bahawa rhTM amelio-rate progresif fifibrosis dan disfungsibuah pinggangdengan memanjangkan kemandirian atau menghalang EMT sel glomerular dan dengan menekan keradangan, pelengkap pengaktifan, dan aktiviti faktor pertumbuhan secara langsung atau tidak langsung melalui pengaktifan laluan protein C dan pengurangan ekspresi HMGB1. Penambahbaikan nefropati diabetik pada tikus dengan peningkatan domain seperti lektin TM yang beredar dan kemerosotan penyakit pada tikus yang tidak mempunyai domain seperti lektin menyokong kesan bermanfaat rhTM pada fifibrosis buah pinggang.20,21
Perencatan apoptosis podosit
Podosit memainkan peranan penting dalam penyelenggaraan penghalang penapisan glomerular dan pembentukan diafragma celah untuk mengelakkan kehilangan protein beredar yang penting.47Kecederaan buah pinggangdisebabkan oleh spesies oksigen reaktif, glukosa tinggi, atau mediator keradangan termasuk TGFb1 mendorong apoptosis podosit yang membawa kepada pengurangan podosit yang akhirnya boleh menyebabkan disfungsi buah pinggang.47 Selepas mengikat dan mengaktifkan kompleks reseptor transmembran serine/treonine kinase jenis I dan jenis II , TGFb1 memancarkan isyarat intraselular melalui keluarga faktor transkripsi Smad atau melalui laluan isyarat bebas Smad.48 Pengaktifan laluan bergantung kepada Smad berlaku apabila reseptor TGFb1 diaktifkan memfosforilasi Smad2 dan Smad3, yang dengan Smad4 translokasi ke nukleus.49 The Smad2/ Kompleks Smad3/Smad4 merangsang transkripsi faktor proapoptotik dan mengurangkan faktor antiapoptosis yang membawa kepada apoptosis sel.49 Selaras dengan ini, kami mendapati tahap buah pinggang yang tinggi bagi faktor proapoptotik Bax dan tahap rendah faktor antiapoptotik Bcl2 dan Bcl-XL dalam TGFb1- TG tikus. TM boleh menghalang apoptosis jenis sel yang berbeza.21,41,49 Selaras dengan ini, di sini kami mendapati bahawa rhTM menghalang apoptosis podosit yang disebabkan oleh hidrogen peroksida, glukosa tinggi, atau TGFb1, dan penemuan ini mungkin menjelaskan kesan bermanfaat rhTM dalam CKD . Di samping itu, rhTM menyengetkan keseimbangan ke arah perencatan apoptosis dengan mengurangkan ekspresi Bax, dengan meningkatkan ekspresi Bcl2, Bcl-XL, BIRC5, dan BIRC6, dan dengan meningkatkan pengaktifan laluan Akt dalamtisu buah pinggang. Secara keseluruhan, pemerhatian ini mencadangkan bahawa rhTM merangsang survival podosit dengan memihak kepada pengaktifan Akt dan ekspresi faktor antiapoptosis.
cistanche untuk penyakit buah pinggang kronik
Perencatan EMT
EMT podosit juga menyumbang kepada fifibrosis buah pinggang. Podosit yang menjalani EMT membebaskan protein matriks ekstraselular yang terkumpul dan memendap semasa fifibrogenesis buah pinggang1-TGFb.50 TGFb1 menggalakkan EMT melalui pengaktifan pengantara reseptor kompleks Smad2/Smad3/Smad4. Smad3 berfosforilasi menggalakkan EMT dengan merangsang transkripsi protein matriks dan dengan mengurangkan ekspresi penanda epitelium.51 Selaras dengan ini, kami mendapati peningkatan EMT podosit dalam TGFb1-Tikus dan podosit TG yang dibiakkan dengan kehadiran TGFb1 atau di bawah keadaan oksidan atau glukosa tinggi. Laporan sebelumnya mencadangkan bahawa rhTM menindas EMT.52,53 Di sini kami mendapati bahawa rhTM menghalang EMT podosit dan sel epitelium tubulointerstitial dalam tikus TGFb1-TG. Perencatan pengaktifan protein Smad nampaknya merupakan mekanisme kesan bermanfaat rhTM pada EMT kerana tikus TGFb{14}}TG dan podosit primer yang dirawat dengan rhTM menggambarkan fosforilasi Smad2 dan Smad3 berkurangan dengan ketara berbanding keadaan yang tidak dirawat. Penemuan ini menyokong aktiviti perencatan TM pada EMT.
Pengantaraan reseptor dalam aktiviti perlindungan rhTM
Kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa GPR15 atau FGFR1 mengantara aktiviti sitoprotektif TM.26,27,54 Kami menguji sama ada reseptor ini mengantara aktiviti perlindungan rhTM terhadap apoptosis dan EMT. Walaupun menurunkan regulasi protein GPR15 oleh siRNA sepenuhnya menghapuskan aktiviti penindasan rhTM pada TGFb1-apoptosis pengantara podosit, siRNA FGFR1 mahupun perencatnya tidak memansuhkannya, menunjukkan bahawa GPR15 mengantara aktiviti perlindungan rhTM. Terdapat fosforilasi Akt yang dipertingkatkan dalam podosit dan podosit kultur yang diasingkan daripada tikus TGFb1-TG selepas rawatan dengan rhTM, mencadangkan penglibatan laluan Akt intraselular. Kerja yang menunjukkan bahawa rhTM mengaktifkan laluan Akt dalam sel endothelial menyokong penemuan ini.55 Pengaktifan laluan isyarat Akt boleh meningkatkan lagi kesan rhTM dengan meningkatkan ekspresi permukaan GPR15.56 Pemerhatian ini menunjukkan bahawa rhTM melindungi podosit daripada apoptosis dalam TGFb kami{ {13}}Tikus TG dengan mengaktifkan paksi GPR15/Akt yang membawa kepada ekspresi dipertingkatkan faktor anti-apoptosis dan penurunan ekspresi faktor proapoptotik.57 Sebaliknya, kajian terdahulu menunjukkan bahawa anafilatoksin C3a dan C5a melalui GPR mereka mungkin menyumbang kepada CKD dengan mencederakan podosit dan APC boleh menghalang apoptosis podosit dan fifibrosis buah pinggang melalui reseptor protein C endothelial dan reseptor diaktifkan protease 1.23,58–61 Di sini, kami mendapati bahawa rhTM menghalang sistem pelengkap dan meningkatkan penjanaan APC. Oleh itu, selain daripada pengaktifan laluan GPR15/Akt, perencatan faktor pelengkap dan peningkatan pengaktifan protein C dan reseptornya juga mungkin menjelaskan kesan berfaedah rhTM dalam TGFb1-kami yang berkaitanmodel fibrosis buah pinggang.
Di samping itu, pengurangan GPR15 tetapi bukan FGFR1 menyekat kesan perencatan rhTM pada EMT, menunjukkan bahawa GPR15 juga menjadi pengantara aktiviti perlindungan rhTM ini. Perencatan protein Smad terlibat dalam penindasan EMT kerana rawatan dengan rhTM menghalang fosforilasi kedua-dua Smad2 dan Smad3 dalam tikus TGFb1-TG dan podosit terkultur. Walau bagaimanapun, mekanisme tepat perencatan protein Smad melalui GPR15 tidak jelas. Beberapa bukti menunjukkan bahawa laluan Akt mungkin bersilang dengan dan mengawal laluan isyarat Smad,62–64 dan Akt boleh menghalang fosforilasi Smad3 dengan berinteraksi secara langsung dengan Smad3 yang tidak terfosforilasi untuk mengasingkannya di luar nukleus yang membawa kepada perencatan transkripsi dan EMT.62– 64 Berdasarkan laporan ini, boleh difikirkan bahawa Akt diaktifkan selepas rhTM mengikat kepada GPR15 sekuesters Smad3 yang tidak berfosforilasi yang membawa kepada perencatan EMT podocyte. Perlu diingat bahawa kesan berfaedah pengantara Akt ini diperhatikan hanya dalam sel bukan malignan.65–67 Dalam sel malignan, interaksi TGFb1 dengan reseptornya boleh secara langsung mengaktifkan laluan phosphoinositide 3-kinase/Akt/Siput dan menyebabkan EMT.65–67 Secara keseluruhan, hasil kajian kami menyokong peranan GPR15 sebagai reseptor pengantara kesan bermanfaat rhTM pada podosit.
Kesimpulan
Ringkasnya, di sini kami melaporkan buat pertama kalinya tetikus TG transgenik novel yang mengekspresikan kepanjangan gen TGFb1 manusia secara khusus dalam glomeruli yang membangunkan sklerosis glomerular spontan dan progresif, fifibrosis tubulointerstitial dankegagalan buah pinggang, dan pemulihan fifibrosis/kegagalan buah pinggang yang ditubuhkan oleh interaksi rhTM dengan GPR15 yang menghalang apoptosis dan peralihan mesenchymal podosit.
KAEDAH
Penjanaan tetikus TGFb1 BAC TG
TGFb1-Tetikus BAC-TG yang mengekspresikan gen TGFb1 manusia penuh di bawah kawalan promoter podocin tetikus telah dijana melalui suntikan pronuklear ke dalam 392 embrio tetikus C57BL/6J (CLEA Japan, Inc., Tokyo, Jepun). Kami menilai pengasas TG dan penghantaran germanium binaan BAC TG oleh Southern blotting (Bahan dan Kaedah Tambahan).
Haiwan eksperimen
Tikus TGFb1-TG telah dibiakkan selama lebih daripada 10 generasi di bawah latar belakang C57BL/6 sebelum digunakan dalam percubaan. Rakan sampah WT digunakan sebagai haiwan kawalan. Semua haiwan dikekalkan dalam persekitaran bebas patogen tertentu dan tertakluk kepada 12-kitaran gelap terang jam pada suhu dan kelembapan ambien antara 22 darjah dan 26 darjah dan 40 peratus dan 70 peratus , serta dengan akses ad libitum kepada makanan dan air di rumah haiwan Universiti Mie (Bahan dan Kaedah Tambahan).
Kenyataan beretika
Jawatankuasa Keselamatan Eksperimen DNA Rekombinan (no. kelulusan I-629; tarikh: 19 September 2013) dan Jawatankuasa Penyiasatan Haiwan Universiti Mie (no. kelulusan 27-4; tarikh: 19 Ogos 2015) meluluskan protokol kajian. Semua prosedur haiwan dilakukan mengikut garis panduan institusi Universiti Mie dan mengikut prinsip penjagaan haiwan makmal yang diluluskan di peringkat antarabangsa yang diterbitkan oleh Institut Kesihatan Kebangsaan (https://olaw.nih.gov/).
Untuk penyiasatan klinikal, persetujuan termaklum bertulis diberikan oleh semua pesakit dan subjek yang sihat, dan protokol kajian telah diluluskan oleh Jawatankuasa Etika untuk Siasatan Klinikal Universiti Mie (nombor kelulusan 1043 dan 2194).
Reka bentuk eksperimen
Untuk pencirianbuah pinggangmodel fifibrosis, kami memperuntukkan TGFb lelaki {{0}}tikus TG (n=24) dan tikus WT jantan (n=12) berumur 4 minggu dan seberat 20 hingga 23 g menjadi 3 kumpulan dengan 8 tikus TGF b1-TG dan 4 tikus WT dalam setiap kumpulan. Tikus daripada setiap kumpulan WT dan TGFb1-TG telah dieutanasi pada minggu 0, 8 atau 16 untuk mengumpul sampel air kencing, darah dan buah pinggang untuk menilai perubahan dalam parameter fifibrosis dan fungsi buah pinggang dari semasa ke semasa.
Untuk menilai keberkesanan terapeutik rhTM (rhTM telah disediakan oleh Asahi Kasei Pharma Corporation, Tokyo, Jepun) dalam fifibrosis renal, TGFb1-TG tikus (n= 8) atau WT littermates (n {{2 }}) telah dirawat dengan rhTM (3 mg/kg) melalui suntikan ip, 3 kali seminggu selama 4 minggu sebelum tikus dibunuh. Tikus TGFb1-TG (n =8) atau rakan sampah WT (n= 8) yang menerima jumlah SAL fisiologi yang sama melalui suntikan ip telah digunakan sebagai tikus kawalan negatif.
Protokol kajian ini mengikuti garis panduan Penyelidikan Haiwan: Pelaporan Eksperimen In Vivo (TIBA) untuk penyiasatan haiwan. Tikus telah rawak, dan penyelidik yang mengukur parameter telah dibutakan kepada kumpulan rawatan.
Analisis biokimia
Kepekatan jumlah protein (kit ujian protein BCA; Pierce, Rockford, IL), TGFb1 (Sistem R&D, Minneapolis, MN), protein kemoattraktan monosit-1 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA), kompleks antitrombin trombin (Makmal Cedarlane, Hornby, Ontario, Kanada) diukur menggunakan kit immunoassay enzim komersial mengikut arahan pengilang (Bahan dan Kaedah Tambahan).
Kultur sel
Sel primer podocyte manusia dibeli daripada CELPR OGEN (Torrance, CA). Sel primer podosit manusia telah dibiakkan dalam medium Helang yang diubah suai Dulbecco dalam suasana CO2 5 peratus yang lembap pada 37 darjah . Medium itu ditambah dengan 10 peratus serum lembu janin yang tidak diaktifkan haba (Bio Whittaker, Walkersville, MD), 100 IU/ml penisilin, 100 mg/ml streptomycin, dan L-glutamin (Bahan dan Kaedah Tambahan).
Analisis statistik
Data dinyatakan sebagai median±julat antara kuartil. Perbezaan statistik antara pembolehubah dikira dengan analisis varians Kruskal-Wallis dengan analisis post hoc menggunakan ujian Dunn. Ujian Mann-Whitney U digunakan untuk menilai perbezaan antara 2 kumpulan. Analisis statistik telah dilakukan menggunakan GraphPad Prism versi 8.0.1 (GraphPad Software, San Diego, CA). Kepentingan statistik dianggap sebagai P <>
PENDEDAHAN
ECG, CND-G dan YY mempunyai paten pada tetikus TGFb1-TG denganfibrosis buah pinggangdigunakan dalam kajian ini. CND-G dan YY menerima geran daripada Kementerian Pendidikan, Kebudayaan, Sukan, Sains dan Teknologi Jepun untuk kajian ini. ECG, TY, CND-G, dan MT menerima geran daripada Shionogi Pharmaceuticals. Semua pengarang lain mengisytiharkan tiada kepentingan bersaing.
PENGHARGAAN
Penyelidikan ini disokong sebahagiannya oleh geran daripada Kementerian Pendidikan, Kebudayaan, Sukan, Sains dan Teknologi Jepun (Kakenhi no. 17K09824 untuk YY; Kakenhi no. 17K08442 untuk CND-G), dan sebahagiannya oleh geran daripada Shionogi & Co, Ltd., Jepun. Pembiaya tidak mempunyai peranan dalam reka bentuk kajian, analisis data, keputusan untuk menerbitkan, atau penyediaan manuskrip.
Sebahagian daripada karya ini diterbitkan dalam bentuk abstrak.
SUMBANGAN PENULIS
AT menyediakan model penyakit dan menulis draf pertama manuskrip. TY, KN, TT, RI, dan CND-G menyediakan model penyakit dan parameter yang diukur. AM dan SW melakukan kajian mikroskopik penghantaran. MT, YO dan AU mengukur parameter dan melakukan eksperimen in vitro. YT, LQ, TK dan VFD memberikan sumbangan intelektual. YY dan ECG membetulkan draf manuskrip dan mereka bentuk kajian.
cistanche untuk gejala kegagalan buah pinggang
BAHAN TAMBAHAN
Bahan dan Kaedah Tambahan Fail Tambahan (PDF).
Jadual S1. Ciri-ciri mata pelajaran.
Jadual S2. Primer untuk RT-PCR tisu tetikus.
Jadual S3. Primer untuk RT-PCR podosit manusia.
Rajah S1. Serpihan trombomodulin larut berkorelasi dengan TGFb1 dan kreatinin pada pesakit dengan DM.
Rajah S2. Konstruk kromosom buatan (BAC) manusia TGFb1–bakteria. Rajah S3. Tikus pengasas mengekspresikan gen TGFb1 manusia penuh.
Rajah S4. Pencirian faktor pertumbuhan berubah-ubah khusus glomerulus b1 tetikus transgenik.
Rajah S5. Tikus transgenik TGFb1 manusia telah meningkatkan penanda kecederaan buah pinggang.
Rajah S6. Terapi dengan trombomodulin manusia rekombinan (rhTM) mengurangkan penyingkiran proses kaki podosit dan penebalan membran bawah tanah glomerular.
Rajah S7. Tikus transgenik TGFb1 yang dirawat dengan trombomodulin manusia rekombinan (rhTM) mempunyai kepekatan rendah faktor profibrotik dan HMGB1 dalam tisu buah pinggang. Rajah S8. Terapi dengan trombomodulin manusia rekombinan (rhTM) meningkatkan penjanaan protein C diaktifkan, menghalang sistem pelengkap, menurunkan podocin larut yang beredar, walaupun tidak memberi kesan pada sistem pembekuan dalam tikus transgenik TGFb1.
Rajah S9. Terapi dengan trombomodulin manusia rekombinan (rhTM) mengurangkan kepekatan air kencing podocin.
Rajah S10. Terapi dengan trombomodulin manusia rekombinan (rhTM) mengurangkan apoptosis sel glomerular.
Rajah S11. Rawatan TGFb1-fifibrosis buah pinggang yang berkaitan dengan ekspresi berlebihan dengan trombomodulin manusia rekombinan (rhTM) menghalang apoptosis dalam tisu buah pinggang.
Rajah S12. Trombomodulin manusia rekombinan (rhTM) meningkatkan ekspresi faktor antiapoptosis dalam podosit.
Rajah S13. Trombomodulin manusia rekombinan (rhTM) menindas apoptosis podosit yang disebabkan oleh hidrogen peroksida.
Rajah S14. Trombomodulin manusia rekombinan (rhTM) menindas apoptosis podosit yang disebabkan oleh paras glukosa yang tinggi.
Rajah S15. Trombomodulin manusia rekombinan (rhTM) meningkatkan pengaktifan laluan Akt dalam podosit.
Rajah S16. Terapi dengan trombomodulin manusia rekombinan (rhTM) meningkatkan fosforilasi Akt dalam podosit daripada tikus TGFb1-TG.
Rajah S17. Podosit daripada setiap kumpulan rawatan tikus mengekspresikan mRNA GPR15.
Rajah S18. Pewarnaan GPR15 dalam podosit daripada individu yang sihat dan pesakit dengan glomerulosklerosis segmental fokus.
Rajah S19. Reseptor faktor pertumbuhan fibroblast-1 tidak terlibat dalam aktiviti perencatan trombomodulin manusia rekombinan (rhTM) dalam podosit.
Rajah S20. Trombomodulin manusia rekombinan (rhTM) menghalang peralihan epitelium-mesenchymal podosit.
Rajah S21. Terapi dengan trombomodulin manusia rekombinan (rhTM) menghalang ekspresi aktin otot licin-a dalam tubul renal.
Rajah S22. Reseptor berganding protein G (GPR15) mengantara aktiviti perencatan trombomodulin manusia rekombinan (rhTM) pada peralihan epitelium-mesenchymal podosit.
Rujukan Tambahan.
RUJUKAN
1. Webster AC, Nagler EV, Morton RL, et al. Penyakit buah pinggang yang kronik. Lancet. 2017;389:1238–1252.
2. Bello AK, Levin A, Tonelli M, et al. Penilaian status penjagaan kesihatan buah pinggang global. JAMA. 2017;317:1864–1881.
3. Levin A, Tonelli M, Bonventre J, et al. Kesihatan buah pinggang global 2017 dan seterusnya: peta jalan untuk menutup jurang dalam penjagaan, penyelidikan dan dasar. Lancet. 2017;390:1888–1917.
4. Ackland P. Prevalensi, pengesanan, penilaian, dan pengurusan penyakit buah pinggang kronik. BMJ. 2014;348:f7688.
5. Turner JM, Bauer C, Abramowitz MK, et al. Rawatan penyakit buah pinggang kronik. Buah Pinggang Int. 2012;81:351–362.
6. Breyer MD, Susztak K. Generasi terapeutik seterusnya untuk penyakit buah pinggang kronik. Nat Rev Drug Discov. 2016;15:568–588.
7. Liu Y. Fifibrosis buah pinggang: pandangan baharu tentang patogenesis dan terapeutik. Buah Pinggang Int. 2006;69:213–217.
8. Liu Y. Mekanisme selular dan molekul fifibrosis buah pinggang. Nat Rev Nephrol. 2011;7:684–696.
9. Xavier S, Vasko R, Matsumoto K, et al. Mengurangkan isyarat TGF-beta endothelial adalah mencukupi untuk mengurangkan peralihan endothelial-mesenchymal dan fifibrosis dalam CKD. J Am Soc Nephrol. 2015;26:817–829.
10. Higgins SP, Tang Y, Higgins CE, et al. Isyarat TGF-beta1 / p53 dalam fifibrogenesis buah pinggang. Isyarat Sel. 2018;43:1–10.
11. Conway EM. Thrombomodulin dan peranannya dalam keradangan. Semin Immunopatol. 2012;34:107–125.
12. Martin FA, Murphy RP, Cummins PM. Thrombomodulin dan endothelium vaskular: pandangan tentang aspek fungsi, pengawalseliaan dan terapeutik. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2013;304:H1585–H1597.
13. Morser J. Thrombomodulin menghubungkan pembekuan kepada keradangan dan imuniti. Sasaran Dadah Curr. 2012;13:421–431.
14. Roeen Z, Toda M, D'Alessandro-Gabazza CN, et al. Thrombomodulin menghalang pengaktifan eosinofil dan sel mast. Sel Imunol. 2015;293:34–40.
15. Takagi T, Taguchi O, Toda M, et al. Perencatan asma bronkial alahan oleh trombomodulin dimediasi oleh sel dendritik. Am J Respir Crit Care Med. 2011;183:31–42.
16. Tateishi K, Imaoka M, Matsushita M. Dwi fungsi modulasi trombomodulin dalam laluan pelengkap alternatif. Aliran Biosci. 2016;10:231–234.
17. Toda M, D'Alessandro-Gabazza CN, Takagi T, et al. Thrombomodulin memodulasi sel dendritik melalui kedua-dua antagonisme protein kumpulan mobiliti tinggi B1 dan mekanisme bebas. Allergol Int. 2014;63:57–66.
18. Van de Wouwer M, Plaisance S, De Vriese A, et al. Domain trombomodulin seperti lektin mengganggu pengaktifan pelengkap dan melindungi daripada arthritis. J Kegemukan. 2006;4:1813–1824.
19. Sharfuddin AA, Sandoval RM, Berg DT, et al. Trombomodulin larut melindungi buah pinggang iskemia. J Am Soc Nephrol. 2009;20:524–534.
20. Wang H, Vinnikov I, Shahzad K, et al. Domain trombomodulin seperti lektin memperbaiki glomerulopati diabetik melalui perencatan pelengkap. Thromb Haemost. 2012;108:1141–1153.
21. Yang SM, Ka SM, Wu HL, et al. Thrombomodulin domain 1 memperbaiki nefropati diabetik pada tikus melalui inflamasi-mediated inflammasome anti-NF-kappaB/NLRP3, peningkatan aktiviti antioksidan NRF2, dan perencatan apoptosis. Diabetologia. 2014;57:424–434.
22. Ohlin AK, Larsson K, Hansson M. Aktiviti trombomodulin larut dan antigen trombomodulin larut dalam plasma. J Kegemukan. 2005;3: 976–982.
23. Gil-Bernabe P, D'Alessandro-Gabazza CN, Toda M, et al. Protein C teraktif eksogen menghalang perkembangan nefropati diabetik. J Kegemukan. 2012;10:337–346.
24. Yasuma T, Yano Y, D'Alessandro-Gabazza CN, et al. Ameliorasi diabetes oleh protein S. Diabetes. 2016;65:1940–1951.
25. Havasi A, Borkan SC. Apoptosis dan kecederaan buah pinggang akut. Buah Pinggang Int. 2011;80:29–40.
26. Kuo CH, Sung MC, Chen PK, et al. FGFR1 mengantara angiogenesis yang disebabkan oleh domain trombomodulin rekombinan. Kardiovasc Res. 2015;105:107–117.
27. Pan B, Wang X, Kojima S, et al. Rantau trombomodulin seperti faktor pertumbuhan epidermis kelima mengurangkan sepsis yang disebabkan oleh LPS melalui interaksi dengan GPR15. Thromb Haemost. 2017;117:570–579.
28. Lu Y, Ye Y, Bao W, et al. Pengenalpastian seluruh genom bagi gen yang penting untuk sitoskeleton podosit berdasarkan penjujukan RNA sel tunggal. Buah Pinggang Int. 2017;92:1119–1129.
29. Vigolo E, Marko L, Hinze C, et al. Isyarat BMP kanonik dalam sel tiub mengantara pemulihan selepas kecederaan buah pinggang akut. Buah Pinggang Int. 2019;95:108–122.
30. Nangaku M. Hipoksia kronik dan kecederaan tubulointerstitial: laluan biasa terakhir kepada kegagalan buah pinggang peringkat akhir. J Am Soc Nephrol. 2006;17: 17–25.
31. Thomas R, Kanso A, Sedor JR. Penyakit buah pinggang kronik dan komplikasinya. Prim Care. 2008;35:329–344, vii.
32. Mozes MM, Bottinger EP, Jacot TA, et al. Ekspresi buah pinggang protein matriks fibrotik dan mengubah isoform faktor pertumbuhan-beta (TGF-beta) dalam tikus transgenik TGF-beta. J Am Soc Nephrol. 1999;10:271–280.
33. Arif E, Solanki AK, Srivastava P, et al. Protein motor Myo1c mengawal perubahan faktor pertumbuhan-beta-isyarat dan fifibrosis dalam podosit. Buah Pinggang Int. 2019;96:139–158.
34. Ebefors K, Wiener RJ, Yu L, et al. Reseptor endothelin-A mengantara degradasi lapisan permukaan endothelial glomerular melalui crosstalk patologi antara podosit yang diaktifkan dan sel endothelial glomerular. Buah Pinggang Int. 2019;96:957–970.
35. Fu J, Lee K, Chuang PY, et al. Kecederaan sel endothelial glomerular dan cakap silang dalam penyakit buah pinggang diabetes. Am J Physiol Fisiol Renal. 2015;308:F287– F297.
36. Masum MA, Ichii O, Elewa YHA, et al. Mikroskopi elektron pengimbasan yang diubah suai mendedahkan crosstalk patologi antara sel endothelial dan podosit dalam model murine glomerulonephritis membranoproliferatif. Sci Rep. 2018;8:10276.
37. Abbate M, Zoja C, Rottoli D, et al. Sel tubular proksimal menggalakkan fifibrogenesis oleh TGF-beta1-aruhan pengantara myofifibroblas peritubular. Buah Pinggang Int. 2002;61:2066–2077.
38. Liu BC, Tang TT, Lv LL, et al. Kecederaan tubul renal: daya penggerak ke arah penyakit buah pinggang kronik. Buah Pinggang Int. 2018;93:568–579.
39. Loefffler I, Wolf G. Mengubah faktor pertumbuhan-beta dan perkembangan penyakit buah pinggang. Pemindahan Dail Nephrol. 2014;29(bekalan 1):i37–i45.
40. Murakami K, Takemura T, Hino S, et al. Faktor pertumbuhan mengubah urin-beta pada pesakit dengan penyakit glomerular. Pediatr Nephrol. 1997;11:334–336.
41. Fujiwara K, Kobayashi T, Fujimoto H, et al. Perencatan apoptosis sel dan pemulihan fifibrosis pulmonari oleh trombomodulin. Am J Pathol. 2017;187:2312–2322.
42. Kataoka K, Taniguchi H, Kondoh Y, et al. Trombomodulin manusia rekombinan dalam keterukan akut fifibrosis pulmonari idiopatik. dada. 2015;148:436–443.
43. Tsushima K, Yamaguchi K, Yokoyama T, et al. Thrombomodulin untuk eksaserbasi akut fifibrosis pulmonari idiopatik: bukti kajian konsep. Pulm Pharmacol Ther. 2014;29:233–240.
44. Umemura Y, Yamakawa K. Pemilihan pesakit yang optimum untuk terapi antikoagulan dalam sepsis: cadangan berasaskan bukti dari Jepun. J Kegemukan. 2018;16:462–464.
45. Chen Q, Guan X, Zuo X, et al. Peranan kotak kumpulan mobiliti tinggi 1 (HMGB1) dalam patogenesis penyakit buah pinggang. Acta Pharm Sin B. 2016;6:183–188.
46. Miyake Y, D'Alessandro-Gabazza CN, Takagi T, et al. Kesan pembezaan yang bergantung kepada dos trombin dalam asma bronkial alahan. J Kegemukan. 2013;11:1903–1915.
47. Assady S, Wanner N, Skorecki KL, et al. Pandangan baharu tentang biologi podosit dalam kesihatan dan penyakit glomerular. J Am Soc Nephrol. 2017;28: 1707–1715.
48. Derynck R, Zhang YE. Laluan bergantung kepada Smad dan bebas Smad dalam isyarat keluarga TGF-beta. alam semula jadi. 2003;425:577–584.
49. Schuster N, Krieglstein K. Mekanisme apoptosis pengantaraan TGF-beta. Res Tisu Sel. 2002;307:1–14.
50. Greka A, Mundel P. Biologi sel dan patologi podosit. Annu Rev Physiol. 2012;74:299–323.
51. Isaka Y. Menyasarkan isyarat TGF-beta dalam fifibrosis buah pinggang. Int J Mol Sci. 2018;19:2532.
52. Chang YJ, Cheng YW, Lin RK, et al. Thrombomodulin mempengaruhi kelangsungan hidup pesakit dengan kanser kolorektal bukan metastatik melalui peralihan epitelium-ke-mesenchymal (EMT). PLoS One. 2016;11:e0160550.
53. Zheng N, Huo Z, Zhang B, et al. Thrombomodulin mengurangkan potensi tumorigenik dan metastatik sel-sel kanser paru-paru dengan pengawalseliaan E-cadherin dan pengurangan ekspresi N-cadherin. Biochem Biophys Res Commun. 2016;476:252–259.
54. Pan B, Wang X, Nishioka C, et al. Reseptor gandingan G-protein 15 mengantara angiogenesis dan fungsi sitoprotektif trombomodulin. Sci Rep. 2017;7:692.
55. Chen PS, Wang KC, Chao TH, et al. Trombomodulin rekombinan memberikan tindakan anti-autofagik dalam sel endothelial dan memberikan kesan anti-aterosklerosis dalam tikus kekurangan apolipoprotein E. Sci Rep. 2017;7: 3284.
56. Chung JJ, Okamoto Y, Coblitz B, et al. Ekspresi permukaan protein pengantara isyarat PI3K/Akt yang dikesan oleh 14-3-3 motif berinteraksi. FEB J. 2009;276:5547–5558.
57. Sanchez-Capelo A. Peranan dua untuk TGF-beta1 dalam apoptosis. Faktor Pertumbuhan Sitokin Rev. 2005;16:15–34.
58. Griffifin JH, Zlokovic BV, Mosnier LO. Protein C diaktifkan, reseptor diaktifkan protease 1, dan pelindung saraf. darah. 2018;132:159–169.
59. Isermann B, Vinnikov IA, Madhusudhan T, et al. Protein C yang diaktifkan melindungi daripada nefropati diabetik dengan menghalang apoptosis endothelial dan podosit. Nat Med. 2007;13:1349–1358.
60. Klos A, Tenner AJ, Johswich KO, et al. Peranan anafilatoksin dalam kesihatan dan penyakit. Mol Immunol. 2009;46:2753–2766.
61. Morigi M, Perico L, Corna D, et al. Sekatan reseptor C3a melindungi podosit daripada kecederaan dalam nefropati diabetik. JCI Insight. 2020;5: e131849.
62. Conery AR, Cao Y, Thompson EA, et al. Akt berinteraksi secara langsung dengan Smad3 untuk mengawal sensitiviti kepada apoptosis yang disebabkan oleh TGF-beta. Nat Cell Biol. 2004;6:366–372.
63. Derynck R, Muthusamy BP, Saeteurn KY. Kerjasama laluan isyarat dalam peralihan epitelium-mesenchymal yang disebabkan oleh TGF-beta. Biol Sel Opin Curr. 2014;31:56–66.
64. Remy I, Montmarquette A, Michnick SW. PKB/Akt memodulasi isyarat TGF-beta melalui interaksi langsung dengan Smad3. Nat Cell Biol. 2004;6: 358–365.
65. Hamidi A, Song J, Thakur N, et al. TGF-beta menggalakkan isyarat PI3K-AKT dan penghijrahan sel kanser prostat melalui TRAF6-pengantaraan ubiquitylation p85alpha. Isyarat Sains. 2017;10:eaal4186.
66. Peng Z, Weber JC, Han Z, et al. Kesan dikotomi isyarat Akt dalam kanser payudara. Kanser Mol. 2012;11:61.
67. Zhou F, Geng J, Xu S, et al. Isyarat FAM83A mendorong peralihan mesenchymal epitelium oleh laluan PI3K/AKT/Snail dalam NSCLC. Penuaan (Albany NY). 2019;11:6069–6088.