Cistanche untuk merawat keradangan dan penyakit buah pinggang: Apakah Punca Peranan Patogenik Keradangan dalam Penglibatan Buah Pinggang dalam Cystinopathy?
Mar 13, 2022
Hubungi:joanna.jia@wecistanche.com
Interaksi antara galectin-3 dan cystinosin mendedahkan peranan patogenik keradangan dalam penglibatan buah pinggang cystinosis
Tatiana Lobry1,2 et al
Keradanganterlibat dalam patogenesis banyak gangguan. Walau bagaimanapun, mekanisme asas sering tidak diketahui. Di sini, kami menguji sama adacystinosis, protein yang terlibat dalamcystinosis, ialah pengawal selia kritikal galektin-3, ahli keluarga protein pengikat b-galactosidase, semasakeradangan. Sistinosisadalah gangguan penyimpanan lisosom dan, walaupun terdapat ungkapan cystinosis di mana-mana, iabuah pinggangadalah organ utama yang terjejas oleh penyakit ini.Sistinosisdidapati meningkatkan penyetempatan lisosom dan degradasi galektin-3. Dalam Ctns–/–tikus, model tikuscystinosis, galectin-3 diekspresikan secara berlebihan dalambuah pinggang. Ketiadaan galektin-3 dalam tikus sistinotik memperbaiki fungsi dan struktur buah pinggang patologi dan mengurangkan penyusupan makrofaj/monosit dalam buah pinggang Ctns–/–Gal3–/–tikus berbanding Ctns–/– tikus. Data ini sangat mencadangkan bahawa galectin-3 menjadi pengantarakeradanganterlibat dalambuah pinggangperkembangan penyakit dalam cystinosis. Tambahan pula, galectin-3 didapati berinteraksi dengan sitokin pro-radang MonocyteChemoattractant Protein-1, yang merangsang pengambilan monosit/makrofaj, dan terbukti meningkat dengan ketara dalam serum Ctns–/– tikus dan juga pesakit dengancystinosis. Oleh itu, penemuan kami menyerlahkan peranan baharu untuk interaksi cystinosis dan galectin-3 dalam keradangan dan memberikan penjelasan mekanistik tambahan untukbuah pinggangpenyakit cystinosis. Ini boleh menyebabkan pengenalpastian sasaran dadah baharu ditangguhkancystinosisperkembangan.
KATA KUNCI:penyakit buah pinggang yang kronik; cystinosis; galectin-3;keradangan; protein chemoattractant monosit–1
cistanche boleh merawat penyakit buah pinggang kronik dan cystinosis
Punca keradangan ialah oksida nitrik boleh menyebabkan penghasilan sel-sel radang.Cistancheadalah ubat herba Cina yang berharga. Bahan aktifnya boleh menghalang rembesan nitrik oksida dan memainkan peranan dalam mencegah dan merawat keradangan dan penyakit buah pinggang.
Pernyataan Terjemahan
Walaupun rawatan, pesakit masih mengalami kegagalan buah pinggang peringkat akhir. Dalam kajian ini, kami menunjukkan bahawa ketiadaancystinosismengakibatkan degradasi lisosom galektin-3 (Gal-3) terjejas, yang membawa kepadakeradangandan perkembanganpenyakit buah pinggang yang kronikdalamcystinosis. Penemuan ini membuka perspektif baharu mengenai sasaran terapeutik yang berpotensi yang boleh mengehadkan atau melambatkan degenerasi buah pinggang pada pesakit dengancystinosis. Oleh itu, ubat antiradang dan perencat Gal-3 seperti ubat antiradang bukan steroid atau indomethacin boleh meningkatkan patogenesis buah pinggang dalam cystinosis.
Keradanganialah tindak balas akut biasa organisma kepada kecederaan atau jangkitan,1tapi kronikkeradangandikaitkan dengan kerosakan tisu. Dalam kes penyakit kronik, seperti diabetes, tisu yang rosak mengaktifkan sistem imun, yang membawa kepada tindak balas keradangan yang berterusan dan, akhirnya, degenerasi tisu.2 Sitokin adalah modulator utama bagikeradangandan mampu mengaktifkan atau menyelesaikankeradanganproses.3 Pada pesakit denganpenyakit buah pinggang yang kronik(CKD), kepekatan plasma sitokin yang tinggi (interleukin [IL]-6 dan faktor nekrosis tumor-a) dankeradanganpenanda (protein C-reaktif, IL-6, hyaluronan dan neopterin) dikaitkan dengan perkembangan kepada penyakit buah pinggang peringkat akhir.4 Memahami mediator khusus yang mencetuskan tindak balas keradangan memudahkan penemuan sasaran ubat yang sesuai untuk mencegah kerosakan degeneratif .
Sistinosisadalah penyakit metabolik autosomal-resesif yang tergolong dalam keluarga gangguan penyimpanan lisosom dan dicirikan oleh pengumpulan sistin dalam semua organ.5 Gen rosak dalamcystinosis, CTNS, mengekod sistin lisosom/pengangkut bersama proton, sistinosis.6,7 Walaupun CTNS dinyatakan di mana-mana,buah pinggangadalah organ pertama yang terjejas pada orang dengancystinosis. Pesakit biasanya hadir pada tahun pertama kehidupan mereka dengan sindrom Fanconi, dicirikan oleh gangguan cecair dan elektrolit yang teruk, pertumbuhan yang lemah, dan riket.8CKD kemudiannya berkembang, yang berkembang menjadi penyakit buah pinggang peringkat akhir dan memerlukanbuah pinggangpemindahan. Pengumpulan sistin dalam semua tisu akhirnya membawa kepada disfungsi multiorgan; pesakit mengalami fotofobia dan buta, hypothyroidism, hypogonadism, diabetes, myopathy, dan kemerosotan sistem saraf pusat.9 Dalam latar belakang C57BL/6, model tetikus kalah mati (Ctns–/–) 10 mereplikasi fenotip buah pinggang pesakit cystinotik,11 serta pemendapan kristal sistin dalam kornea12dan disfungsi tiroid.13
Dalam kajian ini, kami mendedahkan peranan baru untukcystinosisdalamkeradanganmelalui interaksinya dengan Gal-3. Gal-3 ialah ahli keluarga protein pengikat lektin dan b-galaktosida 21 dan terlibat dalam pelbagai fungsi biologi, termasukkeradangan.22Dalam konteksbuah pinggangpenyakit, perencatan Gal-3 ditunjukkan untuk mengurangkan ekspresi penanda pro-radang dan fibrosis buah pinggang dan menghalang penurunan kadar penapisan glomerular dalam model hiperaldosteronisme, hipertensi atau obesiti.23–26Di sini kami menyediakan bukti bahawa, dalamcystinosis, ketiadaancystinosismembawa kepada Gal{0}} ekspresi berlebihan dalambuah pinggang, meningkatkan penyusupan makrofaj dan perkembangan CKD. Selain itu, kami mengenal pasti monocyte chemoattractant protein–1 (MCP-1) sebagai pengantara yang berpotensi, mendedahkan sasaran gen baharu untuk terapi dadah. HASIL Gal-3 berinteraksi dengan cystinosis melalui domain pengecaman karbohidratnya Untuk mengenal pasti interaksi khusus rakan kongsi menggunakan spektrometri jisim kuantitatif, taring Madin-Darbybuah pinggang(MDCK) telah ditransduksi dengan binaan lentiviral untuk menyatakan secara stabil protein gabungan protein pendarfluor FL (GFP) cystinosis-hijau. Sebagai tambahan kepada 9 subunit Hþ adenosine triphosphatase jenis vakuolar yang diterbitkan sebelum ini,19Gal-3 dikenal pasti sebagai salah satu protein yang berinteraksi dengannyacystinosis(Rajah 1a). Interaksi ini selanjutnya disahkan oleh co-imunoprecipitation diikuti oleh Western blotting (Rajah 1b dan c). Selain itu, kami menunjukkan bahawa interaksi antara Gal-3 dancystinosistelah dimediasi oleh domain pengecaman karbohidrat (CRD) Gal{0}} yang disetempatkan dalam ekor terminal-C protein. Interaksi itu dihalang oleh thiodigalactoside, perencat kuat interaksi galektin-karbohidrat (Rajah 1d). Seperti semua galektin, Gal-3 mempunyai pertalian untuk protein terglikosilasi,21 jadi kemungkinan besar interaksi dengan Gal-3 berlaku melalui bahagian terglikosilasi sistinosis yang terletak di ekor terminal N intralisosomal protein.27
Cystinosin meningkatkan penyetempatan dan degradasi lisosom Gal-3
Untuk mengesahkan potensi penyetempatan lisosom Gal-3 apabila berinteraksi dengancystinosis, kami menunjukkan bahawa Gal-3, seperti cathepsin D (protease intralysosomal), dilindungi daripada pencernaan oleh proteinase K, manakala kedua-dua protein dicerna apabila lisosom telah meresap dengan Triton X- 100 (Rajah 2a dan Tambahan Rajah S1). Data yang sama diperolehi dalam lisosom yang diasingkan daripada hati tikus, mengesahkan penyetempatan lisosom Gal-3 dalam vivo (Rajah 2b dan c). Kerana ketiadaan antibodi yang boleh dipercayai untuk dikesancystinosis, imunostaining dilakukan padacystinosis-GFP–mengekspresikan garisan sel MDCK dengan antibodi anti-Gal-3. Ia mengesahkan kehadiran Gal-3 dalam lumen lisosom, manakala cystinosis-GFP dan Lamp-2 (protein transmembran lisosom) hanya ditemui pada membran vesikel (Rajah 2d).
Untuk menyiasat jikacystinosinterlibat dalam Gal-3 trafiking, kami menganalisis dinamik kedua-duanyacystinosisdan Gal-3–vesikel positif menggunakan jumlah pantulan dalaman sel hidup dwi-warna mikroskop pendarfluor FL dalam fibroblas embrionik tetikus (MEFs) daripada jenis liar (WT) dan Ctns–/–tikus yang menyatakan kedua-dua CTNS-DsRed dan Gal-3–GFP. Analisis kami mengesahkannyacystinosisdan Gal-3 menjalani kolokalisasi sebenar dalam Ctns–/– MEFs seperti yang disahkan oleh taburan spatiotemporal yang serupa bagi molekul ini dalam jumlah pantulan dalaman FL zon mikroskop pendarfluor (Rajah 2e). Data dalam WT MEF adalah serupa (data tidak ditunjukkan). Selain itu, apabila MEF yang ditransfeksi hanya dengan Gal- 3–GFP dianalisis, Gal-3–GFP ditemui dalam sitoplasma dan tiada struktur vesikular yang berbeza diperhatikan, bertentangan dengan pemindahan bersama dengan CTNS-DsRed ( data tidak ditunjukkan).
Data ini disahkan dalam sel 293T, di mana isyarat GFP yang kuat dalam sitoplasma diperhatikan dalam sel yang menyatakan hanya Gal-3–GFP, manakala dalam sel yang menyatakan kedua-dua Gal-3–GFP dancystinosin-DsRed, Gal-3–GFP terutamanya disetempatkan dalam cystinosis-DsRed–lisosom yang mengekspresikan (Rajah 3a). Selain itu, kuantifikasi ekspresi protein Gal-3 dalam sel yang ditransfeksi dengan Gal-3–GFP sahaja atau Gal- 3–GFP dan CTNS-DsRed, dan Gal-3–GFP dan DsRed sebagai kawalan, menunjukkan dengan ketara kurang protein Gal-3–GFP dalam sel yang ditransfeksi bersama dengan CTNS-DsRed berbanding dengan sel yang ditransfeksi dengan Gal-3–GFP sahaja atau ditransfeksi bersama dengan DsRed (Rajah 3b). Secara keseluruhan, keputusan ini mencadangkan bahawacystinosinmeningkatkan penyetempatan lisosom dan degradasi Gal-3. Cystinosin ditunjukkan terlibat dalam CMA.28 Protein kejutan haba 70 kDa (Hsc70) mengambil bahagian dalam CMA dengan membantu pembentangan dan pemindahan protein substrat merentasi membran ke dalam lumen lisosom dalam cara yang bergantung kepada LAMP2A.29,30 Kerana Gal{ {8}} telah dicadangkan untuk direndahkan oleh CMA,31 kami menyiasat penyetempatan Gal-3 berbanding Hsc70 dalam MEF sistinotik. Analisis mikroskopi konfokal mengesahkan pengkolokalisasian Gal{12}}–GFP di Hsc{13}} struktur positif dalam kedua-dua WT (data tidak ditunjukkan) dan Ctns–/–sel (Rajah 3c), menyokong pengangkutan bersama Gal-3 dengan Hsc70 dan mencadangkan bahawa penghayatan lisosom tetapi bukan Gal-3 pengecaman oleh pendamping adalah rosak dalamcystinosis.
Gal-3 terlibat dalam keradangan buah pinggang dalam Ctns–/–tikus
Untuk mengkaji peranan Gal-3 dalamcystinosisdalam vivo, kami menghasilkan model tetikus kalah mati berganda yang kekurangan dalam kedua-duanyacystinosindan Gal-3 (Ctns–/–Gal{0}}–/–tikus). WT, Ctns–/–, dan Gal-3–/–tikus digunakan sebagai subjek kawalan. Dalam C57BL/6 Ctns–/–tikus, anomali buah pinggang muncul sekitar 10 bulan.11 Oleh itu, kajian dilakukan pada 8 hingga 9 bulan, apabilabuah pingganganomali mula dikesan, dan pada 12 hingga 15 bulan apabila anomali buah pinggang telah berkembang. Kerana kandungan sistin didapati berbeza pada Ctn lelaki dan perempuan–/– buah pinggang, mereka dianalisis secara berasingan. Jika kandungan sistin meningkat dengan usia dalam kedua-dua genotip, tiada perbezaan yang ketara diperhatikan dalam buah pinggang lelaki dan wanita antara Ctns–/– Gal-3–/– tikus dan Ctns–/– tikus pada umur 8 hingga 9 bulan dan 12 hingga 15 bulan (Rajah 4a).
Fungsi buah pinggang dinilai dalam serum dan air kencing dan tiada perbezaan ketara diperhatikan antara WT dan Ctns–/–tikus pada 8 hingga 9 bulan (data tidak ditunjukkan), tetapi pada 12 hingga 15 bulan, Ctns–/–tikus menunjukkan tahap kreatinin dan urea serum yang jauh lebih tinggi berbanding dengan tikus WT. Menariknya, Ctns–/–Gal{0}}–/–tikus mempamerkan fungsi buah pinggang yang lebih baik berbanding dengan Ctns–/–tikus pada 12 hingga 15 bulan, dengan kreatinin serum yang lebih rendah (P < 0.05) dan urea (P < 0.05; Jadual 1).
Kajian histologi 8- hingga 9-bulan dan 12- hingga 15-bulan tetikusbuah pinggangbahagian mendedahkan kehadiran anomali teruk dalam Ctns–/– buah pinggang, termasuk atrofi tiub, glomeruli yang ditarik balik, dan penyusupan mononuklear. Analisis buta bahagian buah pinggang berjulat tahap kerosakan kortikal daripada 1 (struktur tisu terpelihara) hingga 6. Skor purata untuk Ctns–/–tikus ialah 2.64 - 0.36 pada umur 9 bulan (n ¼ 7) dan 4.12 0.37 pada umur 12 hingga 15 bulan (n ¼ 16). Di buah pinggang Ctns–/–Gal{0}}–/–tikus pada umur yang sama, anomali ini adalah kurang meluas dengan ketara: 1.62 - 0.11 pada 9 bulan (n ¼ 21; P < 0.05,="" mann-whitney="" t-="" ujian)="" dan="" 3.04="" -="" 0.22="" pada="" 12="" hingga="" 15="" bulan="" (n="" ¼="" 33;="" p="">< 0.05,="" ujian-t="" mann-whitney)="" (rajah="" 4b="" dan="" rajah="" tambahan="" s2).="" selain="" itu,="" peratusan="" atrofi="" tiub="" telah="" diberikan="" kepada="" setiap="" tisu,="" dan="" purata="" untuk="">–/–tikus dan Ctns–/–Gal{0}}–/–tikus ialah 66 peratus dan 42 peratus , masing-masing pada 12 hingga 15 bulan (P ¼ 0.01). Tambahan pula, perbezaan yang ketara antara Ctns–/–dan Ctns–/– Gal{0}}–/– buah pinggangbahagian adalah kehadiran beberapa penyusupan mononuklear dalam Ctns–/–Gal{0}}–/–bahagian, manakala penyusupan berat secara konsisten diperhatikan dalam Ctns–/– buah pinggang(Rajah 4b).
Kami mencirikan infiltrat mononuklear yang diperhatikan melalui pemeriksaan histologi dalam 8- hingga 9-Ctns berusia sebulan–/– buah pinggangsebagai makrofaj/monosit dengan pewarnaan bersama dengan CD68 dan CD45 dan dengan CD68 dan kelas histokompatibiliti utama II (Tambahan Rajah S3), tetapi tidak dengan CD68 dan CD163, menunjukkan bahawa makrofaj ini mempunyai profil proinflamasi seperti M1-.32 ,33 Kuantifikasi sel positif CD{10}} menunjukkan lebih sedikit makrofaj/monosit dalam WT, Gal-3–/–, dan Ctns–/–Gal{0}}–/– buah pinggangberbanding dengan Ctns–/– buah pinggang(Rajah 4c), mengesahkan data histologi (Rajah 4b).
Secara keseluruhannya, penemuan ini mencadangkan bahawa Gal-3 terlibat dalam pengambilan makrofaj/monosit dalam sistinotikbuah pinggangdan bahawa ketiadaannya memulihkan penyakit buah pinggang inCtns–/–tikus. Oleh itu ia mencadangkan bahawakeradanganbertanggungjawab, sekurang-kurangnya sebahagiannya, untuk kemerosotan buah pinggang dalam Ctns–/– tikus.
Buah pinggang kekurangan Ctns mempamerkan ekspresi berlebihan Gal{1}}.
Menggunakan analisis Western blot, kami mendapati bahawa ekspresi Gal-3 telah meningkat dengan ketarabuah pinggangdaripada 12-bulan Ctns–/–tikus berbanding dengan tikus WT (Rajah 5a dan b). Untuk menyiasat sama ada ungkapan Gal yang meningkat-3 ini khusus untuk Ctns–/– buah pinggang, kami mengukur ekspresi Gal-3 pada tahap transkrip dan protein dalambuah pinggangdaripada tikus dengan CKD yang disebabkan oleh operasi nefrektomi langkah 2-subtotal standard dan daripada haiwan yang menjalani pembedahan palsu. WT dan Ctns–/–tikus digunakan sebagai subjek kawalan. Transkrip Gal-3 telah meningkat dengan ketara dalam Ctns–/– dan buah pinggang palsu tetapi sangat meningkat dalam CKDbuah pinggangberbanding dengan tikus WT (Rajah 5c). Sebaliknya, pada tahap protein, Gal-3 hanya dikesan dalam Ctns–/–buah pinggang, sangat mencadangkan bahawa hanya Ctns–/–buah pinggang tidak dapat merendahkan protein Gal-3 (Rajah 5d). Pewarnaan imunofluoresen Gal-3 dalam murinebuah pinggangpada 8 hingga 9 bulan juga menunjukkan ekspresi berlebihan Gal-3 dalam Ctns–/– buah pinggangberbanding dengan WTbuah pinggang(Rajah 5e). Selain itu, Gal-3 telah dinyatakan oleh makrofaj CD68þ, serta sel renal dalam Ctns–/– buah pinggangpada 8 hingga 9 bulan (Tambahan Rajah S4). Secara keseluruhannya, data ini konsisten dengan penurunan kemerosotan Gal-3 jika tiadacystinosisseperti yang ditunjukkan secara in vitro (Rajah 3a dan b), membawa kepada pengumpulan protein Gal-3 dalam Ctns–/– buah pinggang.
Ketiadaan cystinosin membawa kepada peningkatan MCP serum-1 melalui penyelarasan Gal-3
Gal-3 mengawal seliakeradanganmelalui mekanisme yang berbeza.34 Oleh itu, untuk mendapatkan pandangan lanjut tentang mekanisme dalamcystinosis, kami menyiasat ekspresi sitokin pro-radang atau anti-radang yang berbeza dalam serum 12- hingga 15-WT berusia sebulan, Ctns–/–, Gal-3–/–, dan Ctns–/–Gal{0}}–/–tikus. Enam tahap sitokin diukur dengan tatasusunan manik sitometri tetikus, MCP-1, interferon-g, faktor nekrosis tumor dan IL-10, IL-6 dan IL-12p70. Hanya ekspresi MCP-1 telah meningkat dengan ketara dalam Ctns–/– serum tikus berbanding dengan WT dan Gal-3–/– tikus dan juga kepada Ctns–/–Gal{0}}–/–tikus, yang tahap serum MCP-1nya setanding dengan tikus WT (Rajah 6a). MCP-1 dihasilkan oleh jenis sel yang berbeza, dengan sumber utama MCP-1 ialah makrofaj dan monosit,35 dan bertindak sebagai chemoattractant untuk monosit dan makrofaj yang mengawal selia penghijrahan dan penyusupannya. Sebaliknya, pada usia yang sama, ekspresi Gal-3 didapati serupa dalam serum tikus Ctns–/– (44.33 9.81 ng/ml; n ¼ 5) dan tikus WT (40.{{12} }.41 ng/ml;n ¼ 7).
Hubungan antara Gal-3 dan MCP-1 telah disiasat selanjutnya oleh co-imunoprecipitation menggunakan Gal-3–GFP dan MCP-1–DsRed– atau Gal-3– GFP dan CTNS-DsRed– (sebagai kawalan positif) yang menyatakan sel 293T. Interaksi antara Gal-3 dan MCP-1 telah diperhatikan (Rajah 6b), mencadangkan aruhan langsung MCP-1 oleh Gal-3. Pengeraman dengan N-Acetyl-D-lactosamine (LacNAc), perencat Gal{16}} CRD, menunjukkan bahawa, berbeza dengancystinosininteraksi, CRD tidak terlibat dalam interaksi antara Gal-3 dan MCP-1 (Rajah 6c).
Untuk menilai sama ada penemuan ini berkaitan pada manusia, kami mengukur tahap Gal-3 dan MCP-1 pada pesakit dengancystinosisyang tidak menjalani terapi imunosupresif atau mengambil ubat anti-radang. Walaupun tahap Gal-3 didapati meningkat sedikit dalam serum pesakit dengan cystinosis berbanding dengan penderma yang sihat, perbezaannya tidak ketara (Rajah 6e), mengesahkan keputusan kami yang diperolehi dalam Ctns–/–tikus. Hanya 2 pesakit mempunyai tahap Gal-3 yang tinggi (25.34 dan 39.54 ng/ml); ia dianggap terpencil dan oleh itu tidak dimasukkan dalam Rajah 6e. Sebaliknya, menggunakan ujian imunosorben berkaitan enzim yang ditujukan terhadap MCP-1 manusia (Rajah 6d), tahap MCP-1 serum didapati meningkat dengan ketara pada pesakit dengancystinosis(252.1 - 18.4 pg/ml; n ¼ 19; lingkungan umur 1–23 tahun) walaupun rawatan cysteamine berbanding subjek kawalan sihat (166.9 -13.5 pg/ml; n ¼ 1 0; julat umur 8–63 tahun) (P < 0.001).="" tiada="" korelasi="" ditemui="" antara="" umur="" dan="" tahap="" mcp-="" 1="" dalam="" kedua-dua="" pesakit="">cystinosisdan penderma yang sihat (data tidak ditunjukkan).
Cistanchemempunyaianti-radangharta benda
PERBINCANGAN
Walaupun fakta bahawa cystine terkumpul dalam semua tisu pada pesakit yang terjejas dengancystinosis, buah pinggang adalah organ yang paling terdedah kepada kerosakan. Oleh itu, kami percaya pengumpulan sistin tidak bertanggungjawab sepenuhnya untuk kemerosotan buah pinggang. Di sini, kami menerangkan peranan baharu untukcystinosindalam peraturankeradanganterlibat dalam perkembangan penyakit buah pinggang kronik dicystinosis. Kajian ini mungkin menjelaskan mengapa pesakit berkembang kepada kegagalan buah pinggang peringkat akhir walaupun menjalani terapi cysteamine.
Kajian tentang pasangan molekul cystinosis mendedahkan interaksi langsung dengan Gal-3, yang boleh dihalang oleh perencat Gal-3 CRD. Kajian terbaru menunjukkan bahawa Gal-3 boleh berinteraksi dengan glycan yang terletak dalam lumen lisosom selepas kerosakan lisosom seperti pembentukan kristal.36 Dalam kajian kami, interaksi antara Gal-3 dancystinosintelah dikaji dalam sel yang sihat mengekspresikancystinosindan, oleh itu, tidak mengumpul kristal sistein atau sistin. Selain itu, ekspresi berlebihan Gal-3 dan cystinosin dalam sel sihat telah mengubah suai penyetempatan subselular Gal-3, yang kemudiannya disetempatkan kepada lisosom, berbanding dengan ekspresi berlebihan Gal-3 sahaja, yang terletak di dalam sitoplasma. Keputusan ini sangat mencadangkan bahawa interaksi antara Gal-3 dan cystinosin berlaku secara bebas daripada kerosakan lisosom dan cystinosin bertanggungjawab secara aktif untuk penyetempatan lisosom Gal-3. Sebelum ini Gal-3 telah ditunjukkan terdegradasi melalui proteolisis yang bergantung kepada lisosom tanpa kehadiran Abl dan Arg, 2 kinase tyrosine.31
Di samping itu, kami menunjukkannyacystinosisdan Gal-3 menyetempat bersama pada struktur vesikular dinamik dan bersama-sama digerakkan dalam cara spatiotemporal.Cystinosinsebelum ini telah dikaitkan dengan mekanisme pemerdagangan LAMP2A lisosom, satu-satunya reseptor CMA yang diketahui, yang salah tempat dalamcystinosis.28Kemerosotan Gal-3 sebelum ini telah ditunjukkan sebagai pengantara oleh CMA.31Analisis mikroskopi konfokal mengesahkan kolokalisasi Gal-3 pada Hsc70-struktur positif dalam kedua-dua Ctns–/– dan sel WT, menyokong pengangkutan bersama Gal-3 dengan Hsc70 untuk pembentangan pada lisosom dan degradasi oleh CMA kerana Hsc70 membantu pemindahan protein substrat merentasi membran ke dalam lumen lisosom.29,30Tafsiran yang mungkin keputusan kami ialahcystinosinmengawal selia pemerdagangan dan penghantaran Gal-3 kepada lisosom aktif CMA untuk degradasi.
Laluan novel inicystinosinpenyetempatan dan degradasi lisosom yang bergantung Gal-3 disokong secara in vivo sebagai tikus kekuranganCtns mempamerkan ekspresi berlebihan Gal-3 dalambuah pinggang. Selain itu, manakala peningkatan mRNA Gal-3 terhad dalam Ctns–/–buah pinggang berbanding model CKD yang lain, kuantiti protein Gal{0}} yang banyak dikesan hanya dalam–/– buah pinggang. Data ini sangat menyokong kesimpulan bahawacystinosinterlibat dalam degradasi protein Gal-3, yang boleh mengawal ekspresi berlebihan Gal-3 mRNA dalam keadaan tekanan seperti CKD.
Gal-3 mempunyai beberapa peranan biologi, termasuk peranan dalam akut dan kronikkeradangandengan menarik monosit dan makrofaj.37,38Dalam Ctns–/– tikus, kami memerhatikan penyusupan mononuklear berat terutamanya dalambuah pinggangseperti yang diterangkan sebelum ini,11,39yang dicirikan sebagai monosit/makrofaj. Sebaliknya, buah pinggang daripada Ctns kalah mati berganda–/–Gal{0}}–/–tikus mempamerkan sangat sedikit monosit/makrofaj penyusupan, sangat mencadangkan bahawa Gal-3 terlibat dalamkeradangandalam buah pinggang Ctns–/–tikus. Dalam konteks kecederaan tisu berulang, Gal-3 mungkin mencetuskan peralihan kepada kronikkeradangandan fibrosis.34Selaras dengan penemuan ini, data kami menunjukkan penglibatan Gal-3 dalam perkembangan CKD dalamcystinosis. Sesungguhnya, Ctns kalah mati berganda–/– Gal{0}}–/–tikus dipamerkan dengan lebih baikbuah pinggangfungsi dan struktur berbanding dengan Ctns–/–tikus. Begitu juga, tikus kekurangan Gal-3–mempamerkan kurang fibrosis buah pinggang dalambuah pinggangberbanding dengan tikus WT selepas halangan ureter unilateral,40 dan tikus kalah mati Gal-3 yang mengalami kecederaan reperfusi iskemia mempunyai fungsi buah pinggang yang lebih baik berbanding tikus WT yang mengalami kecederaan reperfusi iskemia.41
Walaupun korelasi antara tahap Gal-3 dalam plasma dan perkembangan CKD ditemui,42 tiada perbezaan ekspresi Gal-3 diperhatikan dalam serum tikus dan manusia yang terjejas olehcystinosisdan subjek kawalan sihat. Dengan mengukur tahap sitokin yang berbeza dalam serum, kami mendapati peningkatan ketara MCP-1 dalam Ctns–/–tikus, manakala Ctns–/–Gal{0}}–/–tikus mempunyai tahap yang setanding dengan tikus WT. MCP-1 ialah sitokin yang boleh dilepaskan dalam serum dan membentuk kecerunan untuk menarik monosit dan makrofaj ke tapak kecederaan.35 Peningkatan MCP-1 dalam sera Ctns–/–tikus berbanding dengan Ctns–/–Gal{0}}–/–tikus bebas daripada pengumpulan sistin keranabuah pinggangkandungan sistin adalah serupa dalam kedua-dua genotip. Tambahan pula, walaupun rawatan cysteamine yang membenarkan sistin keluar daripada lisosom, MCP-1 didapati meningkat dengan ketara dalam serum pesakit dengancystinosisberbanding dengan penderma yang sihat. Data ini sangat mencadangkan bahawa ketiadaancystinosin, bukannya pengumpulan sistin, bertanggungjawab untuk peningkatan MCP-1 dalam serum. Selain itu, kami menunjukkan interaksi langsung antara Gal-3 dan MCP-1, yang baru-baru ini dicadangkan oleh Gordon-Alonso et al.43 tetapi tidak dikaji lagi. Mekanisme pengaktifan Gal-3–MCP-1 tidak dikaji di sini. Hipotesis ialah kehadiran peptida isyarat dalam MCP manusia-1, yang boleh dibelah untuk meningkatkan rembesannya.44 Selain itu, plasmin boleh membelah terminal-C MCP-1, yang meningkatkan kemoatraktannya. potensi.45 Selain itu, mengaitkan dengan data kami, perencatan MCP-1 dalam model tetikus nefropati diabetik menghalang penyusupan makrofaj buah pinggang dan meningkatkan fungsi buah pinggang.46,47 Dalamcystinosis, data kami amat mencadangkan bahawa ketiadaancystinosinmembawa kepada peningkatan Gal-3, yang mengaktifkan MCP-1 mobilisasi darah, meningkatkan buah pinggangkeradangandan perkembanganpenyakit buah pinggang yang kronik.
Penemuan ini membuka perspektif baharu mengenai sasaran terapeutik yang berpotensi yang boleh mengehadkan atau melambatkan degenerasi buah pinggang pada pesakit dengancystinosis. Sesungguhnya, ubat anti-radang bukan steroid seperti aspirin dan indomethacin telah didapati menghalang ekspresi Gal-3 dengan menghalang transkripsinya.48 Indomethacin sebenarnya digunakan untuk mengawal poliuria dan polidipsia dalamcystinosis,49 dan kajian terbaru terhadap 307 pesakit Eropah dengan cystinosis menunjukkan hasil buah pinggang yang lebih baik pada pesakit yang dirawat dengan indometasin.50 Berdasarkan kajian kami, penggunaan indometasin atau ubat anti-radang bukan steroid untukcystinosispesakit boleh dipertimbangkan semula.
KAEDAH
Eksperimen haiwan
C57BL/6 Ctns–/–tikus disediakan oleh Dr. Antignac (Inserm U1163, Paris, Perancis). C57BL/6 galectin-3 null (Gal-3–/–) tikus telah disediakan oleh Dr. Fu-Tong Liu (University of California, Davis) dan Dr. Jerrold M. Olefsky (University of California, San Diego). Strategi pembiakan untuk menjana WT, Ctns–/–, Gal-3–/–, Ctns–/– dan Gal- 3–/–tikus diterangkan dalam Kaedah Tambahan.
Talian sel
kekacauan itu dihasilkan daripada biopsi kulit baru lahir WT dan Ctns–/–tikus. Talian sel MEF, 293T dan MDCK jenis II (ATCC, Manassas, VA) telah ditanam dalam medium Eagle diubah suai Dulbecco yang mengandungi 10 peratus serum anak lembu janin atau serum lembu janin, 100 unit/ml penisilin, 0.1 mg/ml streptomycin , dan 2 mM L-glutamin.
Co-imunoprecipitation dan analisis spektrometri jisim
Untuk mengkaji interaksi protein-protein, sel MDCK telah ditransduksi menggunakan tulang belakang vektor pRRL.SIN.cPPT.PGK/WPRE lentiviral untuk menyatakan secara stabilcystinosin-GFP.51Co-imunoprecipitation telah dilakukan seperti yang diterangkan dalam Kaedah Tambahan. Protein co-immunoprecipitated telah diselesaikan oleh elektroforesis gel sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE) dan dianalisis dengan spektrometri jisim, LTQ Orbitrap seperti yang telah diterangkan.19
Sel 293T yang menyatakan Gal-3–GFP dan MCP-1–DsRed atau Gal-3– GFP dan CTNS-DsRed telah digunakan untuk co-imunopresipitasi seperti yang diterangkan dalam Kaedah Tambahan. Protein co-imunoprecipitated telah diselesaikan oleh SDS-PAGE, dan Gal-3–mengikat MCP-1 telah dikesan menggunakan antibodi anti-DsRed (Clontech Laboratories, Mountain View, CA).
Pecahan Subselular
Lapan hati diperolehi daripada tikus C57BL/6 dan disediakan seperti yang diterangkan sebelum ini.52 Keadaan kecerunan pada dasarnya adalah sama seperti yang diterangkan dalam penerbitan asal,52 kecuali Nycodenz digunakan dan bukannya metrizamide.
Gal-3–perawatan perencat dan proteinase K
Lysates daripadacystinosin-GFP MDCK sel dan 293T mengekspresikan Gal-3–GFP dan CTNS-DsRed atau Gal-3–GFP dan MCP-1–DsRed telah diinkubasi dengan atau tanpa 5 mM thiodigalactoside atau 5 mM N -Acetyl-D-Lactosamine, masing-masing, 2 perencat Gal-3 CRD. Selepas 30 minit pengeraman pada 4 - C dengan goncangan berterusan, lisat diinkubasi dengan 50 ml mikrobead anti-GFP dan imunopresipitasi dilakukan seperti yang dinyatakan sebelum ini. Protein yang dimendakan telah diselesaikan oleh SDS-PAGE pada 10 peratus gel.
Lysates daripadacystinosin-Sel GFP MDCK dan pecahan yang diperkaya lisosom hati tikus diinkubasi dengan atau tanpa 2 peratus Triton X-100 selama 10 minit pada 4 - C dan kemudian diinkubasi 30 minit dengan atau tanpa 2.5 mg/ml dan 25 mg /ml proteinase K, masing-masing. Selepas penyahaktifan enzim dengan 1 mM fenilmetilsulfonil fluorida selama 5 minit pada 4 - C, protein telah diselesaikan oleh SDS-PAGE pada 10 peratus gel.
Analisis imunofluoresensi
Sel MDCK tetap diinkubasi dengan anti-Lamp-2 (OriGeneTechnologies, Rockville, MD) dan antibodi anti-Gal-3 (CedarlaneLaboratories, Burlington, Ontario, Kanada) 2 jam pada suhu bilik, diikuti oleh Alexa Fluor 555 antibodi sekunder (Invitrogen, Carlsbad, CA) selama 1 jam pada suhu bilik. Imej confocal diambil menggunakan mikroskop Zeiss LSM 700 (Carl ZeissMicroscopy, Jena, Jerman).
Sel 293T secara sementara menyatakan Gal-3–GFP sahaja, Gal-3–GFP dan DsRed atau Gal-3–GFP dancystinosin-DsRed dikultur pada slip penutup sebelum dipasang pada slaid. Sel telah diimej menggunakan instrumen Keyence BZ-X700 (Keyence Corp., Osaka, Jepun).
tetapbuah pinggangbahagian diinkubasi semalaman pada 4 - C dengan antibodi anti-CD68 (BioLegend, San Diego, CA) atau anti-Gal-3 (BioLegend), diikuti oleh antibodi sekunder Alexa Fluor 488 (Invitrogen), 1 jam pada suhu bilik. Imej diperoleh menggunakan instrumen Keyence BZ-X700. Kuantifikasi ungkapan CD68 diterangkan dalam Kaedah Tambahan.
MEF yang menyatakan Gal-3–GFP telah diwarnakan menggunakan antibodi anti-Hsc70 (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY) dan digambarkan seperti yang diterangkan sebelum ini.53
Jumlah pantulan dalaman FL mikroskop pendarfluor
WT dan Ctns–/–MEF yang mengekspresikan Gal-3–GFP dan CTNS-DsRed telah disemai pada 4-ruang 35- mm hidangan bawah borosilikat (Cellvis, Mountain View, CA). Selepas 2 hari dalam kultur, MEF dianalisis dengan jumlah refleksi dalaman mikroskop pendarfluor FL seperti yang diterangkan sebelum ini54dan dalam Kaedah Tambahan. Imej dianalisis menggunakan perisian ImageJ.
Analisis ekspresi Gal-3.
Sel 293T yang menyatakan Gal-3–GFP, Gal-3–GFP dan DsRed, atau Gal-3–GFP dan CTNS-DsRed dan diterangkanbuah pinggangtelah disaring dalam penimbal ujian radioimunopresipitasi yang mengandungi koktel perencat proteinase. Protein diasingkan pada gel 4 peratus hingga 15 peratus dan didedahkan menggunakan antibodi anti-Gal-3 (Abcam, Cambridge, UK) atau anti-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). .
buah pinggangtelah dihomogenkan dalam penimbal RLT yang mengandungi b-mercaptoethanol menggunakan Precellys 24 (Bertin Instruments, Montigny-le-Bretonneux, Perancis). RNA telah diasingkan dan Gal-3– tindak balas rantai polimerase digital titisan khusus telah dilakukan seperti yang diterangkan dalam Kaedah Tambahan. Ungkapan transkrip Gal-3 dinyatakan sebagai nisbah berbanding dengan kawalan endogen 18S. Ujian imunosorben berkaitan enzim (Abcam) telah digunakan untuk mengesan tahap Gal-3 dalam tikus dan sera manusia, mengikut arahan pengilang.
Fungsi buah pinggang
Tahap serum dan fosfat air kencing, kreatinin serum dan urea dianggarkan menggunakan Kit Ujian Fosfat QuantiChrom, Kit Kreatinin Quanti Chrom dan Kit Ujian Urea QuantiChrom (BioassaySystems, Hayward, CA). Tahap protein dalam air kencing diukur menggunakan Kit Assay Protein Pierce BCA (Rockford, IL).
Histologi
Pada masa tikus dibunuh,buah pinggangdikumpulkan, difiksasi dalam formalin, dan dibenamkan dalam parafin. Bahagian yang diwarnai dengan hematoxylin dan eosin telah disemak secara buta oleh Dr. Marie Claire Gubler seperti yang diterangkan dalam Kaedah Tambahan.
Pengukuran kandungan sistin
Pengukuran cystine tisu dilakukan oleh spektrometri jisim (LC-ESI-MS/MS) seperti yang diterangkan sebelum ini.39
Nefrektomi standard dan operasi palsu
CKD tikus telah diinduksi oleh operasi nefrektomi peringkat subtotal 2-seperti yang diterangkan sebelum ini.55,56Kumpulan tikus palsu menjalani prosedur yang sama tetapi tanpa memotong mana-manabuah pinggangtisu.
Tahap sitokin dalam serum
Untuk mengukur tahap sitokin dalam serum tetikus, tetikuskeradangansusunan manik sitometrik kit (BD Biosciences, San Jose, CA) telah dilakukan mengikut arahan pengilang. Kepekatan MCP-1 dalam serum manusia ditentukan menggunakan ujian imunosorben berkaitan enzim yang ditujukan terhadap MCP-1 (Abcam, Cambridge, UK) mengikut arahan pengilang.
Analisis statistik
Nilai dinyatakan sebagai min - SEM. Kepentingan keputusan telah dinilai oleh 2-ujian-t berekor tidak berpasangan atau ujian-t berekor 2-tidak berpasangan dengan pembetulan Welch. Perbandingan kumpulan 3 keadaan atau lebih telah dibuat dengan analisis parametrik varians, diikuti dengan ujian perbandingan berbilang Tukey untuk perbandingan berpasangan. Skor histologi dibandingkan menggunakan ujian Mann-Whitney. Analisis dilakukan menggunakan perisian Prism 6 (GraphPad, San Diego, CA). Nilai P kurang daripada 0.05 dianggap penting.
Kelulusan belajar
Eksperimen tikus telah dijalankan dengan mematuhi protokol Jawatankuasa Penggunaan Haiwan Institusi. Penggunaan tisu manusia dalam kajian ini telah diluluskan oleh Program Perlindungan Penyelidikan Manusia Universiti California, San Diego.
PENDEDAHAN
SC ialah ahli Lembaga Saintifik dan ahli Lembaga Pemegang AmanahcystinosisYayasan Penyelidikan. SC ialah pengasas bersama, pemegang saham dan ahli lembaga saintifik dan lembaga pengarah GenStem TherapeuticsInc. Syarat pengaturan ini telah disemak dan diluluskan oleh Universiti California–San Diego selaras dengan dasar konflik kepentingannya. Semua pengarang lain mengisytiharkan tiada kepentingan bersaing.
menyediakan Gal-3–/–tikus. Kami berterima kasih kepada Lou Devanneaux dan NicholeFlerchinger atas bantuan teknikal mereka dan Elizabeth Souter kerana menyemak manuskrip. Kami menghargai Christopher Alfonso dari BDBioscience kerana menyediakan tetikuskeradangantatasusunan manik sitometrik dan atas bantuannya dengan tafsiran keputusan. Kerja ini disokong oleh Institut Kesihatan Nasional memberikan RO1-DK090058dan R01-DK110162,SistinosisYayasan Penyelidikan dan Institut Perubatan Regeneratif California (CIRM, CLIN-09230). TL disokong oleh persekutuan siswazah daripada Vaincre Les MaladiesLysosomales. AB dan JZ disokong oleh persekutuan daripadacystinosisYayasan Penyelidikan. UCSD Neuroscience MicroscopyShared Facility telah dibiayai oleh geran P30-NS047101 Institut Kecelaruan neurologi dan Strok (NINDS) Kebangsaan.
RUJUKAN
1. Medzhitov R. Asal dan peranan fisiologikeradangan. alam semula jadi. 2008;454:428–435.
2. Donath MY. Penyasarankeradangandalam rawatan diabetes jenis 2. Metab Obes Diabetes. 2013;15(bekalan 3):193–196.
3. Jaffer U, Wade RG, Gourlay T. Sitokin dalam sindrom tindak balas keradangan sistemik: kajian semula. Rawatan Rapi HSR Proc Cardiovasc Anesth. 2010;2:161–175.
4. Pecoits-Filho R, Heimburger O, Barany P, et al. Persatuan antara penanda keradangan yang beredar dan sisa fungsi buah pinggang dalam pesakit CRF. Am Jbuah pinggangDis. 2003;41:1212–1218.
5.Gahl WA, Thoene JG, Schneider JA.Sistinosis. N Engl J Med. 2002;347: 111–121.
6.Cherqui S, Kalatzis V, Trugnan G, Antignac C. Penyasarancystinosinkepada membran lisosom memerlukan isyarat berasaskan tirosin dan motif pengisihan novel. J Biol Chem. 2001;276:13314–13321.
7. Kalatzis V, Cherqui S, Antignac C, Gasnier B.Cystinosin, protein rosak dalamcystinosis, ialah pengangkut sistin lisosom yang dipacu oleh H(). EMBO J. 2001;20:5940–5949.
8. Cherqui S, Courtoy PJ. Sindrom Fanconi buah pinggang dalamcystinosis: pandangan patogenik dan perspektif terapeutik. Nat Rev Nephrol. 2017;13:115–131.
9. Nesterova G, Gahl W. Nefropaticystinosis: komplikasi lewat penyakit multisistemik. Pediatr Nephrol. 2008;23:863–878.
10. Cherqui S, Sevin C, Hamard G, et al. Pengumpulan sistin intralysosomal pada tikus kurangcystinosin, protein rosak dalamcystinosis. Biol Sel Mol. 2002;22:7622–7632.
11. Nevo N, Chol M, Bailleux A, et al. Fenotip buah pinggangcystinosismodel tetikus bergantung kepada latar belakang genetik. Pemindahan Dail Nephrol. 2010;25:1059–1066.
12. Kalatzis V, Serratrice N, Hippert C, et al. Anomali okular dalam acystinosismodel haiwan meniru patogenesis penyakit. Pediatr Res. 2007;62:156–162.
13. Panduan Chevronnay HP, Janssens V, Van Der Smissen P, et al. Model tetikus mencadangkan dua mekanisme untuk perubahan tiroid pada bayicystinosis: penurunan sintesis tiroglobulin disebabkan oleh tekanan retikulum endoplasma/tindak balas protein terungkap dan pemprosesan lisosom terjejas. Endokrinologi. 2015;156:2349–2362.
14. Brodin-Sartorius A, Tete MJ, Niaudet P, et al. Terapi Cysteamine melambatkan perkembangan nefropaticystinosispada akhir remaja dan dewasa.buah pinggangInt. 2012;81:179–189.
15. Terapi Cherqui S. Cysteamine: rawatan untukcystinosis, bukan penawar.buah pinggangInt. 2012;81:127–129.
16. Gahl WA, Balog JZ, Kleta R. Nephropathiccystinosispada orang dewasa: sejarah semula jadi dan kesan terapi cysteamine oral. Ann Intern Med. 2007;147:242–250.
17. Cherqui S, Courtoy PJ. Sindrom Fanconi buah pinggang dalamcystinosis: pandangan patogenik dan perspektif terapeutik. Nat Rev Nephrol. 2017;13:115–131.
18. Napolitano G, Johnson JL, He J, et al. Kemerosotan autophagy yang dimediasi oleh pendamping membawa kepada kecacatan degradasi lisosom terpilih dalam penyakit penyimpanan lisosomcystinosis. EMBO Mol Med. 2015;7:158–174.
19. Andrzejewska Z, Nevo N, Thomas L, et al.Cystinosinialah komponen kompleks H -ATPase-regulator-rag vacuolar yang mengawal sasaran mamalia kompleks rapamycin kompleks 1 isyarat. J Am Soc Nephrol. 2016;27: 1678–1688.
20. Rega LR, Polishchuk E, Montefusco S, et al. Pengaktifan faktor transkripsi EB menyelamatkan keabnormalan lisosom dalam cystinotikbuah pinggangsel.buah pinggangInt. 2016;89:862–873.
21. Dumic J, Dabelic S, Flogel M. Galectin-3: cerita terbuka. Biochim Biophys Acta. 2006;1760:616–635.
22. Sciacchitano S, Lavra L, Morgante A, et al. Galectin-3: satu molekul untuk abjad penyakit, dari A hingga Z. Int J Mol Sci. 2018;19(2).
23. Calvier L, Martinez-Martinez E, Miana M, et al. Kesan perencatan galectin-3 pada kecederaan jantung dan buah pinggang akibat aldosteron. Gagal Jantung JACC. 2015;3:59–67.
24. Frenay AR, Yu L, van der Velde AR, et al. Perencatan farmakologi galectin-3 melindungi daripada nefropati hipertensi. Am J Physiol Fisiol Renal. 2015;308:F500–F509.
25. Kolatsi-Joannou M, Price KL, Winyard PJ, Long DA. Pektin sitrus yang diubah suai mengurangkan ekspresi galektin-3 dan keterukan penyakit dalam akut eksperimenbuah pinggangkecederaan. PloS One. 2011;6:e18683.
26. Martinez-Martinez E, Ibarrola J, Clavier L, et al. Sekatan galectin-3 mengurangkan fibrosis buah pinggang dalam dua model eksperimen normotensif kerosakan buah pinggang. PloS One. 2016;11:e0166272.
27. Nevo N, Thomas L, Chhuon C, et al. Kesan daripadacystinosisglikosilasi pada kestabilan protein oleh pembezaan pelabelan isotop stabil dinamik oleh asid amino dalam kultur sel (SILAC). Proteomik Sel Mol. 2017;16:457–468.
28. Napolitano G, Johnson JL, He J, et al. Kemerosotan autophagy yang dimediasi oleh pendamping membawa kepada kecacatan degradasi lisosom terpilih dalam penyakit penyimpanan lisosomcystinosis. EMBO Mol Med. 2015;7:158–174.
29. Majeski AE, Dadu JF. Mekanisme autophagy pengantara pendamping. Int J Biochem Cell Biol. 2004;36:2435–2444.
30. Xie W, Zhang L, Jiao H, et al. autophagy pengantara pendamping menghalang apoptosis dengan merendahkan BBC3/PUMA. Autophagy. 2015;11:1623–1635.
31. Li X, Ma Q, Wang J, et al. c-Abl dan Arg tyrosine kinase mengawal degradasi lisosom bagi oncoprotein Galectin-3. Kematian Sel Berbeza. 2010;17:1277–1287.
32. Takeuchi H, Tanaka M, Tanaka A, et al. Penguasaan M2-makrofaj terpolarisasi dalam kanser pundi kencing menjejaskan angiogenesis, gred tumor dan invasif. Oncol Lett. 2016;11:3403–3408.
33.Chavez-Galan L, Olleros ML, Vesin D, Garcia I. Lebih banyak daripada makrofaj M1 dan M2, terdapat juga makrofaj CD169( ) dan TCR(). Imunol hadapan. 2015;6:263.
34. Henderson NC, Sethi T. Peraturan bagikeradanganoleh galectin-3. Immunologic Rev. 2009;230:160–171.
35. Deshmane SL, Kremlev S, Amini S, Sawaya BE. Monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1): gambaran keseluruhan. J Interferon Cytokine Res. 2009;29:313–326.
36.Skowyra ML, Schlesinger PH, Naismith TV, Hanson PI. Pencetusan pengambilan jentera ESCRT menggalakkan pembaikan endolisosomal. Sains. 2018;360(6384).
37.MacKinnon AC, Farnworth SL, Hodkinson PS, et al. Peraturan pengaktifan makrofaj alternatif oleh galectin-3. J Immunol. 2008;180: 2650–2658.
38. Sano H, Hsu DK, Yu L, et al. Galektin manusia-3 ialah chemoattractant baru untuk monosit dan makrofaj. J Immunol. 2000;165:2156–2164.
