Apakah Perbezaan Antara Cistanche Tumbuh Liar Dan Cistanche yang Ditanam Secara Buatan Pada Aktiviti Meningkatkan Imuniti

Hubungi: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Zhao Bing; Yang Xiumei; Wu Daocheng; Ba Xueli; Li Quanxiao; Tan Yachao; Zhang Ailian

Abstrak:

Objektif:Untuk membandingkan kesan peningkatan imun daripada cistanche yang tumbuh secara liar dan polisakarida cistanche yang ditanam secara buatan daripada cistanche (selepas itu: masing-masing WCDPS & CCDPS).

Kaedah:Dos yang berbeza (rendah, sederhana, dan tinggi) WCDPS dan CCDPS dan ovalbumin (OVA) telah diimunisasi secara subkutan dengan tikus ICR, IgG antibodi khusus OVA, dan subtipe antibodi IgGl dan IgG2a telah dikesan oleh ELISA, dan dengan kaedah MTT. Aktiviti percambahan limfosit khusus OVA, sitometri aliran untuk mengesan tahap ekspresi CD4 ditambah sel T dan CD8 ditambah sel T.

Keputusan:Kedua-dua WCDPS dan CCDPS boleh meningkatkan tahap ekspresi IgG antibodi khusus OVA dan antibodi menaip IgG1 dan IgG2a (P<0.05), and="" there="" is="" no="" statistically="" significant="" difference="" between="" the="" same="" doses="" of="" wcdps="" and="" ccdps="" (f="">0. 05); WCDPS and CCDPS can significantly promote OVA-specific lymphocyte proliferation, and the difference between the same dose is not statistically significant (P>0.05); WCDPS dan CCDPS juga boleh meningkatkan dengan ketara peratusan CD4 tambah T dan CD8 tambah sel T Sub-kandungan (P<0.05), and="" the="" difference="" between="" the="" same="" dose="" was="" not="" statistically="" significant="" (p="">0.05), WCDPS dan CCDPS tidak mempunyai kesan ke atas berat tikus yang diimunisasi.

Kesimpulan:Kedua-dua WCDSP dan CCDPS boleh meningkatkan dengan ketara tindak balas imun humoral dan selular khusus OVA, dan tidak ada perbezaan yang signifikan secara statistik antara keduanya, dan mereka mempunyai keselamatan yang baik.

Kata kunci: cistanche; polisakarida daripada cistanche; ovalbumin; adjuvant

Cistanche (C. deserticola. YC Ma),juga dikenali sebagai Cunyun dan Dayun, adalah tumbuhan herba parasit dari Lydanaceae selama bertahun-tahun. Ia adalah bahan perubatan Cina yang jarang dan berharga. Bahan utamanya termasuk polisakarida daripada cistanche, sebatian glikosida phenylethanoid Cistanche, Asid organik, alkaloid, dsb.⑷, mempunyai pelbagai fungsi seperti pati berkhasiat dan darah, membantu yang dan menguatkan buah pinggang, dan melegakan penuaan⑸. Disebabkan oleh nilai perubatan cistanche yang sangat tinggi, eksploitasi berlebihan spesies liar berada di ambang kepupusan, dan cistanche yang ditanam secara buatan telah berjaya. Penyelidik di dalam dan luar negara telah melakukan banyak penyelidikan tentang komponen kimia dan bahan aktif cistanche yang tumbuh secara liar dan cistanche yang ditanam secara buatan, tetapi terdapat beberapa laporan mengenai perbandingan polisakarida cistanche liar dan ditanam daripada aktiviti adjuvant cistanche (WCDPS/CCDPS). . Sebilangan besar kajian telah menunjukkan bahawa polisakarida tumbuhan daripada cistanche sebagai adjuvant boleh mengawal tindak balas imun badan. Ramai penyelidik telah menggunakan ubat herba Cina sebagai adjuvant vaksin dan telah mencapai kemajuan yang baik ".

Kajian ini adalah berdasarkan kajian lepas (6) untuk membandingkanmeningkatkan imunaktiviti WCDPS dan CCDPS Xinjiang. Terutamanya melalui eksperimen imunisasi tikus, dos yang berbeza WCDPS dan CCDPS telah diimunisasi secara subkutan dengan OVA dalam tikus ICR, dan kesannya terhadap tahap humoral.imunitidan imuniti selular yang disebabkan oleh OVA selepas imunisasi diuji. Bandingkantumbuh liar cistanchedancistanche yang ditanam secara buatanpolisakarida Aktiviti meningkatkan imun polisakarida dalam sitrus boleh memberikan rujukan untuk pembangunan yang lebih baik dan penggunaan cistanche yang ditanam secara buatan di Xinjiang.

Bahan dan Kaedah

Bahan Eksperimen:

Tumbuhan cistanche secara liar dan cistanche yang ditanam (tersedia secara komersial). Medium kultur RPMI 1640 telah dibeli daripada GIBCO; Serum lembu janin dibeli daripada Israel Bioind; Antibodi sitometri aliran: PE CD3 anti tikus tikus, CD4 anti tikus APC, FITC anti tikus CD8a dibeli daripada syarikat BD Amerika, produk Protein putih telur (Ovalbumin, OVA) Sigma, anti-tikus kambing berlabel lobak pedas peroksida IgG, IgGl, dan IgG2a telah dibeli dari Southbiotech, Amerika Syarikat. Reagen kimia eksperimen yang lain adalah semua reagen analisis domestik.

Haiwan eksperimen:

Tikus ICR betina gred bersih (6-8 minggu, 18-22 g) telah dibeli daripada Pusat Haiwan Eksperimen Universiti Perubatan Xinjiang. Haiwan itu disimpan di dalam bilik haiwan makmal kami, dan eksperimen dimulakan 7 hari selepas haiwan itu disesuaikan.

Penyediaan WCDPS dan CCDPS:

Rujukan [17] menggunakan kaedah pengekstrakan air dan pemendakan alkohol. Langkah-langkah ringkas adalah seperti berikut: Ambil serbuk cistanche liar Xinjiang yang ditanam kering, tambahkan 10 kali ganda isipadu jeli petroleum dan etanol mutlak kepada ultrasonik selama 1 jam; selepas penapisan sedutan, kekalkan sisa ubat dan keringkan, tambahkan 10 kali ganda isipadu air suling 37T Ultrasound dua kali, sentrifugasi pada 4 000 r/min selama 10 minit, gabungkan supernatan, sejat berputar dan pekat, dan mendakan semalaman dengan alkohol; selepas penapisan vakum dan pengeringan, serbuk ekstrak mentah diperolehi; Kaedah Savage ⑻ mengeluarkan protein daripada WCDPS dan CCDPS. Kandungan polisakarida daripada cistanche dalam WCDPS dan CCDPS yang ditentukan oleh kaedah asid bawang-sulfurik masing-masing ialah 76.82 peratus dan 59.58 peratus.

Imunisasi tikus dan pengumpulan serum:

Tikus betina ICR berumur {{0}} minggu telah digunakan sebagai model haiwan eksperimen. Percubaan dibahagikan kepada 9 kumpulan, 5 dalam setiap kumpulan: 0.9 peratus NaCl, OVA 10 jig, OVA-Alum 200 |jLg, OVA-WCDPS 10 |xg, OVA -WCDPS 50 |xg, OVA- WCDPS 100 bersih, OVA-CCDPS 10 |jLg, OVA-CCDPS 50 |xg, OVA-CCDPS 100 bersih. Larutkan dengan 0.9 peratus NaCl sebelum imunisasi, dan imunkan tikus secara subkutan dua kali dengan selang 2 minggu. Darah dikumpul sebelum imunisasi, dan serum-80Y disediakan dan disimpan untuk kegunaan kemudian.

Kesan WCDPS dan CCDPS pada pertumbuhan tikus:

Untuk melihat kesan WCDPS dan CCDPS ke atas pertumbuhan tikus, berat tikus dalam setiap kumpulan ditimbang pada 0 d sebelum imunisasi awal, 14 hari, dan 21 hari selepas imunisasi.

Pengesanan IgG antibodi serum tikus dan menaip selepas imunisasi WCDPS dan CCDPS:

Kaedah ELISA tidak langsung digunakan untuk menentukan antibodi serum. Salut plat ELISA dengan 2.5 jig/ml OVA, 4Y semalaman; dibasuh dengan PBST 3 kali dan kemudian ditambah 5 peratus susu tepung tanpa lemak 37L untuk menyekat selama 1 jam; dibasuh 3 kali dengan PBST, dan menambah antibodi utama kepada tikus selepas imunisasi dalam setiap kumpulan Serum, nisbah pencairan antibodi utama ialah 1: 100, 100 pil setiap telaga, 37Tl h; selepas mencuci 3 kali dengan PBST, tambah antibodi sekunder: IgG anti-tikus kambing, IgGl, IgG2a (l: 5 000) berlabel HRP 37 Inkubasi naga selama 1 jam; selepas mencuci 4 kali dengan PBST, tambah larutan substrat tetramethylbenzidine (TMB) untuk mengelakkan cahaya selama 15 minit. Tambahkan 50 pada setiap perigi untuk menghentikan tindak balas dengan 2 mol/L H2SO4, dan ukur nilai A45O/655. Bandingkan tahap antibodi dalam setiap kumpulan.

Pengesanan percambahan limfosit splenik tikus selepas imunisasi WCDPS dan CCDPS:

Kaedah MTT digunakan untuk mengesan percambahan limfosit dalam limpa tikus yang diimunisasi dengan CCDPS dan WCDPS. Limpa tikus diasingkan di bawah keadaan aseptik 21 hari selepas imunisasi awal dan sel limpa dicairkan dengan medium RPMI 1640 1{15}} peratus FBS yang mengandungi FBS untuk menjadikan sel tunggal Penggantungan, pengiraan dan pelarasan sel(r sel/ml merebak ke dalam 96-plat kultur sel telaga, tambahkan 20 OVA (kepekatan akhir 10 |xg/ml) dan ConA (kepekatan akhir 5 babi/ml) masing-masing Rangsang, tetapkan kawalan sel kosong dan serum kosong kawal pada masa yang sama, masukkan ke dalam inkubator sel 37Y selama 48 jam, tambah 20 MTT pada setiap telaga, 37^ dan teruskan mengeram selama 4 jam, tambah 100|±1 DMSO pada setiap telaga untuk melarutkan dan menguji jantung 0 /63. Nilai, hitung indeks rangsangan (SI) setiap kumpulan tikus.

Ekspresi CD4 dan CD8 pada CD3 ditambah sel T selepas imunisasi WCDPS dan CCDPS:

Sitometri aliran digunakan untuk mengesan ekspresi sel CD4 ditambah T dan CD8*T pada permukaan sel CD3 ditambah T. Limpa tetikus telah diasingkan di bawah keadaan aseptik 21 hari selepas imunisasi utama dan limpa telah dirawat dengan medium RPMI 1640 yang mengandungi 10 peratus FBS. Sediakan penggantungan sel tunggal, kira dan laraskan bilangan sel kepada 1x106 sel/sampel, lakukan pewarnaan CD4 dan CD8 pada permukaan sel T CD3 tambah, lindungi daripada cahaya pada suhu bilik selama 25 minit, dan gunakan 10 ml a larutan penimbal fosfat yang mengandungi 0.5 peratus FBS (larutan penimbal fosfat). saline, PBS) 1 200 r/min 7 min cuci sekali, tambah 250 |jil PBS, lulus 200 mesh copper mesh, flow cytometry untuk mengesan ekspresi CD4 dan CD8 pada permukaan sel CD3*T.

Kaedah statistik:

Perisian Flowjo 7.6 memproses keputusan ujian sitometri aliran; GraphPad Prism 5.0 digunakan untuk analisis data dan semua data adalah berdasarkan min ± sisihan piawai. Gunakan Pelajar dan uji untuk membandingkan data antara kumpulan eksperimen. P<0.05 means="" that="" there="" is="" a="" difference.="" statistical="">

Hasilnya

1. The effect of WCDPS and CCDPS on the growth of mice: After co-immunization with WCDPS and CCDPS and OVA, weigh the weight of the mice (Table 1). There was no statistically significant difference in the bodyweight of mice in each group during the same growth period ( P>0.05).

2. Kesan WCDPS dan CCDPS pada IgG antibodi khusus OVA: WCDPS dan CCDPS telah diimunisasi secara subkutan dengan OVA untuk mengesan ekspresi IgG antibodi khusus OVA dalam serum selepas 14 hari dan 21 hari imunisasi. Keputusan ditunjukkan dalam Rajah 1, WCDPS dan CCDPS mempromosikan ekspresi antibodi IgG dalam serum dalam cara yang bergantung kepada dos; OVA tambah WCDPS 50 p,g berbanding dengan OVA tambah CCDPS 50 |xg boleh menggalakkan antibodi khusus OVA dengan ketara berbanding dengan OVA tambah CCDPS 50 |xg. Ekspresi IgG (F<0.05), but="" the="" difference="" was="" not="" statistically="" significant="" compared="" with="" the="" aluminum="" adjuvant="" group="" (p="">0.05); the difference between WCDPS and CCDPS at the same dose was not statistically significant (P>0.05).

3. Kesan WCDPS dan CCDPS pada penaipan antibodi khusus OVA: 21 hari selepas imunisasi, ekspresi menaip antibodi spesifik OVA IgG1 dan IgG2a dalam serum telah dikesan. Keputusan ditunjukkan dalam Rajah 2. OVA-WCDPS 50 jig dan OVA-WCDPS 100 |xg Mumu dengan ketara mempromosikan ekspresi antibodi IgG2a dalam serum berbanding kumpulan OVA sahaja (P<0.05); both="" ova-wcdps="" 50="" and="" ova-ccdps="" 50="" pigs="" could="" significantly="" promote="" the="" expression="" of="" ova-specific="" antibody="" iggl=""><0. 001);="" compared="" with="" ova-wcdps="" 50="" p,g,="" and="" ova-wcdps="" 100="" jig,="" the="" aluminum="" adjuvant="" group="" can="" significantly="" promote="" the="" expression="" of="" antibody="" igg2a=""><0.05); the="" expression="" of="" antibody="" typing="" is="" different="" between="" wcdps="" and="" ccdps="" at="" the="" same="" dose="" no="" statistical="" significance="" (p="">0.05).

4. Kesan WCDPS dan CCDPS pada percambahan limfosit khusus OVA tetikus: Untuk mengesan kesan WCDPS dan CCDPS pada limfosit splenik, polisakarida daripada cistanche telah diimunisasi secara subkutan dengan OVA, dan sel limpa dipisahkan 21 hari selepas imunisasi , dan kaedah MTT digunakan untuk mengesannya Menggalakkan percambahan limfosit khusus OVA. Keputusan ditunjukkan dalam Rajah 3. WCDPS dan CCDPS meningkatkan percambahan limfosit khusus OVA dalam cara yang bergantung kepada dos. Gabungan WCDPS dan CCDPS dengan kumpulan OVA boleh menggalakkan percambahan limfosit khusus OVA dengan ketara berbanding dengan kumpulan OVA sahaja. Pembiakan limfosit (P<0.05); ova-wcdps="" 50="" jig="" and="" ova-ccdps="" 50="" |xg="" compared="" with="" an="" aluminum="" adjuvant="" group="" can="" significantly="" promote="" ova-specific="" lymphocyte="" proliferation=""><0.05); the="" same="" dose="" of="" wcdps="" there="" was="" no="" statistically="" significant="" difference="" between="" ccdps="" and="" ccdps="" (p="">0.05).

5. Kesan WCDPS dan CCDPS pada CD3 tambah CD4 tambah T dan CD3 tambah CD8 tambah sel T: 21 hari selepas WCDPS dan CCDPS diimunisasi secara subkutan dengan OVA, ekspresi CD4 dan CD8 dalam CD3 tambah sel T telah dikesan oleh sitometri aliran. , seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 4A Ditunjukkan bahawa OVA-WCDPS 50, OVA-CCDPS 50 jig dan OVA-WCDPS 100 boleh menggalakkan pembiakan CD3 tambah CD4 tambah sel T dengan ketara (P<0.05); as="" shown="" in="" figure="" 4b,="" ova-wcdps="" 10="" a,="" ova-wcdps="" 50="" zhao="" significantly="" promotes="" the="" proliferation="" of="" cd3+cd8+="" t="" cells=""><0.05), ova-wcdps="" 100="" |xg,="" ova-ccdps="" 100="" significantly="" promotes="" the="" proliferation="" of="" cd3+cd8+="" t="" cells=""><0.01); but="" the="" same="" dose="" there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" wcdps="" and="" ccdps="" (p="">0.05); there was no significant difference between WCDPS and CCDPS and OVA compared with an aluminum adjuvant group (P>0.05).

Perbincangan

Banyak kajian telah menunjukkan bahawa ubat herba Cina mempunyai fungsi imunomodulator "Da], dan terdapat juga sejumlah besar laporan yang membuktikan bahawa polisakarida perubatan herba Cina daripada cistanche boleh digunakan sebagai bahan tambahan untuk meningkatkan kesan imunisasi vaksin"3], dan daging gurun Xinjiang dari Congrong yang dipilih dalam kajian ini adalah bahan perubatan yang unik di Xinjiang, dan spesies liar berada di ambang kepupusan, digabungkan dengan nilai perubatan yang lebih tinggi, penanaman spesies yang ditanam adalah sangat penting untuk pembangunan dan penggunaan sumber tumbuhan ubatan . Vaksin baru di pasaran semasa mempunyai kekhususan antigen yang baik, tetapi imunogenisiti yang lemah. Polisakarida tumbuhan daripada cistanche boleh menampung kekurangan ini. negara saya mempunyai kelebihan yang besar dalam penyelidikan perubatan herba Cina. Kami menyaring adjuvant vaksin daripada ubat herba Cina semulajadi. Kebolehlaksanaan yang tinggi. Kajian telah menunjukkan bahawa polisakarida herba Cina daripada cistanche mempunyai tahap peraturan yang berbeza-beza mengenai imuniti khusus dan imuniti bukan spesifik, seperti polisakarida Ganoderma daripada cistanche, polisakarida Radixisatidis daripada cistanche, polisakarida Poria cocos daripada cistanche koji, polisakarida inulin daripada cistanche], dsb. Boleh meningkatkan kesan imunisasi vaksin.

Disebabkan oleh peningkatan pesat dalam permintaan untuk cistanche, spesies liarnya telah pupus dilombong dan kini disenaraikan sebagai tumbuhan terancam dan dilindungi di negara saya. Berdasarkan kejayaan penanaman buatan padang pasir Caulis Carlsbad, spesies yang ditanam dijangka menggantikan spesies liar. Dalam eksperimen ini, cistanche yang ditanam secara liar dan polysaccharides cistanche yang ditanam tiruan telah digunakan sebagai adjuvant OVA untuk menjalankan eksperimen imunisasi tikus in vivo. Dengan menguji pelbagai penunjuk, kesan imuniti cistanche liar dan ditanam pada awalnya dinilai, yang memberikan rujukan untuk penggunaan berkesan cistanche yang ditanam di Xinjiang.

Untuk memahami keselamatan cistanche tumbuh liar dan ditanam secara buatansakarida cistanchedari cistanche, eksperimen imunisasi haiwan in vivo telah memerhatikan ciri-ciri penampilan tikus dan mendapati bahawa tikus tidak mempunyai cirit-birit, rambut tegang, atau koyakan selepas imunisasi, dan aktiviti dan pernafasan mereka adalah normal, dan tiada otot berkedut. Tiada perbezaan ketara dalam berat badan tikus dalam setiap kumpulan disebabkan fenomena gangguan, menunjukkan bahawa imunisasi WCDPS dan CCDPS tidak menjejaskan pertumbuhan tikus dan mempunyai tahap keselamatan tertentu. IgG antibodi dan keputusan ujian menaip menunjukkan: WCDPS dan CCDPS boleh meningkatkan dengan ketara ekspresi IgG antibodi khusus OVA selepas imunisasi bersama dengan OVA, dan kesannya bersamaan dengan bahan pembantu aluminium; ia boleh meningkatkan dengan ketara ekspresi antibodi jenis IgG2a dan IgGl khusus OVA, Ia menunjukkan bahawa polisakarida daripada cistanche meningkatkan tindak balas imun Th1 dan Th2 pada masa yang sama, dan tidak terdapat perbezaan yang ketara antara WCDPS dan CCDPS. Keputusan penaip antibodi IgG2a mendapati bahawa kumpulan imunisasi bersama WCDPS dan CCDPS dan OVA boleh meningkatkan ekspresi IgG2a dengan ketara berbanding dengan kumpulan adjuvant aluminium, adjuvant aluminium lebih lemah dalam mempromosikan ekspresi sel T, yang membuktikan bahawa WCDPS dan CCDPS digunakan. sebagai adjuvan Keupayaan untuk menggalakkan imuniti selular adalah jauh lebih tinggi daripada adjuvan aluminium.

Keputusan pengesanan pembiakan limfosit melalui kaedah MTT menunjukkan sel-sel limpa tikus dalam setiap kumpulan telah dirangsang oleh OVA. Indeks rangsangan (SI) percambahan limfosit dalam WCDPS dan CCDPS digabungkan dengan OVA adalah jauh lebih tinggi daripada dalam kumpulan imunisasi OVA sahaja. OVA- Indeks rangsangan kumpulan jig WCDPS 50 Ah dan OVA-CCDPS 50 adalah jauh lebih tinggi daripada kumpulan adjuvant aluminium; ia menunjukkan bahawa WCDPS dan CCDPS digabungkan dengan kumpulan OVA boleh meningkatkan dengan ketara percambahan limfosit khusus OVA berbanding dengan kumpulan OVA dan kumpulan adjuvant aluminium.

Terdapat beberapa subkumpulan limfosit T yang berbeza. CD3 ialah molekul permukaan semua limfosit T. Mengikut fenotip yang berbeza, mereka boleh dibahagikan kepada sel T CD8 ditambah dan sel T CD4. Molekul CD4 plus boleh dibentuk di bawah tindakan molekul MHC fl, yang digunakan terutamanya sebagai sel penolong (Th) selepas pengaktifan. Molekul CD8 plus perlu dibentuk di bawah tindakan molekul MHC I. Selepas pengaktifan, mereka menjadi sel pembunuh (TC atau CTL), yang memainkan peranan penting dalam imuniti terhadap jangkitan virus dan imuniti tumor. 3". Sitometri aliran mengesan CD3PD4 ditambah T dan CD3 ditambah CD8 ditambah ekspresi sel T, keputusan menunjukkan bahawa WCDPS dan CCDPS boleh menggalakkan percambahan sel CD4 tambah T dan CD8 tambah T dengan ketara dalam julat dos tertentu, dan tidak ada yang ketara. perbezaan antara WCDPS dan CCDPS pada dos yang sama. Gabungan CCDPS dan OVA boleh merangsang ekspresi CD3 tambah CD4 tambah T dan CD3 tambah CD8 tambah sel T, dan kedua-dua kesan adalah setara.

Ringkasnya, WCDPS dan CCDPS selamat sebagai adjuvant. Selepas diimunisasi dengan OVA, mereka boleh meningkatkan imuniti humoral khusus dan imuniti selular secara serentak. Berbanding dengan bahan pembantu aluminium, WCDPS dan CCDPS mempunyai kesan yang lebih baik pada peningkatan imuniti selular, dan tiada perbezaan dalam kesan peningkatan dua polisakarida daripada cistanche. Hasil penyelidikan ini menyediakan rujukan bahan untuk polisakarida cistanche yang ditanam secara buatan Xinjiang daripada cistanche sebagai bahan tambahan dan juga menyediakan asas bahan untuk menyaring bahan bantu imun yang selamat dan cekap dari gurun Xinjiang.cistanche.

Rujukan

[1] Zhao X, Sun W, Zhang S, et al. Tindak balas adjuvant imun polisakarida daripada Atractylodis macrocephalus Koidz dalam ayam yang divaksinasi terhadap penyakit Newcastle (ND) [J]. Karbohidr Polim, 2016, 190-196. DOI: 10. 1016/j. karbo pop. 2016. 01.033.

[2]Li J, Wang X, Wang W, et al. Ekstrak air ferulate Pleurotus meningkatkan kematangan dan fungsi sel dendritik yang berasal dari sumsum tulang murine melalui laluan isyarat TLR4 [J]. Vaksin, 2015, 33(16) : 1923-1933. DOI: 10.1016/j. vaksin.2015.02. 063.

[3]Zhao H, Luo Y, Lu C, et al. Tindak balas imun mukosa enterik mungkin mencetuskan aktiviti imunomodulasi polisakarida Ganoderma pada tikus [J]. Planta Med, 2010, 76(3): 223-227. DOI: 10. 1055/S-0029-1186055.