Pesakit Pembedahan Vaskular Dengan Nisbah Neutrofil-ke-limfosit yang Tinggi Telah Mengurangkan Neutrofil Pelengkap Ekspresi RNA

Nisbah neutrofil-ke-limfosit (NLR) yang tinggi pada pesakit yang menjalani pembedahan vaskular elektif (EVS) telah meningkatkan kematian tanpa bergantung kepada hasil pembedahan perioperatif. Untuk memahami mengapa NLR tinggi dikaitkan dengan kematian yang lebih tinggi, kami menyiasat ekspresi transkriptom neutrofil dan limfosit pada pesakit yang menjalani EVS. Sampel darah dikumpulkan daripada pesakit yang menjalani EVS dan penderma yang sihat untuk pengiraan NLR. Sampel RNA telah diasingkan daripada neutrofil dan limfosit pesakit dan dibahagikan kepada NLR_Rendah (<3) and NLR_High (≥3) groups (n = 6 each). Paired samples with the highest RNA integrity number (mean = 9.8 ± 0.4) were sequenced and analyzed for differential expression. Normalized data were inputted for downstream analysis using iPathwayGuide (AdvaitaBio) and gene set enrichment analysis using GenePattern and MSigDB (Broad Institute). There was no clinical difference between the patient groups about clinical diagnosis, age, sex, history of hypertension, lipid abnormalities, diabetes mellitus, smoking, or statin use. The mean NLR was 4.37 ± 0.27 SEM in the NLR_High and 1.88 ± 0.16 for the NLR_Low groups. Significantly differentially expressed gene sets identified in the RNA sequence data were enriched highly (P = 1E-24) in the humoral immunity and complement systems. Neutrophils from NLR_High patients downregulated complement genes (C1QA, C1QB, C1QC, C1S, C2, CR2, C3AR1, C3, C8G, and C9 and complement regulatory genes CD59, SERPING1, C4BPA, CFH, and CFI). Downregulation of gene expressions of humoral immunity and complement within the neutrophils are associated with elevated NLR. It remains to be determined whether and how these changes contribute to increased late mortality previously observed in patients undergoing EVS.

manfaat cistanche untuk lelaki-menguatkan sistem imun

pengenalan

Penyakit kardiovaskular (CVD) adalah punca utama kematian di seluruh dunia. Sebahagian besarnya disebabkan oleh aterogenesis dan aterosklerosis yang, sebagai tambahan kepada genetik dan diet individu, dimediasi oleh mekanisme keradangan dan imun.1-3 Baru-baru ini, kiraan leukosit pembezaan (neutrofil dan limfosit) telah menjadi tumpuan. untuk meramalkan hasil kardiovaskular (CV). Nisbah kiraan neutrofil-kepada-limfosit mutlak (NLR) telah diiktiraf sebagai peramal jumlah kematian dalam berbilang kajian kecil intervensi koronari akut,4-6 hipertensi,7,8, dan kegagalan jantung.9

Jadual 1. Ciri-ciri klinikal pesakit pembedahan vaskular elektif yang diperiksa oleh RNA-seq

Siasatan terdahulu juga menunjukkan bahawa NLR ialah peramal hasil jangka panjang pada pesakit dengan penyakit vaskular periferi.10-13 Kajian retrospektif kami terhadap populasi pesakit pembedahan vaskular menyokong kesimpulan ini. Dalam 1 kajian ke atas 108 pesakit dengan pembaikan aneurisma aorta abdomen endovaskular elektif, tiada perbezaan dalam 30-kematian selepas pembedahan hari antara NLR<4 and an NLR of >4 (P = .507). However, the 1-year, 3-year, and 5-year mortality between the groups were 4.2% vs 28.1%, 15.1% vs 64.9%, and 24% vs 90%, respectively.14 In a second study of 290 asymptomatic patients undergoing prophylactic carotid endarterectomy, the risk for stroke was noted to be significantly higher (P < .0001) in patients with an NLR of >3 (n=116 pesakit, 42.6% risiko strok) berbanding mereka yang mempunyai NLR sebanyak<3 (n = 174 patients, 9.3% stroke risk).15 In a third study with 488 patients who underwent percutaneous interventions of femoropopliteal arteries, the 30-day mortality rates increased significantly (P = .005) with increasing NLR (1.4%, 4.3%, and 7.0% for low [<3], mid [3-4], and high [>4] kumpulan NLR, masing-masing).16 Pesakit dengan NLR praoperasi yang lebih rendah mencapai kelangsungan hidup bebas amputasi yang lebih besar pada 4-tahun susulan (NLR rendah 65.5%, NLR pertengahan, 37.5% dan NLR tinggi, 17.6 % [P < .0001]).16

Dalam kajian ini, kami melakukan penjujukan RNA (RNA-seq) neutrofil dan limfosit daripada pesakit yang layak untuk pembaikan pembedahan vaskular elektif (EVS) untuk menentukan mekanisme berpotensi untuk peningkatan NLR. Kajian mengkaji sama ada terdapat asas molekul untuk NLR tinggi. Penyiasatan kami mendedahkan bahawa pesakit dengan NLR tinggi yang mempunyai pembaikan EVS dibezakan oleh pengurangan kawalan imunoglobulin yang sangat ketara dan pelengkap gen dalam neutrofil.

manfaat cistanche-menguatkan sistem imun

Kaedah

Pesakit

Blood samples were collected from candidate patients for EVS procedures and healthy volunteers for NLR calculation and RNA sequence studies of neutrophils and lymphocytes. In screening patients for participation, any individual with an active local or systemic infection or obvious inflammatory disease was excluded from participation. Peripheral blood collection was approved by the institutional review board of University Hospitals Cleveland Medical Center (#01-06-02). Informed consent was obtained from each patient and healthy volunteer. All patients for EVS seen in the outpatient department were eligible. Patients in the study were characterized for the type of vascular surgery, age, sex, hypertension (blood pressure >130/80 mm Hg), diabetes mellitus (fasting blood glucose >100 mg/dL), status merokok, rawatan statin, sejarah perubatan penyakit pulmonari obstruktif kronik, kanser, penyakit buah pinggang kronik, penyakit arteri koronari (CAD), penyakit arteri periferal, penyakit serebrovaskular dan kegagalan jantung kronik. Semua pesakit mempunyai kiraan darah lengkap dengan kiraan sel darah putih yang berbeza. Pesakit dibahagikan kepada NLR rendah (NLR_Rendah [<3]) and high NLR (NLR_High [≥3]) groups (n = 6 each) and healthy volunteers aged 18 to 71 years (n = 6). Eleven of 12 patients' blood was drawn before surgery. One patient had blood drawn 4 months after surgery. 

Pemisahan darah

Darah keseluruhan (20 mL setiap pesakit) dikumpulkan dalam 10 mL tiub vacutainer antikoagulasi dengan EDTA, dan darah dipisahkan dalam masa sejam selepas pengumpulan. Populasi sel neutrofil dan limfosit masing-masing diasingkan daripada 8 mL darah menggunakan kit pengasingan sel manusia langsung EasySep (STEMCELL Technologies, Vancouver, Kanada) dan magnet Big EasySep (STEMCELL Technologies, Vancouver, Kanada) mengikut protokol pengeluar. Magnet telah disejukkan pada ais sebelum ini, dan sel darah dan reagen dicampur perlahan-lahan dengan menyongsangkan tiub berbanding dengan pemipetan. Nisbah reagen juga diselaraskan mengikut cara berikut untuk mengoptimumkan pemulihan: 400 mL campuran antibodi, 400 mL manik magnetik, dan 4 mL garam penampan fosfat ditambah ke dalam darah sebelum pemisahan pertama, diikuti dengan 200 mL antibodi. campuran dan 400 mL manik sebelum pengasingan kedua dan 200 mL manik sebelum pengasingan ketiga dan terakhir. Aliquot kecil 200 mL telah diambil daripada volum pemulihan akhir untuk pengiraan sel dan penyediaan slaid. Baki isipadu pemulihan telah disentrifugasi pada 1000 pusingan seminit selama 7 minit untuk pellet sel.

Rajah 1. Seluruh transkrip RNA daripada neutrofil dan limfosit yang dikumpul daripada pesakit dengan NLR, tinggi (NLR_Tinggi), rendah (NLR_Rendah) atau kawalan (NLR_Kawalan) . Kod huruf "N" atau "L" dalam nama sampel bermakna sama ada neutrofil atau limfosit adalah sumber RNA. Terdapat 6 pesakit dalam setiap kategori. Biru=tahap ungkapan berkurangan; merah=tahap ekspresi tinggi.

Pengiraan sel dan penyediaan slaid

Sel-sel yang digantung semula dalam salin penampan fosfat diasingkan lagi, dicampur dengan biru trypan, dan dikira secara manual menggunakan hemositometer. Biasanya, 9 × 106 hingga 15 × 106 neutrofil dan 3 × 106 hingga 10 × 106 limfosit telah diasingkan bagi setiap sampel. Slaid sel terpencil disediakan menggunakan cytocentrifuge, dipusing pada 600 putaran seminit selama 3 minit, dan kemudian diwarnakan dengan pewarnaan Wright-Giemsa. Ketulenan setiap populasi sel ditentukan oleh pengiraan manual, di mana sekurang-kurangnya 1000 sel dibezakan setiap slaid. Purata ketulenan pemisahan neutrofil dan limfosit dengan pengiraan sel masing-masing adalah 98.3% dan 96.2%. Sitometri aliran dilakukan pada 1 pasangan sampel neutrofil dan limfosit dan menunjukkan ketulenan 90.6% dan 92.2%. Sel-sel lain dalam penyediaan neutrofil dipecahkan kepada limfosit (4%), monosit (2%), eosinofil (2.3%), dan basofil (0.3%). Dalam penyediaan limfosit, sel-sel lain adalah neutrofil (1.2%), monosit (1.4%), eosinofil (1.2%), dan basofil (1.8%). Data RNA-seq pukal daripada semua sampel individu juga digunakan untuk menentukan tahap pencemaran monosit dalam persediaan sel dengan menentukan sama ada neutrofil atau limfosit daripada NLR_Tinggi atau NLR_Sampel rendah telah meningkatkan CD14 dengan ketara. , CD68, CD83 atau CD163. Secara bebas, data RNA-seq dimasukkan untuk menganggarkan bahagian sel imun dan kanser (EPIC), sebuah program yang direka untuk menganggarkan bahagian sel imun dan kanser dalam data ekspresi gen pukal.17 Profil rujukan yang digunakan disediakan oleh EPIC untuk sel imun yang mengedarkan darah dan mengandungi profil untuk sel B, sel T CD4 dan CD8, monosit, neutrofil dan sel pembunuh semulajadi. Output yang dilaporkan diberikan sebagai pecahan sel setiap sampel.

Rajah 2. Gen yang dinyatakan secara ketara berbeza daripada neutrofil dan limfosit. (A) Bilangan gen yang dinyatakan secara ketara dalam neutrofil (biru) dan limfosit (oren). (B) Plot analisis komponen utama bagi gen yang dinyatakan secara ketara berbeza dalam neutrofil (hijau dan ungu) dan limfosit (merah dan biru) dalam NLR_Tinggi (bulatan) dan NLR_Rendah (segi empat). (C) Peta haba bagi gen yang dinyatakan secara ketara berbeza daripada NLR_Tinggi vs NLR_RNA neutrofil rendah. (D) Peta haba bagi gen yang dinyatakan secara ketara berbeza daripada NLR_Tinggi vs NLR_RNA limfosit rendah.

RNA-seq dan analisis statistik

Kaedah terperinci untuk pengekstrakan dan penjujukan RNA dibentangkan dalam Kaedah tambahan. Bacaan jujukan telah dinilai untuk kualiti, dan penyesuai telah dipangkas menggunakan TrimGalore! (Babraham Institute), skrip pembalut untuk FastQC dan CutAdapt. Bacaan yang lulus kawalan kualiti diselaraskan dengan genom rujukan manusia GRCh38 menggunakan perisian penjajar STAR. Bacaan sejajar telah diproses menggunakan Cufflinks versi 2.2.1 untuk analisis ekspresi pembezaan menggunakan anotasi gen GENCODE untuk GRCh38 dan data ekspresi peringkat gen telah dilaporkan dalam serpihan setiap transkrip kilobase setiap juta bacaan yang dipetakan.18 Gen yang dinyatakan secara ketara telah dikenal pasti menggunakan palsu. pemotongan kadar penemuan nilai P bagi<.05, after the Benjamini-Hochberg correction for multiple testing. Normalized fold-change and P values for all expressed genes were then used as input for downstream analysis using iPathwayGuide (AdvaitaBio) and gene set enrichment analysis (GSEA) using GenePattern and MSigDB (Broad Institute). Additional figures including heat maps and scatterplots were generated in R and ClustVis.

Keputusan

Ciri-ciri pesakit

Enam pasangan sampel pesakit telah dipilih daripada 7 NLR_Tinggi dan 9 NLR_Rendah berdasarkan kualiti tertinggi RNA dalam pasangan seperti yang dinilai oleh nombor integriti RNA (RIN) (Jadual 1 ). Enam kawalan daripada 8 penderma yang sihat juga telah diperiksa. Dalam pesakit yang dimasukkan dalam kajian, min ± sisihan piawai NLR untuk NLR_Tinggi ialah 4.37 ± 0.66 berbanding untuk NLR_Rendah, 1.87 ± 0. 39 (P < .0001). Purata ± sisihan piawai umur pesakit ialah 61.0 ± 17.0 tahun untuk NLR_Tinggi dan 64.5 ± 7.5 tahun untuk NLR_Rendah (P= .68). Semua kecuali 1 pesakit mempunyai penyakit aneurisma aorta, 9 adalah toraks/thoracoabdominal, dan 2 adalah perut. Kedua-dua pesakit dengan aneurisme aorta abdomen berada dalam kumpulan_NLR Rendah. Sebelas daripada 12 pesakit mempunyai sejarah hipertensi. Empat daripada 6 pesakit dalam kedua-dua kumpulan NLR_Tinggi atau NLR_rendah mempunyai sejarah perubatan keabnormalan lipid. Empat pesakit dalam NLR_Tinggi dan 3 pesakit dalam NLR_Kumpulan rendah adalah bekas perokok. Seorang pesakit dalam kumpulan rendah_NLR ialah seorang perokok aktif. Lima pesakit dalam NLR_Tinggi dan 4 dalam NLR_Kumpulan rendah menggunakan statin. Hanya 3 pesakit dalam kedua-dua kumpulan menghidap diabetes. Seorang pesakit dalam setiap kumpulan mempunyai sejarah CAD dan 2 pesakit dalam NLR_Kumpulan rendah mempunyai penyakit arteri periferal.

Rajah 3. Data RNA-seq dalam penyiasatan ini digunakan sebagai cara bebas untuk menentukan pencemaran sel lain dalam persediaan neutrofil dan limfosit. Hanya data daripada neutrofil ditunjukkan. Analisis EPIC telah dilakukan untuk menganggarkan bahagian sel imun dan kanser dalam data ekspresi gen pukal. Analisis ini menghasilkan peratusan neutrofil, monosit, sel B, sel T CD4, sel T CD8, sel pembunuh semulajadi (NK) dan sel lain dalam penyediaan neutrofil.

Transkriptom keseluruhan

Kami melihat perbezaan global dalam keseluruhan transkrip apabila membandingkan profil ekspresi gen antara neutrofil dan limfosit (Rajah 1). Penemuan ini tidak menghairankan kerana ekspresi gen khusus jenis sel sebelum ini telah dicirikan sebagai berbeza.19 Dalam bahagian neutrofil, merentas pesakit dalam NLR_Tinggi, NLR_Rendah dan NLR{{ 4}}Kumpulan kawalan, terdapat banyak gen yang dikawal selia yang jelas tidak dikawal dalam bahagian limfosit dan sebaliknya. Pada keseluruhan tahap transkrip, perbezaan khusus sel antara neutrofil dan limfosit adalah berbeza dan dominan tanpa mengira NLR atau sama ada pesakit atau kawalan. Namun, apabila diteliti lebih dekat, perbezaan mula kelihatan. Plot analisis komponen utama menunjukkan bahawa NLR_Kawalan untuk sama ada neutrofil atau limfosit bertindih dengan NLR_Tinggi dan NLR_Rendah dalam kedua-dua sel (Tambahan Rajah 1). Penyiasatan seterusnya cuba mencari perbezaan tambahan antara kumpulan NLR_Tinggi dan NLR_rendah dalam gen yang dinyatakan secara ketara berbeza. Telah diperhatikan bahawa 900 (74.5%) gen yang dinyatakan secara ketara telah diperhatikan dalam neutrofil dalam NLR_Tinggi vs NLR_Kumpulan rendah (Rajah 2A). Sebagai perbandingan, limfosit hanya mempunyai 190 (15.7%) gen yang dinyatakan dengan ketara berbeza. Plot analisis komponen utama NLR_Gen tinggi lwn NLR_Gen rendah dalam neutrofil dan limfosit mendedahkan bahawa kumpulan NLR_Tinggi lwn NLR_Gen rendah dalam neutrofil diasingkan kepada 2 kawasan yang berbeza, manakala gen limfosit rendah NLR_Tinggi dan NLR_rendah bertindih (Rajah 2B). Sekali lagi, seperti pada keseluruhan data transkrip, NLR_Kawalan bertindih dengan NRL_Tinggi dan NLR_Gen yang dinyatakan secara berbeza dengan ketara dalam kedua-dua neutrofil dan limfosit (Tambahan Rajah 2). Kebanyakan gen yang dinyatakan secara ketara berbeza dalam NLR_Tinggi neutrofil telah dikurangkan daripada NLR_Rendah (Rajah 2C). Bilangan gen yang serupa tetapi jauh lebih rendah telah dikurangkan dalam NLR_Tinggi limfosit berbanding neutrofil (Rajah 2D). Data ini mencadangkan bahawa tahap NLR kebanyakannya dikaitkan dengan ekspresi gen yang diubah dalam neutrofil. Tambahan pula, ia perlu dibandingkan dengan pesakit daripada kumpulan penyakitnya NLR_Rendah, bukan NLR-Control, kerana kumpulan dahulu jelas dipisahkan daripada NLR_Tinggi tetapi bukan NLR_Kawalan ( Rajah 2B; Rajah tambahan 2).

cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun

Sebelum menyiasat ekspresi pembezaan gen dan pengayaan set gen, kajian tambahan mencirikan tahap pencemaran monosit dalam penyediaan neutrofil. Menggunakan data RNA-seq, kami memerhatikan bahawa ekspresi penanda monosit CD14, CD68, CD83 dan CD163 dalam NLR_Tinggi vs NLR_Sediaan neutrofil atau limfosit rendah tidak jauh berbeza. Analisis EPIC bagi data RNA-seq neutrofil menunjukkan bahawa sel bukan imun ("sel lain") dan sel CD4 T adalah bahan cemar utama dalam persediaan neutrofil (Rajah 3). Kecuali untuk NLR{{10}}sel T CD4 rendah dan sel B, tiada sel pencemar lain yang berbeza dengan ketara dalam NLR_Neutrofil rendah berbanding NLR_Neutrofil tinggi . Dalam penyediaan neutrofil, pencemaran monosit oleh analisis EPIC hanyalah 0.17% ± 0.05% untuk NLR_Rendah berbanding 0.1% ± 0.033% untuk NLR_persediaan tinggi (P=.12). Nilai ini menunjukkan bahawa pencemaran monosit adalah susunan magnitud yang lebih rendah apabila ditentukan oleh analisis data RNA-seq vs sitometri aliran.

Rajah 4. Plot gelembung taburan kategori set gen GO yang dinyatakan dengan ketara untuk proses biologi antara NLR_Tinggi dan NLR_Rendah. Nisbah k: K pada absis ialah bilangan gen yang dinyatakan secara ketara berbeza (k) berbanding dengan jumlah bilangan gen dalam kategori (K). Ordinat ialah kepentingan pengayaan yang dinyatakan sebagai log (nilai P). (A) Set gen GO yang diperoleh daripada neutrofil RNA-seq yang membandingkan NLR_Tinggi ke NLR_Rendah. ( B ) Set gen GO yang diperoleh daripada RNA-seq limfosit. Set gen di sudut kiri bawah kedua-dua plot adalah yang paling tidak ketara. Set gen di sudut kanan atas kedua-dua plot adalah yang paling penting.

Rajah 4 (bersambung)

Untuk mengkaji sifat gen yang dinyatakan secara berbeza, kami melakukan kategori GSEA dengan Gene Ontology (GO) untuk proses biologi menggunakan set gen yang dinyatakan secara ketara berbeza antara NLR_Tinggi dan NLR_Rendah. Hasilnya ditunjukkan dalam plot gelembung serakan (Rajah 4). Pengasingan set gen ke bahagian atas sebelah kanan setiap plot menunjukkan (1) peratusan tinggi gen dalam set gen yang berubah dengan ketara dan (2) tahap kepentingan yang tinggi untuk pengayaan set gen. Dalam sampel kami, plot gelembung taburan menunjukkan pengayaan kedua-dua kategori GO tindak balas pelengkap dan humoral secara bebas untuk kedua-dua neutrofil dan limfosit. Dalam neutrofil, set gen untuk laluan klasik pengaktifan pelengkap, pengawalan lata pengaktifan protein, dan tindak balas imun humoral yang dimediasi oleh imunoglobulin yang beredar adalah yang paling ketara dengan peratusan tertinggi ahli set gen berubah dengan ketara (Rajah 4A). Secara bebas, set gen yang sama dalam limfosit juga diperhatikan mempunyai nisbah gen yang berubah dengan ketara dan tahap kepentingan seperti dalam kajian neutrofil (Rajah 4B).

Jadual 2. Set gen imunologi dalam neutrofil dan limfosit

Jadual 2 menyenaraikan set gen imunologi yang paling ketara berubah dalam neutrofil (Jadual 2, Panel A) dan limfosit (Jadual 2, Panel B). Kajian ini membandingkan ekspresi gen dalam neutrofil atau limfosit antara NLR_Sampel tinggi dan NLR_Sampel rendah. NLR sihat_Sampel kawalan tidak dibandingkan kerana tahap ekspresinya bertindih dengan NLR_Tinggi dan NLR_Sampel pesakit rendah dalam kedua-dua keseluruhan transkrip dan set gen yang dinyatakan secara ketara berbeza. Selain itu, sampel Kawalan NLR_yang sihat tidak dipadankan dengan umur, penyakit dan keadaan pembedahan (Tambahan Rajah 1 dan 2). Dalam kedua-dua neutrofil (Jadual 2) dan limfosit (Jadual 2), data menunjukkan bahawa ekspresi set gen yang berkaitan dengan sistem imun adalah berbeza dengan ketara apabila NLR_Tinggi dibandingkan dengan NLR_Rendah . Pada RNA seq, setiap jenis sel mempunyai penemuan yang sama seperti jenis sel yang lain. Dalam kedua-dua panel, tahap kepentingan set gen utama dimaksimumkan pada P <1E-24. Data ini sangat penting tanpa mengira sama ada neutrofil atau limfosit telah diperiksa. Untuk memberi tumpuan kepada kawasan kandungan yang sangat penting dalam penyiasatan RNA-seq ini, ekspresi gen imunoglobulin yang dinyatakan secara signifikan telah diperiksa. Mula-mula, plot analisis komponen utama gen neutrofil menunjukkan bahawa untuk NLR_Tinggi vs NLR_Rendah, gen imunoglobulin yang dinyatakan secara ketara telah diasingkan kepada 2 kumpulan (Tambahan Rajah 3A). Sebagai alternatif, gen limfosit NLR_Tinggi vs NLR_Low over lapped (tambahan Rajah 3A). Seterusnya, peta haba gabungan ekspresi gen berkaitan imun antara NLR_Tinggi dengan NLR_Rendah dibandingkan dalam neutrofil dan limfosit (Rajah 5). Secara keseluruhannya, apabila keseluruhan peta haba diperiksa, terdapat penurunan regulasi yang jelas bagi keseluruhan keluarga gen gen imunoglobulin dalam kumpulan NLR neutrofil_Tinggi berbanding dengan NLR_Rendah. Kebanyakan gen (69/156, 44%) adalah berkaitan dengan imunoglobulin. Hanya 12 daripada 156 (7.7%) gen yang berkaitan dengan pelengkap: C1QA, C1QB, Serping1, C2, C2R, C4BPA, C3AR1, CR1, CR1L, CFH, CFD, dan CD59. Dalam kumpulan limfosit, terdapat juga pengurangan peraturan kebanyakan gen imunoglobulin dalam kategori NLR_Tinggi.

Set gen pelengkap dalam neutrofil dan limfosit diperincikan dalam Jadual 3. Dalam kedua-dua neutrofil (Jadual 3) dan limfosit (Jadual 3), ekspresi gen dalam 3 set gen yang berkaitan dengan sistem pelengkap adalah berbeza dengan ketara (P <1E{{ 5}}) apabila NLR_Sampel tinggi dibandingkan dengan NLR_Sampel rendah. Pemerhatian ini adalah sama sama ada perbandingan antara RNA daripada neutrofil atau limfosit. 3 set gen termasuk pengaktifan pelengkap, laluan klasik pengaktifan pelengkap, dan peraturan pengaktifan pelengkap. Plot analisis komponen utama gen neutrofil sekali lagi menunjukkan bahawa untuk NLR_Tinggi vs NLR_Rendah, gen pelengkap yang dinyatakan secara ketara telah diasingkan kepada 2 kumpulan (tambahan Rajah 3B). Sebagai alternatif, gen limfosit NLR_Tinggi lwn NLR_Tindan rendah (Tambahan Rajah 3B).

Rajah 5. Peta haba bagi gen yang dinyatakan secara ketara berbeza dalam set gen imunoglobulin dalam neutrofil (kiri) dan limfosit (kanan). Gen yang disenaraikan di sebelah kanan setiap peta haba adalah ahli imunoglobulin

Peta haba bagi neutrofil dan ekspresi limfosit bagi set gen berkaitan pelengkap yang membandingkan NLR_Tinggi dengan NLR_Rendah ditunjukkan dalam Rajah 6. Dalam neutrofil, sejumlah besar gen telah dikurangkan dalam NLR_Penduduk yang tinggi. Dalam set gen ini, sama dengan set gen imunoglobulin, kebanyakan gen (69/ 86, 80%) adalah berkaitan dengan imunoglobulin. Hanya 12 daripada 86 (14%) adalah gen komponen pelengkap dan kawal selia (C1QA, C1QB, SERPING1, C2, CR2, C4BPA, C3AR1, CR1, CR1L, CD59, CFH dan CFD). Dalam kumpulan limfosit secara keseluruhan, terdapat lebih sedikit ekspresi gen pelengkap, dan gen imunoglobulin dikurangkan sedikit dalam kumpulan NLR_Tinggi. Oleh kerana terdapat pemahaman yang lebih besar tentang gen sistem pelengkap berbanding dengan gen sistem imunoglobulin, perhatian tertumpu pada sistem pelengkap sebagai calon berpotensi untuk gen sasaran yang berkaitan dengan NLR tinggi dan rendah. Peta haba komposit yang membandingkan NLR_Tinggi dengan NLR_Rendah telah disediakan menunjukkan ekspresi sistem pelengkap dan gen yang berkaitan dalam kedua-dua sampel neutrofil dan limfosit (Rajah 7). Untuk sebahagian besar, limfosit bukanlah sistem sel takungan untuk sistem pelengkap. Kebanyakan gen pelengkap tidak dikawal selia dalam limfosit. Hanya C1S, CR2, C5, C8G, C5 dan CFB hadir dengan perbezaan ekspresi antara NLR_Tinggi dan NLR_limfosit rendah (Rajah 7). CD81 dalam limfosit adalah tetraspanin sel B. Ekspresi C1S dan C8G nampaknya jauh lebih tinggi dalam NLR limfosit_Tinggi berbanding NLR limfosit_Rendah, serupa dengan KLKB1, gen untuk prekallikrein plasma.

Sebaliknya, dalam neutrofil, NLR_Tinggi menunjukkan penurunan kawal selia gen komponen pelengkap C1QA, C1QB, C1QC, SERPING1, C1R, C4BPA, C3 dan C3AR1 serta gen pengawalseliaan (perencatan) pelengkapnya CD59, CFB dan CFI . Hanya gen C2 dan CFD yang dikawal selia dalam pesakit NLR_Tinggi_N. CD59 dan C9 secara relatifnya dikawal selia dalam NLR neutrofil_Rendah_N berbanding dengan NLR_Tinggi_N. FGFR4 ialah reseptor faktor pertumbuhan. CFH hadir tetapi nampaknya tidak dipengaruhi oleh neutrofil NLR_Tinggi atau NLR_Rendah. Ia lebih tinggi dinyatakan dalam limfosit.

manfaat cistanche untuk lelaki-menguatkan sistem imun

Klik di sini untuk melihat produk Cistanche Enhance Immunity

【Minta lebih lanjut】 E-mel:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Perbincangan

NLR pada kiraan leukosit pembezaan telah menjadi penanda mudah yang digunakan secara meluas untuk mengenali potensi hasil yang merosakkan dalam pelbagai gangguan, termasuk CVD, tumor pepejal, dan gangguan keradangan seperti lupus eritematosus sistemik dan sklerosis sistemik. Dalam penyiasatan retrospektif kami sendiri ke atas pesakit dengan CVD aterosklerotik, kami mendapati bahawa pesakit dengan NLR yang tinggi mempunyai kadar kematian lewat yang lebih tinggi selepas pembaikan aneurisma aorta elektif, kadar strok/kematian lewat yang lebih tinggi selepas endarterektomi karotid profilaksis, dan kelangsungan hidup bebas amputasi yang berkurangan selepas revaskularisasi femoral-popliteal elektif jika NLR mereka dinaikkan.14-16 Siasatan sekarang telah dimulakan untuk mencari asas mekanistik untuk NLR tinggi. limfoma, pelbagai tumor pepejal, dan gangguan keradangan seperti lupus erythematosus sistemik dan sklerosis sistemik. Dalam penyiasatan retrospektif kami sendiri ke atas pesakit dengan CVD aterosklerotik, kami mendapati bahawa pesakit dengan NLR yang tinggi mempunyai kadar kematian lewat yang lebih tinggi selepas pembaikan aneurisma aorta elektif, kadar strok/kematian lewat yang lebih tinggi selepas endarterektomi karotid profilaksis, dan kelangsungan hidup bebas amputasi yang berkurangan selepas revaskularisasi femoral-popliteal elektif jika NLR mereka dinaikkan.14-16 Penyiasatan sekarang telah dimulakan untuk mencari asas mekanistik untuk NLR tinggi.

Jadual 3. Set gen pelengkap dalam neutrofil dan limfosit

Untuk membangunkan pendekatan yang tidak berat sebelah mengenai mekanisme (s) kesan pembezaan NLR pada hasil CV, kami melakukan RNA-seq pada kedua-dua neutrofil dan limfosit daripada pesakit yang sama. Untuk kajian ini, semua pesakit dengan penyakit aorta secara prospektif dikumpulkan dan dikumpulkan ke dalam kategori NLR mengikut keputusan mereka. 6 sampel akhir dalam setiap 2 jenis sel telah dipilih oleh tahap tertinggi RIN mereka dalam RNA yang disediakan bagi sampel neutrofil dan limfosit berpasangan tanpa mengambil kira jantina, umur, atau keadaan perubatan sebelumnya. Seperti yang boleh dilihat dalam Jadual 1, pesakit dalam kumpulan NLR_Tinggi dan NLR_rendah adalah agak serupa dan hanya dibezakan oleh NLR mereka.

Kualiti RNA yang digunakan dalam kajian ini ditunjukkan oleh RIN dan pengasingan lengkap corak ekspresi gen antara neutrofil dan limfosit dalam semua kumpulan pesakit yang dikumpul (NLR tinggi, NLR rendah, dan kawalan) (Rajah 1). Plot analisis komponen utama menunjukkan bahawa NLR_Data kawalan tidak relevan dalam penyiasatan ini kerana NLR pesakit bertindih dengan NLR_Tinggi dan NLR_Rendah dalam populasi neutrofil dan limfosit pesakit . Analisis GSEA memberikan gambaran yang hebat tentang set gen mana yang diperkaya dalam set gen GO proses biologi, dan plot gelembung serakan jelas menunjukkannya dengan memplot kepentingan log berbanding nisbah bilangan gen yang diubah ke atas jumlah gen. dalam set gen. Apabila disemak, set gen yang memisahkan diri mereka daripada keseluruhan senarai adalah dalam sistem imuniti humoral (imunoglobulin) dan pelengkap (Jadual 2 dan 3) berdasarkan nisbah dan kepentingan statistik dalam pendekatan penemuan yang tidak berat sebelah.

Sebilangan besar gen imunoglobulin imuniti humoral yang terlibat sukar untuk digunakan kerana perbezaan penting antara gen ini tidak diketahui. Sebagai alternatif, banyak lagi yang diketahui tentang sistem pelengkap, dan tumpuan pada sistem pelengkap klasik yang diaktifkan oleh imunoglobulin ialah sasaran yang boleh dikenali untuk keradangan dan penyakit yang berkaitan dengan imunoglobulin. Data kami mencadangkan bahawa gen komponen pelengkap klasik C1QA, C1QB, C1R, CR1, C1S, SERPING1, C2, C4BPA, C3 C3AR1, C8G, C9, dan beberapa gen pengawalseliaan (CD59, CFB CFI, dan CFH) dikurangkan dalam neutrofil pesakit. dengan NLR tinggi (Rajah 7). Penemuan ini menarik kerana 3 sebab. Pertama, gen yang terlibat adalah kebanyakannya daripada laluan pelengkap klasik. Kedua, dalam pesakit NLR tinggi, gen pelengkap ini, sebahagian besarnya, dikurangkan berbanding dengan pesakit NLR rendah. Terakhir, lebih banyak F12 dinyatakan dalam neutrofil daripada NLR_Tinggi daripada NLR_Sampel rendah. Bentuk enzimatik produk protein F12 (faktor XII [FXII]) mengaktifkan laluan klasik pelengkap dan neutrofil.20 Sebaliknya, PLG, gen untuk plasminogen dan pengaktif FXII, dikurangkan dalam limfosit dan neutrofil daripada pesakit dalam NLR{ {21}}Tinggi, mencadangkan bahawa pengaktifan FXII itu sendiri mungkin merupakan pengawal selia pengaktifan pelengkap.

Di samping itu, telah ditunjukkan bahawa sistem pelengkap klasik terlibat dalam CVD dipercepatkan. Komponen pelengkap 1q (C1q) ialah faktor awal laluan pelengkap, yang mempunyai peranan penting dalam kedua-dua sistem imun semula jadi dan diperolehi.21 C1q telah ditunjukkan mempunyai dua peranan, kesan positif dan negatif terhadap aterosklerosis.22 Dalam klasikal laluan pelengkap, C1q mempunyai peranan pelindung dalam aterosklerosis peringkat awal dengan mengawal isyarat molekul makrofaj melalui laluan bebas pelengkap, memodulasi pengambilan lipoprotein aterogenik, pengantaraan sel apoptosis, dan penghapusan serpihan sel.23,24 Kajian terbaru oleh Jia et al23 menunjukkan bahawa pengurangan serum C1q dikaitkan dengan CAD. Satu lagi kajian oleh Guo et al24 menunjukkan bahawa peningkatan aktiviti C1q dikaitkan dengan CAD. Akhir sekali, kajian baru-baru ini menunjukkan bahawa pesakit diabetes dengan pengurangan C1q telah memendekkan survival.25 Data ini menunjukkan bahawa pemeriksaan sistem pelengkap mungkin penting dalam memahami patogenesis CVD yang dimediasi keradangan.

Rajah 6. Peta haba bagi gen yang dinyatakan secara ketara berbeza dalam set gen pelengkap dalam neutrofil (kiri) dan limfosit (kanan). Gen yang disenaraikan di sebelah kanan setiap peta haba ialah ahli set gen pelengkap. RNA adalah daripada neutrofil atau limfosit yang dikumpul daripada pesakit dengan NLR tinggi (NLR_Tinggi) atau rendah (NLR_Rendah). Enam sampel individu daripada NLR_Tinggi dibandingkan dengan 6 sampel individu daripada NLR_Rendah daripada kedua-dua neutrofil dan limfosit.

Rajah 7. Peta haba komposit bagi pelengkap dan gen berkaitan daripada neutrofil atau limfosit NLR_Tinggi atau NLR_Rendah. Dalam setiap kategori, peta haba komposit disediakan daripada 6 sampel RNA-seq individu daripada setiap jenis sel.

Recently, a retrospective investigation of the data from the CANTOS, JUPITER, SPIRE-1, SPIRE-2, and CIRT trials on 60 087 patients was conducted to determine whether NLR predicts major adverse CV events and is modified by anti-inflammatory therapy.26 NLR modestly correlated (ie, r 2 ≤ 0.26) with interleukin 6, C-reactive protein, and fibrinogen levels but minimally with lipids.25 In all 5 trials, NLR predicted incident CV events and death in patients with NLR >3.08.26 Walaupun penurun lipid tidak memberi kesan ke atas NLR, terapi anti-radang dengan canakinumab, perencat interleukin 1 menurunkan NLR (P <.0001).26 Data ini mencadangkan bahawa NLR mungkin merupakan penanda untuk CVD bebas daripada lipid dan pengaruh statin. Analisis ad hoc bagi pelbagai ujian rawak prospektif ini menunjukkan bahawa NLR mungkin merupakan faktor risiko bebas untuk kematian dalam CVD.

Terdapat beberapa batasan dalam kajian ini. Persediaan neutrofil kami mempunyai 4% limfosit dan 2% pencemaran monosit oleh sitometri aliran. Oleh kerana neutrofil tidak diketahui mensintesis imunoglobulin, perubahan gen imunoglobin neutrofil mungkin daripada mencemarkan sel B. Pada analisis EPIC, terdapat peningkatan ketara dalam pencemaran sel B bagi sampel NLR-Low. Pemerhatian ini menunjukkan bahawa peningkatan dalam tahap gen imunoglobulin dalam NLR_Sampel neutrofil rendah mungkin timbul daripada pencemaran sel B. Oleh itu, pengurangan gen imunoglobulin dalam NLR_Sampel tinggi mungkin disebabkan peningkatan sel B dalam NLR_Sampel rendah dan tidak semestinya mengurangkan tahap gen imunoglobulin dalam NLR_Sampel tinggi. Begitu juga, neutrofil tidak diketahui sebagai sel penghasil pelengkap. Pencemaran dua peratus dengan monosit boleh menjadi sumber gen pelengkap. Walau bagaimanapun, menggunakan data seq RNA, kami mendapati bahawa tiada perbezaan ketara dalam pencemaran monosit bagi persediaan neutrofil antara NLR_Rendah dan NLR_Tinggi. Tambahan pula, melakukan analisis EPIC bagi data RNA-seq menunjukkan bahawa pencemaran monosit telah<0.1% (<1:1000) of the neutrophil preparations, indicating that the RNA-seq was unlikely influenced by contaminating monocytes (Figure 3). The contaminating B cells in the NLR_Low samples do not influence the complement data observed. Finally, even now, it is not known that the changes we observed in complement and immunoglobulin genes are specific to vascular surgery patients with high NLR or older patients in general. NLR and genetic studies need to be performed on healthy age- and sex-matched patients without CVD.

manfaat cistanche untuk lelaki-menguatkan sistem imun

Kesimpulannya, penemuan utama dalam penyiasatan ini ialah, dalam keadaan NLR yang tinggi, banyak gen komponen pelengkap dan beberapa pengawal selianya dikurangkan dalam neutrofil. Tidak jelas tentang makna keseluruhan dan keadaan pengaktifan gen pelengkap terkawal turun yang dikenal pasti. Oleh kerana set gen pelengkap berkurangan dengan ketara, kami membuat spekulasi bahawa individu dengan NLR_Kelangsungan hidup pasca operasi yang tinggi dan singkat mengalami kehilangan mekanisme perlindungan CV utama yang disediakan oleh sistem pelengkap. Penilaian ini perlu diperiksa secara prospektif dalam penyiasatan klinikal untuk mekanisme asas untuk hasil ini.

Rujukan

1. Ross R. Atherosclerosis–penyakit radang. N Engl J Med. 1999;340(2):115-126.

2. Getz GS. Siri ulasan tematik: sistem imun dan atherogenesis. Fungsi imun dalam atherogenesis. J Lipid Res. 2005;46(1):1-10.

3. Hansson GK, Hermansson A. Sistem imun dalam aterosklerosis. Nat Immunol. 2011;12(3):204-212.

4. Duffy BK, Gurm HS, Rajagopal V, Gupta R, Ellis SG, Bhatt DL. Kegunaan nisbah neutrofil kepada limfosit yang tinggi dalam meramalkan kematian jangka panjang selepas campur tangan koronari perkutaneus. Am J Cardiol. 2006;97(7):993-996.

5. Tamhane UU, Aneja S, Montgomery D, Rogers EK, Eagle KA, Gurm HS. Persatuan antara nisbah kemasukan neutrofil kepada limfosit dan hasil pada pesakit dengan sindrom koronari akut. Am J Cardiol. 2008;102(6):653-657.

6. Gibson PH, Croal BL, Cuthbertson BH, et al. Nisbah neutrofil-limfosit pra operasi dan hasil daripada cantuman pintasan arteri koronari. Am Heart J. 2007;154(5):995-1002.

7. Fici F, Celik T, Balta S, et al. Kesan perbandingan nebivolol dan metoprolol pada lebar pengedaran sel merah dan nisbah neutrofil/limfosit pada pesakit dengan hipertensi penting yang baru didiagnosis. J Cardiovasc Pharmacol. 2013;62(4):388-393.

8. Karaman M, Balta S, Ay SA, et al. Kesan perbandingan valsartan dan amlodipine pada Tahap vWf dan nisbah N / L pada pesakit dengan hipertensi yang baru didiagnosis. Clin Exp Hypertens. 2013;35(7):516-522.

9. Uthamalingam S, Patvardhan EA, Subramanian S, et al. Utiliti nisbah neutrofil kepada limfosit dalam meramalkan hasil jangka panjang dalam kegagalan jantung dekompensasi akut. Am J Cardiol. 2011;107(3):433-438.

10. Bhat TM, Afari ME, Garcia LA. Nisbah limfosit neutrofil dalam penyakit vaskular periferal: kajian semula. Pakar Rev Cardiovasc Ther. 2016;14(7):871-875.

11. Bhutta H, Agha R, Wong J, Tang TY, Wilson YG, Walsh SR. Nisbah neutrofil-limfosit meramalkan kelangsungan hidup jangka sederhana berikutan pembedahan vaskular utama elektif: kajian keratan rentas. Vasc Endovasc Surg. 2011;45(3):227-231.

12. Appleton ND, Bailey DM, Morris-Stiff G, Lewis MH. Nisbah neutrofil kepada limfosit meramalkan kematian perioperatif berikutan pembaikan elektif terbuka aneurisma aorta abdomen. Vasc Endovasc Surg. 2014;48(4):311-316.

13. Bath J, Smith JB, Kruse RL, Vogel TR. Nisbah neutrofil-limfosit meramalkan keterukan penyakit dan hasil selepas prosedur bahagian bawah. J Vasc Surg. 2020;72(2):622-631.

14. Raja AH, Schmaier AH, Harth KC, et al. Nisbah neutrofil-limfosit yang tinggi meramalkan kematian berikutan pembaikan aneurisma endovaskular elektif. J Vasc Surg. 2020;72(1):129-137.

15. Raja AH, Kim AH, Kwan S, et al. Nisbah neutrofil-ke-limfosit yang tinggi dikaitkan dengan hasil yang lebih teruk selepas endarterektomi karotid dalam pesakit tanpa gejala. J Strok Cerebrovasc Dis. 2021;30(12):106120.

16. Raja AH, Kwan S, Schmaier AH, et al. Nisbah neutrofil-ke-limfosit yang tinggi dikaitkan dengan penurunan kelangsungan hidup bebas amputasi selepas revaskularisasi perkutan femoropopliteal. Int Angiol. 2021;40(5):442-449.

17. Racle J, de Jonge K, Baumgaertner P, Speiser DE, Gfeller D. Penghitungan serentak jenis kanser dan sel imun daripada data ekspresi gen tumor pukal. Elife. 2017;6:e26476.

18. Trapnell C, Roberts A, Goff L, et al. Analisis ekspresi gen dan transkrip berbeza bagi eksperimen RNA-seq dengan TopHat dan Cufflinks. Nat Protoc. 2012;7(3):562-578.

19. Palmer C, Diehn M, Alizadeh AA, Brown PO. Profil ekspresi gen spesifik jenis sel leukosit dalam darah periferi manusia. BMC Genomics. 2006;7:115.

20. Stavrou EX, Fang C, Bane KL, et al. Faktor XII dan uPAR mengimbangi fungsi neutrofil untuk mempengaruhi penyembuhan luka. J Clin Invest. 2018;128(3): 944-959.

21. Dunkelberger JR, WC Lagu. Pelengkap dan peranannya dalam tindak balas imun semula jadi dan adaptif. Sel Re. 2010;20(1):34-50.

22. Speidl WS, Kastl SP, Huber K, Wojta J. Pelengkap dalam aterosklerosis: kawan atau lawan? J Kegemukan. 2011;9(3):428-440.

23. Jia Y, Wen W, Yang Y, et al. Peranan klinikal gabungan serum C1q dan hsCRP dalam meramalkan penyakit arteri koronari. Clin Biochem. 2021;93:50-58.

24. Guo S, Mao X, Li X, Ouyang H, Gao Y, Ming L. Aktiviti C1q pelengkap serum dikaitkan dengan penyakit arteri koronari obstruktif. Cardiovasc Med. 2021;8:618173.

25. Cavusoglu E, Kassotis JT, Anwar A, et al. Kebergunaan pelengkap C1q untuk meramalkan 10-tahun kematian pada lelaki dengan diabetes mellitus yang dirujuk untuk angiografi koronari. Am J Cardiol. 2018;122(1):33-38.

26. Adamstein NH, MacFadyen JG, Rose LM, et al. Nisbah neutrofil-limfosit dan kejadian aterosklerotik kejadian: analisis daripada lima ujian rawak kontemporari. Eur Heart J. 2021;42(9):896-903.