Variasi dalam Ekspresi Gen Antara Dua Garisan Sorghum Bicolor Berbeza dalam Tindak Balas Kekebalan Semula Jadi

Abstrak:

Kekebalan tercetus corak molekul berkaitan mikrob (MAMPs) (MTI) ialah komponen utama tindak balas imun semula jadi tumbuhan terhadap pengecaman mikrob. Walau bagaimanapun, kebanyakan pengetahuan semasa kami tentang MTI datang daripada tumbuhan model (iaitu, Arabidopsis thaliana) dengan kerja yang agak kurang dilakukan menggunakan tumbuhan tanaman. Dalam kerja ini, kami mengkaji letusan oksidatif (ROS) yang dicetuskan oleh MAMP dan tindak balas transkrip dalam dua genotip dua warna Sorghum, BTx623 dan SC155-14E. SC155-14E ialah garisan yang menunjukkan rintangan antraknosa yang tinggi dan garisan BTx623 terdedah kepada antraknosa. Keputusan kami mendedahkan variasi yang jelas dalam ekspresi gen dan ROS sebagai tindak balas kepada sama ada flagellin (flg22) atau elisitasi kitin antara dua baris. Walaupun tindak balas transkrip kepada setiap MAMP dan dalam setiap baris adalah unik, terdapat tahap pertindihan yang besar, dan kami dapat menentukan set teras gen yang dikaitkan dengan tindak balas transkrip MAMP sorgum. Istilah GO dan analisis pengayaan laluan KEGG menemui lebih banyak DEG berkaitan imuniti dan rintangan patogen dalam sampel SC155-14E yang dirawat MAMP berbanding BTx623 dengan rawatan yang sama. Hasilnya memberikan garis dasar untuk kajian masa depan untuk menyiasat laluan imuniti semula jadi dalam sorghum, termasuk usaha untuk meningkatkan daya tahan penyakit.

Klik untuk membeli sebuahproduk imuniti yang lebih baik

    For more information:1950477648nn@gmail.com

Kata kunci:

Sorghum bicolor; ROS; imuniti semula jadi; MAMP; RNA-seq; ekspresi gen

1. Pengenalan

Tumbuhan secara semula jadi terdedah kepada pelbagai tekanan, termasuk pelbagai patogen bakteria, kulat dan virus [1]. Tumbuhan melindungi diri mereka daripada patogen menggunakan struktur dan bahan kimia yang telah dibentuk, dan tindak balas sistem imun yang disebabkan oleh jangkitan. Sistem imun tumbuhan menggunakan sistem persepsi dua peringkat dengan dua lapisan reseptor yang saling berkaitan.

Peringkat pertama diaktifkan oleh reseptor pengecaman corak setempat permukaan (PRR), yang mengesan molekul di luar sel dengan mengenali patogen yang menyerang melalui pengesanan motif struktur yang dipelihara, yang dinamakan Corak Molekul Berkaitan Mikrob (MAMP), yang mencetuskan sederhana, tetapi luas, tindak balas pertahanan [2]. Flagellin, kitin, lipopolysaccharides, peptidoglycans (PGNs), dan faktor pemanjangan Tu adalah contoh MAMP yang dikaji dengan baik [3-5]. Tindak balas pertahanan ini dipanggil imuniti MAMPtrigged (MTI) [6]. Peringkat kedua pertahanan yang dikenali sebagai Kekebalan Tercetus Efektor (ETI) berlaku sebagai tindak balas kepada protein efektor yang berasal dari patogen tertentu yang diiktiraf oleh tumbuhan melalui tindakan protein rintangan, menghasilkan tindak balas imun yang kuat tetapi sangat spesifik. ETI selalunya boleh dikenali dengan induksi kematian sel setempat yang dipanggil tindak balas hipersensitif (HR) [7]. Kedua-dua sistem MTI dan ETI merasakan patogen dan bertindak balas dengan mengaktifkan pertahanan antimikrob dalam sel yang dijangkiti dan sel jiran [3,8]. Tumbuhan juga membawa reseptor imun yang mengiktiraf pengesan patogen yang sangat berubah-ubah, ini termasuk kelas protein NBS-LRR [9].

Selain itu, rintangan diperoleh sistemik (SAR) ialah tindak balas rintangan "tumbuhan keseluruhan" yang berlaku berikutan pendedahan setempat yang lebih awal kepada patogen. SAR dikaitkan dengan induksi pelbagai gen (gen berkaitan patogenesis), dan pengaktifan SAR memerlukan pengumpulan asid salisilik endogen (SA) [10].

Kajian yang dilakukan terutamanya menggunakan Arabidopsis telah menunjukkan bahawa MTI boleh menyebabkan pelbagai tindak balas termasuk perubahan dalam pengeluaran spesies oksigen reaktif (ROS), pengeluaran spesies nitrogen reaktif seperti oksida nitrik (NO), pemendapan callose, tahap kalsium intraselular, fluks ion merentasi plasma. membran, induksi atau penindasan ekspresi beberapa gen berkaitan pertahanan tumbuhan, perubahan pada dinding sel tumbuhan, induksi sebatian antimikrob dan sintesis protein berkaitan patogenesis (PR) [3,11].

Walaupun beberapa tindak balas MTI ini boleh dianggap sebagai tindak balas tumbuhan umum, magnitudnya boleh menjadi spesifik spesies tumbuhan dan juga khusus kultivar [12–17]. Kaedah telah dibangunkan untuk mengukur tindak balas MTI tumbuhan. Kaedah ini termasuk mengukur pengeluaran ROS atau NO, fosforilasi protein kinase yang diaktifkan mitogen, ekspresi gen yang disebabkan oleh MAMP tertentu, perencatan pertumbuhan anak benih, lignin dan fenol terikat dinding sel, dan rintangan yang disebabkan oleh MAMP terhadap patogen bakteria dan kulat [18-20].

Sorghum bicolor (L.) Moench ialah tanaman bijirin global utama yang telah disesuaikan dengan pelbagai habitat dan dibiakkan untuk tujuan yang pelbagai [21]. Penanaman sorghum dijangka meningkat dengan ketara di seluruh dunia sebagai salah satu tanaman utama untuk pengeluaran makanan dan biojisim [22].

Apabila amalan dan kawasan geografi di bawah penanaman sorgum semakin meningkat, tidak dapat dielakkan tekanan penyakit akan meningkat. Sorgum dibezakan antara bijirin lain dengan pelbagai penyakit yang luar biasa luas, yang merupakan salah satu kekangan yang paling penting untuk pengeluarannya. Di peringkat global, penyakit kulat yang meluas adalah penyakit sorghum yang paling merosakkan yang mengakibatkan kerugian besar dalam hasil, baik dari segi kuantiti dan kualiti bijirin [23]. Anthracnose adalah salah satu penyakit kulat paling teruk yang menjejaskan hasil bijirin sorghum dan pengeluaran biojisim. Kehilangan hasil akibat patogen ini boleh menjadi 50 hingga 70 peratus dalam kultivar yang terdedah [24,25]. Tumbuhan telah membangunkan pelbagai strategi pertahanan untuk melawan pencerobohan patogen. Dalam sorghum, strategi ini termasuk pengaktifan protein PR [26], pengumpulan hidrogen peroksida [27], dan biosintesis phytoalexin flavonoid [28]. Pendekatan yang berbeza telah digunakan untuk mengkaji tindak balas rintangan sorghum, mengenal pasti sebatian pertahanan, dan mengenal pasti halangan fizikal terhadap antraknosa (lihat rujukan [29,30] untuk semakan). Kajian ekspresi gen digunakan secara meluas untuk mengenal pasti gen rintangan calon dalam tumbuhan berdasarkan ekspresi pembezaan antara kultivar yang tahan dan mudah terpengaruh atau tumbuhan yang tidak diinokulasi dan yang diinokulasi patogen (cth, rujukan [31–37]). Wang et al., [37] melakukan analisis transkriptomi untuk mengkaji tindak balas kultivar sorgum BTx623 kepada C. subline-ola. Mereka melaporkan bahawa gen yang terlibat dalam metabolisme fenilpropanoid, dan biosintesis metabolit sekunder dikenal pasti sebagai dinyatakan secara berbeza sebagai tindak balas kepada jangkitan dengan patogen berbanding dengan tumbuhan kawalan yang tidak diinokulasi.

Walau bagaimanapun, eksperimen ini telah dijalankan dengan anak benih kultivar mudah terdedah BTx623. Kajian transkriptom tambahan untuk membandingkan tindak balas ekspresi gen kepada patogen dalam kultivar sorgum yang mudah terdedah dan tahan akan menjadi nilai. Oleh itu, adalah penting untuk memahami seni bina genetik yang mengawal rintangan penyakit basal sorghum dan kaitannya dengan rintangan penyakit kuantitatif.

Sebagai langkah awal ke arah ini, kami baru-baru ini menyaring satu set plasma nutfah sorghum yang pelbagai untuk variasi dalam tindak balas mereka terhadap flg22 dan elisitasi kitin, serta rintangan penyakit kulat [38]. Dalam kes ini, MTI telah dikira dengan mengukur pengeluaran ROS semasa elisitasi MAMP. Antara hasil kajian awal ini, adalah pengenalpastian genotip sorghum yang menunjukkan sama ada tindak balas yang kuat atau lemah terhadap elisitasi MAMP.

Penjujukan pemprosesan tinggi generasi seterusnya dan kajian transkriptom boleh membantu untuk menjelaskan tindak balas jangkitan kulat dalam tumbuhan dan meningkatkan pemahaman tentang tindak balas perumah. Analisis transkrip digunakan secara meluas untuk mengkaji tindak balas tumbuhan terhadap jangkitan kulat dalam banyak spesies tumbuhan termasuk tanaman bijirin (cth, rujukan [31-37]).

Walau bagaimanapun, data yang diterbitkan mengenai analisis transkriptom perbandingan tanaman bijirin telah tertumpu terutamanya pada tindak balas kepada pelbagai patogen. Dalam sorghum, beberapa penerbitan memberi tumpuan kepada perbandingan transkriptom tumbuhan yang dirawat dengan pelbagai patogen, termasuk antraknosa [35,37]. Beberapa penerbitan terdahulu mencadangkan bahawa tidak ada korelasi yang signifikan antara tindak balas terhadap MAMP dan penyakit kulat. Sebagai contoh, Zhang et al. [17] melaporkan korelasi yang kuat antara tindak balas kepada dua MAMP flg22 dan kitin dalam populasi pemetaan jagung tetapi tiada korespondensi terhadap tindak balas terhadap penyakit kulat. Kimball et al. [38] juga melaporkan korelasi yang rendah antara skor tindak balas ROS terdorong flg22-dan skor tahan tompok daun sasaran dalam dua populasi RIL sorgum termasuk populasi BTx623/SC155-14E. Oleh itu, memandangkan kekurangan data, kami merasakan penting untuk memprofilkan secara transkripsi tindak balas sorgum terhadap rawatan MAMP.

Dalam laporan semasa ini, kami melanjutkan analisis awal kami dengan mengukur tindak balas transkrip global terhadap elisitasi MAMP. Kami menggunakan analisis penjujukan RNA berasaskan Illumina untuk meninjau perubahan transkrip sebagai tindak balas kepada sama ada flg22 atau rawatan kitin dalam genotip sorghum BTx623 dan SC155-14E, yang sebelum ini kami sifatkan masing-masing sebagai responden MTI lemah dan kuat. BTx623 ialah garis rujukan genom bicolor Sorghum [22] dan SC155-14E ialah garisan yang menunjukkan rintangan antraknosa yang tinggi [39]. Patil et al. [39] melaporkan bahawa SC155-14E menunjukkan tahap rintangan stabil yang tinggi (hampir bebas penyakit) terhadap penyakit antraknosa dalam semua persekitaran yang diuji manakala BTx623 terdedah kepada penyakit kulat ini. Analisis RNA-seq kami mengenal pasti 5252 dan 8085 Differentially Expressed Gens (DEGs) dalam BTx623 dirawat dengan flg22 dan kitin, masing-masing, dan 3849 dan 5786 DEGs dalam flg22 dan chitin dirawat SC155-14E, masing-masing, berbanding kawalan olok-olok yang tidak dirawat daripada dua genotip ini.

Tambahan pula, perbandingan DEG yang dipilih menggunakan dua saluran paip bioinformatik yang berbeza menunjukkan hasil yang hampir sama. Profil ekspresi gen yang dinyatakan secara berbeza, analisis pengayaan ontologi gen (GO), dan analisis pengayaan laluan KEGG menunjukkan variasi berasaskan genotip yang jelas dalam ekspresi gen berkaitan MTI. Istilah GO dan keputusan pengayaan laluan KEGG mendedahkan lebih banyak imuniti dan DEG berkaitan rintangan patogen (gen PR, tindak balas gen kepada kitin, tindak balas gen kepada asid salisilik, tindak balas gen kepada tekanan, dsb.) yang dibentangkan dalam SC yang dirawat MAMP{{4} }Sampel E relatif kepada BTx623 yang dirawat MAMP. Hasilnya menyediakan garis dasar untuk mengenal pasti pelbagai komponen tindak balas MTI sorgum.

2. Keputusan dan Perbincangan

2.1. Variasi Letusan Oksidatif dalam Daun Sorgum Berbeza

Analisis terdahulu kami terhadap tindak balas MTI bagi genotip sorgum pelbagai menunjukkan variasi ketara dalam letusan oksidatif yang dicetuskan MAMP antara genotip BTx623 dan SC155-14E [38]. Selain itu, SC155-14E ialah garisan yang menunjukkan rintangan antraknosa yang tinggi, manakala garisan BTx623 terdedah kepada antraknosa [39]. Atas sebab ini, kedua-dua genotip ini dipilih untuk perbandingan menggunakan RNA-seq.

Semasa menjalankan pengukuran ROS yang lebih awal, kami mendapati variasi yang ketara walaupun dalam loji yang sama, yang membawa kami untuk menyiasat sumber variasi ini dengan lebih berhati-hati. Khususnya, kami menguji pengeluaran ROS menggunakan tiga set daun, dari bahagian bawah ke bahagian atas loji BTx623 dan SC{3}}E yang berusia lima belas hari. Daun ditandakan sebagai #1, #2, dan #3, dari bawah ke atas seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1A. Keputusan ujian ROS (Rajah 1B) mendedahkan bahawa: (1) tahap pengeluaran ROS adalah lebih rendah pada daun tua (daun #1), manakala tahap tertinggi pengeluaran ROS sebagai tindak balas kepada sama ada flg22 atau kitin adalah daripada daun termuda ( daun #3). (2) Kedua-dua daun bongsu BTx{15}}d MAMP yang dirawat dan tidak dirawat (daun #2) menghasilkan tahap pengeluaran ROS yang rendah.

Sebaliknya, daun ke-2 termuda SC155-14E yang dirawat MAMP menghasilkan dengan ketara (pada tahap 0.01) tahap pengeluaran ROS yang lebih tinggi daripada olok-olok yang tidak dirawat, serta olok-olok BTx{ {5}}daun bongsu ke. (3) Letupan oksidatif yang dicetuskan oleh aplikasi flg22, atau kitin dikesan dalam cakera daun dari daun termuda (daun #3) kedua-dua genotip, walaupun, seperti yang diperhatikan sebelum ini, tahap pengeluaran ROS lebih tinggi dalam SC yang dirawat MAMP. 155-14E relatif kepada BTx623. Jangka masa flg22-pengeluaran ROS yang dicetuskan dan dicetuskan kitin dalam SC155-14E daun ke-2 termuda mendedahkan bahawa pengeluaran ROS yang dicetuskan oleh kitin berlaku lebih awal daripada pengeluaran ROS yang dicetuskan oleh flg22- (Rajah 1C ). Keputusan yang sama dilaporkan oleh Zhang et al. [17] di mana pengeluaran ROS yang dicetuskan kitin muncul lebih awal daripada flg22-yang mencetuskan pengeluaran ROS dalam flg22 dan anak benih jagung yang dirawat kitin. Telah dilaporkan [40] bahawa pengeluaran ROS sebagai tindak balas kepada flg22 menunjukkan pengeluaran ROS tertinggi sekitar 12 minit, dan paling rendah pada 30 minit dalam Arabidopsis. Keputusan ujian ROS kami dalam sorgum menunjukkan pengeluaran ROS tertinggi sekitar 13 minit, dan terendah pada 30 minit selepas rawatan flg22, yang sangat serupa dengan keputusan dalam Arabidopsis. Memandangkan matlamat kami adalah untuk mencari keadaan optimum untuk perbandingan tindak balas MTI bagi kedua-dua genotip, kami memilih daun ke-2 termuda 15-tumbuhan berumur sehari untuk pengekstrakan RNA dan analisis transkriptik seterusnya. Variasi antara daun tumbuhan sorgum tunggal adalah peringatan bahawa keputusan boleh berbeza-beza antara eksperimen bergantung pada sumber, masa dan ciri lain bagi eksperimen tertentu dan, oleh itu, parameter eksperimen perlu dikawal dengan teliti.

Letupan oksidatif, pengeluaran spesies oksigen reaktif (ROS) yang pantas, sementara, merupakan salah satu aspek terawal yang boleh diperhatikan dalam tindak balas pertahanan tumbuhan [41]. Memandangkan pecah ROS adalah tindak balas segera, tindak balas transkrip gen yang berkaitan dengan MTI yang sedikit kemudian dijangka. Kami menuai sampel 60 minit selepas rawatan MAMPs untuk analisis RNA-Seq.

2.2. Gen Berbeza (DEG) BTx623 dan SC155-14E sebagai Tindak Balas kepada Rawatan MAMP

Untuk menilai tahap ekspresi gen pengekodan protein Sorghum bicolor beranotasi untuk setiap sampel, bilangan bacaan bersih RNA-seq yang dipetakan kepada setiap gen telah dikira dan kemudian dinormalkan menjadi FPKM (serpihan per kb model exon per juta serpihan dipetakan). Perubahan ekspresi setiap gen dalam cakera daun yang dirawat MAMP bagi BTx623 dan SC155-14E berbanding dengan rawatan olok-olok (air) telah disiasat. Jumlah gen yang dinyatakan adalah serupa dalam semua rawatan kedua-dua genotip: 27,171, 27,283, 27,161, 27,182, 27,512, dan 27,175 gen yang dinyatakan dalam olok-olok BTx623, flg{18}}chick3, BTx3-BT62 yang dirawat {22}}E, flg22-SC yang dirawat155-14E dan SC yang dirawat kitin155-14E, masing-masing. Kami menggunakan genom rujukan BTx623 untuk pemetaan baca dalam kedua-dua baris kerana rujukan khusus untuk SC155-14E tidak tersedia. Nombor gen yang dinyatakan yang diambil daripada BTx623 dan SC{{30}}}E dengan semua keadaan di atas mendedahkan bahawa kedua-dua baris berkongsi bilangan gen yang dinyatakan yang serupa. Kadar pemetaan bacaan keseluruhan sampel SC155- 14E olok-olok (3 ulangan), SC155-14E dirawat dengan flg22 (3 ulangan), SC155-14E dirawat dengan kitin (3 ulangan) , BTx623 olok-olok (3 ulangan), BTx623 dirawat dengan flg22 (3 ulangan), BTx623 dirawat dengan kitin (3 ulangan) ialah: 93.6 peratus , 93.9 peratus , 93.9 peratus , 93.8 peratus , 93.9 .9 peratus , 93.93 .9 peratus , 93.1 peratus, 96.9 peratus, 97.0 peratus, 97.0 peratus, 97.2 peratus, 96.8 peratus, 97.0 peratus, 96.9 peratus, 97.0 peratus , 97.0 peratus , masing-masing. Keputusan ini mencadangkan bahawa kesan berbeza rawatan MAMP pada transkriptom BTx623 dan SC155-14E bukan disebabkan oleh perbezaan jujukan genomik antara kedua-dua genotip

Plot PCA ekspresi gen memberikan pandangan tentang persatuan antara sampel. Untuk meneroka persamaan sampel kami, kami melakukan analisis PCA. Pemplotan sampel pada PC1 dan PC2 (Rajah 2) menunjukkan bahawa empat keadaan percubaan (BTX623_flg22; SC155-14E_flg22 flg22; BTX623_kitin dan SC{ {10}}E_kitin) telah diasingkan secara meluas. Sebaliknya, tiga replika biologi setiap baris sorghum dan setiap rawatan MAMP, serta rawatan olok-olok, dikelompokkan rapat bersama, masing-masing, menunjukkan kebolehulangan yang baik antara replika biologi (Rajah 2).

Plot gunung berapi dalam Rajah 3 menunjukkan ekspresi gen dalam dua garisan sorgum yang dirawat dengan flg22 atau kitin. Plot gunung berapi ialah sejenis plot serakan yang menunjukkan kepentingan statistik (nilai-p) berbanding magnitud perubahan (perubahan kali ganda). Ia membolehkan pengenalan visual pantas gen dengan perubahan lipatan besar yang juga signifikan secara statistik. Ini mungkin gen yang paling penting secara biologi. Dalam Rajah 3, gen dengan −log10 (nilai-p) bersamaan atau lebih besar daripada 3 dianggap DEG. Titik warna merah mewakili DEG dan titik warna hitam mewakili bukan DEG. Dalam setiap plot, gen dengan log2 (lipat{10}}perubahan) lebih besar daripada 0 ialah gen terkawal atas, sebaliknya, gen terkawal turun. Gen yang paling dikawal ke atas adalah ke arah kanan, gen yang paling dikawal ke bawah adalah ke arah kiri, dan gen yang paling ketara secara statistik adalah ke arah atas.

Gen yang dinyatakan secara berbeza (DEG) dipilih daripada setiap rawatan mengikut kepentingan ekspresinya (nilai p 0.001). Perlu diingat bahawa kami menggunakan nilai-p 0.001 sebagai ambang kami tetapi bukan FDR (nilai-q) untuk memilih DEG dalam laporan ini. FDR (nilai-q) juga signifikan pada tahap ini (Jadual S2–S5). Pada nilai p 0.001, FDR ialah 0.0039, 0.0051, 0.0025 dan 0.0035 untuk BTx623 dengan rawatan flg22, SC155-14E dengan rawatan flg22, BTx623 dengan rawatan kitin dan SC{{ 26}}E dengan rawatan kitin, masing-masing. Nilai-p dan nilai-q bagi gen BTx623 dan SC155-14E dalam semua keadaan disenaraikan dalam Jadual S2–S5. Dengan menganalisis corak ekspresi gen ini dalam daun BTx623 dan SC{35}}E yang dirawat MAMP, kami memerhatikan sejumlah besar gen (14–30 peratus daripada jumlah gen yang dinyatakan) yang menunjukkan perbezaan besar selepas flg22 atau kitin rawatan di kedua-dua garisan sorgum. Bilangan jumlah DEG BTx623 (8085) yang dirawat kitin adalah sangat hampir dengan yang dilaporkan dalam kajian transkriptom sebelumnya dalam BTx623 yang dijangkiti oleh patogen antraknosa C. subline-ola (8078) [37]. Bilangan DEG adalah lebih tinggi dalam flg22 (19 peratus ) atau kitin (30 peratus ) yang dirawat daun BTx623 berbanding SC155-14E (masing-masing 14 peratus dan 21 peratus ).

Walaupun bilangan DEG yang lebih tinggi dalam BTx623 yang dirawat MAMP berbanding SC155-14E adalah bertentangan dengan tindak balas ROS bagi kedua-dua genotip ini, ini mungkin tidak menghairankan kerana tindak balas ROS dan tindak balas ekspresi gen terhadap rawatan MAMP berlaku pada masa yang berbeza, sebahagian besarnya bebas, dan dimediasi oleh mekanisme yang berbeza [42,43]. Istilah GO dan pengayaan laluan KEGG mendedahkan lebih banyak imuniti dan DEG berkaitan rintangan patogen yang dibentangkan dalam sampel SC155-14E yang dirawat MAMP. Selain itu, fakta bahawa bilangan DEG lebih tinggi dalam sampel yang dirawat kitin berbanding dengan yang dirawat dengan flg22 dipadankan dengan baik dengan ujian tindak balas ROS (Rajah 1B) di mana kita melihat tindak balas ROS yang lebih kuat semasa rawatan kitin.

Untuk menyiasat sejauh mana gen dan proses biologi dikongsi antara rawatan flg22 dan kitin dalam BTx623 dan SC155-14E, kami membandingkan DEG mereka dengan lebih terperinci. Gambar rajah Venn dalam Rajah 4A menunjukkan pertindihan dalam DEG dalam jumlah keseluruhan, set gen terkawal atas dan bawah pada nilai p 0.001. Daripada jumlah 10,535 DEG, set teras 2272 gen bertindak balas terhadap kedua-dua flg22 dan rawatan kitin dalam kedua-dua garisan sorgum. Begitu juga, daripada jumlah 5410 gen yang dikawal selia, set teras 1778 gen telah dikawal selia dalam kedua-dua genotip, manakala, daripada sejumlah 5125 gen terkawal turun, set teras 474 telah dikawal ke bawah dalam kedua-dua genotip. genotip.

Data seq RNA yang dibentangkan di sini telah dianalisis menggunakan saluran paip bioinformatik dengan alat Bowtie2 2.3.4.3, TopHat 2.1.1 dan Cufflinks 2.2.1 (Cuffmerge, Cuffdiff) dengan parameter lalai (talian paip #1). Untuk mengesahkan lagi keputusan ujian, kami menggunakan saluran paip lain (talian paip #2) dengan HiSat2, HTSeq dan edgeR untuk melaksanakan analisis. HiSat2 ialah perkembangan seterusnya bagi TopHat2. Kami membandingkan DEG bagi setiap keadaan (iaitu, dua genotip yang dirawat dengan flg22 atau kitin, semua, DEG terkawal atas atau bawah) yang dipilih menggunakan kedua-dua saluran paip. Keputusan (Rajah 5) menunjukkan bahawa nombor DEG yang dipilih menggunakan kedua-dua saluran paip adalah sangat rapat.

Jumlah DEG yang dipilih dengan saluran paip #1 lwn. saluran paip #2 ialah BTx623_flg22: 5241 lwn. 5413; SC155-14E_flg22: 3849 lwn. 3476; BTx{11}}kitin: 8085 lwn. 8320; SC155-14E_kitin: 5786 lwn. 5383. DEG terkawal yang dipilih dengan talian paip #1 lwn. talian paip #2 ialah BTx623_flg22: 3074 lwn. 3076; SC155-14E_flg22: 2591 lwn. 2483; BTx623_kitin: 4156 lwn. 4583; SC155-14E_kitin: 3486 lwn. 3346. DEG terkawal ke bawah yang dipilih dengan saluran paip #1 lwn. talian paip #2 ialah BTx623_flg22: 2152 lwn. 2237; SC155-14E_flg22: 1257 lwn. 993; BTx623_kitin: 3919 lwn. 3757; SC155-14E_kitin: 2296 lwn. 2037. Selain itu, keputusan dalam Rajah 5 juga mendedahkan bahawa peratusan tinggi DEG yang dipilih menggunakan dua saluran paip bertindih dalam semua keadaan. Peratusan nombor DEG bertindih/nombor DEG yang dipilih menggunakan talian paip#1 ialah 79.6 peratus dan 73.7 peratus . 80.8 peratus dan 74.4 peratus daripada jumlah DEG BTx623_flg22, SC155-14E_flg22, BTx623_kitin dan SC155-14E{{73} }kitin, masing-masing; 83 peratus , 80.6 peratus , 85.3 peratus dan 81.1 peratus DEG terkawal BTx623_flg22, SC155-14E_flg22, BTx623_kitin dan SC{{ 88}}E_kitin, masing-masing; 75.1 peratus , 59.5 peratus , 75.8 peratus dan 67.4 peratus DEG terkawal rendah bagi BTx623_flg22, SC155-14E_flg22, BTx623_kitin dan SC{{ 105}}E{106}}kitin, masing-masing. Oleh itu, keputusan perbandingan ini membuktikan bahawa data seq RNA yang dibentangkan adalah betul tanpa mengira yang mana antara dua kaedah digunakan untuk analisis.

Peta haba profil ekspresi berkelompok DEG BTx623 dan SC155-14E yang dirawat dengan flg22 atau kitin untuk tiga replika biologi ditunjukkan dalam Rajah 6. Nilai ekspresi gen telah dinormalisasi sebagai z-skor. Warna bertukar daripada ungu kepada merah apabila nilainya meningkat, menunjukkan ekspresi gen dari rendah ke tinggi. Peta haba ini dengan jelas menunjukkan peraturan pembezaan gen dalam BTx623 dan SC155-14E sebagai tindak balas kepada rawatan flg22 atau kitin. Di samping itu, keputusan juga menunjukkan peta haba bagi tiga replika biologi dalam setiap keadaan adalah sangat rapat, menunjukkan kebolehulangan yang baik antara replika biologi.

Selain itu, perbandingan berpasangan (Rajah 7A) antara DEG terkawal atas dan bawah daripada rawatan flg22 dan kitin menunjukkan bahawa terdapat pertindihan yang besar antara BTx623 dan SC155-14E. Antara 3074 flg22-gen teraruh dalam BTx623, 83.8 peratus turut diinduksi dalam BTx623 sebagai tindak balas kepada rawatan kitin, manakala daripada 2591 flg22-gen teraruh dalam SC155-14E, {{ 16}}.6 peratus juga bertindak balas terhadap SC yang dirawat kitin155-14E. Ini mungkin tidak menghairankan kerana kerja-kerja terdahulu dalam Arabidopsis thaliana menunjukkan pertindihan yang ketara dalam gen yang bertindak balas kepada pelbagai MAMP yang berbeza, yang mentakrifkan laluan MTI umum [44-46].

Selain itu, Zhang et al. [17] juga melaporkan korelasi yang signifikan antara flg22 dan tindak balas kitin dalam jagung. Kurang pertindihan diperhatikan antara cakera daun BTx623 dan SC155-14E yang dirawat dengan MAMP yang sama (Rajah 7A). 64.3 peratus daripada gen teraruh flg22-dalam BTx623 diaruh dalam flg22-SC{10}}E dan 68.3 peratus gen teraruh kitin dalam BTx623 diaruh dalam SC dirawat kitin155-14 E. Begitu juga, daripada 2152 gen yang dikawal ke bawah semasa rawatan flg22 BTx623, peratusan yang tinggi (75.9 peratus ) juga dikawal oleh kitin dalam BTx623. Daripada 1257 gen yang dikurangkan oleh flg22 dalam SC155-14E, 70.8 peratus juga dikawal oleh kitin dalam SC155-14E. Walau bagaimanapun, hanya 29 peratus daripada gen terkawal turun flg22 dalam BTx623 turut dikawal selia ke bawah dalam flg22-SC155-14E yang dirawat dan 45 peratus daripada gen terkawal turun kitin dalam BTx623 dikawal selia ke bawah. dalam SC 155-14E yang dirawat kitin (Rajah 7A). Oleh itu, walaupun terdapat penumpuan yang ketara dalam laluan MTI kepada flg22 dan kitin dalam kedua-dua genotip berbanding, data juga membayangkan kerumitan yang menarik tentang bagaimana kedua-dua genotip ini bertindak balas terhadap MAMP yang berbeza.

2.3. Analisis Pengayaan Fungsian Gen Membandingkan Respons MTI BTx623 dan SC155-14E

Untuk menentukan kategori fungsi gen yang dikawal selia sebagai tindak balas kepada sama ada flg22 atau kitin dan tindak balas pembezaan dua garis sorgum yang diuji, kami menggunakan platform PlantRegMap [47,48] untuk melakukan Analisis Pengayaan Set Gen berdasarkan DEG yang dikesan dalam biologi. kategori proses. Rajah 8A, dan B menunjukkan istilah GO teratas bagi gen diperkaya proses biologi dengan DEG terkawal dan DEG terkawal ke atas daripada kedua-dua BTx623 dan SC155-14E. Senarai lengkap DEG disediakan dalam Jadual S6–S13. Kebanyakan gen ini dikaitkan dengan proses termasuk tindak balas tekanan, tindak balas pertahanan tumbuhan, tindak balas kepada rangsangan, tindak balas kepada rangsangan biotik, tindak balas kepada bakteria, tindak balas kepada organisma lain, komunikasi sel, proses metabolik fosforus, dan fosforilasi protein.

Keputusan dalam Rajah 8A, dan B menunjukkan perbezaan yang jelas dalam ekspresi gen yang biasanya dikaitkan dengan imuniti semula jadi antara dua genotip sorgum. Dalam istilah GO yang diperkaya itu, beberapa DEG unik ditemui dalam setiap keadaan dengan pertindihan. Sebagai contoh, tindak balas pertahanan istilah GO (GO 0006952): 91 dan 84 DEG terkawal telah diperkayakan dalam BTx623 atau SC155-14E yang dirawat dengan flg22, masing-masing. Dalam DEG tersebut, 24 DEG adalah unik dalam BTx623 dan 15 DEG hanya ditemui dalam SC155-14E dan yang lain dibentangkan dalam kedua-dua genotip sorgum. Begitu juga, 102 dan 93 DEG terkawal telah diperkayakan dalam BTx623 atau SC{16}}E yang dirawat dengan kitin, masing-masing. Dalam DEG tersebut, 20 DEG adalah unik dalam BTx623 dan 14 DEG adalah unik dalam SC155-14E, dan yang lain dibentangkan dalam kedua-dua genotip sorgum.

Dalam istilah GO "tindak balas kepada kitin (GO: 0010200)", kami memerhatikan 18 DEG terkawal daripada sejumlah 779 gen dalam kategori ini diperkaya dalam sampel SC155-14E yang dirawat kitin (Rajah 8 ), manakala tiada gen diperkaya dalam sampel BTx623 yang dirawat kitin. Selain itu, 16 DEG terkawal telah diperkaya dalam sampel flg22-SC155-14E yang dirawat dan 12 DEG terkawal telah diperkaya dalam sampel BTx623 flg22-yang dirawat (Rajah 8). Perbandingan senarai DEG istilah GO "tindak balas kepada kitin" dalam flg22 dan BTX623 yang dirawat kitin dan SC155-14E (Jadual S9) mendedahkan bahawa DEG diperkaya dalam flg22, atau SC yang dirawat kitin155- 14 E adalah sama kecuali kitin teraruh dua lebih DEG daripada flg22. Sebaliknya, kesemua 12 DEG yang diperkaya dalam flg22-BTX623 yang dirawat adalah berbeza daripada DEG yang disebabkan oleh MAMP dalam SC155-14E. DEG yang disebabkan oleh MAMP tersebut mungkin menyumbang kepada tindak balas rintangan antraknosa dalam SC155-14E kerana kitin ialah molekul MAMP biasa daripada dinding sel kulat yang menimbulkan tindak balas imun tumbuhan. Stringlis et al. [49] juga melaporkan satu set DEG terkawal telah diperkaya dalam istilah GO "tindak balas kepada kitin" daripada kitin, flg22, dan tumbuhan rhizobakteria Pseudomonas simiae WCS417 yang dirawat tumbuhan Arabidopsis yang bermanfaat. Matic et al. [33] melaporkan bahawa 21 DEG telah diperkayakan dalam istilah GO "tindak balas kepada kitin" daripada analisis RNA-seq daun padi bagi kultivar tahan tetapi bukan daripada kultivar yang mudah terdedah selepas jangkitan dengan patogen kulat Fusarium fujikuroi.

Gen PR (berkaitan patogenesis) terlibat dalam tindak balas imun tumbuhan [50] dan mempunyai aktiviti antikulat terhadap banyak kulat fitopatogenik [51]. Protein PR-10 adalah kecil, terutamanya berasid, protein intraselular dengan sifat antikulat yang telah dikaitkan dengan tindak balas pertahanan dalam spesies tumbuhan termasuk sorghum [52]. Ahli keluarga gen PR-10 telah diinduksi oleh serangan patogen dalam pelbagai jenis spesies tumbuhan [53]. Dalam sorghum, Lo et al. [26] melaporkan bahawa ungkapan PR-10 telah diinduksi sebagai sebahagian daripada pertahanan perumah aktif sorghum terhadap patogen kulat daun C. heterostrophus dan C. sublineolum. Katie et al. [54] melaporkan bahawa beberapa kultivar sorgum menunjukkan induksi ketara kuantiti relatif PR yang dinormalisasi-10 selepas inokulasi dengan spora kulat C. lunata dan F. capsicum dalam ujian lapangan. Dalam keadaan rumah hijau, glumes tumbuhan yang diinokulasi menunjukkan induksi PR{11}} mRNA, dan tindak balas adalah lebih besar dalam dua kultivar tahan yang diuji berbanding dengan dua kultivar yang mudah terdedah.

Keputusan kami mendedahkan bahawa antara DEG yang dikenal pasti, empat gen PR-10 ditemui (SORBI_3001G401300, SORBI_3001G401200, SORBI_3001G400800, SORBI_3001 G401000). Dalam SC155-14E semua empat PR-10 DEG dikawal oleh flg22 atau rawatan kitin, sebaliknya, dalam BTx623, SORBI_3001G401000 tidak ditemui dalam DEG dan SORBI{{15} }G401300 (terkawal naik) hanya dibentangkan dalam BTx623 dengan rawatan kitin tetapi tidak dengan rawatan flg22. Ini menunjukkan bahawa ekspresi gen PR boleh digunakan sebagai tindak balas kepada tahap produk ROS yang lebih tinggi selepas rawatan MAMP dan rintangan terhadap antraknosa dalam SC155-14E.

Asid salisilik (SA) ialah isyarat imun tumbuhan yang penting untuk tindak balas pertahanan tempatan dan rintangan yang diperoleh sistemik. Ia memainkan peranan penting dalam rintangan dan pertahanan tumbuhan terhadap serangan patogen [55]. Dalam sorghum, Tugizimana et al. [56] melaporkan perubahan kuantitatif dalam tahap asid jasmonik, konjugat asid salisilik, dan asid absisik dalam sorghum yang dijangkiti C. subline-ola. C. subline-ola ialah agen penyebab antraknosa. Genotip sorgum dengan tahap asid amino yang dipertingkatkan (tryptophan dan tyrosine), asid jasmonik dan konjugat salisilik, dan zeatin lebih tahan terhadap antraknosa. Dalam kajian ini, istilah GO 'tindak balas kepada asid salisilik' (GO:0009751) termasuk 19 DEG terkawal diperkaya secara khusus hanya dalam SC155-14E yang dirawat dengan kitin (Jadual S9). Oleh itu, laluan isyarat salisilik boleh memainkan peranan penting sebagai tindak balas kepada tahap pengeluaran ROS yang lebih tinggi selepas rawatan dan rintangan MAMP terhadap antraknosa dalam SC155-14E.

Tambahan pula, 169 DEG terkawal telah diperkaya dalam tindak balas istilah GO kepada tekanan semata-mata dalam SC155-14E yang dirawat dengan kitin (Jadual S9). Istilah GO lain yang ditemui semata-mata dalam SC155-14E yang dirawat dengan MAMP, tetapi tidak dalam BTx623 dengan rawatan yang sama ialah proses metabolik sekunder (GO:0019748), proses biosintetik fosfatidilkolin (GO:0006656) dan proses biosintetik lipid ( GO:0008610).

Tambahan pula, 169 DEG terkawal telah diperkaya dalam tindak balas istilah GO kepada tekanan semata-mata dalam SC155-14E yang dirawat dengan kitin (Jadual S9). Istilah GO lain yang ditemui semata-mata dalam SC155-14E yang dirawat dengan MAMP, tetapi tidak dalam BTx623 dengan rawatan yang sama ialah proses metabolik sekunder (GO:0019748), proses biosintetik fosfatidilkolin (GO:0006656) dan proses biosintetik lipid ( GO:0008610).

Kami juga mengkaji komposisi gen yang dikawal bersama antara kedua-dua genotip selepas rawatan flg22 atau kitin serta set teras DEG dalam semua rawatan dan dua genotip oleh analisis pengayaan GO (Rajah 4B dan 7B). Senarai penuh DEG disediakan dalam Jadual S14 dan S15. Rajah 4B menunjukkan syarat GO yang diperkaya bagi set teras jumlah DEG terkawal atas dan bawah dalam BTx623 dan SC155-14E dengan semua rawatan. Istilah GO yang berkaitan dengan tindak balas MAMP dan pertahanan tumbuhan (cth, pengikatan kitin, tindak balas pertahanan, aktiviti kinase protein, fosforilasi protein, aktiviti protein serin/treonine kinase) diperkaya dengan ketara dalam DEG yang dikawal selia manakala istilah GO bagi proses biosintesis metabolit sekunder, pengikatan ion besi, aktiviti oksidoreduktase hanya diperkaya dalam DEG yang dikawal ke bawah. Keputusan ini adalah serupa dengan keputusan dalam Arabidopsis di mana istilah GO yang berkaitan dengan tindak balas kepada elicitor (peptida flg22 daripada P. simile WCS417 dan P. aeruginosa PAO1, chitin, dan sel bakteria P. simile WCS417) telah diperkaya dengan paling ketara dalam terkawal naik. set teras DEG [49].

Rajah 7B menunjukkan terma GO yang diperkaya dengan ketara bagi set terkawal bersama (iaitu, terkawal atas atau bawah dalam kedua-dua genotip) set DEG antara BTx623 dan SC155-14E selepas rawatan flg22 atau kitin. Keputusan menunjukkan bahawa istilah GO yang berkaitan dengan tindak balas MAMP dan pertahanan tumbuhan (cth, tindak balas pertahanan, aktiviti kinase protein, fosforilasi protein, aktiviti kinase serin/treonin protein) hanya diperkaya dalam DEG terkawal flg22 atau kitin dalam kedua-dua genotip manakala istilah GO proses biosintesis metabolit sekunder, pengikatan heme, pengikatan ion besi, aktiviti oksidoreduktase satu atom oksigen dan proses biosintesis fosfatidilkolin diperkayakan semata-mata dalam set DEG yang dikawal ke bawah.

2.4. Analisis Pengayaan Laluan KEGG bagi Respons MTI BTx623 dan SC155-14E

Rajah 9 menunjukkan analisis pengayaan laluan KEGG bagi DEG terkawal yang ditemui dalam sampel BTx623 dan SC155-14E yang dirawat MAMP menggunakan alat dalam talian DAVID [57]. Senarai penuh DEG disediakan dalam Jadual S16–S20. Hasilnya mengenal pasti laluan KEGG teratas khusus yang diperkaya sebagai hasil daripada pengaktifan MTI dalam dua genotip sorgum. Dalam laluan KEGG "interaksi tumbuhan-patogen", kami memerhatikan bahawa 24 DEG terkawal telah diperkayakan dalam sampel SC{11}}E yang dirawat kitin, manakala tiada satu pun DEG diperkaya dalam sampel BTx623 yang dirawat kitin. Tindak balas kitin yang lebih kuat bagi genotip SC155-14E memang berkait dengan rintangan yang lebih besar bagi genotip ini kepada penyakit kulat antraknosa [39]. Selain itu, pengayaan laluan KEGG mendedahkan 28 gen yang terlibat dalam biosintesis fenilpropanoid jangka dalam SC155-14E dirawat dengan flg22. Laluan biosintesis fenilpropanoid bermula dengan fenilalanin yang boleh ditukar kepada sebatian aromatik seperti flavonoid, benzenoid, kumarin, hidroksisinamat, dan lignin [58,59]. Banyak fenilpropanoid dan flavonoid terlibat dalam tindak balas rintangan penyakit [28,60]. Pengeluaran phytoalexin adalah tindak balas pertahanan utama terhadap patogen antraknosa C. subline-ola [28] dalam sorghum. 3- anthocyanidins deoksi ialah kumpulan flavonoid luar biasa yang diiktiraf sebagai fitoaleksin dalam sorghum. Phytoalexin adalah molekul kecil dengan aktiviti antimikrob yang dihasilkan selepas jangkitan patogen [61]. Wang et al. [37] juga mendapati bahawa biosintesis fenilpropanoid istilah KEGG diperkaya dengan ketara dalam DEG tumbuhan yang dijangkiti subline-ola dalam kajian transkriptomi sorghum mereka. Kita harus ambil perhatian bahawa keputusan pengayaan laluan KEGG (Rajah 9) juga menunjukkan tindak balas BTx623 yang lebih tinggi selepas rawatan MAMP dalam beberapa laluan yang mungkin memainkan peranan dalam interaksi tumbuhan-patogen (cth, dalam laluan fenilalanin dan biosintesis triptofan, biosintesis antibiotik).

Tambahan pula, hasil analisis pengayaan laluan KEGG bagi DEG terkawal turun menunjukkan bahawa sepuluh DEG terkawal turun telah dijelaskan sebagai 'protein antena fotosintesis' dan 84 DEG telah dijelaskan sebagai mengambil bahagian dalam 'biosintesis metabolit sekunder' telah diperkaya dalam flg22 dirawat. BTx623. Walau bagaimanapun, kajian ekspresi gen tersebut boleh mengenal pasti gen yang dinyatakan secara berbeza sebagai tindak balas kepada rawatan MAMP atau jangkitan patogen, tetapi ia tidak semestinya menunjukkan bahawa gen ini penting untuk penentangan terhadap patogen tertentu. Oleh itu, penyelidikan lanjut diperlukan untuk memahami hubungan penyebab antara rintangan kulat dan pengaktifan laluan KEGG dalam kedua-dua genotip, seperti yang didedahkan oleh analisis RNA-Seq.

Kami juga melakukan analisis pengayaan laluan KEGG untuk set teras DEG dalam semua keadaan (Rajah 4C) serta DEG yang dikawal bersama antara kedua-dua genotip selepas rawatan flg22 atau kitin (Rajah 7C). Keputusan menunjukkan bahawa enam laluan penting, termasuk laluan interaksi tumbuhan-patogen, diperkayakan hanya dalam set teras terkawal atas DEG tetapi tidak dalam set teras DEG terkawal bawah. Begitu juga, tujuh dan tiga laluan, termasuk laluan interaksi tumbuhan-patogen, diperkaya dengan ketara dalam DEG terkawal kitin dan DEG terkawal naik flg22 dalam BTx623 dan SC155-14E, masing-masing. Sebaliknya, hanya biogenesis ribosom dalam laluan eukariota diperkaya dalam DEG yang dikawal ke bawah kitin dalam kedua-dua genotip.

2.5. Pengesahan Data RNA-Seq Menggunakan RT-PCR Kuantitatif bagi Gen Terpilih

Untuk mengesahkan data profil ekspresi gen yang diperolehi oleh RNA-seq, kami melakukan analisis qRT-PCR untuk menilai ekspresi sembilan gen calon terpilih. Sembilan gen tersebut dipilih berdasarkan ungkapan yang diperhatikan oleh RNA-seq dalam tiga kategori: (a) dinyatakan sama dalam BTx623 dan SC155-14E dengan rawatan flg22 atau kitin; (b) dinyatakan hanya dalam MAMP yang dirawat SC155-14E tetapi dengan ungkapan yang sangat rendah dalam BTx623 yang dirawat dan (c) dinyatakan 2–21-kali ganda lebih tinggi dalam MAMP yang dirawat SC155-14E berbanding dengan BTx623 . Keputusan analisis qRT-PCR (Jadual 1) mendedahkan persetujuan penuh dengan tahap ekspresi yang ditentukan oleh analisis RNA-seq untuk setiap sembilan gen yang dinilai. Keputusan ini memberi kita keyakinan bahawa pengukuran yang dibuat oleh RNA-seq mencerminkan tindak balas transkrip garis sorghum kepada rawatan MAMP

2.6. Kesimpulan

Dalam kajian ini, kami mula-mula menemui keadaan optimum untuk perbandingan tindak balas MTI kedua-dua genotip dengan menguji pengeluaran ROS menggunakan tiga set daun dan memilih daun kedua termuda tumbuhan berusia lima belas hari untuk pengekstrakan RNA dan analisis transkriptomi berikutnya. Satu perjalanan masa flg22-penghasilan ROS yang dicetuskan dan dicetuskan kitin dalam barisan sorghum SC155-14E (Rajah 1C) mendedahkan bahawa pengeluaran ROS yang dicetuskan kitin berlaku lebih awal daripada yang dicetuskan oleh rawatan flg22. Kami memperoleh profil ekspresi penyakit kulat anthracnose-resistant Sorghum bicolor genotip SC155-14E dengan tindak balas yang tinggi terhadap rawatan MAMP pada pengeluaran ROS dan genotip mudah terdedah BTx623 dengan tindak balas yang rendah pada produk ROS kepada rawatan MAMP semasa peringkat awal daripada tindak balas imuniti semula jadi.

Keputusan menunjukkan variasi ekspresi gen yang jelas dalam genotip sorghum BTx623 dan SC155-14E sebagai tindak balas kepada rawatan MAMP. Walaupun respons kepada dua MAMP menunjukkan pertindihan yang banyak dalam setiap baris (86.6–70.8 peratus ), ia adalah berbeza. Beberapa, walaupun lebih rendah, pertindihan (68.3-29 peratus ) juga diperhatikan antara tindak balas dua baris kepada MAMP yang sama. Sebilangan besar DEG, 2272 daripada 10,535 DEG, telah dikenal pasti dalam keempat-empat keadaan dan secara tentatif mentakrifkan tindak balas MAMP teras. Senarai gen ini sepatutnya berguna kepada makmal yang ingin memprofilkan tindak balas ekspresi gen terhadap rawatan MAMP. Analisis RNA-seq mengenal pasti set besar gen yang dinyatakan secara berbeza dalam BTx623 dan SC155-14E yang dirawat dengan flg22 atau kitin berbanding kawalan olok-olok yang tidak dirawat bagi kedua-dua baris tersebut. Tambahan pula, perbandingan DEG yang dipilih menggunakan dua saluran paip bioinformatik yang berbeza menunjukkan hasil yang hampir sama. Analisis profil ekspresi terperinci DEG ini, analisis pengayaan GO dan analisis laluan KEGG mendedahkan variasi yang jelas dalam tindak balas ekspresi gen kedua-dua genotip. Istilah GO dan pengayaan laluan KEGG menemui lebih banyak imuniti dan DEG yang berkaitan dengan rintangan patogen (gen PR, tindak balas gen kepada kitin, tindak balas gen kepada asid salisilik, tindak balas kepada tekanan, biosintesis fenilpropanoid, dll.) dalam SC yang dirawat MAMP{{18} } Sampel E relatif kepada BTx623 dengan rawatan yang sama. Maklumat ini menyediakan maklumat asas yang penting tentang cara sistem imun semula jadi tumbuhan tanaman utama ini bertindak balas terhadap elisitasi MAMP. Memandangkan kekurangan maklumat umum tentang tindak balas imun semula jadi tumbuhan tanaman, berbanding dengan model Arabidopsis, senarai gen dan kaedah yang diterangkan menyediakan sumber untuk penerokaan lanjut tentang tindak balas sorgum kepada patogen dan harus memudahkan usaha untuk akhirnya meningkatkan ketahanan penyakit dalam makanan penting dan tanaman biojisim ini.

3. Bahan dan Kaedah

3.1. Bahan Tumbuhan

Dua garisan sorghum yang disediakan oleh Dr. William Rooney (Texas A&M University, College Station, USA) dan Dr. Stephen Kresovich (Clemson University, Clemson, USA) telah digunakan dalam kajian ini. BTx623 ialah garis sorghum standard dengan jujukan genom keseluruhan yang tersedia [22], dan SC155-14E ialah garisan yang dibangunkan untuk rintangan antraknosa [39].

3.2. Ujian ROS

Biji sorgum BTx623 dan SC155-14E disterilkan di permukaan (70 peratus etanol selama 1 minit dan kemudian 10 peratus peluntur selama 10 minit, dibilas dengan ddH2O diautoklaf) dan ditanam dalam campuran pasu Sunshine diautoklaf, dan bercambah dalam ruang pertumbuhan ( 16 j/8 j terang/gelap, 28/26 ◦C, 60–70 peratus kelembapan). Tumbuhan berusia lima belas hari digunakan untuk eksperimen.

Dua MAMP, flg22 (Katalog Genscript# RP19986) dan kitin daripada kulit ketam (Sigma-Aldrich, katalog# C3641), telah digunakan dalam kajian ini. Flg22 adalah peptida yang diperoleh daripada flagellin N-terminus bakteria patogen tumbuhan dan terkenal untuk menimbulkan tindak balas imun semula jadi tertentu dalam tumbuhan [62]. Kitin adalah molekul MAMP tipikal yang diperoleh daripada dinding sel kulat, yang menimbulkan tindak balas imun tumbuhan [3]. Ujian ROS dilakukan mengikut Kimball et al. [38]. Untuk menilai variasi dalam tindak balas MAMP dalam genotip individu, serta kedudukan daun, ketiga-tiga daun tumbuhan yang berkembang sepenuhnya bagi setiap genotip dinilai secara individu. Daun dari bawah ke bahagian atas tumbuhan sorgum berumur lima belas hari bagi setiap genotip ditandakan sebagai daun #1, #2, dan #3. Kami hanya menggunakan bahagian tengah daun untuk pensampelan untuk mengukur pengeluaran ROS. Sejurus selepas rawatan, isyarat chemiluminescent setiap sampel direkodkan selama 30 minit menggunakan kamera CCD Photek (Photek Ltd., East Sussex UK). Lapan telaga terdiri daripada rawatan olok-olok (tanpa MAMP) dan lapan telaga terdiri daripada rawatan (dengan MAMP). Dalam setiap kes, tiga replika biologi dengan jumlah 8 sampel dibandingkan untuk setiap rawatan.

3.3. Rawatan Sampel dengan MAMP

Tumbuhan berusia lima belas hari digunakan untuk eksperimen. Rawatan MAMP telah dilakukan seperti yang diterangkan dalam Valdes-Lopez et al. [12] dengan pengubahsuaian kecil. Secara ringkas, daun kedua (dari bahagian atas iaitu, daun kedua termuda) daripada lima tumbuhan bagi setiap garisan sorgum telah ditanggalkan dan kemudian vakum menyusup dengan ddH2O diautoklaf selama 2 minit. Kira-kira lima puluh 1 cm diameter cakera daun dipotong daripada daun yang diresap air bagi setiap genotip dan dikumpulkan. Empat puluh lima cakera daun daripada setiap genotip dipindahkan ke dalam tiga cawan Petri yang berbeza (15 cakera daun dalam setiap piring petri) dan kemudian diapungkan semalaman pada suhu bilik pada ddH2O diautoklaf dengan plat ditutup dengan kerajang aluminium. Keesokan harinya, air dikeluarkan dari semua cawan Petri dan digantikan dengan 10 mL ddH2O (olok-olok), 10 mL 1 µM flg22, atau 10 mL larutan kitin 20 mg/mL. Selepas 60-rawatan min, hirisan daun olok-olok dan dirawat MAMP dituai ke dalam tiub yang berbeza dan serta-merta dibekukan dalam nitrogen cecair. Sampel hirisan daun (untuk 101quenced "ies ied-11272) imunitiBTx623 dan SC155-14E dengan rawatan olok-olok, flg22 atau kitin, tiga replika biologi) disimpan pada −80 ◦C untuk pengekstrakan RNA. Semua prosedur yang diterangkan di atas telah dilakukan dalam keadaan gelap untuk menghapuskan sebarang kemungkinan kesan fotosintesis.

3.4. Pengekstrakan RNA, Penjujukan dan Pembinaan Perpustakaan

Pengekstrakan RNA dilakukan menggunakan kit Direct-zol RNA Miniprep Plus daripada Zymoresearch (katalog #R2071) mengikut arahan pengilang

Penjujukan prestasi tinggi telah dilakukan di Kemudahan Teras DNA Universiti Missouri. Lapan belas perpustakaan telah dibina mengikut protokol pengeluar dengan reagen yang dibekalkan dalam kit penyediaan sampel terkandas TruSeq mRNA Illumina. Kepekatan sampel ditentukan oleh fluorometer Qubit (Invitrogen) menggunakan kit ujian RNA Qubit HS, dan integriti RNA telah diperiksa menggunakan sistem elektroforesis automatik Fragment Analyzer. Secara ringkas, poli-A yang mengandungi mRNA telah disucikan daripada jumlah RNA (1 µg), RNA telah berpecah-belah, cDNA beruntai dua dihasilkan daripada RNA yang berpecah, dan indeks yang mengandungi penyesuai diikat ke hujungnya. Konstruk cDNA yang diperkuat telah disucikan dengan penambahan manik Pembersihan PCR Axyprep Mag. Pembinaan akhir setiap perpustakaan yang telah dimurnikan telah dinilai menggunakan sistem elektroforesis automatik Penganalisis Fragmen, dikira dengan fluorometer Qubit menggunakan kit ujian dsDNA Qubit HS, dan dicairkan mengikut protokol penjujukan standard Illumina untuk penjujukan pada NextSeq 500. Panjang penjujukan adalah tunggal dibaca pada 75 pangkalan.

3.5. Pemetaan dan Pemprosesan Bacaan RNA-Seq

Data jujukan mewakili enam keadaan berbeza: BTx623 dengan rawatan olok-olok, flg22 atau kitin dan SC155-14E dengan rawatan olok-olok, flg22 atau kitin. Setiap keadaan diwakili oleh tiga replika biologi, menghasilkan 18 jumlah sampel. Mula-mula, 30 hujung bacaan telah "dipotong" untuk penyesuai Illumina, untuk nukleotida samar-samar (N's) dan (kerana teknologi NextSeq) untuk poli-G buatan (diwakili sebagai G{100}) menggunakan cutadapt versi 1.15 (http://dx.doi.org/10.14806/ej.17.1.200, diakses pada 21 Ogos 2019) untuk bacaan yang 30 hujungnya bertindih dengan penyesuai untuk sekurang-kurangnya 3 pangkalan dengan 90 peratus identiti. Jika selepas pemangkasan ini, bacaan mengandungi kurang daripada sepuluh asas ia dibuang (bersama bacaan berpasangan, jika berkenaan). Skor kualiti untuk data seq RNA selepas pemangkasan diperiksa menggunakan FASTQC (versi 0.11.9) [63]. Untuk semua kedudukan dalam bacaan, skor kualiti median adalah sekitar 34, menunjukkan ketepatan panggilan asas adalah lebih tinggi daripada 99.9 peratus . Bacaan untuk setiap sampel telah diselaraskan dengan genom rujukan (Sorghum_bicolor_NCBIv3.dna. peringkat atas. fa) dengan Tophat 2.1.1. Fail penjajaran yang terhasil telah disediakan kepada Cufflinks 2.2.1 untuk memasang transkrip bagi setiap sampel. Versi anotasi yang digunakan dalam penyelidikan ini ialah Sorghum_bicolor_NCBIv3.38.gff3. Sampel daripada keadaan yang sama telah digabungkan menggunakan Cuffmerge. Tujuannya adalah untuk menyediakan asas seragam untuk mengira ekspresi gen dan transkrip dalam setiap keadaan.

3.6. Analisis Bioinformatik Data RNA-Seq

Data seq RNA dianalisis menggunakan alat bioinformatik Bowtie{{0}}.3.4.3, TopHat 2.1.1 dan Cufflinks 2.2.1 (Cuffmerge, Cuffdiff) dengan parameter lalai. Kami menggunakan saluran paip yang sama dengan alat ini seperti yang diterangkan dalam Trapnell et al. [64]. Untuk mengesahkan lagi keputusan ujian, kami menggunakan saluran paip lain dengan HiSat2 (versi 2.1.0), HTSeq (versi 0.12.4) dan edgeR (versi 3.26.8) untuk melaksanakan analisis. HiSat2 ialah perkembangan seterusnya bagi TopHat2. Pertama, kami menggunakan HiSat2 untuk melakukan penjajaran menggunakan genom rujukan Sorghum. Kemudian kami menggunakan HTSeq untuk melakukan pengiraan bilangan bacaan yang dipetakan kepada setiap gen. Untuk ini, kami memerlukan fail bam yang dijana daripada langkah sebelumnya dan anotasi genom (fail gif). Ambil perhatian bahawa genom rujukan dan fail anotasi adalah sama seperti yang kami gunakan dalam saluran paip asal. Akhirnya, kami menggunakan pakej R edgeR untuk menentukan gen yang dinyatakan secara berbeza dalam setiap keadaan

3.7. Pengenalpastian Gen Berbeza
Perhimpunan yang digabungkan telah disalurkan kepada Cuffdiff, yang mengira tahap ekspresi dan menguji kepentingan statistik perubahan yang diperhatikan antara dua keadaan. Kami membandingkan keadaan antara mock vs. flg22 dan mock vs. chitin untuk BTx623 dan SC155-14E, masing-masing. Gen yang dinyatakan secara berbeza telah diekstrak menggunakan 0.001 ambang nilai p. Plot gunung berapi dibuat menggunakan pakej R (ggplot2 V3.3.0) untuk menunjukkan kepentingan perubahan ekspresi gen dalam keadaan BTx623 yang dirawat dengan flg22 atau kitin dan SC155- 14E dirawat dengan flg22 atau kitin, masing-masing. Titik gen dengan −log10 (nilai p) sama dengan atau lebih daripada tiga dianggap DEG. Dalam setiap plot, titik gen dengan log2 (lipatan{17}}perubahan) lebih besar daripada sifar ialah gen terkawal naik, jika tidak, gen terkawal turun.

3.8. Plot PCA

Untuk mengkaji hubungan antara nilai ekspresi gen bagi tiga replika biologi setiap baris sorghum dan setiap rawatan MAMP, plot analisis komponen utama (PCA) dijana menggunakan pakej R (ggfortify V{{0}}.4.10, ggplot2 V3 .3.0). Setiap titik mewakili keadaan selepas memetakan daripada ruang ciri asal (ungkapan gen) kepada dua komponen utama yang pertama. Titik yang tergolong dalam keadaan yang sama cenderung berkumpul bersama

3.9. Peta Haba DEG

1 Bahagian Sains Tumbuhan dan Teknologi dan Biokimia, Pusat Sains Hayat CS Bond, Universiti Missouri, Columbia, MO 65211, Amerika Syarikat; cuiy@missouri.edu (YC); chendq@cau.edu.cn (DC)

2 Jabatan Kejuruteraan Elektrik dan Sains Komputer, Pusat Sains Hayat CS Bond, Universiti Missouri, Columbia, MO 65211, Amerika Syarikat; yjm85@mail.missouri.edu (YJ); xudong@missouri.edu (DX)

3 Department of Entomology and Plant Pathology, NC State University, Raleigh, NC 27695, USA; pjbalint@ncsu.edu

4 Unit Penyelidikan Sains Tumbuhan, USDA-ARS, Raleigh, NC 27695, Amerika Syarikat

* Correspondence: staceyg@missouri.edu