Perubahan Metabolomik Urin Mengiringi Remisi Albuminuria Selepas Pembedahan Pintasan Gastrik Untuk Penyakit Ginjal Diabetik Jenis 2 Ⅱ

3. Perbincangan

Dalam subkajian MOMS RCT [20] ini, kami menyoal siasat perubahan metabolik 1H-NMR urin selepas rawatan dengan ubat sahaja atau dengan RYGB plus ubat dalampesakit obesiti, diabetes jenis 2, danmikroalbuminuria(Rajah 8).

Rajah 8. Gambaran keseluruhan perubahan metabolomik kencing yang berlaku pada 6 bulan selepas CSM. Metabolit yang meningkat dari garis dasar ke bulan 6 digariskan dengan warna merah manakala yang menurun digariskan dengan warna biru. Dicipta dengan BioRender.com. 1H-NMR, spektroskopi resonans magnetik nuklear proton; ACR,nisbah albumin kepada kreatinin; BMI, indeks jisim badan; HbA1c, haemoglobin terglikasi.

Berbanding dengan MTA, rawatan dengan CSM menghasilkan profil metabolomik kencing yang tersendiri. Perubahan metabolomik kencing yang disebabkan oleh CSM termasuk peningkatan perkumuhan hos-mikrob kometabolit N-phenylacetylglycine, trimethylamine N-oksida, dan 4-aminobutyrate (GABA) [28-33], serta peningkatan perkumuhan asid amino arginin dan glutamin. CSM juga mengurangkan kepekatan urin asid amino aromatik (phenylalanine dan tyrosine) serta BCAA (valin dan leucine) dan perantaraan katabolik yang berkaitan (3-hydroxyisobutyrate, 3-hydroxyisovalerate, dan 3-methyl{ {9}}oksovalerat). Walaupun pengurangan dalam kedua-dua asid amino aromatik dan BCAA mungkin berkaitan dengan penurunan berat badan dan kepekaan insulin yang lebih baik berikutan CSM [34-40], kepekatan urin asid amino aromatik yang berkurangan mungkin juga berkaitan secara langsung dengan penyerapan usus yang berkurangan berikutan RYGB, yang mengakibatkan peningkatan. metabolisme oleh bakteria usus [30].

Perkhidmatan Sokongan Wecistanche-Pengeksport cistanche terbesar di China:

E-mel:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Beli Untuk Butiran Spesifikasi Lebih Lanjut:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

KLIK DI SINI UNTUK MENDAPATKAN EKSTRAK CISTANCHE ORGANIK SEMULAJADI DENGAN 25% ECHINACOSIDE DAN 9% ACTEOSIDE UNTUK FUNGSI BUAH PINGGANG

Perubahan metabolomik yang paling ketara diperhatikan dalam kajian ini ialah peningkatan dalam perkumuhan air kencing bagi kometabolit hos-mikrob pada 6 bulan selepas CSM, termasuk N-phenylacetylglycine, trimethylamine N-oxide, 4-aminobutyrate (GABA), dan arginin. Yang penting, perubahan dalam hos kencing-mikrob kometabolit berikutan CSM adalah sederhana kepada kuat berkorelasi dengan peningkatan dalam tekanan darah, trigliserida, dan uACR sehingga 2 tahun selepas permulaan rawatan. Peningkatan perkumuhan kencing mikrometabolit hos berikutan RYGB telah dilaporkan sebelum ini, dan dikaitkan dengan perubahan komposisi dan fungsi dalam mikrobiota usus, yang mungkin menyumbang kepada peningkatan metabolik bebas penurunan berat badan berikutan prosedur [28-33,41,42]. ]. Seyfried et al. menunjukkan peningkatan perkumuhan kencing hos–mikrob kometabolit phenylacetylglycine, indoxyl sulfate, dan 4-cresyl glucuronide pada 2 dan 4 minggu selepas RYGB dalam model tikus Zucker yang obes [32]. Perubahan ini tidak diperhatikan berikutan sekatan kalori sahaja dalam model haiwan. Kami juga sebelum ini telah memerhatikan peningkatan perkumuhan N-phenylacetylglycine dan 3-indoxyl sulfate melalui kencing pada 4 minggu selepas kedua-dua RYGB sahaja dan RYGB digabungkan dengan fenofibrate, metformin, ramipril dan rosuvastatin dalam model tikus Zucker Diabetic Sprague Dawley [33] . Peningkatan perkumuhan air kencing mata N-phenylacetylglycine untuk mengurangkan penyerapan fenilalanin asid amino aromatik dan akibatnya metabolisme dipertingkatkan oleh bakteria usus berikutan RYGB [32]. Selaras dengan ini, perkumuhan fenilalanin kencing menurun dari garis dasar ke bulan 6 dalam lengan CSM.

Mengurangkan motilitas usus berikutan RYGB menggalakkan pembusukan protein, dengan protein yang tidak dicernakan sepenuhnya sampai ke kolon akibat pintasan pembedahan foregut [29]. Oleh itu, peningkatan perkumuhan najis GABA telah dilaporkan berikutan RYGB dalam model tikus dan dikaitkan dengan pembusukan protein dan pemprosesan mikrob putrescine yang diperoleh daripada ornithine [29,32,43]. Peningkatan GABA najis terlibat dalam peningkatan yang dicirikan dengan baik dalam peptida seperti glukagon-1 (GLP-1) yang diperhatikan selepas RYGB, kerana GABA boleh merangsang pelepasan GLP-1 daripada enterosit melalui GABAA ionotropik dan Reseptor GABAC [44,45]. GLP{11}}natriuresis terdorong terlibat dalam kesan antihipertensi dan renoprotektif RYGB [16,46]. GABA bukan sahaja boleh merangsang rembesan GLP{14}}, tetapi juga boleh memberikan kesan natriuretik langsung dan menurunkan tekanan darah melalui sistem GABAergik buah pinggang tempatan [47]. Oleh itu, potensi kesan renoprotektif langsung dan tidak langsung peningkatan perkumuhan GABA kencing diperhatikan berikutan CSM dalam kajian ini patut disoal siasat lanjut.

Perkumuhan arginin dan glutamin melalui air kencing (prekursor arginin [48]) juga meningkat berikutan CSM, dan kepekatan air kencing kedua-dua asid amino berkorelasi kuat antara satu sama lain secara sederhana (r=0.6). Dalam model tikus Wistar diet tinggi lemak, RYGB telah ditunjukkan untuk mengubah biosintesis arginin mikrob, menghasilkan kepekatan arginin kolon yang lebih rendah dan kepekatan aspartat kolon yang lebih tinggi [42]. Perubahan sedemikian tidak diperhatikan berikutan penurunan berat badan yang setara melalui cara pemakanan. Perubahan dalam arginin dan glutamin juga mungkin menunjukkan peningkatan penyerapan asid amino berikutan RYGB. RYGB mempercepatkan penghadaman protein dan menghasilkan peningkatan post-prandial yang lebih cepat dan lebih sementara dalam mengedarkan asid amino [49]. Dalam model tikus Zucker yang obes, RYGB telah ditunjukkan untuk meningkatkan penyerapan glutamin secara selektif dalam biliopancreatic dan anggota Roux melalui regulasi transkrip pengangkut glutamin B0AT1 [50]. Perubahan sedemikian dalam pengangkutan asid amino mungkin terlibat dalam faedah metabolik prosedur, kerana kedua-dua arginin dan glutamin boleh merangsang rembesan insulin daripada sel-sel pankreas, serta GLP-1 daripada sel-L usus [51– 53].

Mengurangkan perkumuhan urin BCAAs valine dan leucine serta perantaraan katabolik BCAA 3-hidroksibutirat (valine catabolite), 3-hydroxyisovalerate (leucine catabolite), dan 3-metil-2- oxovalerate (katabolit isoleucine) diperhatikan selepas CSM. Pengurangan dalam air kencing 3-hidroksiisobutirat, 3-metil-2-oksovalerat, dan perkumuhan valin adalah sederhana hingga kuat berkorelasi dengan peningkatan tekanan darah pada bulan 6 dan 24 dalam lengan CSM. Memandangkan hubungan yang mantap antara peningkatan tahap BCAA, rintangan insulin, dan hipertensi [34-40], ini menunjukkan bahawa sekuela fisiologi katabolisme BCAA yang lebih baik dalam otot rangka dan tisu adipos mungkin memainkan peranan dalam faedah antihipertensi dan metabolik RYGB [54]. ]. Malah, pengurangan dalam BCAA yang beredar telah dilaporkan berikutan RYGB dan gastrectomy lengan menegak [55,56], walaupun pengurangan dalam BCAA yang beredar mungkin tidak diperlukan untuk mencapai kesan metabolik yang bermanfaat dari pembedahan obesiti [57].

Katabolisme BCAA mungkin memberi kesan renoprotektif dengan membekalkan perantaraan kitaran asid trikarboksilik apabila pengoksidaan asid lemak (FAO) terjejas. Asid lemak adalah sumber tenaga utama untuktubul proksimal buah pinggang, rantau yang sangat memerlukan tenaga yang sensitif kepada kecederaan apabila FAO terjejas [58]. Sesungguhnya, kemerosotan FAO tiub proksimal terlibat dalam patogenesis DKD [58]. Ketukan khusus tubular proksimal faktor 6 Krüppel-like (KLF6), faktor transkripsi yang diinduksi dalam tubul proksimal pada awalkecederaan buah pinggang akutdan itu menindas katabolisme BCAA, tikus yang dilindungi daripadakecederaan buah pinggang akutdan fibrosis [59]. Tikus dilindungi daripadakecederaan buah pinggang akuttelah ditunjukkan untuk mengekalkan ekspresi gen yang mengekod enzim katabolik BCAA [59]. Oleh itu, katabolisme BCAA yang dipertingkatkan mungkin terlibat dalam pengurangan yang lebih besar dalam albuminuria yang diperhatikan selepas CSM pada 2-tahun susulan.

Kajian kita harus ditafsirkan dalam konteks batasan tertentu. Saiz kajian adalah sederhana, dengan sejumlah 97 sampel tertakluk kepada 1H-NMR merentasi dua cabang kajian (MTA dan CSM) dan dua titik masa (garis dasar dan bulan 6). Namun begitu, hakikat bahawa subkajian ini disarangkan dalam salah satu RCT pertama untuk menilai kesan RYGBon atitik akhir buah pinggang primeradalah kekuatan tersendiri bagi reka bentuk kajian [19,20]. Di antara pesakit yang termasuk dalam sub-kajian ini, terdapat perbezaan dalam etnik antara kedua-dua kumpulan kajian, dengan bahagian yang lebih tinggi daripada pesakit dalam kumpulan CSM adalah daripada etnik Kaukasia. Penemuan yang sama diperhatikan dalam kohort kajian utama [20]. Namun begitu, model PLS yang membandingkan keamatan puncak 1H-NMR kencing antara individu Kaukasia (n=18) dan etnik lain (n=10) pada garis dasar dalam cabang MTA tidak memberikan bukti perbezaan sistematik dalam air kencing. profil metabolomik yang berkaitan dengan etnik dalam kajian ini (Rajah S2). Analisis metabolik dilakukan pada sampel air kencing tempat awal pagi dan bukannya pengumpulan air kencing bermasa. Tidak semua sampel yang dianalisis dalam kajian semasa adalah sampel berpasangan daripada individu yang sama pada kedua-dua garis dasar dan bulan 6. Walau bagaimanapun, kami melakukan analisis sensitiviti terhad kepada subset sampel berpasangan (hampir separuh daripada semua sampel) dan menemui keputusan yang serupa.

PLS, berbanding kuasa dua terkecil separa ortogon (OPLS), model klasifikasi telah dilaksanakan dalam kajian ini. Walaupun model OPLS menawarkan kelebihan untuk mengalih keluar varians sistematik dalam set data yang tidak berkaitan dengan kelas sampel [60], model PLS yang dijalankan dengan pakej R MUVR mendapat manfaat daripada prosedur pengesahan silang berganda berulang bersarang, yang mengurangkan risiko overfitting model. [61]. Bertentangan dengan algoritma PLS konvensional yang menyediakan anggaran daripada model ramalan kesesuaian dan keputusan pengesahan silang sebagai titik perbandingan, algoritma MUVR hanya menyediakan anggaran daripada pengesahan silang untuk mengurangkan kemungkinan pemasangan model dan penemuan positif palsu [61] . Ini adalah pertimbangan penting dalam kajian seperti ini dengan saiz sampel yang agak kecil [61,62]. Malangnya, model klasifikasi OPLS masih belum dapat dilaksanakan menggunakan pakej R MUVR [61]. Oleh itu, walaupun kekurangan penilaian variasi dalam pembolehubah peramal ortogon kepada tindak balas, kami merasakan bahawa adalah lebih baik untuk membentangkan hasil daripada model PLS yang dilaksanakan melalui MUVR berbanding model OPLS yang dijalankan tanpa pengesahan silang berganda berulang dalam kajian ini.

4. Bahan dan Kaedah

4.1. MOMS RCT: Reka Bentuk dan Hasil Kajian

Kajian Hasil Mikrovaskular selepas Pembedahan Metabolik (MOMS) ialah satu pusat, rawak, tidak buta, percubaan klinikal terkawal (NCT01821508) yang menyiasat keberkesanan gabungan pembedahan metabolik serta terapi perubatan (CSM) berbanding terapi perubatan sahaja (MTA) untuk mencapai pengampunan albuminuria pada orang dewasa dengan obesiti kelas 1, diabetes jenis 2, dan mikroalbuminuria [20]. Kriteria kemasukan utama adalah umur 18-65 tahun, indeks jisim badan (BMI) 30-35 kg/m2, diabetes jenis 2 dengan HbA1c <12%, dan uACR> 30 mg/g. Hasil kajian utama ialah remisi mikroalbuminuria (uACR <30 mg/g). Pengambilan kajian berlaku antara 1 April 2013 dan 31 Mac 2016.

Pintasan gastrik Roux-en-Y (RYGB) ialah pembedahan metabolik yang digunakan dalam kajian MOMS dan dilakukan secara laparoskopi oleh pakar bedah tunggal (RVC) dengan kantung gastrik 30 mL, 150 cm anggota badan dan 80 cm biliopancreatic anggota badan. Ubat-ubatan dengan kesan berfaedah ke atas hasil mikrovaskular dan makrovaskular diabetes jenis 2 diberikan lebih awal selepas percubaan bermula jika pesakit belum menerimanya. Algoritma rawatan perubatan adalah konsisten dengan garis panduan masyarakat diabetes yang dikemas kini semasa susulan kajian [63]. Butiran lanjut tentang rawatan kajian tersedia dalam protokol kajian dan 24-kertas hasil bulan [19,20].

Hasil kajian yang dinilai pada peringkat awal serta pada bulan 6 dan 24 dan dibentangkan dalam subkajian ini termasuk uACR, kreatinin serum, HbA1c, lipid darah (kolesterol total, kolesterol lipoprotein berketumpatan rendah (LDL-C), kolesterol lipoprotein berketumpatan tinggi (HDL-C), dan trigliserida), tekanan darah, dan antropometri (berat badan, lilitan pinggang dan BMI). Sampel darah dan air kencing diperolehi selepas sekurang-kurangnya 8-j puasa. Sampel air kencing bintik telah dikumpul pada awal pagi. Pengukuran makmal dilakukan oleh makmal pusat yang sama, diperakui oleh ISO9001 dan ISO14001, dan diakreditasi oleh Kolej Patologi Amerika. Tekanan darah diukur dengan sphygmomanometer aneroid yang ditentukur selepas 5 minit berehat. Tekanan darah sistolik (SBP) dan tekanan darah diastolik (DBP) dikira sebagai min aritmetik bagi dua bacaan yang diperolehi dengan jarak 5 minit. Purata tekanan darah arteri (MAP) dikira dengan menambah 1/3 daripada tekanan nadi kepada DBP.

Kajian itu dijalankan mengikut garis panduan Deklarasi Helsinki dan diluluskan oleh Jawatankuasa Etika Penyelidikan Institusi Hospital Alemão Os waldo Cruz (nombor kajian: NCT01821508). Semua peserta memberikan persetujuan bertulis secara rasmi.

4.2. Analisis Metabolomik: Spektroskopi Resonans Magnet Nuklear (NMR).

Metabolom kencing dinilai oleh spektroskopi resonans magnetik nuklear 1H (NMR) dalam sampel air kencing yang dikumpul pada peringkat awal dan 6 bulan selepas campur tangan dalam subkumpulan pesakit yang mendaftar dalam kajian MOMS. Secara keseluruhan, 97 sampel daripada kedua-dua titik masa telah dianalisis; subset 46 daripada sampel ini adalah sampel berpasangan daripada individu yang sama pada kedua-dua titik masa. Bilangan sampel yang dianalisis, berstrata mengikut bahagian kajian dan titik masa, dibentangkan dalam Jadual 4.

Spektroskopi 1H-NMR telah dilakukan mengikut kaedah penyelidikan nostik Bruker In Vitro Diag standard (IVDr) [64]. Sampel air kencing telah dicairkan pada suhu bilik selama 20 min sebelum putaran ringkas pada 2000 g pada 4 ◦C selama 10 minit. Sampel NMR untuk rak SampleJet 5 mm disediakan dengan mencampurkan 9 bahagian air kencing dengan 1 bahagian penimbal air kencing (1.5 M KH2PO4 pD 6.95, 0.5% w/v NaN3, 0.1% w/v 3-trimethylsilyl propionic-2 ,2,3,3 garam natrium asid D4 (TSP-d4) dalam 99.8% D2O) menggunakan robot pengendalian cecair Samplepro Tube L (Bruker BioSpin, Ettlingen, Jerman), mengekalkan suhu pada 279 K sepanjang proses penyediaan sampel. Untuk mengelak tiub sampel, bola POM telah ditambah pada penutup tiub sebelum meletakkan rak dalam penukar sampel SampleJet yang disejukkan pada spektrometer.

Spektroskopi kesan Overhauser nuklear 1D (NOESY) dan eksperimen diselesaikan J 2D telah diperoleh untuk setiap sampel dengan spektrometer HD 600 MHz Bruker Avance III pada 300 K dilengkapi dengan probe suhu bilik 5 mm BBI , menggunakan set parameter standard IVDr untuk jujukan nadi 'noesygppr1d' dan 'jresgpprqf'. Percubaan NOESY 1D memerlukan pengumpulan 32 imbasan ke dalam 64k titik data, dengan lebar spektrum 20 ppm, masa pemerolehan 2.726 s, kelewatan kelonggaran selama 4 s, masa campuran NOESY 10 ms, 4 imbasan dummy pada tetapan keuntungan penerima 90.5, dan pengimbangan pratepu berpusat pada isyarat air. Untuk percubaan 2D J yang diselesaikan, selepas 16 imbasan tiruan, dua imbasan setiap kenaikan dikumpul kepada 40 kenaikan dalam dimensi tidak langsung, dengan 8k titik data dalam dimensi langsung, dan masa pemerolehan 0.4085 s dan 0.2137 s untuk langsung dan tidak langsung dimensi, masing-masing. Kelewatan kelonggaran ialah 2 s. Tingkap spektrum masing-masing ialah 16.7 ppm dan 93.6 Hz dalam dimensi langsung dan tidak langsung. Keuntungan penerima ditetapkan kepada 90.5 dan penindasan air dicapai melalui pratepu semasa kelewatan kelonggaran, serupa dengan eksperimen 1D NOESY.

Sampel air kencing telah rawak semasa penyediaan sampel supaya sampel dari kumpulan kajian dan titik masa yang berbeza diagihkan secara sama rata semasa pemerolehan data. TSP-d4 digunakan untuk rujukan anjakan kimia dalaman.

Sepuluh sampel terkumpul (n=5 setiap satu mengandungi aliquot sampel daripada kedua-dua titik masa, garis dasar dan bulan 6) telah dimasukkan sebagai kawalan kualiti dalaman. Pekali peratusan variasi dalam keamatan puncak ternormal PQN di kalangan sampel terkumpul garis dasar dan bulan 6 telah dikira untuk setiap puncak 1H-NMR beranotasi (n=208) seperti berikut:

Pengiraan dilakukan secara berasingan untuk sampel terkumpul garis dasar dan untuk bulan 6, dan pekali nilai variasi untuk setiap puncak beranotasi telah dimuat naik ke https: //osf.io/vs2dg/ (diakses pada 15 Januari 2022). Plot ketumpatan yang menonjolkan taburan pekali nilai variasi untuk setiap puncak 1H-NMR beranotasi telah dibina. Paksi-x plot ketumpatan telah diubah log menggunakan transformasi 'log1p' daripada skala pakej R [25]. Plot ilustrasi spektrum sampel terkumpul yang dinormalisasi PQN dijana untuk puncak tertentu yang didapati diubah oleh CSM melalui analisis multivariat menggunakan fungsi 'ROIplot' daripada pakej R speaq [26], dengan itu menunjukkan varians rendah dalam intensiti puncak antara sampel terkumpul .

Untuk memudahkan anotasi metabolit, satu set percubaan 2D pada sampel terpilih telah diperoleh pada magnet Oxford 800 MHz yang dilengkapi dengan konsol Bruker Avance III HD dan cryoprobe TCI 3 mm. 13C-HSQC yang diedit kepelbagaian telah diperoleh menggunakan jujukan nadi 'hsqcedetgpsisp2.3' menggunakan lebar spektrum 20 dan 90 ppm masing-masing dalam dimensi langsung dan tidak langsung, mengumpul 64 imbasan setiap kenaikan untuk sejumlah 512 kenaikan dan 2048 titik data. Masa pemerolehan masing-masing ialah 63.9 dan 14 ms untuk dimensi langsung dan tidak langsung, dan kelewatan kelonggaran ialah 1.5 s. TOCSY 1H-1H telah diperoleh menggunakan jujukan nadi 'dipsi2esgpph' dengan lebar sapuan dalam kedua-dua dimensi 12 ppm, mengumpul 16 imbasan setiap kenaikan kepada 512 kenaikan dan 8192 titik data. Masa pemerolehan masing-masing adalah 0.426 s dan 26.6 ms untuk dimensi langsung dan tidak langsung. Kelewatan pemindahan TOCSY ialah 60 ms dan kelewatan kelonggaran antara imbasan ialah 1 s. 1H-1H-COSY telah diperoleh dengan jujukan nadi 'cosygpppqfpr'. Lebar sapuan adalah 13.95 ppm dalam kedua-dua dimensi; 4 imbasan setiap kenaikan telah dikumpulkan untuk sejumlah 1024 kenaikan dan 2048 titik data. Masa pemerolehan ialah 92 ms dan kelewatan kelonggaran 2 s. Semua spektrum 2D dirujuk kepada TSP-d4. Jadual anjakan kimia yang menggariskan nilai anjakan 13C-HSQC, 1H-TOCSY dan 1H-COSY untuk semua puncak (n=475) dan untuk subset puncak beranotasi (n=208) boleh didapati di: https ://osf.io/vs2dg/, diakses pada 15 Januari 2022.

4.3. Pemprosesan Spektrum 1H-NMR

Spektrum NOESY 1D yang ditakdirkan untuk pemilihan puncak dan analisis multivariate telah diproses oleh program IVDr AU automatik, bermakna ia diisi sifar dua kali sebelum transformasi Fourier menjadi 128k titik data, menambah 0.3 Hz eksponen garis-pelebaran dan merujuk kepada TSP-d4. Spectra telah diproses dalam TopSpin3.5pl7 (Bruker BioSpin, Et tlingen, Jerman). Spektrum NOESY 1D telah dimuatkan ke dalam MATLAB menggunakan RBNMR [65]. Pembetulan garis dasar spektrum dilakukan kerana kepekatan glukosa kencing yang tinggi terdapat dalam sampel garis dasar menggunakan perintah 'msbackadj' dengan saiz tetingkap ditetapkan kepada 2000, kuantiti ditetapkan kepada 0.1 dan saiz langkah ditetapkan kepada 1000 [66 ]. Spektrum NOESY 1D yang diperbetulkan garis dasar dan vektor anjakan kimia bahagian per juta (ppm) yang disertakan bersama metadata sampel tersedia di: https://osf.io/vs2dg/, diakses pada 15 Januari 2022.

Analisis lanjut data NMR dilakukan menggunakan bahasa pengaturcaraan statistik R (4.1.1) [67]. Nilai anjakan kimia spektrum dan ppm telah diimport dan diproses menjadi matriks keamatan puncak mengikut aliran kerja standard menggunakan pakej R bercakap [26]. Pengesanan puncak dilakukan menggunakan kaedah wavelet topi Mexico yang dilaksanakan oleh fungsi 'getWaveletPeaks'. Puncak yang dikesan telah diselaraskan dan dikumpulkan ke dalam satu nilai indeks ppm menggunakan fungsi 'PeakGrouper'. Plot spektrum mentah, pengesanan puncak dan pengumpulan/penjajaran puncak menggunakan speaq dijana menggunakan fungsi 'ROIplot' dan disemak secara manual untuk setiap puncak minat. Contoh ilustrasi bagi satu plot sedemikian dibentangkan dalam Rajah 9. PDF yang menggariskan plot spektrum mentah, pengesanan puncak, penjajaran puncak dan keamatan puncak mengikut kumpulan untuk semua puncak beranotasi (n=208) tersedia di: https ://osf.io/vs2dg/, diakses pada 15 Januari 2022.

Rajah 9. Spektrum mentah dan pemprosesan spektrum bagi puncak spektroskopi 1H-NMR urin terpilih. (A) Spektrum mentah 1H-NMR bagi puncak N-phenylacetylglycine terpilih. Setiap baris sepadan dengan spektrum sampel tunggal. (B) Pengesanan puncak dalam spektrum menggunakan transformasi wavelet topi Mexico. Setiap titik mewakili keamatan puncak untuk satu sampel. (C) Penjajaran puncak dengan mengumpulkan untuk mengambil kira anjakan puncak antara spektrum disebabkan oleh perbezaan dalam persekitaran sampel dan/atau keadaan eksperimen. Setiap titik mewakili keamatan puncak untuk satu sampel. Pemeriksaan manual spektrum dan pemprosesan spektrum dalam speaq telah dilakukan seperti yang digariskan di sini untuk puncak yang dikenal pasti sebagai penting kepada prestasi pengelasan oleh model multivariate untuk memastikan bahawa perbezaan antara kumpulan dalam puncak yang dikenal pasti tidak artifak dan boleh dikenal pasti dengan pasti dalam spektrum. Spektroskopi 1H-NMR, spektroskopi resonans magnetik nuklear proton; CSM, gabungan pembedahan metabolik serta terapi perubatan; CSM0, sampel garis dasar daripada kumpulan CSM; CSM6, sampel bulan 6 daripada kumpulan CSM; MTA, terapi perubatan sahaja; MTA0, sampel garis dasar daripada kumpulan MTA; MTA6, sampel bulan 6 daripada kumpulan MTA; PPM, bahagian per juta anjakan kimia berbanding TSP-d4.

Nilai siluet dikira sebagai metrik kualiti pengumpulan puncak menggunakan fungsi 'SiluetR'. Kumpulan puncak dengan nilai siluet kurang daripada {{0}}.6 telah dialih keluar dan puncak dikumpulkan semula dengan fungsi 'kumpulan semula'-proses ini diulang secara berulang sehingga semua kumpulan puncak mempunyai nilai siluet Lebih besar daripada atau sama dengan 0.6. Pengisian puncak dilakukan untuk mengesan puncak yang mungkin terlepas semasa pusingan pertama pengesanan puncak.

Akhirnya, matriks keamatan puncak dibina dengan puncak berkumpulan (dikenal pasti oleh nilai anjakan ppm mereka) sebagai lajur dan sampel sebagai baris. Normalisasi hasil kebarangkalian (PQN) telah digunakan pada matriks keamatan puncak [68,69], yang kemudiannya digunakan sebagai input untuk statistik multivariate. Matriks intensiti puncak yang dinormalisasikan mentah dan PQN serta metadata yang sama tersedia di: https://osf.io/vs2dg/, diakses pada 15 Januari 2022. Anotasi spektrum yang diproses telah dilakukan menggunakan perisian Chenomx 8.6 (Chenomx Inc.) , Pangkalan Data Metabolom Manusia (HMDB; https://hmdb.ca/; diakses pada 15 Januari 2022), Bank Data Resonans Magnetik Biologi (BMRB; https://bmrb.io/; diakses pada 15 Januari 2022), dan data NMR 2D yang diperoleh untuk sampel terpilih [70-72].

4.4. Analisis Komponen Utama Data 1H-NMR

Pengelompokan oleh analisis komponen utama (PCA) telah dilakukan pada intensiti puncak NMR yang dinormalisasi PQN menggunakan fungsi 'prcomp', dan diplotkan oleh fenotip di sepanjang komponen utama 1-3 menggunakan fungsi 'scatter3D' daripada pakej R plot3D [73] . Sampel garis dasar dari lengan CSM dan MTA telah dipertimbangkan bersama untuk meningkatkan kejelasan pada plot PCA. Centroid dikira sebagai skor min sepanjang komponen utama 1–3 untuk tiga kumpulan: garis dasar, MTA6 dan CSM6. Ellipsoid dikira di sepanjang komponen utama 1–3 menggunakan fungsi 'makeEllipsoid' daripada pakej R ChemoSpec dan diplot menggunakan 'scatter3D' [27,73]. Pemuatan diekstrak daripada objek komponen utama dan diplot menggunakan fungsi 'scatter3D', dengan puncak terpilih dilabelkan [73].

4.5. Pengujian Perubahan Lipat Data 1H-NMR

Untuk perbandingan minat antara kumpulan, perubahan kali ganda dalam keamatan puncak 1H-NMR kencing ternormal PQN telah dikira. Untuk perbandingan antara kumpulan menggunakan semua sampel yang tersedia, ujian-t tidak berpasangan dilakukan menggunakan statik pakej R untuk membandingkan keamatan setiap puncak antara kedua-dua kumpulan sampel [74]. Untuk perbandingan antara kumpulan hanya menggunakan sampel berpasangan, ujian t berpasangan dilakukan menggunakan statik pakej R [74]. nilai-p telah diperbetulkan kepelbagaian untuk bilangan perbandingan (puncak) menggunakan kaedah Benjamini-Hochberg [75]. Untuk perbandingan antara kumpulan menggunakan semua sampel yang tersedia, purata intensiti puncak bagi setiap kumpulan telah diekstrak daripada objek ujian-t tidak berpasangan. Untuk perbandingan antara kumpulan sampel berpasangan, purata keamatan puncak mengikut kumpulan dikira menggunakan asas R fungsi 'min' kerana anggaran min tidak dikembalikan dalam objek ujian-t berpasangan [67]. Perubahan log2 kali ganda dikira sebagai:

Keputusan ujian perubahan lipatan untuk perbandingan menggunakan semua sampel yang tersedia (MTA{{0}} lwn. CSM0, MTA0 lwn. MTA6, CSM0 lwn. CSM6 , dan MTA6 lwn. CSM6) dipersembahkan sebagai plot gunung berapi, dengan perubahan lipatan log2 pada paksi-x dan –log10 nilai p-dibetulkan kepelbagaian pada paksi-y. Nilai perubahan lipatan log2 dan nilai p yang berkaitan untuk semua sampel yang tersedia CSM0 lwn. CSM6, sampel berpasangan CSM0 lwn. CSM6 dan perbandingan MTA6 lwn. CSM6 juga diringkaskan dalam jadual untuk puncak yang dikenal pasti sebagai diubah oleh CSM dari garis dasar ke bulan 6 oleh model klasifikasi kuasa dua terkecil separa multivariate (PLS).

4.6. Pemodelan Klasifikasi 1H-NMR

Untuk menjelaskan perbezaan dalam metabolom kencing antara pesakit yang dirawat dengan CSM dan MTA, pakej R MUVR digunakan untuk menyesuaikan satu siri model klasifikasi PLS multivariate untuk perbandingan dua kumpulan sampel pada satu masa [61]. Model MUVR telah dipasang pada matriks intensiti puncak 1H-NMR yang dinormalisasi PQN (matriks X) yang mengandungi sampel yang berkaitan untuk setiap perbandingan [61]. Vektor tindak balas AY yang menunjukkan tugasan kumpulan sampel telah dimasukkan ke setiap model yang diselia.

Kumpulan sampel yang digunakan untuk perbandingan yang disoal siasat oleh model MUVR digariskan dalam Jadual 5, bersama dengan bilangan sampel yang dimasukkan ke setiap model serta lokasi keputusan model dalam manuskrip. Seperti yang digariskan dalam Jadual 4 di atas, tidak semua sampel dari garis dasar hingga bulan 6 semestinya daripada individu yang sama. Untuk memaksimumkan penggunaan sampel serta kuasa statistik, model PLS utama dijalankan pada semua sampel yang tersedia (campuran sampel tidak berpasangan dan berpasangan) untuk perbandingan tertentu. Sebagai analisis sensitiviti, model PLS juga dipasang pada subset sampel berpasangan daripada individu yang sama pada kedua-dua titik masa untuk perbandingan yang berkaitan. ID sampel telah dimasukkan ke model sampel berpasangan ini dalam usaha untuk mengurangkan lampiran model dengan memastikan sampel daripada individu yang sama disimpan bersama dalam segmen pengesahan silang.

Jadual 5. Gambaran keseluruhan model MUVR dan lokasi keputusan dalam manuskrip 1 .

1 CSM, gabungan pembedahan metabolik serta terapi perubatan; CSM0, sampel garis dasar daripada kumpulan CSM; CSM6, sampel bulan 6 daripada kumpulan CSM; MTA, terapi perubatan sahaja; MTA0, sampel garis dasar daripada kumpulan MTA; MTA6, sampel bulan 6 daripada kumpulan MTA; MUVR, kaedah multivariate dengan pemilihan pembolehubah tidak berat sebelah dalam R.

Algoritma MUVR meminimumkan overfitting dalam pemodelan multivariate dengan melakukan penyingkiran rekursif pembolehubah yang paling kurang bermaklumat dalam prosedur pengesahan silang berganda berulang [61]. Parameter pemodelan berikut digunakan seperti yang disyorkan: nOuter=8 (bilangan segmen pengesahan silang luar, untuk memastikan kedua-dua kelas hadir dalam semua segmen model), nRep=100 (bilangan ulangan model, bilangan tinggi telah dipilih untuk meningkatkan kebolehulangan), dan varRatio=0.85 (kadaran pembolehubah dikekalkan dalam data setiap lelaran model semasa penghapusan pembolehubah) [61].

MUVR mengembalikan tiga model konsensus ('min', 'mid', dan 'max') dengan kecergasan yang serupa [61]. Model 'maks', yang mempertimbangkan semua peramal yang berkaitan tanpa menjejaskan prestasi pengelasan, telah dipilih untuk mengenal pasti seberapa banyak puncak 1H-NMR kencing yang mungkin yang berkaitan dengan mengelaskan sampel air kencing mengikut tugasan kumpulan. Kestabilan model merentas 100 ulangan dipastikan dengan memeriksa bilangan dan bahagian pembolehubah terpilih serta bilangan salah klasifikasi setiap ulangan dan secara kumulatif; penumpuan berlaku sebanyak 20 ulangan untuk semua model.

Kawasan di bawah lengkung ciri kendalian penerima (AUC) dan beberapa salah klasifikasi model telah digunakan untuk menilai prestasi model. Bilangan salah klasifikasi digunakan untuk menilai kesesuaian model klasifikasi MUVR PLS, dan bukannya metrik seperti R2X, R2Y, dan Q2 [61]. AUC dan selang keyakinan 95% yang berkaitan dikira dengan memasukkan kelas sampel sebenar bersama kebarangkalian kelas sampel yang diramalkan (diperolehi daripada model MUVR) kepada fungsi 'roc' daripada pakej R pROC [76]. Lengkung ciri operasi penerima (ROC) dijana menggunakan fungsi 'ggroc' daripada pakej pROC [76]. Metrik prestasi tambahan yang berkaitan dengan klasifikasi model, termasuk ketepatan pengelasan keseluruhan, statistik Kappa, kepekaan, kekhususan, nilai ramalan positif dan nilai ramalan negatif, telah dikira dengan memasukkan kelas sampel sebenar bersama kelas sampel yang diramalkan pada ambang kebarangkalian 50%. (diperolehi daripada model MUVR) kepada fungsi 'matriks kekeliruan' daripada karet pakej R [77]. Metrik prestasi ini dibentangkan dalam jadual untuk setiap model, disediakan menggunakan fungsi 'ggtexttable' daripada pakej R ggpubr [78]. Matriks kekeliruan telah diplotkan untuk setiap model MUVR yang menggariskan bilangan dan bahagian klasifikasi model yang betul dan salah menggunakan fungsi plot ggplot2 tersuai [79].