Dua Metabolit Manusia Menyelamat A C. Model Elegans Penyakit Alzheimer Melalui Tindak Balas Protein Terbuka Sitosolik Ⅱ

Rajah 3 Carnosine dan asid kinurenik menghalang A 42 toxicity in a cistanche model AD (GMC).Strategi saringan in vivo untuk mengenal pasti metabolit endogen yang menghalang A 42 pengagregatan digambarkan dalam (a). Kami menyaring enam metabolit calon yang dikenal pasti dalam acistanche model daripadaAlzheimer's penyakit. Metabolit (digambarkan sebagai M) diberi makan pada peringkat L4 cacing GMC dan kesannya dinilai pada hari ke-5 dewasa melalui (i) motilitas.ujian yang menentukan keseluruhankecergasandaripada cacing, dari segi perubahan dalam motilitas, dikira sebagai badan membongkok seminit (BPM) dan (ii) kuantifikasi NIAD-4-berwarna A 42 agregat (data saringan ditunjukkan dalam Rajah Tambahan 1). Panelb–g tunjukkan pencirian asid kinurenik dan karnosin untuk menyelamatkan acistanche model AD. Panel (b danc) menunjukkan motilitas cacing, diukur dalam lentur badan seminit (BPM) padaY-paksi vs hari dewasa padaX-paksi, dirawat dengan peningkatan kepekatan carnosine (biru) dan asid kinurenik (merah) berbanding cacing yang tidak dirawat (hitam). Peningkatan kekerapan membelasah diperhatikan sepanjang jangka hayat cacing sehingga 15µM carnosine dan asid kinurenik (b danc). Motilitas pada hari ke-5 dewasa, di mana manifestasi fenotip A 42 menonjol dalam cacing GMC, adalah signififibertambah baik dengan meningkatkan carnosine sehingga 15µM dan untuk asid kynurenik pada 10µM (d dane). Carta radar menunjukkan keseluruhannyakecergasandaripadacistanche sebagai fungsi kelajuan, lenturan seminit (BPM), dan nisbah langsung seperti yang dilihat pada setiap paksinya (d dane). Pewarnaan agregat dikira selepas cacing diinkubasi dengan pewarna khusus amyloidogenik NIAD-4 (f–g) (bar skala, 80μm). Anak panah putih dalam panel (f–g) tunjuk kepada NIAD-4-berwarna A 42 agregat, yang kelihatan berwarna oren-merah. Pada semua kepekatan yang diuji, rawatan carnosine signififimenghalang A 42 agregasi berbanding dengan cacing GMC seperti yang ditunjukkan dalam (f). Cacing kawalan N2, yang tidak menyatakan A 42, ditunjukkan sebagai perbandingan (bar skala, 80μm). Sama seperti carnosine, pengagregatan A 42 telah dihalang oleh rawatan asid kinurenik seperti yang ditunjukkan dalam (g). Untuk pemeriksaan NIAD-4 agregat, lebih kurang 15–23 haiwan dianalisis setiap keadaan untuk cacing GMC (AD) dan∼10 haiwan setiap cacing kawalan (N2). Kesan berfaedah asid kynurenic dan carnosine diperhatikan dalamn = 3 eksperimen bebas biologi. Semua bar ralat mewakili ralat standard min (SEM). Statistik dilakukan menggunakan ANOVA sehala, Dunnett's pelbagai perbandingan terhadap A yang tidak dirawat 42 kumpulan menggunakan GraphPad Prism,p-nilai ditunjukkan pada plot.

Rajah 4 Carnosine dan asid kinurenik tidak mempunyai kesan langsung pada A 42 pengagregatan.Profil kinetik pengagregatan 2μM A 42 sampel dalamketiadaan (hitam) dan kehadiran peningkatan kepekatan carnosine atau asid kinurenik (diwakili dalam warna yang berbeza). Proses pengagregatan bagiA 42 bukan signififidipercepatkan atau terencat dengan kehadiran salah satu metabolit (kepekatan metabolit yang lebih tinggi 20, 50, 100, dan 500μM ditunjukkan dalam Rajah Tambahan 3). Bar ralat dinyatakan sebagai sisihan piawai daripada tiga replika teknikal.

Klik Di Sini Untuk Mendapatkan Maklumat Lanjut Mengenai Cara Cistanche merawat AD

Carnosine dan asid kinurenik tidak secara langsung menghalang pengagregatan A 42. Untuk menguji sama ada carnosine atau asid kinurenik boleh secara langsung menghalang A 42 agregasi, kami menjalankan ThTflflujian kinetik kimia yang mengikat uorescence (lihat"Kaedah" bahagian). Kami tidak melihat, bagaimanapun, sebarang kesan langsung kedua-dua metabolit ini pada pengagregatan A 42, sekurang-kurangnya dalam julat kepekatan yang agak luas yang kami uji (Gamb.4 dan Rajah Tambahan 3), yang termasuk yang berkaitan secara fisiologi, menunjukkan bahawa mekanisme lain harus hadir yang bertindak untuk membersihkan agregat. Oleh kerana kehadiran mekanisme ini tidak mengecualikan kemungkinan bahawa metabolit endogen lain mungkin mempunyai kesan langsung pada A 42 pengagregatan, mungkin olehmembentuk agregat sendiri atau menggalakkan pemisahan fasa A 42 dalam sitoplasma, kami mencadangkan bahawa ia akan menjadi sangatmenarik untuk menguji metabolit endogen lain untuk kesan langsung ke atas pengagregatan protein.

Kesan Cistanche

Carnosine dan asid kinurenik meningkatkan tahap HSF-1 dan pendamping molekul. Kami kemudiannya menyiasat kesan carnosine dan asid kinurenik pada ekspresi HSF-1, pengawal selia induk HSR dalamcistanche. HSF-1 mengimbangi gen protein kejutan haba yang bertindak sebagai pendamping molekul untuk mengekalkan konformasi protein normal di bawah tekanan selular, melipat semula protein tersalah lipat dan menyasarkan protein yang rosak tidak dapat dipulihkan untuk degradasi42–44 (Gamb.5 dan Rajah Tambahan 5). Kami menggunakan antibodi yang disahkan untuk mengenal pasticistanche HSF-1 oleh imunopresipitasi dan spektrometri jisim45, untuk menyiasat HSF-1 dalam lisat daripada cacing yang dirawat dengan carnosine atau asid kinurenik. Kami memerhatikan peningkatan tahap HSF-1 berikutan rawatan dengan kedua-dua metabolit (Gamb.5a). Tahap HSF-1 meningkat dalam cara yang bergantung kepada dos sebagai tindak balas kepada kedua-dua rawatan asid karnosin dan kinurenik (Rajah 1).5a). Di dalamcistanche lisat dirawat dengan dua metabolit, kami memerhatikan jalur HSF-1 di∼100 kDa. HSF-1 terutamanya mengawal ekspresi gen yang mengekodkan pendamping molekul, terutamanya protein kejutan haba HSP90, HSP70 dan HSP40 yang bertindak sebagai cochaperone untuk HSP7046–48. Kami melihat pada tahap teras HSF-1-pengawal terkawal dan mendapati tahap HSP90 dan HSP70 telah dinaikkan dalam cacing GMC yang dirawat dengan 15μM kynurenic acid, tetapi bukan 15μM carnosine berbanding dengan GMC yang tidak dirawat dan cacing jenis liar (Rajah 1).5b, c). Kedua-dua DNJ-12 dan DNJ-19 menunjukkan tahap tinggi sebagai tindak balas kepada rawatan dengan asid karnosin dan kinurenik berbanding cacing GMC yang tidak dirawat dan cacing N2 jenis liar yang dirawat (Gamb.5d, e). Sebaliknya, kami tidak memerhatikan tandafifitidak dapat mengubah tahap DNJ-13 semasa rawatan metabolit (Gamb.5f). DNJ-12 dan DNJ-19 ialah kochaperon kelas A J-protein (HSP40) yang telah dicirikan secara in vivo dan in vitro untuk fungsi pemisahan proteinnya yang menggalakkan kesihatan organisma.48. Protein J juga telah dicirikan sebelum ini mempunyai aktiviti disaggregase dalam acistanche model polyQ, di mana pendamping bersama protein J kompleks bagi kelas A (DNJ-12 dan DNJ-19) dan B (DNJ-13) membolehkan aktiviti penyahgregatan melalui perkaitan dengan HSP{{5} } dan HSP-70, secara individu dan dalam kerjasama sinergi48,49. Data kami mencadangkan bahawa peningkatan dalam tahap HSF-1 selepas rawatan dengan carnosine dan

asid kynurenic menggalakkan peningkatan paras molekul pendamping dan kokaperon, khususnya, DNJ-12 dan DNJ-19 untuk membersihkan A 42 agregat. Kami kemudian bertanya sama ada perubahan dalam tahap protein disebabkan oleh transkripsi yang diubah dengan melakukan PCR kuantitatif masa nyata (RTqPCR). Tiada tandafifiperubahan lipatan tidak boleh dalam tahap mRNAhsf- 1, daf-21,danhsp-70 diperhatikan selepas rawatan dengan mana-mana metabolit. Walau bagaimanapun, selaras dengan data protein kami, kami mendapati bahawa tahap mRNAdnj-12 dandnj-19 telah dinaikkan dengan rawatan dengan kedua-dua metabolit. Menariknya, tahap mRNA untukdnj-13 juga dinaikkan dalam carnosine, tetapi bukan asid kynurenic, cacing yang dirawat, walaupun pada hakikatnya tiada tandafifiperubahan cant diperhatikan pada tahap protein (Rajah 1).6a). Kami selanjutnya bertanya sama ada metabolit ini mencetuskan UPR yang berkaitan dengan ER (UPRER) atau mitokondria (UPRmt) dengan meneliti tahap mRNA bagihsp-4danhsp-6, penanda kanonik UPRERdan UPRmt, masing-masing50,51. Tiada tandafifitidak dapat mengubah kedua-dua penanda ini berbanding dengan kawalan (Rajah.6b), dengan itu mengecualikan tindak balas ini sebagai mekanisme asas untuk pembersihan agregat dalam kajian ini. Untuk menentukan sama ada rawatan carnosine dan asid kinurenik menekan A 42 ketoksikan dan pengagregatan melalui HSF-1 dan

Rajah 5 Carnosine dan asid kinurenik mengaktifkan tindak balas protein terungkap sitosolik melalui mekanisme yang bergantung kepada HSF-1-.Western blots menunjukkan peningkatan perbezaan tahap protein pada rawatan dengan dua metabolit (a–f). Pada rawatan dengan asid carnosine dan kinurenik, kami melihat peningkatan relatif dalam tahap protein pendamping molekul dan pendamping bersama mereka dalam lysates cacing berbanding dengan kawalan, N2 yang tidak dirawat, dan GMC.n = ∼3000 cacing setiap keadaan; kami mengukur 3–4 ulangan setiap syarat; hanya wakil western blot ditunjukkan untuk setiap syarat. Daripada eksperimen yang diterangkan dalam Rajah.3, tandafifitidak dapat meningkatkan motilitas dan penurunan yang sepadan dalam agregat berwarna NIAD-4-diperhatikan pada dos 15μM daripada kedua-dua metabolit. Semua bar ralat menggambarkan ralat standard min (SEM).a–f tunjukkan jalur HSF-1, pendamping molekul hiliran dan protein J iaitu HSP-90, HSP-70, DNJ-12, DNJ-19 dan DNJ{{ 5}}, masing-masing, untuk kedua-dua cacing N2 (jenis liar) dan GMC (model AD). Untuk setiap eksperimen Western blot, kami menggunakan isyarat Tubulin untuk menormalkan jumlah kepekatan protein dalam setiap lorong. Kami kemudiannya menormalkan setiap keadaan band pendamping/co-chaperone dengan jalur tubulin yang sepadan daripada eksperimen yang sama dijalankan pada gel selari, untuk merancang keamatan dalam ImageJ. Gel untuk setiap keadaan dijalankan, masing-masing, pada masa yang sama, menggunakan penimbal berjalan yang sama, dalam sel elektroforesis yang sama dan sandwic pemindahan western blot yang sama ke membran. Membran ini dikembangkan lagi menggunakan antibodi yang sesuai (lihat"Kaedah" bahagian, Rajah Tambahan 5). Statistik dilakukan dalam GraphPad Prism menggunakan ANOVA sehala biasa; kami menggunakan Dunnett's ujian perbandingan berbilang dengan tidak dirawat (H2O) untuk setiap kumpulan yang dirawat metabolit N2 dan GMC;p-nilai ditunjukkan dalamangkasub-panel.

E-mel:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp tambah 86 15292862950