Tubuloside B Daripada Cistanche Salsa Menyelamatkan Sel-sel Neuronal PC12 Daripada 1-Metil-4-Apoptosis Dan Tekanan Oksidatif Ion Fenylpiridinium

Hubungi: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mel:audrey.hu@wecistanche.com

Guoqing Zheng, Xiaoping Pu, Li Lei, Pengfei Tu, Changling Li

Abstrak:

Pelindung sarafkesan tubuloside B daripada cistanche, salah satu phenylethanoid yang diasingkan daripada orang Cinaubat herba Cistanche salsa, pada apoptosis dan tekanan oksidatif yang disebabkan oleh 1-metil-4-fenilpiridinium ion (MPP tambah) dan tekanan oksidatif dalam sel neuron PC12 telah disiasat. Sel PC12 yang dirawat dengan MPP ＋mengalami kematian apoptosis seperti yang ditentukan oleh ujian MTF, sitometri aliran dan elektroforesis gel agarose DNA; pengumpulan intraselular spesies oksigen reaktif (ROS) diukur dengan pewarnaan DCFH-DA dengan mikroskopi konfokal pengimbasan laser (LSCM). Rawatan serentak dengan tuhuloside B melemahkan dengan ketara MPP＋ - sitotoksisiti yang disebabkan, pemecahan DNA, dan pengumpulan intrasel ROS. Keputusan ini menunjukkan dengan kuat bahawa tubuloside B menghalang apoptosis dan tekanan oksidatif yang disebabkan oleh MPP. Tubuloside B boleh digunakan sebagaipenyakit anti-Parkinsonejen.

pengenalan

Secara patologi, penyakit Parkinson sporadis (PD) biasanya dicirikan oleh kehilangan neuron katekolaminergik, terutamanya neuron dopaminergik substantia nigra pars compacta (SNc), dan kehadiran ciri intraneurona| kemasukan yang dipanggil badan Lewy di kawasan otak yang terjejas. Walaupun pelbagai faktor telah terlibat dalam patogenesis PD, mekanisme yang terlibat dalam permulaan dan perkembangan PD kekal tidak pasti, Walaupun punca PD kekal terjawab, beberapa baris bukti sangat mencadangkan penglibatan tekanan oksidatif, akhirnya memimpin kepada kematian neuron atau apoptosis oleh penjanaan radikal bebas yang berlebihan [1 ], [2], [3]. Hakikat bahawa sistem dopaminergik nigral boleh menghasilkan tahap radikal bebas yang tinggi dan mempunyai tahap sistem pertahanan antioksidatif yang agak rendah menyokong lagi hipotesis ini. Kedua-dua kajian in vivo dan in vitro menunjukkan neurotoksisiti pengantara tekanan oksidatif MPP＋, metabolit aktif l-metil-4-fenil-l,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) pada neuron dopaminergik [4 ], [5]. Penglibatan radikal bebas yang dihasilkan secara berlebihan oleh tekanan oksidatif sebagai punca terdekat gangguan neurodegeneratif seperti PD mencadangkan peranan penting untuk antioksidan. Tubuloside B (Rajah l) ialah salah satu sebatian phenylethanoid yang diasingkan daripada batangsalsa cistanche. Kajian terdahulu telah menemui banyak feniletanoid termasuk tubuloside B menunjukkan aktiviti penghapusan radikal bebas yang kuat[6], [7].

Memandangkan penemuan ini, kami menyiasat dalam kajian ini kesan tubu] nside B pada MPP plus -induced neurotoksisiti in vitro, menggunakan talian sel pheochromocytoma saraf simpatetik PC12 yang telah berjaya digunakan selama ini untuk mengkaji fungsi neuron [8], [9].

penyakit anti-Parkinson:cistanche

Bahan dan Kaedah

Bahan

Tubuloside B daripadasalsa cistanchetelah dibekalkan oleh Dr. Li Lei (Jabatan Produk Asli, Pusat Pengajian Sains Farmaseutikal, Universiti Peking, Beijing, China). Ketulenan sebatian adalah lebih daripada 98 peratus oleh analisis HPLC. Medium Eagle's modified Dulbecco (DMEM), serum kuda dan serum betis janin dibeli daripada GIBCO BRL, 1-ion metil~-fenilpiridinium (MPP tambah ), poli-L-lisin, 3-(4, 5 -dimethylthiazol-2 -yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT), propidium iodide (PI), RNase A, proteinase K dan 2;7'-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) telah dibeli daripada Sigma.

Kultur sel

Sel PCI2 dikekalkan dalam DMEM ditambah dengan 1{10}} peratus serum kuda, 5 peratus serum anak lembu janin, 100U/ml penisilin dan 100ug/ml streptomycin. Sel-sel telah dibiakkan dalam inkubator lembap yang diudara dengan 95 peratus udara dan 5 peratus CO2 pada 37 darjah. Semua eksperimen telah dijalankan 24-48 h selepas sel disemai. Sel-sel telah dituai secara rutin dengan trypsinization 0.25 peratus apabila sel menghampiri peringkat subconfluent dan disalut dalam kelalang kultur 25 cm terbelah pada 1: 8.

Analisis daya maju sel

Daya maju sel ditentukan menggunakan ujian MTT yang diubah suai seperti yang diterangkan sebelum ini [10], Secara ringkasnya, sel PC12 telah disemai dalam 96-plat perigi pada ketumpatan I × 104 siling setiap telaga. Kultur ditanam selama 48 jam, dan kemudian medium ditukar kepada yang mengandungi pelbagai kepekatan tubulnside B atau MPP＋. Selepas pengeraman sehingga 48j dan 72 jam, larutan MTr(5 mg/ml dalam DMEM) telah ditambahkan pada 96-plat perigi dan sel-sel dibenarkan untuk mengeram selama 4j pada 37 darjah . Selepas medium telah dikeluarkan, sel dan kristal pewarna telah dilarutkan dengan menambah 200μL DMSO, dan penyerapan diukur pada 570nm (540 nm sebagai rujukan) dengan model 550 pembaca plat mikro (Bio-Rad). Daya maju sel juga dianalisis menggunakan kaedah pengecualian biru trypan. Sel-sel telah dikumpulkan, dipel dengan lembut, dan diwarnakan dengan larutan 0.6 peratus trypan blue selama 3 hujan. Peratusan sel tidak berwarna kemudiannya dinilai dalam sepuluh bidang mikroskop yang dipilih secara rawak. Sebagai ubat positif, 100 ng／ml faktor pertumbuhan epidermis (EGF) telah digunakan.

Pengesanan apoptosis oleh sitometri aliran

Sel apoptosis dikesan oleh sitometri aliran menggunakan propidium iodide (PI) [11]. Secara ringkas, kira-kira 1 × 106 sel yang diinkubasi dengan bahan ujian telah dituai melalui sentrifugasi dan dibasuh sekali dengan PBS. Sel telah ditetapkan dengan 70 peratus etanol selama 24 jam pada - 20 darjah dan dibasuh sekali dengan PBS. Sel kemudiannya digantung semula dalam 300μL PBS yang mengandungi 0.5 mg/ml RNase dan 0.5 mg/ml PI. Selepas inkubasi lanjut selama 30 minit dalam gelap, sitometri aliran dilakukan dengan FACScan (Becton Dickinson, Heidelberg, Jerman).

Kami menggunakan protokol Moore [12] yang mengasingkan hanya DNA yang berpecah-belah dan eksperimen dinormalisasi dengan menggunakan bilangan kultur yang sama daripada setiap kumpulan ujian. Secara ringkas, 3 × 106 neuron daripada setiap sampel yang dirawat telah dibasuh dalam larutan garam seimbang Hank (1000g selama 10 minit) dan pelet yang terbentuk di bahagian bawah tiub telah dihomogenkan dengan 1 ml penimbal lisis (10 mM Tris pada pH 7.4. 5 mM EDTA, 1 peratus Triton X-100) selama 20 minit di atas ais. Selepas sentrifugasi pada 11,000 g untuk 20 hujan pada 4 darjah, supernatan yang mengandungi DNA berserpihan dikeluarkan dan dicerna dengan 20 mg/ml RNase A pada 37 darjah selama 1 jam dan 0.1 mg/ml proteinase K pada 56 darjah untuk tambahan 1 jam. DNA berserpihan telah diekstrak menggunakan fenol dan kloroform dan disentrifugasi pada 1O,000g untuk 1 hujan pada 4 C. Fasa akueus dipindahkan ke dalam tiub Eppendorf baharu, dicampur dengan 2 jilid etanol ais sejuk, dan kemudian diletakkan pada-20 darjah selama sekurang-kurangnya 1 jam untuk memendakan DNA. Selepas sentrifugasi pada 15,000g selama 20 minit pada 4 darjah , supernatan dikeluarkan dan pelet DNA dibasuh dengan 80 peratus etanol sekali (15,000 g selama 15 minit pada 4 darjah ), dikeringkan di udara dan dilarutkan dalam 20μL TE penimbal pada pH 7.6. Keseluruhan sampel kemudiannya dielektroforesis pada gel agarose 1.5 peratus selama 1j pada 85 V. Gel tersebut diperiksa dan difoto oleh Sistem Dokumentasi Gel Produk Ultra Violet (GELDOC-2000, Bio-Rad, USA).

Pengukuran untuk pembentukan ROS intraselular

Pembentukan peroksida intraselular dikesan dengan mikroskop laser pengimbasan confocal menggunakan sebatian bukan pendarfluor, 2"7"-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) [13], yang diesterkan dalam sel oleh esterase endogen kepada asid bebas terion, 2 ;7"-dichlorofluorescein. 2",7-Dichlorofiuorescin mampu dioksidakan kepada pendarfluor 2"7"-dichlorofluorescein (DCF) oleh hidroantioksidan. Sel telah diinkubasi dengan 10 μM DCFH-DA selama 30 minit pada 37 darjah . Kultur telah dibasuh dua kali dengan larutan garam seimbang Hank dan diimej dalam medium yang sama. Pengimejan dilakukan menggunakan mikroskop laser pengimbasan confocal, DCF teruja pada 488 nm dan penapis pelepasan adalah penapis penghalang 510nm, Untuk memberikan perbandingan yang sah, parameter pemerolehan yang sama digunakan untuk semua pemerhatian. Kedudukan menegak optimum di tengah-tengah sel telah ditetapkan, dan kemudian medan diimbas dengan pantas. Oleh kerana pencahayaan pada panjang gelombang pengujaan 488 nm menyebabkan peningkatan pendarfluor kerana pengoksidaan pewarna ini, setiap medan terdedah kepada Cahaya untuk masa yang sama. Nilai garis dasar daripada sel yang tidak dirangsang digunakan sebagai nilai kawalan untuk dibandingkan dengan sel yang dirawat MPP dengan kehadiran atau ketiadaan tubuloside B. Selepas pengimbasan, purata intensiti pendarfluor relatif dalam 15-20 badan sel neuron bagi setiap medan mikroskop dikira dalam empat budaya berasingan setiap keadaan rawatan.

cistanche

Analisis statistik

Semua nilai yang diperolehi dinyatakan sebagai min ±SD. Kepentingan statistik perbezaan antara kumpulan ditentukan oleh ujian-t Pelajar; Nilai p yang dikira kurang daripada 0.05 dianggap sebagai signifikan secara statistik.

Keputusan

Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2, MPP plus menghasilkan penurunan yang bergantung kepada dos dalam daya maju sel PCI2. Sebaliknya, EGF, faktor neurotropik yang terkenal, menghasilkan perlindungan ketara terhadap daya maju sel pada 100ng/mL kesan sitotoksik yang disebabkan oleh MPP＋ turut dilemahkan dengan kehadiran tubuloside B (5, 10, 50 atau100ug-ml-1 ), walaupun dengan potensi kurang daripada ubat rujukan (Rajah.3)． Tubuloside B pada kepekatan ini mempamerkan kesan sitoprotektif dalam cara yang bergantung kepada dos dan sebatian sahaja tidak menyebabkan sebarang sitotoksisiti yang jelas (data tidak ditunjukkan)． Elektroforesis gel ekstrak DNA daripada sel PCI 2 yang dirawat dengan 200 µM MPP tambah selama 48 jam menunjukkan tangga DNA． ciri klasik apoptosis, tubuloside B, pada dos 10 dan100μ g·ml-1bentukan terkecil dari tanggaDNA(Rajah．4)．Rajah．5 menunjukkan histogram tipikal analisis sitometri aliran kematian sel apoptosis yang disebabkan oleh sel MPP＋ dalam PC12 dalam kehadiran atau ketiadaan tubuloside B．Kuantiti profil kitaran sel dengan PI mendedahkan bilangan siling dengan ciri subdiploid(rantau M1) yang menunjukkan pemecahan DNA apoptosis． Dalam sel yang tidak dirawat, pecahan subdiploid apoptosis adalah minimum sehingga 5．94％daripada jumlah 10000 sel(Rajah.5 A). Selepas 48 jam pendedahan kepada MPP＋, peratusan apoptosis meningkat kepada 43．02;j;(Rajah．5 B)． Apabila ditambahkan pada kultur sel, tubuloside B menghalang MPP＋apoptosis yang disebabkan dalam cara yang bergantung kepada dos． Pada kepekatan 10 ug·ml-1perlindungan oleh tubuloside B tidak ketara secara statistik, tetapi pada50 dan 1 00ug·ml-1, 45％dan 63％penurunan．masing-masing, telah diperhatikan mengakibatkan peningkatan peratusan sel hidup (Rajah．5D, E)．

Pengumpulan ROS intraselular boleh dikesan dengan penggunaan sel DCFH—DA．PC12 yang dirawat dengan 200 uM MPP＋ selama 48 jam menunjukkan pendarfluor sengit di dalam sel selepas pewarnaan dengan pewarna DCFH-DA(Rajah 6)． Rawatan serentak dengan tubuloside B (pada dos 10 dan 100ug·ml.) menghalang pengeluaran ROS terdorong MPP＋一 (peratusan berkurangan ialah 24．52％dan 55．63％, masing-masing)．

Perbincangan

Patogenesis PD melibatkan tekanan oksidatif yang kuat, tahap antioksidan yang berkurangan, dan kecacatan mitokondria． semua diketahui mendorong apoptosis dalam beberapa sistem selular． Khususnya, radikal bebas telah ditunjukkan untuk mencetuskan kematian sel aktif dalam neuron[14]． MPTP menghasilkan sindrom seperti parkinsonian yang tidak dapat dipulihkan dan teruk yang menyebabkan degenerasi terpilih neuron dopaminergik nigrostriatal pada manusia． Neurotoksin ini telah digunakan untuk mencipta model haiwan PD[15]．MPTP ditukar oleh monoamine oxidase B kepada MPP＋, yang terkumpul dalam mitokondria． di mana ia menghalang kompleks mitokondria I dan hari-hari mitokondria tersebut． fungsi menyebabkan apoptosis[16]．Oleh itu, neurotoksisiti yang disebabkan oleh MPP ditambah 一 dalam neuron dopaminergik telah digunakan secara meluas sebagai model etiologi PD untuk pemeriksaan agen pelindung saraf．

Dalam kajian ini, kami telah menunjukkan bahawa kematian sel yang disebabkan oleh MPP plus melalui tekanan oksidatif dalam sel PC12 telah dikurangkan oleh tubuloside B. Selanjutnya, kami menunjukkan bahawa tubuloside B juga dilindungi dalam cara yang bergantung kepada dos terhadap tangga DNA yang disebabkan oleh MPP plus. dan apoptosis, seperti yang diukur menggunakan elektroforesis gel DNA dan analisis sitometrik aliran. Selain itu, rawatan serentak dengan kepekatan tubuloside B yang lebih tinggi menghalang pengeluaran ROS yang disebabkan oleh MPP. Oleh itu, tubuloside B telah menunjukkan kesan neuroprotektif pelbagai fungsi. Beberapa mekanisme, secara berasingan atau bersekutu, mungkin terlibat dalam tindakan tubuloside B. Kesan antioksidan adalah mekanisme yang mungkin untuk perlindungan saraf pengantara B tubuloside. Xiong Q mendapati bahawa tubuloside B menunjukkan aktiviti penghapusan radikal bebas yang kuat pada 1,1-difenil-2-radikal picrylhydrazyl dan xanthine]xanthine oxidase yang menjana radikal anion superoksida [6].

Beberapa phenylethanoid baru-baru ini dilaporkan mempunyai sifat penghapus radikal bebas dan melindungi kecederaan toksik akibat tekanan oksidatif. ROS yang dihasilkan oleh MPP plus seperti hidrogen peroksida, anion superoksida, dan radikal hidroksil mudah merosakkan molekul biologi, yang akhirnya boleh menyebabkan kematian sel apoptosis atau nekrotik. Oleh itu, tubuloside B mungkin mempunyai kesan penghapusan langsung terhadap ROS. Walaupun data kami tidak menetapkan tapak yang tepat di mana tubuloside B bertindak untuk menyekat pengumpulan ROS, mereka mencadangkan bahawa mekanisme neuroprotektif melibatkan rangsangan laluan antioksidan. Kajian tentang struktur molekul tubuloside B juga menunjukkan bahawa ia mempunyai kapasiti yang kuat untuk menghilangkan radikal bebas (komunikasi peribadi).

Mekanisme lain juga mungkin berkaitan. Sebagai contoh, tubuloside B mungkin mempunyai kapasiti untuk mengatasi ketoksikan MPP＋ dengan menghalang pembukaan liang peralihan kebolehtelapan mitokondria dan disfungsi. Di samping itu, sama ada tubuloside B mempunyai kesan menggalakkan pertumbuhan langsung pada sel neuron juga harus dipertimbangkan. Mekanisme tepat tindakan neuroprotektif tubuloside B masih tidak jelas. Kajian tambahan diperlukan untuk menjelaskan gambaran penuh kesan neuroprotektifnya.

Secara konklusif, tubuloside B daripada ekstrak salsa Cistanche mempunyai kesan perlindungan yang jelas pada apoptosis dan tekanan oksidatif yang disebabkan oleh MPP plus. Kesan neuroprotektifnya terhadap ketoksikan MPP ＋ mungkin penting dan mencadangkan ia mungkin mempunyai potensi terapeutik dalam pencegahan dan rawatan PD.

rawatan PD: cistanche

Rujukan

7. Xiong Q, Tezuka Y, Kaneko 1", Li H, Tran LQ Hase K, Namba T, Kadota S. Perencatan nitrik oksida oleh phenylethanoids dalam makrofaj diaktifkan. Eur J Pharmaco12000; 400:137 –44

8. Greene LA, Tischler AS. Penubuhan garis klon noradrenergik sel pheochromocytoma adrenal yang bertindak balas kepada faktor pertumbuhan saraf. Proc Nat Acad Sci 1976; 73:2424-8

9. Yao Z, Drieu K, Szweda LI, Papadopoulos V. Radikal bebas dan peroksidasi lipid tidak menjadi pengantara -amyloid yang disebabkan oleh kematian sel neuron. Brain Res 1999; 847: 203- 10

10. Yamamoto T, Yuyama K, Nakamura K, Kato T, Yamamoto H. Pencirian kinetik ketoksikan nitrik oksida untuk sel PC12: kesan masa separuh hayat pelepasan NO. Eur J Pharmacol 2000; 397:25-33

11. Nicoletti l, Migliorati G, Pagliacci MC, Grignani E Riccardi C. Kaedah pantas dan mudah untuk mengukur apoptosis thymocyte dengan pewarnaan propidium iodide dan sitometri aliran. J Kaedah Imunol 1991; 139: 271-9

12. Moore KJ, Matlashewski C. Jangkitan intraselular oleh Leishmania do nova menghalang apoptosis makrofaj. J Immunol 1994; 152: 2930- 7

13. Mark RJ, Keller JN, Kruman I, Mattson MP. FGF asas melemahkan tekanan oksidatif yang disebabkan oleh peptida amyloid, disfungsi mitokondria, dan kemerosotan aktiviti Na ＋-K ＋-ATPase dalam neuron hippocampal. Penyelidikan Otak 1997; 756: 205-14

14. Merad-Boudia M, Nicole A, Santiard-Baron D, Saille C, CeballosPicot L Kemerosotan mitokondria sebagai peristiwa awal dalam proses apoptosis yang disebabkan oleh pengurangan glutation dalam sel neuron: kaitan dengan penyakit Parkinson. Biochem Pharmaco11998; 56: 645-55

15. Langston JW, Ballard P, Tetrud JW, Irwin I. Parkinsonisme kronik pada manusia disebabkan oleh produk sintesis analog-meperidine. Sains 1983; 219:979-80

16. Mizuno Y, Sone N, Suzuki K, Saitoh T. Kajian mengenai ketoksikan 1-me ethyl-4-ion phenylpyridinium (MPP ＋) terhadap mitokondria otak tikus.J Neurol Sci 1988; 86: 97-110