Toleransi Terhadap NADH/NAD serta Ketidakseimbangan Menjangkakan Intervensi Penuaan Dan Anti-penuaan

Sila hubungioscar.xiao@wecistanche.comuntuk maklumat lanjut

RINGKASAN

Pasangan redoks menyelaraskan fungsi selular, tetapi akibat ketidakseimbangan mereka tidak jelas. Ini agak dikaitkan dengan batasan kuantifikasi eksperimen mereka. Di sini kami memintas kesukaran ini dengan mengemukakan pendekatan yang mencirikan profil toleransi berasaskan kecergasan untuk meredoks ketidakseimbangan pasangan menggunakan persembahan dalam silikon metabolisme. Memfokuskan pada pasangan redoks NADH/NAD1 dalam yis, kami menunjukkan bahawa disequilibria reduktif menjana sindrom metabolik yang setanding dengan yang diperhatikan dalam sel kanser.faedah ekstrak cistancheToleransi mutan yis kepada ketidakseimbangan redoks juga boleh menjelaskan 30 peratus daripada kebolehubahan dalam jangka hayat kronologi yang diukur secara eksperimen. Selain itu, dengan meramalkan kepentingan beberapa metabolit untuk membantu mengekalkan ketidakseimbangan, kami mengenal pasti dengan betul nutrien yang mendasari mekanisme patologi, molekul pelindung jangka hayat atau mimetik sekatan kalori. Toleransi terhadap ketidakseimbangan redoks menjadi, dengan cara ini, satu bunyi yang menyediakan rangka kerja untuk mengenali sifat fenotip penuaan sambil konsisten dengan rasional biologi untuk menilai campur tangan anti-penuaan.

PENGENALAN

Penyelidikan tentang homeostasis redoks berkembang dengan ketara sepanjang dua dekad yang lalu, secara berterusan membentuk semula tanggapan klasik kerosakan selular oksidatif (Halliwell dan Gutteridge, 2015). Antara agen molekul yang paling paradigmatik yang mendasari homeostasis ini muncul nisbah pasangan redoks, seperti bentuk konjugat glutation, NADPH, dan NADH. Kedua-dua glutathione dan NADPH bertindak sebagai mekanisme penghapusan penting spesies oksigen reaktif (ROS) dalam mitokondria, manakala NADPH dan NADH pasangan laluan anabolik dan katabolik, masing-masing, dengan keadaan redoks sel.

Sila klik di sini untuk mengetahui lebih lanjut

Walaupun begitu, mekanisme baharu yang menghubungkan pasangan NADPH/NADP* dan NADH/NAD* kepada redoks homeostasis terus diiktiraf. Sebagai contoh, keseimbangan NADPH / NADP ditambah sebahagiannya menerangkan akibat pro-survival kinase protein diaktifkan AMP (She et al., 2014). Juga, ia mengaitkan ketepatan masa sirkadian dengan keadaan redoks (Rey et al., 2016). Nisbah tambah NADH/NAD pada masa ini dianggap terlibat dalam penyelarasan fungsi mitokondria dan nuklear, peraturan epigenetik pembaikan DNA dan identiti selular, dan penalaan metabolisme tenaga kepada pembolehubah persekitaran (Canto et al., 2015; Gomes et al. 2013). Dalam keadaan bukan patologi, nisbah NADH/NAD* berfluktuasi dengan ketegangan oksigen, dengan keadaan hipoksik dan ketersediaan oksigen yang lebih tinggi turut berlaku bersama dengan sisihan reduktif dan oksidatif (Clanton, 2007; Graef et al., 1999).

Tetapi minat yang semakin meningkat dalam nisbah pasangan redoks terutamanya berasal dari implikasinya dalam patologi.cistanche genghis khanPenampilan ROS dalam kedua-dua deria reduktif (hipoksik, rawan NADH) dan oksidatif (hiperoksik, NAD tambah rawan) telah dikaitkan dengan perbezaan daripada potensi redoks optimum yang memastikan prestasi terbaik mitokondria (Aon et al., 2010). Clanton,2007). Mengenai kanser, penurunan NADH/NAD plus mungkin mendasari kematian glioblastomas (Gujar et al., 2016) dan menggalakkan perkembangan kanser kolon (Hong et al., 2019), namun, ia juga boleh menyelamatkan beberapa fenotip yang sihat ke tahap yang berbeza dalam sel daripada jenis tumor lain (Garrido dan Djouder, 2017).

Cistanche boleh anti-penuaan

NADH juga telah menjadi tempat menarik dalam biologi Toronto. Dalam konteks ini, penambahan kolam NAD plus mengakibatkan pembalikan separa penuaan dan fenotip patologi lain yang berkaitan merentasi organisma (Das et al., 2018; Mendelsohn dan Larrick, 2014; Wei et al., 2017; Zhu et al. , 2017), dan sel senescent dan neoplastik didapati menunjukkan ketidakseimbangan nisbah tambah NADH/NAD (Braidy et al., 2011; Schwartz dan Passonneau, 1974; Wiley et al, 2016). Tambahan pula, peranan NADPH yang baru ditemui dan konsep muncul NADH/NADH sebagai pengawal selia induk homeostasis dan penuaan redoks semuanya selaras dengan teori kestabilan metabolik penuaan (Demetrius, 2004). Teori ini mencadangkan bahawa punca penuaan adalah kerentanan tahap mantap pasangan redoks kepada gangguan persekitaran rawak pada kadar tindak balas enzim, dan membuat beberapa ramalan menarik yang berlaku kepada manusia.

Memandangkan semua implikasi ini, banyak kajian telah mengkaji fenomenologi nisbah pasangan redoks sama ada dengan melaporkan tahapnya secara pasif atau dengan mengubahsuainya secara aktif. Manipulasi eksperimen bagaimanapun mencabar. Yang paling tradisional menuduh kaveat eksperimen mendalam (Sun et al., 2012) dan yang lebih baru masih terlepas keadaan biologi tertentu kerana terhad kepada suhu dan selang pH (Hung et al., 2011; Zhao et al., 2015). Lebih-lebih lagi, adalah mahal secara eksperimen untuk memantau pelbagai jenis fenotip berikutan perubahan kumpulan koenzim oleh suplemen metabolit (Hou et al., 2010) dan mutasi atau ekspresi berlebihan enzim NAD(H) yang memakan (Bait al., 2011; Felipe et al.,1998). Oleh itu, terdapat keperluan untuk strategi alternatif untuk menangani kawalan homeostasis redoks melalui manipulasi pasangan redoks, serta pemahaman kita tentang akibat biologi kawalan ini.

Model dalam silico menjadi strategi penyelidikan praktikal apabila pendekatan eksperimen adalah terhad, dengan kelebihan untuk membolehkan akaun mekanistik penuh fenomena yang diperhatikan. Model metabolik skala genom, yang boleh dikaji melalui analisis keseimbangan fluks (FBA) (Orth et al, 2010) telah menjadi piawai dalam biologi sistem untuk mengkaji akibat gangguan metabolik pada fungsi selular (kaedah S1). Antara sumbangan lain, mereka telah membantu dalam penemuan antibiotik dan kemoterapeutik baru, reka bentuk strain bakteria yang dioptimumkan untuk pengeluaran industri bahan yang menarik, dan pemahaman yang lebih baik tentang penyakit metabolik manusia (Burgard et al., 2003; Pagliarini et al. 2016; Raman et al.,2009). Penggunaan FBA mempunyai kelebihan tambahan untuk memberikan gambaran tentang fenomena metabolik tanpa pengaruh faktor pengacau bukan metabolik (genetik, epigenetik, mekanikal, dll.). Oleh itu, model metabolik skala genom amat sesuai untuk mengkaji akibat metabolik penyimpangan daripada homeostasis redoks.

Di sini, kami menggunakan FBA untuk menyiasat keseimbangan pasangan redoks pada pembinaan semula skala genom bagi eukariota uniselular Saccharomyces cerevisiae, di mana kami mencirikan akibat metabolik dan umur panjang yang berkaitan dengan gangguan terkawal NADH/NAD serta fluks yang tersedia merentas genetik yang berbeza. latar belakang. Lebih khusus lagi, keputusan kami mendedahkan bahawa toleransi terhadap ketidakseimbangan ini membawa kepada penghalaan semula metabolik tertentu yang mengingatkan patologi dan juga menerangkan lebih daripada satu perempat daripada kebolehubahan intra-spesifik dalam jangka hayat pasca-mitotik. Di samping itu, rangka kerja ini membantu kami menggariskan protokol pengiraan (yang juga kami gunakan untuk model metabolik haiwan dan manusia) untuk mengenal pasti metabolit dan enzim yang berpotensi sebagai sasaran terapeutik dalam konteks patologi berkaitan usia.

KEPUTUSAN

Profil toleransi berasaskan kecergasan mencirikan gangguan pasangan redoks

Untuk mewakili ketidakseimbangan antara bentuk konjugat pasangan redoks, kami menggabungkan tindak balas boleh balik buatan-"tindak balas ketidakseimbangan"-ke dalam pembinaan semula skala genom rangkaian metabolik yang sepadan (kaedah STAR). Tindak balas mengoksidakan atau mengurangkan pasangan sambil mempertimbangkan petak selular tertentu (cth, sitosol, mitokondria, dsb.), dan aktivitinya boleh ditetapkan kepada sebarang nilai kadar yang dikehendaki. Untuk mana-mana nilai ini, seseorang boleh mengira kadar pertumbuhan ("kecergasan'). yang bertindak sebagai proksi untuk toleransi sel yis terhadap keadaan tertentu itu. Akhir sekali, profil toleransi ditakrifkan dengan mengira kadar pertumbuhan untuk julat daripada nilai ketidakseimbangan (Rajah 1A; ambil perhatian bahawa keadaan reduktif/oksidatif masing-masing diwakili dalam warna biru/merah, di seluruh manuskrip).

Profil toleransi biasanya menunjukkan pertumbuhan maksimum di sekitar titik ketidakseimbangan nol, dengan kira-kira sebarang sisihan (iaitu, nilai bukan sifar tindak balas) yang membawa kepada penurunan kecergasan. Ini menekankan fakta bahawa, untuk metabolisme berfungsi, aktiviti tindak balas yang menala nisbah pasangan redoks dalam satu pengertian mestilah berkadar dengan aktiviti mereka yang menyesuaikannya dengan yang lain. Lebih khusus lagi, ketidakseimbangan sitosolik NADH/NADt dalam S.lanjutan hayat cistanchecerevisiae yang tumbuh pada keadaan glukosa dan aerobik menghasilkan profil dengan pertumbuhan maksimum yang disesarkan dengan ketara ke arah bahagian oksidatif pada titik profil ketidakseimbangan di mana ~ 50 mmol/DW/jam NADH sedang ditukar kepada NADH (Rajah 1B). Apabila mempertimbangkan sebaliknya ketidakseimbangan dalam mitokondria, kami melihat maksimum pada titik ketidakseimbangan nol (Rajah 1C), satu corak yang kami perhatikan dalam profil lain (Rajah S1). Secara umum, keadaan reduktif menjadi

Rajah 1. Profil toleransi mencirikan tindak balas kepada ketidakseimbangan redoks

(A)Atas. Kami memperkenalkan tindak balas buatan dalam model pembinaan semula metabolik organisma (dalam kes ini yis) untuk menukar dua bentuk konjugat koenzim redoks (di sini pasangan NADH / NADH). Di bawah setiap satu siri keadaan ketidakseimbangan, iaitu, nilai kadar tindak balas buatan, kami menggunakan analisis keseimbangan fluks untuk mengira kadar pertumbuhan. Bawah. Nilai ramalan pertumbuhan diplotkan terhadap nilai kadar ketidakseimbangan yang menggambarkan profil toleransi; proksi untuk toleransi metabolisme apabila berhadapan dengan gangguan yang dipilih.cistanche nz(B) Profil toleransi dalam yis yang dikaitkan dengan ketidakseimbangan yang terletak di sitosol.

(C) Profil toleransi dalam yis yang dikaitkan dengan ketidakseimbangan yang terletak di mitokondria. Lorek biru/merah masing-masing mewakili rejim ketidakseimbangan terkurang dan teroksida, dan titik kelabu menunjukkan nilai yang sepadan dengan tiada ketidakseimbangan atau ketidakseimbangan reduktif/oksidatif melampau yang tidak menghasilkan pertumbuhan. merosakkan dan mematikan lebih cepat daripada rejim oksidatif. Dalam dua kes (pasangan konjugasi NADH sitosol atau Thioredoxin mitokondria), pengoksidaan tiruan ringan pasangan meningkatkan pertumbuhan (Rajah S1).

Gangguan NADH/NAD* menyebabkan sindrom metabolik yang mengingatkan patologi

Metabolisme tenaga yis tanpa ketidakseimbangan sepadan dengan metabolisme aerobik ciri dengan kehadiran glukosa (keadaan pertumbuhan yang dikaji) di mana glikolisis digabungkan dengan kitaran asid trikarboksilik (TCA) dan fosforilasi oksidatif. Laluan pentosa fosfat mengoksidakan glukosa dan membekalkan ribosa-5P untuk sintesis nukleotida dan kuasa reduktif kelahiran NADPH untuk anabolisme, manakala laluan anaplerotik meninggalkan kitaran TCA, serupa dengan metabolisme glutamin, digunakan secara sederhana untuk memberi makan pirimidin dan sintesis asid amino. FBA membolehkan kami mengukur perubahan dalam laluan ini dan bagaimana ia akhirnya memperincikan ciri metabolik yang mendasari sebarang rejim ketidakseimbangan tertentu.

Secara khusus, Rajah2A menunjukkan bagaimana ketidakseimbangan reduktif NADH/NADH sitosol menghasilkan peningkatan dalam fluks glikolitik, penurunan dalam aktiviti kitaran TCA dan rantai pengangkutan elektron, dan peningkatan dalam metabolisme glutamin. Tandatangan metabolik pseudohypoxic ini -dengan kehadiran oksigen-menyerupai metabolisme anaerobik, di mana glikolisis digabungkan dengan penapaian alkohol atau laktik untuk menjejaskan laluan mitokondria; bahagian oksigen dari laluan pentosa fosfat ditutup dan metabolisme glutamin, yang lebih aktif, mungkin dialihkan untuk menghasilkan piruvat selain menyumbang kepada anabolisme. Terutama, fenotip ini menangkap beberapa ciri metabolisme hasil paradoks yang diperhatikan dalam pelbagai jenis sel kanser (kesan Warburg) (Potter et al., 2016).

Rajah 2. Fluks laluan utama pengurusan tenaga yang mendasari profil toleransi dalam yis (A) Ketidakseimbangan NADH/NAD sitosol (atas) dan nilai fluks lima laluan perwakilan (bawah); i/glikolisis (Glikolisis, teras), ii/Kitaran Krebs (TCA, merah jambu), ili/pentose fosfat (Penphos, hijau), iv/fosforilasi oksidatif (Oxphos, kelabu), dan metabolisme glutamin (Glutamine, ungu). Vektor fluks yang diwakili adalah hasil purata fluks semua tindak balas laluan tertentu.

(B) Sama seperti(A) berkenaan dengan ketidakseimbangan mitokondria. Perhatikan kehadiran fluks negatif dalam glikolisis (panel A, bawah) mewakili peningkatan glukoneogenesis. Lihat teks utama untuk butiran.

Sebaliknya, metabolisme tenaga yang mendasari toleransi oksidatif (berkenaan dengan sitosol, Rajah 2A) mempamerkan konfigurasi yang lebih seperti aerobik tetapi dengan keanehan, seperti metabolisme poliamina yang sangat aktif; dan sifat ekstrem, termasuk peningkatan glukoneogenesis, fosforilasi oksidatif dan aktiviti kitaran TCA, serta fluks yang sangat tinggi (sehingga 12-lipatan paras normal) melalui laluan pentosa fosfat. Walau bagaimanapun, yang terakhir ini mungkin merupakan artifak perbezaan dalam tindak balas pseudo biojisim, di bawah ketidakseimbangan oksidatif yang sangat tinggi (melepasi 55 mmol/gDW/j) (Lihat kaedah S1).

Apabila tindak balas ketidakseimbangan terletak di mitokondria, pengurangan NADH menghasilkan semula tingkah laku pseudohypoxic tertentu, dengan satu perbezaan (Rajah 2B). Fluks melalui glikolisis dan metabolisme glutamin meningkat, dengan kehilangan serentak bahagian-bahagian kitaran TCA dan laluan pentosa fosfat. Walau bagaimanapun, tidak seperti dalam kes sitosolik, fosforilasi oksidatif meningkat dengan ketara. Sebaliknya, bahagian oksidatif profil mitokondria adalah lebih idiosinkratik: aktiviti glikolitik meningkat selari dengan kitaran TCA, tetapi fosforilasi oksidatif berfungsi untuk sebahagian besar pada tahap yang lebih rendah daripada biasa, dan metabolisme glutamin tidak penting,

Sindrom metabolik terhasil daripada kompromi antara keseimbangan redoks, pengeluaran biojisim, dan pertukaran ATP/NADH

Kami mengenal pasti beberapa elemen utama yang memainkan peranan yang membentuk sindrom sebelumnya.saiz zakar cistancheGangguan oksidatif telah dipenuhi dengan tindak balas aerobik yang lebih teruk sebagai kompromi antara mengekalkan pertumbuhan dan menampan gangguan ketidakseimbangan. Ini melibatkan penghalaan semula fluks melalui bilangan maksimum tindak balas yang mungkin mengurangkan NAD ditambah sambil mengekalkan taburan fluks global yang mampu menjana juzuk biojisim. Kedua-dua elemen mekanistik ini (penimbalan gangguan dan pemaksimuman biojisim) adalah keperluan paling relevan bagi masalah pengoptimuman dan mencukupi untuk menerangkan rejim oksidatif profil toleransi.

Rajah 3. Mekanisme bersaing menyebabkan tingkah laku pseudohypoxic yis

(A) Keseimbangan antara NADH, ATP, dan pengeluaran prekursor biojisim mengutamakan modul tindak balas yang menghasilkan sebanyak ATP dan sedikit NADH yang mungkin untuk mengimbangi akibat rejim reduktif, contohnya, penggunaan glikolisis kepada TCA. Perhatikan di sini bahawa anak panah ungu mewakili pengeluaran ATP, anak panah kuning mewakili pengeluaran NAD(H) dan bulatan putih menunjukkan penjanaan prekursor biojisim, (B) Gangguan NADH/NADt rawan NADH (paksi-x) bertindih dengan ADP buatan. tindak balas fosforilasi (paksi-y) yang secara paksa memperkenalkan kuasa reduktif dalam bentuk ATP ke dalam metabolisme yang tidak seimbang. Kecerunan warna hijau mewakili nisbah antara fluks kitaran glikolitik dan Krebs yang dinormalkan oleh nilai normalnya (sehingga 100-kali ganda). Ia boleh dihargai bahawa fosforilasi ADP mengurangkan fenotip pseudohypoxic dan melambatkan ketenangan.

Walau bagaimanapun, sisi reduktif memerlukan satu pandangan tambahan. Memandangkan semakin banyak NADH diasingkan kepada tindak balas NADH yang menggunakan NADt dan secara langsung atau tidak langsung diperlukan untuk menghasilkan juzuk biojisim menjadi semakin terkekang, jadi metabolisme tenaga mesti dialihkan untuk membolehkan penukaran NADH yang tinggi kepada NAD'dan untuk mengehadkan pengurangan NAD'ke NADH. Ini masih sukar untuk menghadapi gangguan, kerana kebanyakan kuasa reduktif dalam bentuk NADH pada dasarnya tidak berguna untuk banyak objektif metabolik, tindak balas, dan pertumbuhan: tenaga yang disimpan dalam NADH mesti diagihkan semula kepada ADP. Oleh itu, metabolisme mesti mengutamakan modul tindak balas yang menghasilkan sebanyak ATP dan sedikit NADH yang mungkin; ia mesti bergantung pada shunt dan laluan yang mempunyai hasil ATP/NADH yang tinggi, contohnya, glikolisis dan fosforilasi oksidatif.

Keputusan ini antara lain dalam mengurangkan kitaran TCA dan meningkatkan fluks glikolitik (Rajah 3A). Untuk meneroka lebih lanjut kesan pertukaran ATP/NADH ini, kami bertindih gangguan NADH/NAD reduktif dengan tindak balas tiruan yang membenarkan fosforilasi ADP. . Simulasi menunjukkan bahawa glikolisis yang dinaikkan kepada nisbah fluks kitaran TCA yang mencirikan metabolisme reduktif adalah bergantung kepada hasil ATP/NADH.

Rajah 4. Skor toleransi sebagai peramal jangka hayat kronologi dalam yis

(A) Profil toleransi yang diperoleh untuk mutan yis; sektor lengkung biru/merah mewakili rejim reduktif/oksidatif ketidakseimbangan NADH/NADH.

(B) Perkaitan antara skor toleransi ternormal (berkadar dengan keluasan nilai ketidakseimbangan pada kedua-dua rejim oksidatif dan reduktif, kaedah STAR) dan jangka hayat kronologi. Korelasi menerangkan~30 peratus daripada jumlah varians (R'= 0. 29, nilai-p=3.2x 10-4, N= 41).

(C) Sebagai cara alternatif untuk melihat persatuan ini, kami memperoleh histogram nilai cerun regresi yang diperoleh daripada sepuluh ribu persatuan yang dijana secara rawak antara skor toleransi dan jangka hayat. Daripada sampel ini, kami mendapati hanya 3 kes di mana perkaitan antara skor toleransi dan data jangka hayat adalah lebih kuat daripada yang ditemui (ditunjukkan oleh garis menegak merah).

(Rajah 3B). Memfosforilasi ADP secara paksa mengurangkan tandatangan pseudohypoxic ini walaupun dalam menghadapi kadar ketidakseimbangan terdedah NADH yang sangat kuat.

Toleransi menerangkan perbezaan jangka hayat kronologi eksperimen antara mutan yis yang berbeza

Kami bertanya di sebelah sejauh mana profil toleransi boleh bertindak sebagai peramal jangka hayat, memandangkan pasangan redoks telah dibincangkan sebagai penentu jangka hayat yang berpotensi. Satu cara untuk mengkaji ini adalah untuk mengira pro-fail dalam mutan yang berbeza (Rajah 4A) dan kemudian mengukur bagaimana ia sepadan dengan ukuran jangka hayat yang tepat, jangka hayat kronologi ternormal (CLS), tersedia daripada lengkung survival mutan yang diukur secara eksperimen (Garay et al., 2014). CLS dikira daripada lengkung survival mutan ini sebagai peningkatan dalam survival fasa pegun berbanding jenis liar.

Dalam FBA, mutasi dalam gen tertentu disimulasikan dengan mengekang fluks tindak balas yang berkaitan dengannya melalui peraturan Boolean yang mengaitkan setiap tindak balas kimia kepada ORF yang menterjemah untuk enzim tindak balas (kaedah STAR). Bagi setiap mutan ini, kami mengira profil toleransi mutan (Rajah 4A) dan menggunakan jumlah nilai mutlak ketidakseimbangan di mana kadar pertumbuhan dibelah dua (kedua-duanya dalam rejim reduktif dan oksidatif) sebagai skor skalar toleransi (STAR kaedah).

Set mutan kami adalah terhad namun oleh beberapa sekatan (kaedah STAR). Terutama, kami tidak dapat membezakan perbezaan dalam toleransi di bawah 10 ppm nilai jenis liar tanpa mencapai masa pengiraan yang melarang, dan banyak mutan menunjukkan kedua-dua perbezaan yang boleh diabaikan dalam jangka hayat dan perbezaan yang boleh diabaikan dalam toleransi. Di samping itu, secara amnya dianggap bahawa FBA tidak mampu mencirikan pemadaman keuntungan fungsi dan, agak boleh diramalkan, tiada toleransi mutan melebihi jenis liar.

Di sebalik kekangan ini, profil toleransi dalam siliko dapat menerangkan -30 peratus daripada kebolehubahan jangka hayat yang diukur secara eksperimen (Rajah 4B, R2= 0.29, N=41, nilai p{{5 }}.2x 10-) dengan sangat penting:10,000 rawak pasangan data membawa kepada hanya 3 kejadian dengan cerun regresi yang lebih besar (Rajah 4C).

Nutrien konvensional membolehkan toleransi terhadap ketidakseimbangan NADH/NADH

Akhir sekali, kami menyiasat sama ada metabolit pemakanan tertentu sangat menentukan dalam tindak balas kepada ketidakseimbangan redoks. Untuk tujuan ini, kami menggunakan ciri tambahan model FBA, iaitu kemungkinan mengakses penggunaan metabolit tertentu (ditakrifkan sebagai kadar penggunaan dalam keadaan mantap, kaedah STAR). Kami mengkaji cara kadar ini berubah dengan peningkatan nilai NADH/NAD yang reduktif dan oksidatif serta ketidakseimbangan.

Penggunaannya agak linear pada kedua-dua belah profil dan untuk kebanyakan metabolit. Oleh itu, kami memasang corak perubahan ini kepada model linear dan menganggap cerun (mutlak) sebagai wakil skalar perkaitan metabolit yang sepadan untuk bertolak ansur dengan ketidakseimbangan redoks (Rajah 5A). Antara nutrien responsif teratas iAZ900, kami melihat metabolit pemakanan yang diketahui memainkan peranan penting dalam mengawal selia jangka hayat yis, seperti asetat (Burtner et al., 2009), serta banyak yang meningkatkan jangka hayat secara eksperimen dalam yis, cacing, atau juga sel manusia (Madeo et al.,2018; Mishur et al.,2016) termasuk malat, hidroksibutirat, spermidin atau oksaloasetat (Rajah 5B-5D, Jadual S1).

Nutrien tertentu lebih relevan untuk toleransi terhadap NADreduction, yang lain kepada NADHoxidation, dan beberapa untuk kedua-dua rejim ini. Metabolit pemakanan yang paling penting untuk toleransi reduktif adalah tertib asetat, beta-hidroksibutirat (BHB), glutamat, dan glutamin (Rajah 5B), sementara itu, yang paling penting untuk bertolak ansur dengan pengoksidaan NADH ialah asetat, NADP tambah, putrescine, dan spermidine. (Rajah 5D). Antara mereka yang mengambil bahagian dari toleransi pada kedua-dua belah profil, yang paling relevan adalah dalam susunan asetat, glutamat, oksaloasetat, dan oksoglutarat (Rajah 5C).

Kami mempertimbangkan model metabolik dalam organisma lain untuk menguatkan lagi nutrien mana yang menjadi penentu dalam tindak balas kepada ketidakseimbangan (kaedah S1, lihat juga Rajah S2 untuk bagaimana fluks laluan utama berubah). Semua penyumbang utama ini berubah, walaupun tidak secara meluas, dengan asid alfa-keto, pasangan redoks, vitamin tertentu dan asid amino tertentu amat diperlukan untuk mengawal gangguan NADH/NADt dalam C.elegans dan pembinaan semula manusia. Reaksi yang paling lazim terhadap ketidakseimbangan redoks dalam organisma ini berkaitan dengan metabolit yang menjadi pengantara homeostasis pH, seperti asetat, bikarbonat, bifosfat, natrium, air, dan lain-lain yang serupa. Begitu juga, perkaitan glutamat, glutamin, aspartat, threonine, serine, dan glisin membezakannya daripada asid amino lain dan kebanyakan metabolit. Asid bersaiz sederhana, teroksida seperti oxoglutarate, malate, dan oxaloacetate juga memainkan peranan dalam toleransi secara konsisten, seperti yang cenderung untuk melakukan biotin dan beberapa folat (lihat Jadual S1 untuk senarai lengkap).

PERBINCANGAN

Kami mencadangkan di sini pendekatan alternatif untuk memahami akibat biologi yang luas daripada perubahan dalam pasangan redoks. Pendekatan ini berdasarkan model metabolik dalam silico dan memperkenalkan tanggapan profil tolerance sebagai ukuran yang mengukur daya tahan selular terhadap perubahan ini.

Rajah 5. Nutrien homeostatik dalam yis

(A) Contoh profil penggunaan nutrien dengan regresi linear reduktif (biru) dan oksidatif (merah) yang sepadan yang dicirikan oleh cerun m, dan m., masing-masing (dalam nilai mutlak). Kami memasukkan profil toleransi sitosol di latar belakang sebagai rujukan.

(B) Cerun regresi linear(m,) daripada 4 nutrien homeostatik teratas dalam pengertian reduktif NADH/NAD ditambah gangguan.

(C) Cerun regresi linear bagi nutrien top4 yang homeostatik dalam kedua-dua deria gangguan; Biru: Cerun regresi linear reduktif; Merah: Cerun regresi linear oksidatif.

(D) Cerun regresi linear (m.) daripada 4 nutrien homeostatik teratas dalam pengertian oksidatif NADH/NAD ditambah gangguan.

Pelarasan metabolik yang mendasari profil mendedahkan kehadiran fenotip pseudohypoxic yang dikaitkan dengan rejim NADH reduktif. Fenotip ini mengingatkan beberapa metabolisme tenaga hasil rendah yang nampaknya paradoks yang diperhatikan dalam kanser (kesan Warburg) dan juga diiktiraf dalam sel yis (kesan Crabtree) dan bakteria (metabolisme limpahan) (Basan et al., 2015; Mori et al., 2016; Potter et al., 2016). Kemungkinan bahawa tingkah laku ini boleh disebabkan oleh kekangan peruntukan sumber yang timbul pada pertumbuhan yang agak tinggi atau kadar pengambilan glukosa telah dikemukakan dalam beberapa tahun kebelakangan ini (Basan et al, 2015; Mori et al, 2016). Walau bagaimanapun, fenotip pseudohypoxic yang kami perhatikan adalah bebas daripada kadar pertumbuhan dan pengambilan glukosa, dan sebenarnya, ia berlaku bersama dengan kadar pertumbuhan yang rendah (kaedah STAR). Kami telah menunjukkan bahawa puncanya terletak pada pertukaran asas ATP/NADH, rasional yang disokong oleh kajian eksperimen baru-baru ini (Maldo-nado dan Lemasters, 2014).

Tambahan pula, analisis fluks kami menunjukkan bahawa penyelenggaraan ATP boleh terjejas secara negatif oleh NADH/NAD reduktif ditambah ketidakseimbangan. Peningkatan NADH dianggap sebagai korelasi dengan penurunan ketersediaan ATP, kerana kemerosotan fosforilasi oksidatif mungkin mengakibatkan kedua-dua peningkatan NADH/NAD ditambah dan penurunan dalam ATP/ADP. Kami menunjukkan bahawa ketidakseimbangan NADH yang dijana secara ekstrinsik boleh menjadi punca penurunan ketersediaan tenaga melalui mekanisme metabolik ortogon, walaupun semasa fosforilasi oksidatif berfungsi pada tahap normal. Ini adalah sangat penting dalam konteks penyelidikan penuaan, kerana ketersediaan tenaga yang berkurangan dan nisbah ATP/ADP merupakan ciri utama penuaan selular dan patologi yang berkaitan dengan usia (Moreira et al., 2003; Pall, 1990; Yaniv et al., 2013). ) dan mungkin menggalakkan pengumpulan sisa toksik dan kehilangan proteostasis (satu lagi ciri penuaan) dengan mengurangkan perolehan protein dan oleh itu meningkatkan separuh hayat protein (Anisimova et al., 2018).

Kami menyasarkan seterusnya untuk menentukan kesahihan rangka kerja kami sebagai peramal jangka hayat dan metabolit pemakanan yang menampan ketidakseimbangan redoks. Toleransi memang menjangkakan jangka hayat selular, dengan beberapa pengehadan disebabkan set data yang tersedia. Mengawal batasan ini (Garay et al., 2014), kami mendapati bahawa korelasi yang terhasil masih cukup bukti tentang hubungan antara varians toleransi dan CLS.

Bertentangan dengan jangkaan kami, pengajaran paling jelas yang diperoleh daripada analisis metabolit pemakanan kami ialah bahan utama yang mendorong tindak balas kepada ketidakseimbangan tidak bergantung terutamanya pada rangkaian penyelamat NADt. Sesungguhnya, "nutrien homeostatik" teratas adalah perantaraan kitaran TCA dan bahagian lain metabolisme pusat yang tindakannya jauh lebih meresap daripada prekursor NAD. Di samping itu, kaitan tindak balas yang mengurangkan atau mengoksidakan NAD(H) semasa bertindak sebagai jambatan antara pasangan redoks dan laluan metabolik utama adalah jauh lebih baik daripada enzim pengehad penyelamat NADt (seperti nicotinamide mononucleotide adenyltransferase).

Sebagai contoh, skor oksaloasetat dan oxoglutarat dalam model yis antara empat metabolit paling berkesan yang mendasari toleransi dalam kedua-dua keadaan reduktif dan oksidatif, ciri konsisten yang menyokong keputusan eksperimen terdahulu (Chin et al., 2014; Williams et al., 2009) . Metabolit penting lain termasuk hidroksibutirat yang telah secara konsisten ditunjukkan untuk meningkatkan jangka hayat, mengawal NAD dan mengantara tindak balas terhadap kebuluran (Edwards et al., 2014; Newman dan Verdin, 2014), dan spermidine, yang tergolong dalam keluarga poliamina dan dikenali sebagai memainkan peranan dalam proses berkaitan umur, autophagy dan perlindungan DNA (Eisenberg et al,2009; Minois et al.2011: Pietrocola et al.2015).

Kami menggunakan model C.elegans dan manusia untuk mengukuhkan penilaian sebelumnya, mendedahkan gambaran yang lebih luas yang berpusat di sekitar homeostasis pH, pasangan redoks dan kitaran TCA. Ini menunjukkan bahawa cara pH (Burtner et al., 2009) dan ketidakseimbangan NADH (Ayer et al., 2014) menentukan penuaan dalam sel adalah saling berkaitan. Di luar pH, nutrien yang paling meresap dan penting untuk mengawal NADH/NAD serta ketidakseimbangan ialah asid alfa-keto oksaloasetat dan oksoglutarat, bentuk aminanya, dan metabolit lain yang berkaitan dengan mitokondria seperti malat, piruvat dan fumarat, iaitu hab utama kawalan keseimbangan redoks ialah kitaran TCA.

Sehingga hari ini, mekanisme di mana perantaraan asid amino dan kitaran TCA memberi kesan kepada lanjutan hayat dalam yis dan C. elegans kekal kabur. Metabolit seperti malat, oksaloasetat, fumarat, valine, serine, atau threonine sememangnya boleh meningkatkan jangka hayat organisma, tetapi proses yang membawa kepada kesan ini diperdebatkan dan kompleks (Edwards et al., 2013,2015). Keputusan kami menunjukkan bahawa penjelasan umum untuk semua fenomena pro-panjang umur ini terletak pada kesan nutrien pada kapasiti sel untuk bertolak ansur dengan gangguan dalam nisbah tambah NADH/NAD.

Walau bagaimanapun, seseorang boleh berhujah bahawa beberapa metabolit yang dianggap kelihatan jelas kerana mereka terlibat dalam tindak balas yang saling menukar NADH dan NAD plus . Persoalannya ialah mengapa metabolit lain yang juga kelihatan apriori jelas tidak muncul dalam keputusan kami. Jawapannya terletak pada mekanisme yang memastikan ramalan realistik dalam FBA. Agar nutrien menjadi "homeostatik" terhadap ketidakseimbangan redoks, ia bukan sahaja perlu meningkatkan pengeluaran NADHor NADt tetapi berdiri di tengah laluan atau modul dengan hasil ATP/NADH yang tinggi dan/atau kapasiti untuk menyediakan juzuk biojisim.

Akhir sekali, dua lagi cerapan daripada hasil kami patut diberi perhatian. Di satu pihak, mereka mencadangkan bahawa sebagai tindak balas kepada ketidakseimbangan redoks, rangkaian metabolik bersedia untuk semakin menghasilkan dan/atau mengambil beberapa metabolit yang ditafsirkan oleh rangkaian isyarat sebagai menghalang keperluan untuk tindak balas autophagy, antioksidan dan hormetik, serta banyak yang berlebihan. atau suplemen didapati meningkatkan jangka hayat dan/atau sebaliknya meniru kesan sekatan kalori (CR), dengan cara yang bergantung pada laluan isyarat yang terlibat dalam lanjutan jangka hayat pengantara CR. Ini mengukuhkan bukti terdahulu yang menghubungkan keseimbangan CR dan NADH/NADH sebagai sebahagian daripada proses memanjangkan jangka hayat dan menggalakkan kesihatan yang sama (Lin et al., 2004).

Sebaliknya, kajian kami menunjukkan bahawa sebagai tindak balas kepada nisbah yang diubah, metabolisme juga meningkatkan penggunaan bahan tertentu yang boleh merosakkan sel secara kimia, seperti asetat, putrescine, atau asetaldehid; serta beberapa yang boleh menggalakkan tumorigenesis melalui pendawaian semula metabolik, seperti glutamin, succinate, dan fumarate (Sciacovell et al., 2016). Ini kemudiannya boleh menjelaskan sebahagian daripada patologi yang dikaitkan dengan ketidakseimbangan redoks dan proses makroskopik yang terlibat, seperti penyakit degeneratif dan onkologi: jika ketidakseimbangan redoks mesti ditampan dengan bahan toksik, maka bahan ini mungkin merupakan mekanisme patologi yang bersama -berlaku dengan ketidakseimbangan redoks.

Kami menyedari bahawa pendekatan kami terhadap ketidakseimbangan redoks boleh difahami sebagai variasi luar biasa dalam kajian keteguhan rangkaian metabolik dan ia mungkin menuduh kaveat tertentu yang meninggalkan banyak ruang untuk penambahbaikan. Berkenaan dengan keteguhan, kajian menggunakan FBA secara tradisinya mentakrifkannya sebagai perubahan penyelesaian objektif (biasanya pertumbuhan) sebagai tindak balas kepada pengurangan yang berbeza-beza dalam kadar tindak balas, contohnya (Edwards dan Palsson, 2000), dan bukannya kepada gangguan tertentu (ketidakseimbangan redoks). ) dalam metabolit seperti yang kita lakukan. Berkenaan dengan batasan analisis kami, mereka boleh dikaitkan dengan batasan intrinsik FBA itu sendiri, seperti ketiadaan gen pengawalseliaan. Akhirnya, kebolehpercayaan keputusan kami bergantung pada kuasa ramalan pembinaan semula metabolik: model yis semasa adalah ramalan dan maju, tetapi mereka tidak sempurna (Heavner dan Price, 2015), dan masih, mereka jauh lebih baik daripada yang paling banyak. pembinaan semula multisel yang tepat tersedia. Walaupun semua kebimbangan ini, terdapat banyak bukti yang menjamin peningkatan kesetiaan model metabolik kepada tingkah laku semula jadi.

Pada masa ini, penyelidikan lazim cenderung untuk mengabaikan kemungkinan akibat negatif daripada penurunan nisbah NADH/NADH secara sembarangan. Ini sebahagiannya disebabkan oleh faedah yang menjanjikan hasil daripada pengurangan sederhana yang dicapai secara eksperimen, yang termasuk pengurangan fenotip neoplastik, jangka hayat dan lanjutan jangka kesihatan. Walau bagaimanapun, terdapat bukti yang muncul yang mengesyorkan berhati-hati yang melampau mengenai keputusan positif ini (Gujarat al., 2016; Hong et al., 2019), serta rangka kerja teori yang kukuh dan berterusan secara eksperimen yang meramalkan akibat negatif daripada penurunan nisbah NADH/NADH di luar ambang (Aon et al., 2010). Profil toleransi ketidakseimbangan NADH/NADt kami memenuhi gambaran yang muncul ini, kerana sisihan oksidatif yang ringan boleh memberi manfaat, tetapi yang lebih tinggi adalah merosakkan seperti yang sebaliknya.

Lebih khusus lagi, profil toleransi kami mencadangkan bahawa selain menyebabkan masalah kimia atau fisiologi, kedua-dua nisbah NADH/NADH yang rendah dan tinggi juga mesti dipenuhi dengan kelemahan metabolik semata-mata, termasuk penurunan ketersediaan tenaga dan/atau pengeluaran biosintetik. Tambahan pula, dan seperti yang telah kami nyatakan, pemerhatian percubaan terhad yang tersedia pada beberapa soalan yang kami tangani seolah-olah mengingatkan hasil yang kami laporkan di sini.

Batasan kajian

Keputusan yang dibentangkan di sini akan bertambah baik apabila model yang digunakan diperhalusi lagi. Kerja kami juga mengalami batasan intrinsik FBA sebagai teknik. Sebagai contoh, maklumat dinamik tidak dapat dicapai, memandangkan versi analisis fluks dinamik yang tersedia pada masa ini terlalu kecil dalam skop. Begitu juga, kekurangan kekangan tenaga tersirat dalam keseimbangan fluks mengurangkan ramalannya untuk kadar pertumbuhan yang tinggi. Kelemahan ini telah mendorong penambahan teknik seperti CAFBA, seperti yang kita pertimbangkan dalam manuskrip. Akhir sekali, adalah menarik untuk mengakses maklumat kawal selia, yang boleh dikawal dan dihidupkan atau dimatikan dengan mudah. Pada masa ini, tiada pendekatan piawai untuk melaksanakan peraturan gen dalam FBA. Penggunaan skor aktiviti tindak balas kepada had kekangan adalah menjanjikan dalam hal ini.

Artikel ini diekstrak daripada iScience 24, 102697, 23 Julai 2021