Tyrosine Kinase C-Abl Menguatkan Kekebalan Antiviral Pengantara Interferon Dengan Fosforilasi STAT1​

RINGKASAN

Pengaktifan transduser isyarat dan pengaktif keluarga transkripsi (STAT) disebabkan oleh Interferon (IFN) adalah peristiwa penting dalam imuniti antivirus. Di sini, kami menunjukkan bahawa kinase bukan reseptor c-Abl dan Arg secara langsung berinteraksi dengan STAT1 dan menguatkan fosforilasi STAT1 pada Y701. c-Abl/Arg boleh mengantara fosforilasi STAT1 bebas daripada kinase Janus jika tiada IFNg dan mempotensiasi fosforilasi STAT1 yang dimediasi IFNg. Selain itu, dimerisasi STAT1, translokasi nuklear, dan transkripsi gen hiliran dikawal oleh c-Abl / Arg. Kekurangan c-Abl/Arg (abl1/abl2) dengan ketara menyekat tindak balas antivirus dalam sel yang dijangkiti virus stomatitis vesikular. Berbanding dengan kenderaan, pentadbiran perencat selektif c-Abl/Arg AMN107 mengakibatkan peningkatan kematian yang ketara pada tikus yang dijangkiti virus influenza manusia. Kajian kami menunjukkan bahawa c-Abl memainkan peranan penting dalam laluan isyarat pengaktifan STAT1 dan menyediakan pendekatan penting kepada peraturan imuniti antivirus.

cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun

PENGENALAN

Interferon (IFN) memainkan peranan penting dalam imuniti semula jadi terhadap jangkitan virus dan pengawasan imun dengan mengawal selia pengaktifan Janus kinase (JAKs) dan transduser isyarat dan pengaktif transkripsi (STAT) dan dengan memprogram semula ekspresi gen selular (Stark dan Darnell, 2012). Pengikatan IFN kepada reseptor masing-masing menghasilkan fosforilasi silang tiga JAK yang berkaitan (JAK1, JAK2, dan TYK2) dan pengambilan STAT, membolehkan sisa tirosin tunggal berhampiran hujung terminal C STAT ini difosforilasi oleh JAK. (Platanias, 2005). STAT yang diaktifkan kemudian dimerisasi, berhijrah ke nukleus, dan mengikat kepada penganjur gen responsif IFN untuk mendorong transkripsi mereka. Fosforilasi tyrosine STAT adalah langkah penting dalam laluan JAK-STAT isyarat IFN dan terlibat dalam dimerisasi STAT, translokasi nuklear, dan pengikatan DNA (Stark dan Darnell, 2012). Oleh itu, fosforilasi tirosin berfungsi sebagai suis pengaktifan STAT. Bukti yang diperoleh melalui gangguan sasaran gen JAK pada tikus menunjukkan bahawa JAK adalah kinase tyrosine STAT yang paling penting (Villarino et al., 2017). Walau bagaimanapun, sisa tirosin dalam STAT1, STAT3, dan STAT5 juga telah terbukti terfosforilasi dalam sel kekurangan JAK oleh faktor pertumbuhan epidermis dan reseptor faktor pertumbuhan yang berasal dari platelet dengan aktiviti kinase tirosin intrinsik (Leaman et al., 1996; Vignais et al. ., 1996). Di samping itu, pengaktifan konstitutif STAT telah diperhatikan dalam sel berubah yang menyatakan kinase tyrosine onkogenik seperti v-Src, v-Abl, dan BCR-Abl, tetapi sama ada STAT adalah substrat langsung kinase ini masih perlu ditentukan (Danial dan Rothman). , 2000; Reddy et al., 2000). Mamalia Abelson kinase c-Abl yang dikodkan oleh gen c-abl (abl1) dan protein gen berkaitan Abl Arg yang dikodkan oleh gen arg (abl2) adalah ahli keluarga kinase tyrosine bukan reseptor intrasel yang diperlukan untuk pelbagai proses selular, termasuk percambahan, apoptosis, lekatan, penghijrahan sel, dan tindak balas tekanan (Bradley dan Koleske, 2009; Colicelli, 2010; Greuber et al., 2013; Pendergast, 2002). Aktiviti kinase c-Abl dikawal ketat di bawah keadaan fisiologi normal. Transduksi retroviral dan peristiwa translokasi kromosom menimbulkan ekspresi v-Abl atau BCR-Abl, satu bentuk onkogenik Abl, masing-masing (Advani dan Pendergast, 2002). Di samping itu, penghapusan sasaran gen c-abl pada tikus menghasilkan fenotip pleiotropik yang dikaitkan dengan disfungsi imun, termasuk kematian perinatal yang tinggi, atrofi splenik dan timus, limfopenia, dan peningkatan kerentanan terhadap jangkitan (Schwartzberg et al., 1991). Selain itu, rawatan leukemia myeloid kronik (CML) BCR-Abl-positif dengan perencat Abl STI571 (imatinib) dan AMN107 (nilotinib) dikaitkan dengan imunosupresi dalam subset pesakit (Dietz et al., 2004; Hochhaus et al., 2016; Mattiuzzi et al., 2003). Kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa cAbl memainkan peranan dalam pengawalseliaan TCR (reseptor sel T) - dan BCR (reseptor sel B) -pengantara isyarat transduksi, pembangunan, percambahan, dan pengeluaran sitokin (Gu et al., 2009; Pendergast, 2002 Silberman et al., 2008). Tikus yang kekurangan abl juga mempamerkan bilangan sel T / B yang berkurangan (Gu et al., 2009; Liberatore dan Goff, 2009; Schwartzberg et al., 1991). Walau bagaimanapun, mekanisme yang mendasari imuniti terjejas yang timbul tanpa ketiadaan atau perencatan c-Abl kekal sukar difahami. Telah dilaporkan secara meluas bahawa laluan isyarat JAK-STAT adalah penting untuk transformasi yang disebabkan oleh BCR-Abl (Carlesso et al., 1996; Danial et al., 1998; de Groot et al., 1999). Oleh itu, adalah wajar untuk menyiasat sama ada JAK-STAT juga boleh menyumbang kepada imuniti semula jadi yang melibatkan c-Abl. Di sini, kami melaporkan bahawa STAT1 berinteraksi dengan dan difosforilasi oleh c-Abl dengan cara bebas JAK, yang mana dimerisasi, penyetempatan nuklear, dan transkripsi gen hiliran STAT1 dikawal. Penemuan ini mendedahkan bahawa, sebagai tambahan kepada kinase JAK, c-Abl sangat diperlukan untuk pengaktifan penuh STAT1 dan tindak balas antiviral pengantara IFN yang berikutnya.

Kebaikan cistanche tubulosa-menguatkan sistem imun

Klik di sini untuk melihat produk Cistanche Enhance Immunity

【Minta lebih lanjut】 E-mel:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

KEPUTUSAN

Transkripsi gen hiliran yang diaktifkan gamma interferon dikawal oleh Abl kinase

Our previous study suggested that c-Abl widely participates in the regulation of gene transcription (Dong et al., 2017). To illustrate the role of c-Abl in gene expression, the transcription of approximately 22,000 genes in wild-type (WT) and c-abl / arg / MEFs (mouse embryonic fibroblasts) was detected using Affymetrix GeneChips (Mouse Genome 430 2.0) (GEO accession: GSE154568). A total of 1,744 differentially expressed genes (DEGs) with fold changes >4 telah dikenalpasti dalam c-abl/arg double-knockout (DKO) dan WT MEFs, yang mana 960 telah dikawal selia dan 784 telah dikurangkan (Rajah 1A, kiri). Untuk menyiasat lebih lanjut potensi fungsi selular dan laluan berkaitan DEG ini, kami melakukan analisis Gene Ontology (GO) (untuk istilah dalam proses biologi, fungsi molekul dan komponen selular) (Rajah S1A). Gen yang dikurangkan oleh c-Abl dan Arg dikaitkan terutamanya dengan tindak balas pertahanan virus (GO: 0009615, GO: 0051607, dan GO: 0045071) dan tindak balas imun (GO: 0002376, GO: 0045087). Analisis lanjut menunjukkan bahawa gen khusus IFN (Liu et al., 2012) diperkaya di kalangan gen yang dikurangkan (Rajah 1A, kanan, dan S1B). Untuk mengesahkan profil ekspresi pembezaan, tahap transkrip gen antivirus, termasuk cxcl10, psmb9, tap1, dan isg15, ditentukan melalui ujian tindak balas rantai transkripsi-polimerase terbalik masa nyata kuantitatif (RT-PCR) dan dinormalkan kepada tahap psma5 , yang tidak dikawal selia oleh c-Abl. Berbanding dengan WT MEFs, c-abl / arg / MEFs menunjukkan tahap transkrip gen ini yang jauh lebih rendah, tetapi pengurangan yang disebabkan oleh DKO telah diterbalikkan sepenuhnya oleh penyelamatan c-Abl dalam cara yang bergantung kepada dos (Rajah 1B dan S1C). Data ini mencadangkan bahawa panel gen yang disebabkan oleh IFN dikawal oleh c-Abl dan Arg. Untuk menyiasat elemen transkrip utama yang dikawal oleh Abl kinase sebagai tindak balas kepada IFN, sistem wartawan luciferase telah dibina berdasarkan promoter dua arah dikongsi tap1 / psmb9 yang dikawal oleh IFNg (Rajah 1C). Seperti yang dijangkakan, perencat c-Abl / Arg-selektif AMN107 dengan ketara menghalang aktiviti transkrip promoter tap1 (merah) (Rajah 1D). Terutama, tidak seperti pemadaman unsur jujukan NFkB (biru) atau jujukan konsensus (kuning) IFN, rawatan AMN107 mempunyai sedikit jika ada kesan ke atas aktiviti promoter tap1 apabila unsur jujukan gamma-activated (GAS) (hijau) telah dipadamkan (Rajah 1D). ). Penemuan ini menunjukkan bahawa elemen cis GAS yang disasarkan STAT1-terlibat dalam transkripsi tap1 yang dikawal oleh c-Abl, yang sangat mencadangkan bahawa STAT1 bertanggungjawab untuk pengawalan pengantaraan c-Abl bagi ekspresi gen responsif IFN.

c-Abl berinteraksi secara langsung dengan STAT1

Ekspresi TAP1 yang disebabkan oleh IFN dikawal oleh c-Abl, mungkin melalui STAT1, menunjukkan bahawa STAT1 mungkin dikaitkan dengan c-Abl. Untuk mengesahkan hipotesis ini, lisat sel MCF-7 tertakluk kepada imunopresipitasi anti-c-Abl diikuti oleh imunoblotting dengan antibodi anti-STAT1. STAT1 hadir dalam anti-c-Abl tetapi bukan immunoprecipitates IgG (Rajah 2A). Seterusnya, sel 293T telah ditransfeksi bersama dengan Myc-cAbl dan Flag-STAT1 atau Flag-Vector sebagai kawalan. Kehadiran Myc-c-Abl dalam immunoprecipitates anti-Bendera yang disediakan daripada sel yang mengekspresikan Flag-STAT1 tetapi tidak Flag-Vector menunjukkan hubungan antara Myc-c-Abl dan Flag-STAT1 yang dinyatakan secara ektopik (Rajah 2B, kiri). Keputusan yang sama juga diperolehi dalam eksperimen timbal balik (Rajah 2B, kanan). Selain itu, ahli keluarga Abl yang lain, Arg (Abl2), yang sangat homolog dengan c-Abl dalam domain N-terminal (NTD), juga berinteraksi dengan STAT1 (Rajah S2A).

Rajah 1. c-Abl mengawal selia penganjur gen responsif IFN melalui elemen GAS

Seterusnya, lisat yang disediakan daripada sel 293T yang menyatakan Flag-c-Abl telah diinkubasi dengan GST-STAT1 atau GST terkonjugasi agarose sahaja, dan Flag-c-Abl dikesan dalam GST-STAT1 tetapi bukan penjerap GST (Rajah 2C). Untuk menolak pengikatan tidak langsung yang dimediasi oleh komponen lain dalam lisat sel, imunopresipitat anti-Bendera yang disediakan daripada sel 293T yang menyatakan Flag-c-Abl tertakluk kepada SDS-PAGE (elektroforesis gel natrium dodecyl sulfate-polyacrylamide), dan protein dipindahkan ke membran PVDF (polyvinylidene fluoride) dan kemudian dipadamkan dengan GST-STAT1 atau GST larut (sebagai kawalan). Keputusan menunjukkan bahawa GST-STAT1, tetapi bukan GST, terikat c-Abl secara langsung dalam vitro (Rajah 2D). Untuk menentukan domain pengikat c-Abl, STAT1 yang terkonjugasi agarose-conjugated dan GST-fused full-length atau terpotong (Rajah 2E, panel atas) telah diinkubasi dengan lisat sel 293T yang menyatakan Flag-c-Abl. Analisis penjerap dengan immunoblotting dengan antibodi anti-Bendera menunjukkan bahawa asid amino 577-750 STAT1, yang membentuk rantau yang mengandungi domain SH2 dan domain transaktivasi, bertanggungjawab untuk interaksi c-Abl (Rajah 2E, panel bawah) . Begitu juga, Flag-STAT1 immunoprecipitated oleh antibodi anti-Flag telah dipecahkan oleh SDS-PAGE dan telah dipindahkan ke membran PVDF. Kemudian, membran telah dipadamkan dengan larut GST-c-Abl SH3 atau GST-c-Abl SH2 dan GST sahaja. Keputusan menunjukkan bahawa domain c-Abl SH3 adalah domain utama yang bertanggungjawab untuk persatuan STAT1 (Rajah 2F). Tambahan pula, interaksi in situ c-Abl endogen dengan STAT1 dinilai oleh ujian ligation proximity Duolink (PLA). Kompleks STAT1: c-Abl diperhatikan terutamanya dalam sitoplasma, dan pembentukan kompleks ini dikuatkan dengan ketara oleh rangsangan IFNg (Rajah 2G). Secara kolektif, penemuan ini menunjukkan hubungan langsung antara c-Abl dan STAT1 kedua-dua in vitro dan in vivo.

Rajah 2. c-Abl berinteraksi dengan STAT1

c-Abl mengantara fosforilasi STAT1 bebas JAK

Untuk menyiasat sama ada STAT1 ialah substrat c-Abl, STAT1 yang ditag-Nya yang telah disucikan telah diinkubasi dengan c-Abl rekombinan (mengandungi domain pemangkin pada asid amino 237-643) dengan kehadiran ATP untuk ujian kinase in vitro. Immunoblotting produk tindak balas dengan anti-phospho-tyrosine dan anti-phospho-STAT1 Y701 menunjukkan bahawa STAT1 secara langsung difosforilasi oleh c-Abl pada residu tirosin, termasuk Y701, in vitro (Rajah 3A). Seterusnya, kami mendapati bahawa Flag-STAT1 yang dinyatakan dalam sel 293T adalah tirosin terfosforilasi, terutamanya pada residu Y701, oleh Myc-c-Abl tetapi bukan mutan kinase-inaktif Myc-c-Abl (K290R). Tambahan pula, selepas rawatan dengan perencat c-Abl / Arg-selektif AMN107, fosforilasi STAT1 pengantara c-Abl hampir dihapuskan, yang menunjukkan bahawa fosforilasi tyrosine STAT1 bergantung kepada aktiviti kinase c-Abl (Rajah 3B). Fosforilasi STAT1 yang dimediasi c-Abl telah terjejas dengan ketara apabila STAT1 Y701 digantikan dengan fenilalanin, menunjukkan bahawa Y701 ialah fosfosit utama Abl (Rajah 3C). Selain itu, STAT1 juga telah difosforilasi oleh Arg (Rajah S2B). Untuk menggambarkan lebih lanjut residu STAT1 khusus yang difosforilasi oleh c-Abl, Flag-STAT1 yang diekspresikan bersama Myc-c-Abl telah tertakluk kepada kromatografi cecair ditambah dengan analisis spektrometri jisim tandem. Sebagai tambahan kepada fosfosit STAT1 Y701 yang jelas dan berfungsi penting (Schindler et al., 1992; Shuai et al., 1993), dua fosfosit lain, Y106 dan Y665, juga dikenal pasti (Rajah S4A). Berbanding dengan WT STAT1, kedua-dua mutan Y106F dan Y701F menunjukkan fosforilasi tirosin yang terjejas (Rajah 3C). Walau bagaimanapun, fosforilasi STAT1 Y701 tidak banyak terjejas oleh fosforilasi Y106 dan Y665, menunjukkan bahawa Y106 dan Y665 mungkin memainkan peranan yang berbeza (Rajah S4B). Bersama-sama, penemuan ini menunjukkan bahawa sisa tirosin STAT1, termasuk residu Y701 yang dilaporkan sebelum ini, boleh difosforilasi oleh kinase keluarga Abl.

cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun

JAKs bertanggungjawab terutamanya untuk fosforilasi STAT1 Y701 yang disebabkan oleh IFN (Villarino et al., 2017). Seperti yang dijangkakan, fosforilasi STAT1 Y701 telah diinduksi oleh IFNg dan telah dihalang dengan ketara oleh ruxolitinib, perencat bispecific JAK1 dan JAK2 (Rajah 3D). Terutama, fosforilasi Y701 yang terjejas juga diperhatikan apabila perencatan Abl (Rajah 3D, lorong 4), menunjukkan bahawa c-Abl sebahagiannya menyumbang kepada pengaktifan STAT1 yang disebabkan oleh IFNg. Selanjutnya, fosforilasi STAT1 Y701 juga diinduksi oleh DPH, pengaktif c-Abl telap sel, pada tahap yang lebih rendah daripada IFNg, yang boleh diterbalikkan sepenuhnya oleh AMN107 (Rajah 3E). Untuk mengesahkan pengaktifan Abl yang disebabkan oleh DPH, fosforilasi c-Abl Y412, penunjuk pengaktifan Abl, juga dikesan (Rajah 3E). Telah ditunjukkan bahawa pengaktifan JAK2 berlaku dahulu dan diperlukan untuk pengaktifan JAK1 berikutnya (Briscoe et al., 1996). Untuk mengecualikan kesan JAK2 pada pengaktifan STAT1, kami menubuhkan barisan sel jak2-KO MCF-7 melalui CRISPR. Fosforilasi STAT1 Y701 yang berkurangan tetapi boleh dikesan diperhatikan dalam sel jak2-KO MCF-7 berbanding sel MCF-7 ibu bapa, yang boleh diperkuatkan dengan kehadiran Myc-c-Abl. tetapi bukan Myc-c-Abl (K290R) (Rajah 3F) dan semakin berkurangan selepas rawatan AMN107. Dalam sel c-abl / arg/, fosforilasi STAT1 yang disebabkan oleh IFNg pada Y701 telah banyak terjejas dalam cara yang bergantung kepada masa dan dos (Rajah 3G). Semua pemerhatian ini menunjukkan bahawa c-Abl kinase boleh memfosforilasi secara langsung dan mengaktifkan STAT1 bebas daripada laluan isyarat IFNg-JAK dan, yang penting, kedua-dua kinase ini mungkin mempunyai kesan sinergistik pada fosforilasi STAT1 pada Y701.

Rajah 3. STAT1 difosforilasi oleh c-Abl

Rajah 4. c-Abl menggalakkan pembentukan dimer STAT1 dan import nuklear

Fosforilasi pengantara c-Abl mengawal aktiviti transaktivasi STAT1

Fosforilasi tirosin STAT adalah langkah penting dalam laluan JAK-STAT bagi isyarat IFN dan terlibat dalam dimerisasi STAT, translokasi nuklear, dan pengikatan DNA. Untuk menyiasat jika fosforilasi pengantara c-Abl mengawal dimerisasi STAT, GFP-STAT1 dan Flag-STAT1 diekspresikan bersama dalam sel 293T dengan kehadiran atau ketiadaan Myc-c-Abl. Tahap GFP-STAT1 dalam immunoprecipitates anti-Bendera telah diperiksa untuk menunjukkan dimerisasi STAT1. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 4A, ekspresi bersama c-Abl mempotensikan pembentukan homodimer STAT1-STAT1. Mikroskopi imunofluoresensi sel MCF{18}} selanjutnya menunjukkan bahawa ablasi c-abl/arg atau rawatan dengan AMN107 menjejaskan pemindahan nuklear STAT1 yang disebabkan oleh IFNg dengan ketara (Rajah 4B dan 4C).

Tambahan pula, ujian anjakan elektromobiliti digunakan untuk menganalisis aktiviti pengikatan promoter STAT1. Rantau promoter IRF1 bertag biotin yang mengandungi jujukan konsensus mengikat STAT1 digunakan sebagai probe pengesanan (Aaronson dan Horvath, 2002). Siasatan ini diinkubasi dengan ekstrak nuklear daripada sel 293T secara eksogen menyatakan STAT1 dengan atau tanpa c-Abl, yang seimbang berdasarkan Rajah S5A. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 4D, banyak kompleks terikat probe IRF1 yang mengandungi STAT1 diperhatikan dalam ekstrak nuklear (Rajah 4D, lorong 1). Pembentukan kompleks meningkat sedikit dengan rawatan IFNg (Rajah 4D, lorong 2) dan meningkat dengan ketara dalam sel yang mengekspresikan c-Abl secara ektopik (Rajah 4D, lorong 3). Walau bagaimanapun, berbanding dengan WT STAT1, c-Abl menunjukkan sedikit jika ada kesan ke atas pengikatan promoter STAT1 yang melindungi Y701F (Rajah 4D, lorong 7 dan 8), manakala mutasi Y106F dan Y665F menunjukkan hampir tiada perbezaan dengan WT STAT1. Kekhususan kompleks yang mengandungi STAT1 dan probe pengesanan telah disahkan selepas penambahan probe pesaing yang tidak bertanda (Rajah 4D, lorong 9). Selain itu, penambahan antibodi anti STAT1 menghasilkan pembentukan jalur supershifted (Rajah 4D, lorong 11). Apabila probe bertanda diinkubasi dengan ekstrak nuklear sel 293T sebagai kawalan, tiada kompleks diperhatikan (Rajah 4D, lorong 10). Keputusan ini menunjukkan bahawa fosforilasi STAT1 Y701 yang dimediasi c-Abl mempotensikan pengikatan STAT1 dengan penganjur sasarannya.

Rajah 5. c-Abl mengawal ekspresi gen berkaitan IFN

Kemudian, transaktivasi akibat IFNg bagi gen terkawal1-STAT utama, termasuk ccl5, cxcl10, cxcl11, gbp2, ido1, ifi35, irf1, isg15, oasl, psmb9 dan tap1, telah dinilai dalam WT atau c-abl/ arg DKO MCF{13}} sel melalui RT-PCR. Seperti yang dijangkakan, transkripsi gen telah terjejas dengan ketara oleh pengurangan c-abl/arg (Rajah 5A). Selain itu, gen yang biasanya diinduksi oleh IFNg dan IFNa gagal dirangsang oleh IFN dengan kehadiran AMN107 (Rajah 5B dan 5C). Penemuan ini menunjukkan bahawa aktiviti transaktivasi STAT1 dikawal secara positif oleh c-Abl.

c-Abl menggalakkan kesan antivirus yang bergantung kepada IFN

TAP1 dan PSMB9 terlibat dalam pengeluaran dan pembentangan peptida dalam laluan pemprosesan antigen kelas I MHC (Ghannam et al., 2014; Vitale et al., 1998). Selaras dengan penemuan sebelumnya, pembentangan antigen ovalbumin oleh sel JAWS II kepada sel B3Z telah ditindas dengan ketara oleh AMN107 kerana pengeluaran IL2 yang berkurangan (Rajah 6A). Untuk menilai lebih lanjut akibat biologi antiviral peraturan STAT1 oleh c-Abl, WT, dan c-abl / arg / MEF yang diprarawat dengan atau tanpa IFNg yang dicairkan secara bersiri telah dijangkiti virus stomatitis vesikular (VSV). Jangkitan VSV menyebabkan kematian sel yang lebih teruk dalam c-abl / arg / MEF dan sel WT yang dirawat dengan AMN107 berbanding WT MEF yang dirawat dengan kenderaan (Rajah 6B). Rawatan IFNg terutamanya mengurangkan kematian sel yang disebabkan oleh jangkitan virus, tetapi ia mempunyai kesan yang kurang ketara dengan kehadiran AMN107. Selaras dengan penemuan ini, ablasi c-abl/arg dalam MEF mengakibatkan ketidakpekaan terhadap rangsangan IFN, tetapi kesan ini telah diterbalikkan oleh penyelamatan c-Abl (Rajah 6B). Seterusnya, sel A549 yang dirawat dengan atau tanpa AMN107 telah dijangkiti virus penyakit Newcastle (NDV) yang mengekspresikan GFP, dan keputusannya mendedahkan bahawa replikasi virus juga dipotensikan oleh rawatan AMN107 tetapi ditindas oleh ekspresi c-Abl (Rajah 6C). Selaras dengan penemuan bahawa pemindahan DNA membawa kepada pengaktifan tindak balas IFN endogen (Park et al., 2003), pemindahan dengan vektor pcDNA menghalang percambahan virus. Terutama, pemindahan dengan Flag-c-Abl menghasilkan kesan perencatan yang lebih ketara pada percambahan virus daripada pemindahan dengan vektor kosong (Rajah 6C). Tambahan pula, rawatan IFNg mempunyai sedikit, jika ada, kesan ke atas jangkitan virus dengan kehadiran perencat c-Abl-selektif AMN107 (Rajah 6D). Data ini mencadangkan bahawa c-Abl memainkan peranan penting dalam 1-kesan antivirus pengantara STAT. Kami seterusnya menyiasat peranan c-Abl dalam jangkitan virus dalam panggilan / fl, tikus Lck-Cre (c-abl-conditional knockout, c-abl-cKO), di mana c-abl secara khusus tersingkir dalam thymocytes (Rajah S7A ) sejak kalah mati germline gen c-abl mengakibatkan lari dan kematian dalam tempoh dua minggu pertama selepas kelahiran (Koleske et al., 1998; Schwartzberg et al., 1991). Kemudian, tikus WT dan c-abl-cKO secara intranasal dijangkiti virus influenza A (IAV). Kematian yang tidak signifikan secara statistik diperhatikan di kalangan tikus c-abl-cKO berbanding tikus WT. Tikus WT secara berterusan mentadbir AMN107, yang secara sistematik menindas kinase c-Abl / Arg dalam semua tisu, menunjukkan sensitiviti yang meningkat dengan ketara kepada IAV (Rajah 6E). Secara kolektif, penemuan ini menunjukkan bahawa c-Abl diperlukan untuk imuniti antivirus dalam haiwan.

Rajah 6. c-Abl menggalakkan kesan antivirus yang bergantung kepada IFN

PERBINCANGAN

IFNg ialah salah satu sitokin pemodulasi imun yang paling penting dan memainkan peranan penting dalam imuniti semula jadi terhadap jangkitan virus. Dalam isyarat IFNg kanonik, apabila rangsangan IFNg, JAK1 dan JAK2 direkrut ke ekor sitoplasma reseptor IFNg agregat (IFNGRs) dan diaktifkan melalui peristiwa autofosforilasi dan transfosforilasi berurutan (Stark, 2007; Villarino et al., 2017). Kemudian, STAT1 berlabuh ke IFNGR oleh persatuan domain SH2nya dengan urutan pengiktirafan dalam IFNGR (Y440DKPH444), di mana Y440 difosforilasi oleh JAKs (Greenlund et al., 1995). Berikutan fosforilasinya pada Y701 oleh JAKs, STAT1 dimerize dan ditranslokasi ke dalam nukleus, di mana ia mempromosikan transkripsi pelbagai gen responsif IFNg (Aaronson dan Horvath, 2002; Stark dan Darnell, 2012). Ablasi Stat1 pada tikus mengakibatkan ketiadaan tindak balas transkrip kepada IFN dan kekurangan aktiviti antimikrob dan antivirus yang disebabkan oleh IFN dalam sel (Meraz et al., 1996). Stat1 / tikus juga menunjukkan peningkatan kerentanan terhadap perkembangan tumor yang disebabkan oleh spontan dan kimia (3-methylcholanthrene) (Kaplan et al., 1998) dan hipersensitiviti kepada patologi keradangan tertentu (Bettelli et al., 2004; Villarino et al. ., 2010). Selain itu, isyarat STAT1 melindungi sel T daripada sitotoksisiti pengantaraan sel pembunuh semulajadi (Kang et al., 2019).Penemuan ini menunjukkan bahawa STAT1 mengantara pengaktifan imun semula jadi dan imuniti tumor.

cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun

Schlatterer et al. melaporkan bahawa c-Abl, tetapi bukan Arg, boleh menyebabkan kehilangan neuron dengan mendorong pengaktifan STAT1 dan pengeluaran interferon. Walau bagaimanapun, mekanisme tepat yang bertanggungjawab untuk pengaktifan STAT1 yang bergantung kepada c-Abl belum dijelaskan (Schlatterer et al., 2012). Di sini, kami menunjukkan bahawa c-Abl mengikat dan memfosforilasi STAT1 dan berinteraksi dengan STAT2 secara langsung dalam vitro (Rajah 2 dan 3, S8A, S9A, dan S10A). STAT1 Y701 difosforilasi secara eksklusif oleh kinase JAK, yang mengawal pembentukan dimer STAT1 (Schindler et al., 1992; Shuai et al., 1993) dan pengaliran nukleositoplasma semasa isyarat IFNg (Mao et al., 2005; Mertens et al., Mertens et al. Zhong et al., 2005). Kajian kami secara tidak dijangka mendapati bahawa c-Abl, satu lagi kinase selain JAK, juga menyumbang kepada fosforilasi STAT1 Y701 secara bebas (Rajah 3). Walaupun fosforilasi Y701 yang dimediasi c-Abl tidak sekuat JAK, nampaknya Y701 perlu mencapai fosforilasi maksimum kerana fosforilasi Y701 yang terjejas teruk diperhatikan dalam c-abl / arg/sel apabila rangsangan IFNg, dan IFNg- fosforilasi STAT1 Y701 yang diinduksi telah dihalang oleh AMN107, dari 1.25 mM hingga 5 mM, dalam cara yang bergantung kepada dos (Rajah 3G dan S11A). Walau bagaimanapun, fosforilasi Y701 tidak banyak terjejas oleh keadaan fosforilasi Y106 dan Y665, dua lagi fosfosit c-Abl, menunjukkan bahawa fosforilasi STAT1 Y701 yang dipotensikan tidak terhasil daripada fosforilasi berbilang tapak yang dimediasi c-Abl bagi STAT1 tetapi mungkin dikaitkan dengan aktiviti JAK yang dipertingkatkan. Kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa pengaktifan konstitutif JAK1 dan pengaktifan pembolehubah JAK2 telah diperhatikan dalam sel pengekspres BCR-Abl (Chai et al., 1997; Henderson et al., 1997; Shuai et al., 1996). Selain itu, BCR-Abl telah ditunjukkan untuk mengaktifkan STAT1 dan STAT2 secara sederhana melalui fosforilasi tirosin JAK1, JAK2, dan JAK3 (Henderson et al., 1997). Bukti semasa menyokong bahawa Abl dan JAKs mungkin telah menyatakan kesan sinergistik pada fosforilasi STAT1 pada Y701 (Rajah 3E).

Sebagai tambahan kepada Y701, fosforilasi Y106 dan Y665 dikenal pasti secara serentak (Rajah 3C dan S4A). Fosfosit ini tidak terlibat dalam fosforilasi STAT1 Y701 atau homodimerisasi STAT1 (Rajah S4B dan S4C). Walau bagaimanapun, Murphy dan rakan sekerja mendapati bahawa interaksi antara NTD (domain interaksi protein terminal N, asid amino 1-136) monomer adalah perlu untuk dimerisasi molekul STAT penuh tanpa fosforilasi (Ota et al., 2004). Mutan STAT1 (F77A dan/atau L78A) gagal membentuk dimer yang tidak berfosforilasi, dan mutan ini mempamerkan fosforilasi berterusan fenotip dalam sel yang dirawat IFN dan rintangan kepada TC45-penyahfosforilasi pengantaraan secara in vitro (Mertens et al., 2006). Y106 dalam NTD, yang berhampiran F77 dan L78, mungkin bertanggungjawab untuk mengekalkan STAT1 dalam keadaan dimer terfosforilasi dan untuk mengekalkan STAT1 dalam nukleus di bawah sinaran mengion (Rajah S6A dan S6B). Selain itu, domain SH2 berinteraksi dengan domain yang mengandungi tirosin terfosforilasi apabila pembentukan homodimer terfosforilasi diinduksi oleh IFN (Shuai et al., 1994). Y665, yang terletak dalam domain SH2, boleh menjejaskan dimerisasi. Fungsi tapak fosforilasi pengantara c-Abl (Y106 dan Y665) memerlukan siasatan lanjut.

Sama seperti JAK, fosforilasi pengantara c-Abl mengawal pembentukan dimer STAT1 (termasuk homodimer STAT1- STAT1 dan pembentukan heterodimer STAT1-STAT2 (Rajah 4A, S12A dan S12B)), translokasi nuklear, pengikatan DNA , dan transkripsi gen yang dirangsang IFN. Gangguan abl menyumbang kepada percambahan virus yang berpotensi dan peningkatan kematian sel yang disebabkan oleh virus (Rajah 6B, 6C, dan 6D). Selain itu, kami mendapati bahawa sinaran pengionan (IR) menyebabkan translokasi nuklear STAT1 jika tiada perencat c-Abl (Rajah S6A dan S6B). IR mengaktifkan c-Abl secara langsung (Pendergast, 2002) dan seterusnya isyarat IFNg yang bergantung kepada STAT{21}}, yang mungkin menyediakan mekanisme asas di mana terapi sinaran memulakan serangan imun semula jadi dan adaptif IFN ke atas tumor (Burnette et al ., 2011) dan menawarkan status imun semula jadi yang lebih kuat sebagai tindak balas kepada rangsangan IR. Berbanding dengan rakan sampah WT, tikus di mana c-abl tersingkir secara bersyarat dalam thymocytes menunjukkan kematian yang lebih tinggi tetapi tidak signifikan secara statistik. Terutama, tikus secara sistematik mentadbir perencat c-Abl / Arg AMN107 mempunyai kematian yang lebih tinggi (Rajah 6E), yang menunjukkan bahawa ekspresi c-Abl dalam pelbagai tisu menyumbang kepada imuniti antivirus pada haiwan. Daripada data ini, kami mencadangkan bahawa Abl endogen menawarkan rintangan basal terpendam terhadap jangkitan virus dan mengaktifkan Abl yang dirangsang oleh sel pelindung sinaran mengion. Abl kinase diaktifkan secara konstitutif pada kebanyakan pesakit dengan CML. Inhibitor Abl kinase STI571 dan AMN107 mewakili rawatan barisan hadapan untuk terapi CML. Walau bagaimanapun, jangkitan saluran pernafasan atas dan imunosupresi biasanya diperhatikan, yang mungkin disebabkan oleh penindasan laluan pengawalseliaan imun yang dimediasi STAT (Hochhaus et al., 2016; Mattiuzzi et al., 2003). Penemuan kami menambah asas teori untuk mengoptimumkan terapi.

cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun

Ringkasnya, tyrosine kinase c-Abl didapati mengaitkan dengan STAT1 in vivo dan in vitro, untuk mempromosikan fosforilasi STAT1 pada Y701 bebas daripada JAKs, untuk mempotensiasi transaktivasi, dan untuk menengahi tindak balas imun semula jadi terhadap jangkitan, terutamanya dalam konteks c -Tekanan berkaitan abl. Penemuan kami menyediakan pendekatan tambahan untuk pengaktifan STAT1, yang menyumbang kepada peningkatan pengetahuan mengenai peraturan laluan isyarat hiliran IFN.

RUJUKAN

Aaronson, DS, dan Horvath, CM (2002). Peta jalan untuk mereka yang tidak tahu JAK-STAT. Sains 296, 1653–1655.

Advani, AS, dan Pendergast, AM (2002). Varian BcrAbl: aspek biologi dan klinikal. Leuk. Res. 26, 713–720.

Bettelli, E., Sullivan, B., Szabo, SJ, Sobel, RA, Glimcher, LH, dan Kuchroo, VK (2004). Kehilangan T-bet, tetapi bukan STAT1, menghalang perkembangan encephalomyelitis autoimun eksperimen. J. Exp. Med. 200, 79–87.

Bradley, WD, dan Koleske, AJ (2009). Peraturan penghijrahan sel dan morfogenesis oleh kinase keluarga Abl: mekanisme baru muncul dan konteks fisiologi. J. Sel Sci. 122, 3441– 3454.

Briscoe, J., Rogers, NC, Witthuhn, BA, Watling, D., Harpur, AG, Wilks, AF, Stark, GR, Ihle, JN, dan Kerr, IM (1996). Mutan kinase-negatif JAK1 boleh mengekalkan ekspresi gen interferon-gamma-inducible tetapi bukan keadaan antivirus. EMBO J. 15, 799–809.

Carlesso, N., Frank, DA, dan Griffin, JD (1996). Tirosyl fosforilasi dan aktiviti mengikat DNA transduser isyarat dan pengaktif protein transkripsi (STAT) dalam garisan sel hematopoietik yang diubah oleh Bcr/Abl. J. Exp. Med. 183, 811–820.

Chai, SK, Nichols, GL, dan Rothman, P. (1997). Pengaktifan konstitutif JAK dan STAT dalam garisan sel yang mengekspresikan BCR Abl dan sel darah periferal yang diperoleh daripada pesakit leukemia. J. Immunol. 159, 4720–4728.

Colicelli, J. (2010). ABL tyrosine kinase: evolusi fungsi, peraturan, dan kekhususan. Sci. Isyarat. 3, semula6.

Danial, NN, Losman, JA, Lu, T., Yip, N., Krishnan, K., Krolewski, J., Goff, SP, Wang, JY, dan Rothman, PB (1998). Interaksi langsung Jak1 dan v-Abl diperlukan untuk pengaktifan STAT dan percambahan yang disebabkan oleh v-Abl. Mol. Biol Sel. 18, 6795–6804.

Danial, NN, dan Rothman, P. (2000). Isyarat JAK-STAT diaktifkan oleh Abl onkogen. Onkogen 19, 2523–2531.

de Groot, RP, Raaijmakers, JA, Lammers, JW, Jove, R., dan Koenderman, L. (1999). Pengaktifan STAT5 oleh BCR-Abl menyumbang kepada transformasi sel leukemia K562. Darah 94, 1108–1112.

Dietz, AB, Souan, L., Knutson, GJ, Bulur, PA, Litzow, MR, dan Vuk-Pavlovic, S. (2004). Imatinib mesylate menghalang percambahan sel T secara in vitro dan hipersensitiviti jenis tertunda dalam vivo. Darah 104, 1094–1099.

Dong, Q., Li, C., Qu, X., Cao, C., dan Liu, X. (2017). Peraturan global ekspresi gen pembezaan oleh kinase onkogenik c-abl/arg. Med. Sci. Monit. 23, 2625–2635.

Ghannam, K., Martinez-Gamboa, L., Spengler, L., Krause, S., Smiljanovic, B., Bonin, M., Bhattarai, S., Grutzkau, A., Burmester, GR, Haupl, T. , et al. (2014). Penyelarasan subunit immunoproteasome dalam myositis menunjukkan keradangan aktif dengan penglibatan sel pembentang antigen, sel T CD8, dan IFNGamma. PLoS One 9, e104048.

Greenlund, AC, Morales, MO, Viviano, BL, Yan, H., Krolewski, J., dan Schreiber, RD (1995). Pengambilan statistik oleh reseptor sitokin terfosforilasi tirosin: proses yang didorong oleh pertalian boleh balik yang teratur. Kekebalan 2, 677–687.

Greuber, EK, Smith-Pearson, P., Wang, J., dan Pendergast, AM (2013). Peranan kinase keluarga ABL dalam kanser: dari leukemia kepada tumor pepejal. Nat. Rev. Kanser 13, 559–571.

Gu, JJ, Ryu, JR dan Pendergast, AM (2009). Abl tyrosine kinase dalam isyarat sel T. Immunol. Wahyu 228, 170–183.

Henderson, YC, Guo, XY, Greenberger, J., dan Deisseroth, AB (1997). Peranan berpotensi bcr-abl dalam pengaktifan JAK1 kinase. Clin. Kanser Re. 3, 145–149.

Hochhaus, A., Saglio, G., Hughes, TP, Larson, RA, Kim, DW, Issaragrisil, S., le Coutre, PD, Etienne, G., Dorlhiac-Llacer, PE, Clark, RE, et al. (2016). Faedah dan risiko jangka panjang nilotinib vs imatinib barisan hadapan untuk leukemia myeloid kronik dalam fasa kronik: 5-kemas kini tahun percubaan ENESTnd rawak. Leukemia 30, 1044– 1054.

Kang, YH, Biswas, A., Field, M., dan Snapper, SB (2019). Isyarat STAT1 melindungi sel T daripada sitotoksisiti pengantaraan sel NK. Nat. Commun. 10, 912.

Kaplan, DH, Shankaran, V., Dighe, AS, Stockert, E., Aguet, M., Old, LJ, dan Schreiber, RD (1998). Demonstrasi sistem pengawasan tumor yang bergantung kepada interferon gamma dalam tikus imunokompeten. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 7556–7561.

Koleske, AJ, Gifford, AM, Scott, ML, Nee, M., Bronson, RT, Miczek, KA, dan Baltimore, D. (1998). Peranan penting untuk kinase tyrosine Abl dan Arg dalam neurulasi. Neuron 21, 1259–1272.

Leaman, DW, Pisharody, S., Flickinger, TW, Commane, MA, Schlessinger, J., Kerr, IM, Levy, DE dan Stark, GR (1996). Peranan JAK dalam pengaktifan STAT dan rangsangan ekspresi gen c-fos oleh faktor pertumbuhan epidermis. Mol. Biol Sel. 16, 369–375.