Chimeric Human Papillomavirus-16 Zarah seperti Virus yang Membentangkan Peptida P18I10 Dan T20 Daripada HIV-1 Sampul Mengakibatkan HPV16 Dan HIV-1-Kekebalan Humoral dan Pengantaraan Sel T Khusus dalam BALB/c Tikus
Dec 07, 2023
Abstrak:
Dalam kajian ini, peptida HIV-1 P18I10 CTL yang diperoleh daripada gelung V3 HIV-1 gp120 dan peptida anti-gabungan T20 HIV-1 gp41 telah dimasukkan ke dalam protein kapsid HPV16 L1 untuk membina HPV chimeric: HIV (L1:P18I10 dan L1:T20) VLP dengan menggunakan sistem ekspresi sel mamalia. HPV: HIV VLP telah disucikan dengan kromatografi. Kami menunjukkan bahawa kemasukan peptida P18I10 atau T20 ke dalam gelung DE protein kapsid HPV16 L1 tidak menjejaskan kestabilan in vitro, pemasangan sendiri dan morfologi HPV chimeric: HIV VLP. Yang penting, ia tidak mengganggu sama ada dengan-1 kereaktifan antibodi HIV yang menyasarkan peptida P18I10 dan T20 berjujukan dan konformasi yang dibentangkan pada HPV chimeric: HIV VLP atau dengan induksi antibodi spesifik HPV16 L1-dalam vivo. Kami mendapati bahawa vaksin chimeric L1:P18I10/L1:T20 VLPs boleh mendorong HPV16- tetapi HIV lemah-1-tindak balas antibodi khusus dan menimbulkan HPV16- dan HIV-1-T- khusus tindak balas sel dalam tikus BALB/c. Selain itu, boleh menjadi penggalak yang berpotensi untuk meningkatkan tindak balas selular khusus HIV dalam imunisasi heterolog selepas penyediaan vaksin BCG.HIVA. Kerja penyelidikan ini akan menyumbang satu langkah ke arah pembangunan HPV chimeric novel: platform vaksin berasaskan HIV VLP untuk mengawal jangkitan HPV16 dan HIV-1, yang amat diperlukan di negara membangun dan perindustrian.
manfaat cistanche untuk lelaki-menguatkan sistem imun
Klik di sini untuk melihat produk Cistanche Enhance Immunity
【Minta lebih lanjut】 E-mel:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Kata kunci:
HIV-1; HPV16; vaksin; zarah seperti virus; P18I10; T20 enfuvirtide; BCG.HIVA; imuniti humoral; Imuniti pengantaraan sel T
1. Pengenalan
Human immunodeficiency virus-1 (HIV-1), yang menyebabkan acquired immunodeficiency syndrome (AIDS), ditemui pada awal 1980-an, dan sejak itu ia telah menjadi wabak global [1]. Walaupun rawatan anti-retroviral (HAART) yang sangat aktif, bersama-sama dengan profilaksis pra-pendedahan (PrEP) boleh memberi impak sebenar ke atas kawalan jangkitan HIV-1, vaksinasi masih merupakan pendekatan asas untuk faedah awam dan meletakkan menamatkan wabak HIV-1 global [2]. Walaupun lebih tiga dekad penyelidikan HIV-1 menyeluruh dan pelbagai ujian klinikal vaksin, vaksin HIV{10}} berlesen sehingga kini masih tidak dapat dicapai. Percubaan RV144 yang dijalankan di Thailand merupakan kes pertama yang mendedahkan keberkesanan sederhana sebanyak 31.2% terhadap pemerolehan jangkitan HIV-1 [3]. Majoriti calon vaksin HIV{16}} lain yang menjalani ujian klinikal adalah berdasarkan DNA, vektor virus rekombinan atau model protein subunit [4,5]. Sebaik-baiknya, vaksin HIV{19}} yang mujarab mampu mendorong tindak balas imun semula jadi, meneutralkan antibodi untuk mencegah jangkitan virus [6] serta tindak balas limfosit T (CTL) sitotoksik untuk menghapuskan sel yang dijangkiti [7]. Walau bagaimanapun, untuk mendapatkan setiap tindak balas mungkin memerlukan strategi vaksin yang berbeza, yang menjamin usaha pembangunan yang berasingan tetapi selari. Pemilihan imunogen dan vektor penghantaran akan memberi impak yang ketara ke atas fungsi dan kekhususan vaksin HIV-1 [8,9]. Kegagalan berulang menggunakan pendekatan standard untuk pembangunan vaksin HIV-1 membawa kepada pengiktirafan tentang kepentingan pemilihan vektor penghantaran, rejim rangsangan utama dan kekhususan imunogen dalam kedua-dua tindak balas humoral dan selular. Lebih daripada 100 jenis human papillomavirus (HPV) telah diketahui dan genotip HPV 16 dan 18 dianggap bertanggungjawab untuk kira-kira 70% kanser serviks di seluruh dunia [10]. Zarah seperti virus (VLP) HPV L1, yang dikelaskan sebagai sejenis vaksin subunit, kebanyakannya boleh mendorong tindak balas humoral khusus L{34}} yang setanding kepada virion jenis liar dan juga tindak balas pengantaraan sel T [11–13]. Pada masa ini, tiga vaksin pencegahan HPV telah dilesenkan di pasaran dan kesemuanya berasaskan VLP protein kapsid HPV L1. Dua daripadanya, Gardasil (Merck, Rahway, NJ, USA) dan Gardasil-9 (Merck) dihasilkan oleh sistem ekspresi yis (Saccharomyces cerevisiae) manakala satu lagi, Cervarix (GSK, Brentford, UK), dihasilkan oleh sistem vektor ekspresi baculovirus/sel serangga (BEVS/IC) [14]. Sehingga kini, keadaan optimum pengeluaran protein HPV16 L1 dalam sistem ekspresi mamalia belum mantap. Oleh itu, pembangunan vaksin gabungan yang akan melindungi daripada jangkitan HPV dan HIV adalah usaha logik dalam memerangi dua patogen global utama ini.
Dalam penerbitan kertas ulasan kami sebelum ini mengenai konsep reka bentuk vaksin HIV-1 berasaskan zarah seperti virus (VLP), kami menyebut bahawa VLP tidak bersampul, seperti VLP papillomavirus, boleh memainkan peranan berfungsi sebagai vektor penghantaran untuk dipersembahkan. HIV-1 CTL atau epitop antibodi meneutralkan [15,16]. Hipotesis ini telah disahkan dalam beberapa chimeric bovine papillomaviruses (BPV) L1 VLP yang membentangkan epitop P18I10 CTL daripada gelung V3 protein sampul gp120 HIV-1 (Env) dan epitop 2F5 atau kawasan MPER bagi gp41 HIV-1 Env [17–22]. Ciri struktur protein kapsid L1 jenis papillomavirus manusia -16 (HPV16) adalah serupa dengan BPV dan boleh dipasang sendiri menjadi VLP L1 satu lapisan [23]. Lima daripada protein HPV16 L1 membentuk pentamer dan 72 daripada pentamer dipasang sendiri menjadi HPV16 VLP [24]. Walau bagaimanapun, masih tiada bukti jelas bahawa protein kapsid HPV16:HIV chimeric boleh stabil secara in vitro dan terhimpun sendiri menjadi VLP integral morfologi. Sebaliknya, HPV16 L1 VLP telah ditunjukkan sebagai sangat imunogenik dan mampu mendorong tindak balas imun sel T dan B khusus antigen [11-13]. Ia masih belum dapat dilihat sama ada pembentangan epitop HIV{40}} melalui HPV: HIV VLP boleh menjadi imunogenik. Dalam kajian ini, kami menyasarkan untuk membangunkan vaksin HPV berasaskan VLP chimeric: HIV dengan menggunakan sel 293F manusia, sistem ekspresi sel mamalia yang mantap. Protein HPV 16 L1 bertindak sebagai perancah vaksin berstruktur, dan peptida P18I10 dan T20 telah dipilih sebagai imunogen HIV-1 dan dimasukkan ke dalam gelung DE bagi protein HPV 16 L1. Epitop P18I10 CTL immunodominant yang terdiri daripada 10 asid amino (residu 311–320: RGP GRAFVTI) diperoleh daripada domain pembolehubah ketiga (V3) sampul glikoprotein gp120 HIV-1. Peptida P18I10 telah dikenal pasti sebagai molekul MHC kelas-I yang dihadkan H-2Dd untuk mendorong tindak balas limfosit T (CTL) sitotoksik [25,26]. Peptida T20, yang dikenali sebagai Enfuvirtide dan direka sebagai peptida gabungan multimerik antiretroviral, terdiri daripada 36 jujukan asid amino (YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQ ELLELDKWASLWNWF) meniru urutan heliks heptad terminal-C yang hampir dengan membran0 s kawasan luar proksimal (MPER) bagi HIV-1 glikoprotein 41 (gp41) [27]. Kedua-dua epitop berasaskan sel HIV-1 T (P18I10) dan B (T20) ini dipilih sebagai titik permulaan dan bukti eksperimen konsep untuk HPV berasaskan VLP chimeric: platform pembangunan vaksin HIV.
Sepanjang dekad yang lalu, banyak format rangsangan utama yang berbeza bagi vaksin HIV-1 berasaskan VLP telah diuji [15]. Walaupun majoriti strategi vaksin HIV-1 VLP [28] atau chimeric BPV: HIV VLP [17–22] sebelum ini tertumpu pada mendorong tindak balas imun dengan menggunakan rejimen peningkatan perdana homolog, dua kajian terdahulu mencadangkan bahawa imunisasi heterolog terdiri daripada rekombinanMycobacterium bovisBacillus Calmette-Guérin (rBCG) yang mengekspresikan HIV-1 Gag prime dan HIV-1 Gag VLP boost boleh menyumbang untuk meningkatkan imuniti sel T [29,30]. Dalam kumpulan penyelidikan kami, kami telah menunjukkan penyebuan dengan rBCG yang mengekspresikan imunogen HIVA dan meningkatkan dengan vektor virus rekombinan MVA.HIVA selamat dan menimbulkan tindak balas imun sel T khusus HIV-1-dalam BALB/c tikus [31–33]. Imunogen HIVA, yang direka oleh Dr. Tomas Hanke, terdiri daripada protein Gag HIV{11}} penuh yang digabungkan dengan berbilang epitop CTL termasuk epitop P18I10 di terminal-C [34]. Oleh itu, kami berhasrat untuk menilai sama ada BCG.HIVA boleh meningkatkan tindak balas imun sel T yang disebabkan oleh HIV: HPV (L1:P18I10) VLP dalam tikus BALB/c.
Dalam kajian ini, imunogen HPV chimeric: HIV (L1:P18I10 dan L1:T20) telah direka dan dihasilkan dengan menggunakan sistem ekspresi 293F. Ekspresi protein L1:P18I10 dan L1:T20 chimeric telah disahkan oleh imunostaining. HPV: VLP HIV kemudiannya disucikan dengan 3-kaedah kromatografi langkah, termasuk kromatografi kation (CEC), pengecualian saiz (SEC) dan kromatografi pertalian heparin (H-AC). Kemudian, kestabilan in vitro, pemasangan sendiri in vitro, dan morfologi HPV yang telah dimurnikan: HIV VLP telah disahkan oleh SDS-PAGE yang tidak mengurangkan, ujian jisim molekul, dan mikroskop elektron penghantaran (TEM), masing-masing. Peptida P18I10 dan T20 berjujukan dan konformasi yang dibentangkan pada HPV chimeric: VLP HIV dicirikan lagi oleh antibodi monoklonal anti-HIV-1 gp120 V3 dan 2F5 secara in vitro dengan menggunakan Western blot dan ujian ELISA tidak langsung. Akhirnya, imunogenisiti HPV: HIV VLP dinilai dalam model tikus BALB / c. Kami menunjukkan bahawa vaksin berasaskan VLP chimeric L1:P18I10 dan L1:T20 boleh mendorong HPV16- dan HIV-1-tindak balas antibodi khusus dan VLP chimeric L1:P18I10 boleh mendorong HPV16- dan HIV{ {37}}tindak balas sel T khusus dalam tikus BALB/c. Oleh kerana pembangunan dan pembuatan vaksin HPV imunogenik: HIV masih tidak dapat dicapai, kajian ini menyediakan strategi asas yang mungkin berbaloi untuk menyokong usaha global untuk membangunkan vaksin berasaskan VLP chimeric novel untuk mengawal jangkitan HPV dan HIV-1.
2. Bahan-bahan dan cara-cara
2.1. Pembinaan Terikan Vaksin BCG.HIVA2auxo.int
BCG rekombinan yang mengekspresikan imunogen HIVA sebelum ini dibina menggunakan vektor ulang-alik integratif E.coli-mycobacterial p2auxo.int. Pembinaan vektor E. coli/mycobacterial yang menyatakan antigen HIVA telah diterangkan sebelum ini [31-33]. BCG.HIVA2auxo.int telah dicairkan dalam PBS-Tween20 hingga 2 × 107 cfu/mL, disonikasi untuk mengganggu gumpalan bakteria, dan disuntik ke dalam pad makanan belakang atau tikus BALB/c (50 µL, 106 cfu/tikus).
cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun
2.2. Kultur dan Transformasi Bakteria
Sel-sel strain auxotrophic glycine E. coli, M151GlyA (Invitrogen, Waltham, MA, USA), yang disediakan oleh Dr. Pau Ferrer, telah dibiakkan dalam medium derivatif M9-minimum (M9-D: Na2HPO4, 6.78 g/L; KH2PO4, 3 g/L; NaCl, {{10}}.5 g/L; NH4Cl, 1 g/L, glukosa, 1{{20 }} g/L; MgSO4, 2 mmol/L; CaCl2, 0.1 mmol/L; tiamin, 0.1 g/L; FeCl3, 0.{{56 }}25 g/L; AlCl3·6H2O, 0.13 mg/L; ZnSO4·7H2O, 2.6 mg/L; CoCl2·6H2O, 0.47 mg/L; CuSO4·H2O, 4.6 mg/L; H3BO3, 0.03 mg/L; MnCl2·4H2O, 4.2 mg/L; NiCl2·6H2O, 0.02 mg/L; Na2MoO4·2H2O, 0.06 mg/L) , ditambah dengan glisin (70 µg/mL). Sel E. coli M151Gly telah diubah dengan plasmid p2auxo.HIVA melalui elektroporasi. Untuk ini, kultur E. coli telah ditanam kepada ketumpatan optik 0.9 pada 600 nm dan diubah menggunakan elektroporator nadi gen Bio-Rad pada 2.5 kV, 25 µF, dan 200 Ω. Sel-sel yang diubahsuai kemudiannya dibiakkan pada plat agar M9-D (komponen seperti yang diterangkan sebelum ini, dengan 1.5% bactoagar ditambah) tanpa tambahan glisin untuk pemilihan atau dengan tambahan glisin sebagai kawalan. Strain BCG auxotrophic lisin, BCG∆lys, yang disediakan oleh WR Jacobs Jr., BR Bloom, dan T. Hsu telah diubah dengan DNA plasmid p2auxo.HIVAint melalui elektroporasi. Mikobakteria telah dibiakkan dalam medium sup Middlebrook 7H9 atau pada medium Middlebrook agar 7H10 ditambah dengan albumin-dextrose-catalase (ADC; Difco) yang mengandungi 0.05% Tween 80. L-lysine monohydrochloride (Sigma, Kawasaki, Jepun) telah dilarutkan dalam air suling dan digunakan sebagai tambahan pada kepekatan akhir 40 µg/mL. Untuk transformasi, BCG dibiakkan kepada ketumpatan optik 1.5 pada 600 nm dan diubah menggunakan elektroporator denyut gen Bio-Rad pada 2.5 kV, 25 µF, dan 1000 Ω. Transforman kemudiannya dibiakkan pada medium Middlebrook agar 7H10 ditambah ADC yang mengandungi 0.05% Tween 80 tanpa tambahan lisin.
2.3. Garisan Sel dan Kultur Sel
Sel 293F (Tibco), yang berasal daripada sel buah pinggang embrio manusia (HEK) 293, telah dikultur dalam medium ekspresi FreeStyle 293 (Tibco) ditambah dengan 5 mL/L penicillin-streptomycin (Tibco) dan diinkubasi dalam inkubator 37 ◦C yang mengandungi suasana lembap sebanyak 5% CO2 pada platform penggoncang orbit berputar pada 125 rpm.
2.4. Pengeluaran Protein L1:P18I10 dan L1:T20 Menggunakan Sistem Ekspresi 293F
Konstruk pCDNA3.1 mengandungi urutan pengekodan DNA L1:P18I10 atau L1:T20 yang sepadan dengan protein chimeric L1:P18I10 dan L1:T20. Peptida HIV-1 P18I10 CTL (RGPGRAFVTI) atau peptida T20 (YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQE LLELD KWASLWNWF) telah dimasukkan ke dalam gelung DE protein kapsid HPV16 L1. Pengekodan jujukan gelung HPV16 L1 DE 130-136 asid amino telah digantikan dengan sama ada peptida P18I10I10 atau T20. Urutan pengekodan DNA L1:P18I10 atau L1:T20 telah diubah suai dengan jujukan Kozak, dioptimumkan dengan kodon manusia, diapit oleh tapak enzim sekatan HindIII dan XbaI, dan diklonkan ke dalam vektor pcDNA3.1(+) dengan menggunakan perkhidmatan sintesis gen GeneArt ( Thermo Fisher, Waltham, MA, Amerika Syarikat). DNA plasmid rekombinan (pDNA) telah diubah menjadi sel kompeten E. coli DH5 (Invitrogen) untuk penguatan dan diekstrak menggunakan kit Maxi plasmid (QIAGEN, Hilden, Jerman). Sel 293F telah dikultur dengan medium ekspresi 30mL FreeStyle 293 dalam kelalang Erlenmeyer 125mL (Corning, New York, NY, USA) kepada ketumpatan 1.0 × 106/mL dan ditransfeksi secara sementara dengan L1:P18I10 atau L1:T20 pDNA bercabang menggunakan polyethyleneimine dengan MW 25 kDa (PEI-25K) (Polysains) pada nisbah optimum DNA kepada PEI 1:3 (b/b) dan DNA kepada medium kultur 1:1 (w/v), mengikut kepada arahan pengilang [35]. Sel 293F telah dituai pada 96 jam selepas pemindahan. Sel 293F boleh mencapai ketumpatan konfluen 3.6 × 106 sel/mL dengan lebih kurang 50% daya maju.
2.5. Pewarnaan Imunofluoresensi
Sel-sel telah meresap pada slaid kaca dengan 100% aseton sejuk. Selepas itu, sel tetap telah disiasat dengan antibodi anti-HPV16 L1 CAMVIR-1 (Abcam, Cambridge, UK) dan ditangkap dengan anti-tikus IgG-FITC (Sigma). Monolayers sel yang diwarnai imun telah dibasuh dengan teliti dengan PBS dan ditutup dengan medium pelekap dengan DAPI (Abcam). Imej imunofluoresensi telah diperiksa di bawah mikroskop terbalik pada pembesaran 40 ×. Kecekapan pemindahan ditentukan oleh nisbah sel positif FITC (hijau) kepada sel bernoda DAPI (biru).
2.6. Pembersihan HPV: HIV (L1:P18I10 dan L1:T20) VLP
Sebanyak 108 sel 293F yang ditransfeksi dalam kelalang Erlenmeyer 125 mL (30 mL medium/kelalang kultur) dikumpulkan melalui sentrifugasi pada 1500 rpm selama 5 minit dan dibasuh dua kali dengan PBS. Pelet sel telah digantung semula dalam penimbal lisis yang dirumus dengan 1% Triton X-100, perencat protease (1:100) (Millipore) dan Benzonase (25 U/mL) (Millipore). Lisat sel telah dijelaskan dengan penapis picagari PVDF 0.45 µm (Millipore). HPV: HIV (L1:P18I10 dan L1:T20) sampel VLP disucikan secara bersiri menggunakan pertukaran kation (Capto SP ImpRes, GE, Boston, MA, USA), pengecualian saiz (Capto Core 700, GE) dan pertalian (HiTrap Heparin HP , GE) kromatografi. Protokol kromatografi telah diterangkan dalam kajian terdahulu kami [36,37] dan mengikuti protokol pengilang [38]. Isyarat protein L1 dalam setiap langkah penulenan dicirikan oleh analisis Western blot dan disiasat dengan antibodi anti-HPV16 L1 CAMVIR-1 [39].
2.7. SDS-PAGE Tidak Mengurangkan
HPV16 L1, L1:P18I10 dan L1:T20 VLP dicampur dengan penimbal sampel 2× Laemmli (BIO-RAD) tanpa kehadiran atau kehadiran 5% (v/v) 2-mercaptoethanol ({{11} }ME) dan bertindak balas pada suhu bilik (RT) selama 24 jam. Sampel dipisahkan oleh 8-16% gel protein bebas noda TGX (BIO-RAD). Kemudian, gel dipindahkan ke membran PVDF. Membran telah disiasat dengan mAb anti-HPV16 L1 CAMVIR{20}} pada pencairan 1:4000. Selepas itu, membran diinkubasi dengan Konjugat IgG Peroksidase anti-tikus (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Syarikat) pada pencairan 1:4000. Isyarat telah dibangunkan dan divisualisasikan oleh chemiluminescence menggunakan kit substrat ECL Blot Barat (Bio-Rad, Hercules, CA, Amerika Syarikat). Imej blot diperoleh dengan menggunakan sistem pengimejan Odyssey Fc.
2.8. Analisis Jisim Molekul
HPV16 L1, L1:P18I10 dan L1:T20 VLP tanpa 2-merawatan ME telah ditapis keluar melalui peranti ultra penapisan pemotongan berat molekul (MWCO) 1000 kDa (SARTORIUS). HPV16 L1, L1:P18I10 dan L1:T20 VLP dengan 2-merawatan ME telah melalui peranti ultraturasan MWCO 100 kDa (Amicon). Retentat telah dibentuk semula kepada isipadu asal dan dikumpulkan dari takungan sampel peranti penapis, manakala turasan dikumpulkan di bahagian bawah tiub emparan. Isyarat L1 diukur dengan menggunakan dot blot yang disiasat dengan anti-HPV16 L1 mAb dan dikesan oleh konjugat IgG-peroksidase anti-tikus (Sigma-Aldrich). Imej diperoleh menggunakan Sistem Pengimejan Odyssey Fc di saluran chemiluminescence.
Kebaikan cistanche tubulosa-menguatkan sistem imun
2.9. Pewarnaan Negatif dan Transmisi Mikroskop Elektron
Selepas mengecas grid kuprum bersalut karbon (Sigma-Aldrich) di bawah cahaya ultraungu selama 5 minit, HPV16 L1 komersial (Abcam), L1:P18I10 dan L1:T20 VLP yang disucikan diseimbangkan dengan 20 mM Tris-HCl (pH 7.4, 137 mM NaCl ) telah diserap pada grid selama 1 minit dan dibilas tiga kali dengan air miliQ. HPV: HIV VLP diwarnakan negatif dengan 2% uranyl asetat pada pH 4.5 (Sigma-Aldrich) selama 1 minit. Agen pewarnaan yang berlebihan telah dikeluarkan oleh kertas penapis kualitatif Whatman (Sigma-Aldrich). Grid diletakkan di dalam ruang dehumidifier sekurang-kurangnya 2 jam sebelum pemerhatian. Imej diperoleh menggunakan mikroskop elektron penghantaran (Tecnai Spirit 120 kV) pada pembesaran SA135K (100 nm) dan SA59000 (200 nm), masing-masing.
2.10. Sodium Dodecyl Sulfate–Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Western Blotting Analysis
Jumlah yang sama (500 ng) protein HPV16 L1 (Abcam), L1:P18I10 dan L1:T20 VLP yang disucikan dicampur dengan penimbal sampel 2× Laemmli yang mengandungi 5% 2-ME dan direbus pada suhu 95 ◦C selama 5 minit . Sampel dipisahkan oleh 8-16% gel protein bebas noda TGX dan kemudian dipindahkan ke membran PVDF (Millipore, Burlington, MA, USA) menggunakan peranti pemindahan Semi-Dry (Bio-Rad). Membran telah disekat dengan susu skim 5% dalam TBST. Kemudian, membran telah disiasat dengan anti-HPV16 L1 CAMVIR-1 mAb pada pencairan 1:4000, anti-HIV-1 gp120 V3 gelung mAb (NIBSC, EVA3012) pada pencairan 1: 40 dan HIV1 gp41 (2F5) mAb (NIBSC, ARP3063) masing-masing pada pencairan 1:4000. Selepas itu, membran diinkubasi dengan Konjugat IgG Peroksidase anti-tikus (Sigma-Aldrich) pada pencairan 1:4000. Kit substrat ECL Barat (BIO-RAD) telah digunakan untuk pembangunan isyarat. Imej blot diperoleh dengan menggunakan sistem pengimejan Odyssey Fc pada saluran chemiluminescence.
2.11. Imunisasi Tikus, Pengumpulan Sera, dan Pengasingan Splenosit
Ini ialah kajian pembuktian konsep awal untuk menunjukkan keimunogenan HPV: VLP HIV (L1:P18I10 dan L1:T20 VLP). Dos, laluan pentadbiran, dan selang peningkatan utama HPV kami: HIV VLP merujuk kepada kajian terdahulu yang mengimunkan tikus dengan papillomavirus lembu (BPV): HIV VLP untuk mendorong tindak balas antibodi [20,21]. HPV Dimurnikan: VLP HIV telah diemulsikan dengan isipadu yang sama sebanyak (225 µg setiap 0.5 mL dos) aluminium hidroksifosfat sulfat (Thermo Fisher), untuk memastikan formulasi serupa dengan vaksin HPV Gardasil{13}} berlesen [40]. Semua kumpulan tetikus mempunyai taburan jantina yang sama (lelaki n=4 dan perempuan n=4 setiap kumpulan). Dalam kumpulan A dan B, tikus BALB/c telah diimunisasi secara intramuskular (im) dengan 10 µg L1:P18I10 atau L1:T20 VLP, masing-masing, dengan mengikuti rejim peningkatan perdana homolog. Dalam kumpulan C, tikus telah diinokulasi dengan 106 cfu BCG.HIVA2auxo.int secara intradermal (id, pada pad makanan) dan dirangsang dengan 10 µg L1:P18I10 VLPs secara intramuskular. Dalam kumpulan D, tikus kawalan positif telah disuntik dengan Gardasil{30}} prima diikuti oleh Gardasil{31}} meningkatkan secara intramuskular dengan 10 µg HPV16 L1 VLP. Dalam kumpulan E, tikus kawalan negatif telah diimunisasi dua kali dengan penimbal PBS. Selang peningkatan perdana ialah 2 minggu. Tikus telah dikorbankan pada hari ke 28. Sampel darah dikumpulkan dari hati tikus. Sera telah dipulihkan dengan sentrifugasi dan disimpan pada -20 ◦C untuk ujian ELISA. Limpa Murine dikeluarkan dan ditekan secara individu melalui penapis sel (Falcon) dengan pelocok getah picagari 5 mL. Berikutan penyingkiran sel darah merah dengan penimbal lisis ACK (Lonza), splenosit dibasuh dan digantung semula dalam medium limfosit R10 (RPMI 1640 ditambah dengan 10% serum anak lembu janin (FCS), penicillin-streptomycin, 20 mM HEPES dan 15 mM {{ 46}}ME) pada kepekatan 2 × 107 sel/mL.
2.12. Ujian Imunosorben Berkaitan Enzim
Untuk menguji antibodi spesifik HPV16 L1- dan HIV-1-yang mengikat HPV chimeric: HIV VLP membina in vitro, 50 µL kepekatan yang sama (200 ng/mL) protein HPV16 L1 rekombinan (Abcam, ab119880 ), L1:P18I10 dan L1:T20 VLP yang telah disucikan dalam penimbal bikarbonat karbonat 50mM (pH=9.6) (Sigma) telah 2-lipat dicairkan secara bersiri dan disalut pada plat Maxisorb (Nunc). Plat diinkubasi pada suhu 4 ◦C semalaman. Plat telah disekat dengan penimbal penyekat (susu skim 5% dalam TBST) pada suhu 37 ◦C selama sekurang-kurangnya 2 jam. Selepas mencuci dua kali dengan TBST, plat bersalut VLP diinkubasi dengan anti-HPV16 L1 CAMVIR-1 mAb pada pencairan 1:8000, 2F5 mAb (NIBSC, ARP3063) pada pencairan 1:8000 dan anti- HIV-1 gp120 V3 gelung mAb (NIBSC, EVA3012) masing-masing pada pencairan 1:40 dalam penimbal penyekat, pada 37 ◦C selama 2 jam. Selepas mencuci tiga kali dengan TBST, plat diinkubasi dengan konjugat protein G peroksidase rekombinan (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) pada pencairan 1:4000 dalam penampan menyekat pada 37 ◦C selama 1 jam. TMB digunakan untuk membangunkan isyarat ujian imunosorben berkaitan enzim (ELISA) dan dihentikan dengan 50 µL 2M H2SO4. Ketumpatan optik (OD) setiap telaga diukur dan direkodkan pada panjang gelombang 450 nm dengan menggunakan pembaca plat mikro penyerapan EL × 800.
Untuk mengukur antibodi yang disebabkan oleh VLP dalam tikus BALB/c, plat mikrotiter disalut dengan 50 µL 2 µg/mL protein HPV16 L1 rekombinan (Abcam, ab119880), HIV-1 P18I10 peptide (NIBSC, ARP734), Peptida T20 (NIBSC, ARP984), masing-masing, dengan penimbal karbonat-bikarbonat 50 mM (pH=9.6). Plat diinkubasi pada suhu 4 ◦C semalaman. Plat telah disekat dengan penimbal penyekat (susu skim 5% dalam TBST) pada suhu 37 ◦C selama sekurang-kurangnya 2 jam. Pada masa yang sama, sera yang dikumpul daripada tikus imunisasi kumpulan AE telah dicairkan dengan susu skim 5% dalam TBST pada nisbah 1:50. Selepas mencuci dua kali dengan TBST, plat diinkubasi dengan sera yang dicairkan pada suhu 37 ◦C selama 2 jam. Selepas mencuci tiga kali dengan TBST, plat ditambah dengan konjugat G HRP protein rekombinan pada pencairan 1:4000 dalam penampan menyekat dan diinkubasi pada 37 ◦C selama 1 jam. TMB digunakan untuk membangunkan isyarat ELISA dan dihentikan dengan 50 µL 2M H2SO4. OD setiap telaga diukur pada panjang gelombang 450 nm dengan menggunakan pembaca plat mikro penyerapan EL × 800 (Biotek).
2.13. IFN- ELISpot Assay
Ujian tempat penyerap imun berkaitan enzim (ELISpot) dilakukan menggunakan kit IFN-ELISpot murine komersial (Mabtech, Nacka Strand, Sweden), mengikut arahan pengilang. Plat ELISpot (MSISP4510, 96-plat telaga dengan membran polivinilidena difluorida, Millipore, Middlesex County, MA, Amerika Syarikat) telah 70% EtOH dirawat dan disalut dengan interferon anti-tikus tulen- (IFN-) menangkap antibodi monoklonal yang dicairkan dalam garam penampan fosfat (PBS) kepada kepekatan akhir 5 µg/mL pada 4 ◦C semalaman. Kemudian, 2.5 × 105 splenocytes segar ditambah kepada setiap telaga. Selepas itu, sel-sel daripada kumpulan A dan B telah dirangsang dengan masing-masing 2 µg/mL HPV16 L1 VLP dan peptida HIV-1 P18I10. Semua sampel dan kawalan disalut dalam telaga pendua. Ujian ELISpot diinkubasi selama 16 jam pada suhu 37 ◦C, 5% CO2. Plat kemudiannya dibasuh 5 × dengan PBS, diinkubasi selama 2 jam dengan antibodi anti-IFN- monoklonal (mAb) terbiotinilasi yang dicairkan dalam PBS 2% Fetal Calf Serum (FCS) kepada kepekatan akhir 2 µg/mL, dibasuh 5 kali dalam PBS, dan diinkubasi dengan konjugat fosfatase streptavidin-alkali dalam PBS 2% FCS. Kemudian, plat dibasuh 5 kali dengan PBS sebelum mengeram dengan 100 µL larutan substrat 5-bromo-4-chloro-3-indolyl fosfat (BCIP)/nitro blue tetrazolium (NBT) (Sigma-Aldrich). , St. Louis, MO, Amerika Syarikat). Selepas 5-10 minit, plat dibasuh dengan air paip, dikeringkan, dan bintik-bintik yang terhasil dikira menggunakan pembaca ELISPOT (AID, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasberg, Jerman). Bagi setiap haiwan, min tindak balas latar belakang telah ditolak secara individu daripada semua telaga untuk membolehkan perbandingan sel pembentuk tompok IFN (SFC)/106 antara kumpulan. Untuk mentakrifkan tindak balas positif, ambang ditakrifkan sebagai sekurang-kurangnya lima titik setiap telaga, dan tindak balas melebihi bilangan purata titik dalam telaga kawalan negatif ditambah tiga sisihan piawai telaga kawalan negatif.
2.14. Analisis statistik
Semua analisis statistik dilakukan menggunakan perisian Prism 6 GraphPad (CA, USA). Kami menggunakan data daripada eksperimen yang dijalankan ke atas 5 kepekatan salutan plat ELISA yang berbeza (0, 50, 100, 150, 200 ng/mL) protein HPV16 L1 rekombinan (Abcam, ab119880) dan HPV: HIV VLP. Kami mengumpul data daripada 2 kumpulan (HPV16 L1 dan HPV: HIV VLP) dan mengumpul tiga replika untuk setiap kepekatan salutan. Graf dalam Prisma menunjukkan data sebagai plot serakan yang menunjukkan kepekatan salutan (ng/mL) pada paksi-X dan OD450 pada paksi-Y. Memandangkan kami membuat hipotesis bahawa data ELISA in vitro kami berkaitan dalam corak linear, kami melakukan analisis regresi linear dan membandingkan cerun dua baris untuk mengesahkan set data itu-1 dan set data-2 (antibodi kereaktifan antara HPV16 L1 dan HPV: HIV VLP) adalah berbeza dalam tindakan mereka. Kami memilih 95% selang keyakinan bersama garisan paling sesuai. Prisma secara automatik menindih garis regresi linear pada kedua-dua set data kami dan ia telah memplot garis putus-putus yang mewakili 95% selang keyakinan. Semasa analisis regresi linear, perisian hanya mengira nilai min Y bagi set data kami yang menunjukkan kebaikan kesesuaian. Di samping itu, Prism memberi kita ulasan, jadi kita boleh membuat kesimpulan bahawa perbezaan antara kedua-dua cerun adalah sangat ketara.
Kami mempunyai 5 set (ELISA) dan 4 set (ELISPOT) data yang dikumpul daripada eksperimen imunisasi tikus. Set data ini mempunyai nombor yang sama (lelaki n=4 dan perempuan n=4) dalam setiap kumpulan. Kami menggunakan Gardasil-9-tikus imunisasi sebagai kumpulan kawalan positif dan tikus imunisasi PBS sebagai kumpulan kawalan negatif. Data percubaan kami yang direka bentuk tidak sepadan atau berpasangan. Kami menjalankan analisis varians sehala (ANOVA) untuk melihat sama ada cara ini berbeza. Kami mula-mula menyemak data kami sesuai dengan taburan normal Gaussian. Kami mendapati bahawa beberapa kumpulan data dalam ujian ELISA tidak melepasi ujian taburan normal Gaussian. Oleh itu, kami menjalankan analisis statistik bukan parametrik data ini. Sebaliknya, semua kumpulan data dalam ujian ELISPOT melepasi ujian taburan normal Gaussian. Oleh itu, kami melakukan analisis statistik parametrik data ini. Ambang kepentingan dan tahap keyakinan ditetapkan kepada 0.05 (bersamaan dengan selang keyakinan 95%). nilai p menunjukkan secara umum kebarangkalian terdapat perbezaan antara kumpulan. Oleh kerana kebimbangan utama kami untuk eksperimen ini ialah apakah perbezaan antara kumpulan kami, perbandingan berbilang dalam Prisma memberi kami hasil perbandingan dalam semua kumpulan dengan setiap kumpulan lain.
2.15. Pernyataan Etika
Tikus BALB/c berusia enam hingga lapan minggu telah dibeli daripada Envigo (Syarikat Inotiv, Chicago, IL, Amerika Syarikat) dan diluluskan oleh pihak berkuasa tempatan (Generalitat de Catalunya, nombor projek 11157) dan Jawatankuasa Etika Universitat Autònoma de Barcelona. Eksperimen haiwan itu mematuhi undang-undang kebajikan haiwan Generalitat de Catalunya. Semua eksperimen telah diluluskan oleh Jawatankuasa Etika Penyelidikan tempatan (Prosedur 43.19, Hospital de la Vall d'Hebron, Universitat Autònoma de Barcelona).
3. Keputusan
3.1. Reka bentuk Imunogen L1:P18I10 dan L1:T20 dan Penilaian HPV: Ekspresi Protein HIV dengan Menggunakan Sistem Ekspresi 293F
Peptida P18I10 daripada gelung HIV-1 Env domain pembolehubah ketiga (V3) dan peptida T20 daripada HIV-1 Rantau luar proksimal (MPER) membran Env telah dimasukkan ke dalam protein gelung HPV16 L1 DE untuk menjana L1 chimeric :P18I10 dan L1:T20 imunogen. Urutan pengekodan DNA chimeric L1:P18I10 dan L1:T20 telah diklonkan ke dalam pcDNA3.1 (+) vektor ekspresi DNA plasmid untuk pemindahan sementara dalam sel 293F (Rajah 1A). Struktur monomer HPV16 L1, chimeric L1: P18I10, dan L1: T20 protein kapsid telah diramalkan terlebih dahulu menggunakan pelayan model SWISS (Rajah 1B). Protein kapsid utama HPV16 L1 (7cn2.1.R) telah dipilih sebagai templat struktur untuk membina pemodelan homologi protein kapsid HPV16 L1, L1:P18I10 dan L1:T20. Berbanding dengan konformasi peptida P18I10 terikat dalam kajian terdahulu [41], arah rantai utama terminal N ke C peptida P18I10 pada protein chimeric L1: P18I10 kami berjalan dari kanan ke kiri (Rajah 1B, panel tengah dan atas), dan rantai sisi P18I10 yang terdedah berpotensi berinteraksi dengan reseptor sel T (Rajah 1B, panel tengah dan bawah). Berbanding dengan struktur peptida perencat gabungan HIV-1 dalam kertas ulasan sebelumnya [42], peptida T20 yang dimasukkan pada protein kapsid HPV16 L1 dibentangkan sebagai pembentukan seperti heliks (Rajah 1B, panel kanan dan atas ), dan rantai sisi T20 yang terdedah berpotensi dapat dikenali oleh reseptor sel B (Rajah 1B, panel kanan dan bawah). Memandangkan protein kapsid HPV16 L1 boleh berkumpul secara homogen menjadi zarah ikosahedral T=7 dengan 72 kapsomer pentamerik [43], paparan berketumpatan tinggi peptida P18I10 atau T20 ke permukaan luar HPV chimeric: VLP HIV berpotensi sangat imunostimulasi. untuk mendorong tindak balas imun khusus epitope.
Rajah 1. L1:P18I10 dan L1:T20 reka bentuk imunogen dan pembinaan HPV chimeric: HIV VLP dengan menggunakan sistem ekspresi 293F. (A) Urutan pengekodan DNA chimeric L1:P18I10 dan L1:T20 telah diklonkan ke dalam pcDNA3.1+ vektor ekspresi, masing-masing, untuk pemindahan sementara dalam sel 293F. (B) Ramalan struktur monomer HPV16 L1 dan HPV chimeric: protein kapsid HIV dengan menggunakan pelayan model SWISS. Protein kapsid utama HPV16 L1 (7cn2.1.R) telah dipilih sebagai templat struktur untuk membina pemodelan homologi protein kapsid HPV16 L1 (panel kiri), L1:P18I10 (panel tengah) dan L1:T20 (panel kanan). Unsur struktur sekunder protein kapsid HPV16 L1 dilabelkan, dengan huruf h1–h5 untuk 5 -heliks. Gelung protein kapsid HPV16 L1 antara helai dilabelkan BC, CD, DE, EF, FG dan HI. Unsur struktur sekunder HIV-1 P18I10 dan T20 peptida L1 dilabelkan dengan anak panah (panel atas). Bahagian peptida P18I10 dan T20 yang menonjol di atas permukaan protein kapsid HPV16 L1 ditunjukkan oleh anak panah (panel bawah). (C) Pewarnaan imunofluoresensi protein L1 dalam sel 293F. pDNA.L1 berikut:P18I10 (kiri), pDNA.L1:T20 (tengah) dan pDNA.tanpa sisipan (kanan) telah ditransfeksi dalam sel 293F. Sel-sel yang ditransfeksi telah disiasat dengan anti-HPV16 L1 mAb dan dikesan dengan anti-tikus IgG-FITC (saluran hijau). Nukleus sel telah diwarnai dengan DAPI (saluran biru). Imej imunofluoresensi telah digabungkan dengan menggunakan Adobe Photoshop
Oleh kerana jujukan terminal HPV16 L1 protein C mengantara jentera import nuklear selular semasa jangkitan [44], isyarat penyetempatan nuklear (NLS) protein HPV16 L1 telah dikenal pasti dalam kajian terdahulu [45]. Antibodi monoklonal CAMVIR-1 telah dipilih untuk mengenali epitope HPV16 L1 (GFGAMDF, 230–236 aa) [39], dan FITC pewarna berasaskan fluorescein digunakan sebagai wartawan untuk memantau ekspresi L1:P18I10 dan L1: Protein T20. Immunofluo rpresenceimages jelas menunjukkan bahawa HPV16 L1 (berwarna hijau) terutamanya disetempat dalam nukleus (berwarna biru) sel 293F. Tiada isyarat L1 diperhatikan dalam sel 293F transek plasmid kawalan (plasmid pcDNA3.1 tanpa sisipan) (Rajah 1C). Keputusan mencadangkan bahawa kedua-dua protein kapsid L1:P18I10 chimeric dan L1:T20 boleh dinyatakan dengan menggunakan transfeksi pengantara polyethyleneimine (PEI) dan diiktiraf oleh antibodi monoklonal HPV16 L1 CAMVIR{35}}.
3.2. Pembersihan L1:P18I10 dan L1:T20 VLP dengan Menggunakan Kaedah Kromatografi
The chimeric L1:P18I10 and L1:T20 proteins were produced by using the 293F expression system. The capture, intermediate purification, and polishing (CiPP) strategy to develop our chromatographic purification protocol is shown in Figure 2A. Flowthrough (FT) in each purification step was collected and the level of L1 protein expression was detected by Western blot analysis using anti-L1 mAb to trace intermediate HPV: HIV VLPs (Figure 2B, C). A cation exchange (CEC) column was selected as a capturing step to isolate HPV: HIV VLPs from host cell proteins (HCPs). The result of CEC FT revealed that most of the L1:P18I10 and L1T20 VLPs were lost in the FT over the CEC column (Figure 2B, C, lane 2). Traditional CEC matrices we used heavily rely on diffusion-limited mass transfer [46]. Large macromolecular complexes, such as our HPV: HIV VLP samples, might be inefficient for the VLP binding to CEC matrices. In order to reach the maximum binding capacities of the CEC column (~50 mg protein/mL resin), we loaded a double amount of soluble cell lysate containing approximately 2% of HPV: HIV VLPs into the CEC column. In the intermediate purification step, HPV: HIV VLPs were purified using a layered-bead size exclusion chromatography (SEC) resin [38]. Large HPV: HIV particles (>700 kDa) were eluted while most of the small impurities were trapped in the beads (Figure 2B, C, lane 5). Due to heparin having a similar structure as DNA and possibly binding to positively charged peptides of conformational HPV16 L1 VLPs, we selected a heparin affinity chromatography (H-AC) as a polishing step to remove heterogeneous or closely related particles [47]. Analysis of densitometry from Western blot analysis and bovine serum albumin (BCA) assay confirmed that purity of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs after diafiltration step was high, over 76% (Figure 2B, C, lane 10). The purified L1:P18I10 and L1:T20 VLPs were detected as a band in size of approximately 56 kDa and 58 kDa, respectively. We found that the commercial HPV16 L1 protein and our purified chimeric HPV: HIV VLPs (L1:P18I10 and L1:T20) share a similar protein pattern (a target band >50 kDa dan jalur bawah heterologus<50 kDa). These heterologous lower bands could be detected, especially, when we loaded SDS-PAGE gel with a high amount of chimeric HPV: HIV VLP samples (Figure 2B, C, lane 1 to 10). It is probably caused by proteolytic degradation or heterogeneous formation of L1 proteins. A similar pattern (2 bands) was also found in many previous HPV16 L1 purification studies [23,48–51]. These data demonstrated that the 293F expression system and chromatographic purification methods are feasible approaches to engineer chimeric HPV: HIV VLPs.
Rajah 2. Pemurnian dan pencirian L1:P18I10 dan L1:T20 VLP. (A) Carta alir proses skematik L1:P18I10 dan L1:T20 penulenan VLP melalui kromatografi. (B, C) Analisis Western blot sampel L1:P18I10 dan L1:T20 VLP daripada setiap langkah penulenan. Isyarat L1 dalam setiap langkah penulenan dicirikan oleh analisis Western blot yang disiasat dengan anti-HPV16 L1 mAb. Anak panah menunjukkan berat molekul ~56 kDa L1:P18I10 dan ~58 kDa protein L1:T20. Lorong 1: clarified cell lysate (CCL); Lorong 2: pemuatan sampel melalui aliran (FT) daripada kromatografi pertukaran kation (CEC); Lorong 3: eluat CEC; Lorong 4: FT daripada langkah penjanaan semula CEC 2M NaCl; Lorong 5: kromatografi pengecualian saiz (SEC) FT-1; Lorong 6: SEC FT-2; Lorong 7: FT daripada pemuatan sampel kromatografi afiniti heparin (H-AC); Lorong 8: H-AC eluate; Lorong 9: FT daripada langkah penjanaan semula NaCl H-AC 2M; Lorong 10: 10-diafiltrasi kali ganda.
3.3. Kestabilan In Vitro dan Pemasangan Sendiri L1:P18I10 dan L1:T20 VLP
Untuk mengesahkan bahawa HPV yang telah disucikan: VLP HIV menunjukkan kestabilan in vitro yang serupa dengan VLP HPV16 L1, kami melakukan SDS-PAGE yang tidak mengurangkan untuk menilai pautan silang disulfida HPV: protein kapsid HIV (Rajah 3A). Telah diketahui bahawa pH, kekuatan ion, suhu [52], dan persekitaran redoks semuanya berkorelasi dengan ikatan disulfida protein kapsid HPV16 L1 [53]. HPV L1 VLP cenderung untuk dipasang sendiri pada pH rendah dan kekuatan ionik yang tinggi. Penyahpasangan maksimum VLP biasanya memerlukan pendedahan kepada agen penurun kepekatan tinggi, seperti 5% 2-mercaptoethanol (2-ME) untuk tempoh yang agak lama [54]. Dengan ketiadaan agen penurun 2-ME, hanya sebahagian kecil daripada HPV-16 L1, L1:P18I10 dan L1:T20 protein berhijrah kepada monomer dengan berat molekul ketara (MW) 55 kDa . Kira-kira 70% daripada protein L1 adalah disulfida yang terikat kepada dimer atau pentamer yang lebih besar, dengan ramalan MW sebanyak 110 kDa dan 280 kDa (Rajah 3A, lorong 2, 4, dan 6). Sebaliknya, hampir semua protein HPV-16 L1, L1:P18I10 dan L1:T20 dalam penimbal pembongkaran muncul struktur monomerik dalam SDS-PAGE yang tidak mengurangkan (Rajah 3A, lorong 3, 5 dan 7). Keputusan ini menunjukkan bahawa kestabilan in vitro VLP L1:P18I10 dan L1:T20 yang telah dimurnikan mempersembahkan corak pemautan silang disulfida yang serupa seperti VLP HPV16 L1 di bawah pH, kekuatan ionik dan keadaan terma yang sama. VLP yang telah disucikan nampaknya dipecahkan kepada tahap pentamer, trimer dan dimer berikutan pendedahan jangka panjang kepada kepekatan tinggi agen pengurangan. Data ini adalah selaras dengan kajian terdahulu [53,54] Walau bagaimanapun, pembongkaran HPV: HIV VLP masih jauh dari lengkap (monomer).
Rajah 3. Kestabilan in vitro L1:P18I10 dan L1:T20 VLP. (A) Pautan silang disulfida L1:P18I10 dan L1:T20 VLP dalam SDS-PAGE yang tidak mengurangkan. VLP HPV16 L1, VLP L1:P18I10 dan L1:T20 yang telah disucikan telah dicampur dengan penimbal sampel Laemmli jika tiada atau kehadiran 2-mercaptoethanol (2-ME), masing-masing, dan dianalisis secara tidak mengurangkan SDS-PAGE. Kedudukan monomer L1 (55 kDa), L1 dimer (110 kDa), dan L1 pentamer (280 kDa) ditunjukkan oleh anak panah. Lorong 1: penanda berat molekul protein; Lorong 2: HPV16 L1 VLP; Lorong 3: HPV16 L1 VLP dirawat dengan 2-SAYA; Lorong 4: L1:P18I10 VLP; Lorong 5: L1:P18I10 VLP dirawat dengan 2-SAYA; Lorong 6: L1:T20 VLP; Lorong 7: L1:T20 VLP dirawat dengan 2-ME. (B) Analisis jisim molekul L1:P18I10 dan L1:T20 VLP. VLP yang dipasang tidak dirawat dengan 2-ME (lorong 2, 4 dan 6) telah ditapis keluar melalui peranti diafiltrasi potongan berat molekul (MWCO) 1000kDa (panel atas). VLP yang dibongkar yang dirawat dengan 2-ME (lorong 3, 5 dan 7) telah ditapis keluar melalui peranti penapis empar MWCO 100kDa (panel bawah). Retentat (R) dikumpulkan daripada takungan sampel peranti penapis, manakala turasan (F) dikumpulkan di bahagian bawah tiub emparan. Isyarat protein L1 dikesan dengan menggunakan dot blot yang disiasat dengan anti-HPV16 L1 mAb.
To demonstrate that purified HPV: HIV proteins by chromatography are able to self-assemble to icosahedral particles, we further performed molecular mass analysis under the same reducing condition (5% 2-ME). The commercial HPV16 L1, purified L1:P18I10, and L1T20 proteins without reducing agent treatment were filtered out through 1000 kDa molecular weight cut-off (MWCO) diafiltration devices individually (Figure 3B, top panel). The L1 monomers (55 kDa), oligomers (110~200 kDa), or pentameric capsomers (280 kDa) were expected to pass through an ultrafiltration membrane retaining the integral VLPs (MW~20,000 kDa). The L1 signal of commercial HPV16 L1 proteins was detected in both retentates and filtrates. Most of the purified L1:P18I10 and L1T20 proteins formed large particles (>1000 kDa) dan telah dipelihara dalam retentat. Corak itu adalah bertepatan dengan data yang diperhatikan dalam SDS-PAGE yang tidak mengurangkan. Walaupun semua kumpulan VLP yang dirawat dengan 2-ME ditunjukkan dalam jalur monomerik (~55 kDa) dalam SDS-PAGE yang tidak mengurangkan (Rajah 3A, lorong 3, 5 dan 7). Walau bagaimanapun, VLP berkurangan yang sepadan tidak ditapis melalui membran ultraturasan 100kDa (Rajah 3B, panel bawah). Keputusan ini mencadangkan bahawa HPV chimeric: Protein HIV mampu untuk memasang sendiri kepada zarah yang lebih besar, tetapi pembongkaran maksimum VLP kepada monomer memerlukan bukan sahaja pengurangan ikatan disulfida tetapi juga faktor penyahnaturan lain, seperti pH atau kekuatan ionik.
3.4. Pencirian Morfologi L1:P18I10 dan L1:T20 VLP
Mikroskopi elektron penghantaran (TEM) digunakan untuk memeriksa konformasi morfologi HPV16 L1 dan HPV: HIV VLP. Peptida HIV-1 P18I10 dan T20 telah dimasukkan ke dalam gelung DE protein HPV16 L1, masing-masing. HPV16 L1 komersial dan HPV chimeric ini: Protein kapsid HIV boleh secara spontan terhimpun sendiri secara in vitro menjadi VLP integral dalam diameter kira-kira 50–60 nm (Rajah 4A–C, panel kanan). Berbanding dengan mikrograf elektron HPV16 L1 VLP yang diterbitkan dalam kajian terdahulu [55,56], struktur ikosahedral HPV16 L1, L1:P18I10, dan L1:T20 VLP di sini adalah kurang kontras dan kabur. Ia boleh dikaitkan dengan reagen noda negatif yang kami gunakan dalam kajian ini. Dalam kajian terbaru kami yang diterbitkan dalam kajian terdahulu [37] dan satu lagi kertas kerja yang sedang dijalankan di bawah semakan rakan sebaya (data tidak ditunjukkan), kami telah mendapat kualiti dan resolusi mikrograf elektron yang baik apabila L1: P18I10 VLP yang berasal dari yis dan baculovirus (chimeric yang sama. construct) telah diseimbangkan dalam PBS dan diwarnakan negatif dengan asid fosfotungstik (PTA). Oleh kerana kami menggunakan sistem pengeluaran dan penulenan VLP yang berbeza dalam kajian ini, L1:P18I10 dan L1:T20 VLP yang berasal dari sel mamalia telah diseimbangkan dengan Tris-HCl dan diwarnakan negatif dengan uranil asetat. Walaupun mikrograf elektron boleh diperbaiki, kita masih dapat melihat corak yang jelas bahawa kebanyakan protein kapsid HPV16 L1, L1:P18I10, dan L1:T20 boleh dipasang sendiri menjadi VLP morfologi di bawah skrin TEM (Rajah 4A–C, panel kiri ). Pada asasnya, HPV VLP dilindungi daripada pengagregatan dalam keadaan garam yang tinggi [57]. Sebahagian daripada pengagregatan HPV16 L1 dan HPV yang boleh dikesan: VLP HIV dalam penimbal Tris-HCl garam rendah boleh dilihat di bawah pembesaran yang lebih rendah (Rajah 4A-C, panel kiri). Daripada keputusan ini, kami membuat kesimpulan bahawa pengubahsuaian jujukan gelung L1 DE separa dengan memasukkan peptida HIV-1 P18I10 atau T20 tidak menjejaskan morfologi HPV: HIV VLP dengan ketara.
Rajah 4. Mikrograf elektron L1:P18I10 dan L1:T20 VLP. (A) Morfologi HPV16 VLP. (B) Morfologi L1:P18I10 VLP. (C) Morfologi L1:T20 VLP. VLP yang telah disucikan telah diserap pada grid kuprum bersalut karbon bercas UV, dan diwarnakan secara negatif dengan 2% uranil asetat. Imej diperoleh di bawah mikroskop elektron penghantaran. Bar mewakili 200 nm pada pembesaran 59,000 (panel kiri) dan 100 nm pada pembesaran 135K (panel kanan), masing-masing
3.5. Persembahan dan Kereaktifan HPV-16 dan HIV-1 Epitop
Untuk mengesahkan bahawa epitop HIV-1 P18I10 atau 2F5 berjujukan telah dibentangkan dalam VLP L1:P18I10 atau L1:T20 yang ditulen kromatografi, analisis Western blot dan ELISA tidak langsung telah dibentuk menggunakan mAb khusus epitop. Kami memilih antibodi monoklonal (mAb) yang terkenal, CAMVIR yang ditetapkan-1, untuk mengenali epitop yang sangat dipelihara (GFGAMDF, aa 230–236) protein HPV16 L1 [39,58]. Epitop gelung gp120 V3 yang diterbitkan sebelum ini telah diterbitkan (RIQRGPGRAFVTIGK, aa308–322) telah dipilih untuk mengesan epitop P18I10 berjujukan (RGPGRAFVTI, aa311–320) [59]. Sebaliknya, antibodi peneutral luas (bnAb) yang mengiktiraf HIV-1 gp41 2epitop F5 (ELDKWA) terhadap pelbagai jenis HIV makmal-1 telah dipilih untuk pencirian peptida T20 [ 60,61]. Ujian Western blot yang disiasat dengan HPV16 L1 mAb menunjukkan jalur 55, 56, dan 58 kDa yang sepadan dengan protein HPV16 L1, L1: P18I10, dan L1: T20 (Rajah 5A, B, kiri). Berat molekul (MW) protein L1: P18I10 adalah serupa dengan protein HPV16 L1 (Rajah 5A, kiri). Band yang sepadan dengan protein L1: T20 diperhatikan lebih tinggi sedikit daripada protein HPV16 L1, seperti yang diramalkan daripada jujukan asid amino tambahan (Rajah 5B, kiri). Jalur kira-kira 56 dan 58 kDa, sepadan dengan protein L1:P18I10 dan L1:T20, telah dikesan dalam ujian Western blot yang disiasat dengan anti-HIV-1 gp120 V3 dan 2F5 mAb, masing-masing (Rajah 5A, B, kanan ). Kami berpendapat berat molekul (MW) bagi protein L1:T20 anti-2F5-berwarna adalah betul dan sesuai dengan 58 kDa yang dijangkakan (Rajah 5B, kanan). Walau bagaimanapun, MW protein L1:P18I10 anti-HIV-1 gp120 V3-berwarna sedikit lebih rendah (Rajah 5A, kanan). Ini boleh dikaitkan dengan struktur heterogen protein L1:P18I10 chimeric. Memandangkan konformasi epitope berjujukan mungkin hilang di bawah keadaan pendenaturan dalam SDS-PAGE. Oleh itu, kami selanjutnya melakukan ELISA tidak langsung untuk menunjukkan peptida P18I10 konformasi dengan betul dibentangkan pada chimeric L1: P18I10 VLPs kami (Rajah 5E). Sebaliknya, antibodi gelung gp120 V3 anti-HIV yang kami gunakan mengecam keseluruhan gelung HIV{103}} V3 dan bukannya epitop P18I10. Akibatnya, isyarat anti-V3 keseluruhan adalah lebih rendah (Rajah 5A, B, panel kanan). Walaupun begitu, keputusan ini menunjukkan bahawa peptida HIV{110}} P18I10 dan T20 berjujukan dibentangkan dalam HPV: HIV VLP.
Rajah 5. Persembahan epitop HPV-16 dan HIV-1. (A, B) Pengesanan epitope berjujukan bagi VLP chimeric L1:P18I10 dan L1:T20. VLP L1:P18I10 dan L1:T20 yang telah dimurnikan telah dianalisis oleh Western blot, menggunakan anti-HPV16 L1, anti-HIV-1 gp120 V3 dan 2F5 mAb. HPV16 L1 VLP digunakan sebagai kawalan. Berat molekul protein L1 (55 kDa), L1:P18I10 (56 kDa), dan L1:T20 (58 kDa) ditunjukkan oleh anak panah. Lorong 1: penanda berat molekul protein; Lorong 2: Protein HPV16 L1; Lorong 3: L1:P18I10 protein; Lorong 4: L1:T20 protein. (C, D) Pengikatan HPV16 L1 mAb kepada chimeric L1:P18I10 dan L1:T20 VLP. (E) Pengikatan anti-HIV-1 gp120 V3 mAb kepada chimeric L1:P18I10 VLP. (F) Pengikatan HIV-1 2F5 mAb kepada VLP chimeric L1:T20. Graf garis ELISA tidak langsung telah dilakukan untuk mengesan epitop konformasi HPV16 L1 rekombinan, L1:P18I10 dan L1:T20 VLP yang terikat kepada anti-L1, anti-HIV-1 gp120 V3 atau 2F5 mAbs, masing-masing. Data mewakili tiga eksperimen bebas. Ujian regresi linear mudah telah dilakukan untuk membandingkan perbezaan garis L1:P18I10 dan L1:T20 VLP yang telah dimurnikan dengan lengkung standard VLP L1 komersial; ns: tidak ketara; ** p < 0.01.
Selain itu, untuk menentukan sama ada epitop konformasi {{{{50}}}} HIV yang dibentangkan pada HPV: VLP HIV boleh dikenal pasti oleh antibodi peneutral gp120 V3 dan 2F5 secara in vitro, kami melakukan ujian ELISA tidak langsung untuk memeriksa kekhususan dan kereaktifan pengikat epitope. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 5C, D, HPV16 L1, L1:P18I10, dan L1:T20 VLPs telah diiktiraf oleh anti-L1 mAb. Kami melakukan analisis regresi linear untuk membandingkan cerun setiap garisan pencairan. Keputusan mendedahkan bahawa kekhususan pengikat epitope L1 sama ada L1:P18I10 atau L1:T20 VLP tidak berbeza daripada HPV16 L1 VLP. Selain itu, anti-HIV-1 gp120 V3 mAb dapat mengikat VLP L1:P18I10, tetapi bukan VLP HPV16 L1 (Rajah 5E). Di samping itu, 2F5 mAb boleh mengecam L1:T20 VLP, tetapi tidak HPV16 L1 VLP (Rajah 5F). Selepas analisis regresi linear, perbezaan dalam kekhususan pengikat epitope gp120 V3 antara L1:P18I10 dan HPV16 L1 adalah sangat ketara (p < 0.01%). Kekhususan pengikat epitope 2F5 bagi L1:T20 VLPs adalah berbeza dengan ketara daripada HPV16 L1 VLP (p <0.01%). Corak ini mendedahkan bahawa lipid selular hidrofobik tidak diperlukan untuk pengikatan 2F5-antibodi meneutralkan kepada HPV: HIV VLP secara in vitro. Walaupun kereaktifan anti-HIV-1 gp120 V3 dan 2F5 meneutralkan antibodi kepada HPV: HIV VLP adalah agak ringan, pengikatan anti-HIV-1 gp120 V3 dan 2F5 mAb kepada HPV: HIV VLP adalah ketara. khusus epitope.
3.6. Imunogenik L1:P18I10 dan L1:T20 VLP selepas Imunisasi Tikus BALB/c
Kami menilai tindak balas imun khusus HPV16- dan HIV-1-selepas imunisasi tikus BALB/c dengan L1:P18I10 dan L1:T20 VLP. Jadual imunisasi ditunjukkan dalam Rajah 6A. Oleh kerana imunogenisiti yang disebabkan oleh VLP selepas pentadbiran mukosa secara amnya lebih lemah daripada selepas pentadbiran sistemik, tikus telah diimunisasi secara intramuskular dengan satu perenam daripada dos Gardasil-9 HPV16 L1 [22,62]. Bahan pembantu aluminium hidroksi fosfat sulfat untuk dos (10 µg/100 µL) HPV chimeric: VLP HIV telah dilaraskan kepada kepekatan yang sama (1 mg/1 mL) seperti Gardasil-9. Untuk menilai perbezaan jantina dalam hasil vaksinasi, perbandingan tindak balas antibodi antara tikus jantan (n=4) dan betina (n=4) telah dinilai. Dalam kumpulan L1:P18I10 VLP, L1:T20 VLP dan Gardasil-9, tindak balas antibodi anti-HPV16 L1 tikus betina secara purata lebih tinggi daripada tikus jantan tersebut (Rajah 6B). 2 daripada 4 (50%) L1:P18I10 perempuan yang diimunisasi VLP, 3 daripada 4 (75%) perempuan yang diimunisasi L1:T20 dan semua (100%) tikus betina yang diimunisasi Gardasil menimbulkan titer antibodi anti-L1 yang lebih tinggi daripada tikus jantan. Tindak balas anti-L1 yang disebabkan oleh tikus betina dalam kumpulan Gardasil-9 adalah jauh lebih tinggi daripada tikus jantan (p=0.0041) (Rajah 6B). Tahap tindak balas antibodi anti-L1 yang sangat rendah telah dikesan dalam kumpulan penyebuan BCG.HIVA dan peningkatan L1:P18I10 VLP. Corak ini sepadan dengan penemuan sebelumnya yang menggambarkan bahawa BCG kebanyakannya mendorong tindak balas sel T daripada pengeluaran IgG [63].
Rajah 6. Induksi tindak balas imun humoral oleh L1:P18I10 dan L1:T20 VLP dalam tikus BALB/c. Jadual imunisasi digambarkan dalam (A) Semua kumpulan tikus mempunyai pengagihan jantina yang sama (lelaki n=4 dan perempuan n=4). Kumpulan A dan B: imunisasi peningkatan perdana homolog dengan 10 µg L1:P18I10 atau L1:T20 VLP secara intramuskular (im); Kumpulan C: menyebu dengan 106 cfu rBCG.HIVA secara intradermal (id) dan meningkatkan dengan 10 µg L1:P18I10 VLPs im; Kumpulan D: vaksinasi rangsangan perdana homolog dengan Gardasil-9 yang mengandungi 10 µg HPV16 L1 VLP im; Kumpulan E: imunisasi dua kali dengan penimbal PBS. Selang peningkatan perdana ialah 2 minggu. Titik akhir percubaan ini adalah pada hari ke 28. Sera dikumpul dan dicairkan pada titer 1:50 untuk ujian ELISA. (B) HPV L1-IgG khusus dalam tikus jantan dan betina. (C–E) IgG khusus epitope yang disebabkan oleh L1:P18I10 dan L1:T20 VLP. ELISA dilakukan untuk menganalisis anti-L1, anti-P18I10, dan anti-T20 IgG yang disebabkan oleh tikus BALB/c berikutan kombinasi rangsangan perdana yang berbeza seperti yang diterangkan di atas. Data ditunjukkan sebagai min ± SD Ujian ANOVA (bukan parametrik) sehala telah dilakukan untuk membandingkan perbezaan antara kumpulan. OD: ketumpatan optik. Ns tidak ketara; ** p < 0.01
Kami menilai sama ada tikus yang diimunisasi dengan L1: P18110 dan L1: T20 VLP boleh mendorong antibodi spesifik epitop HPV-16 L1-dan HIV-1 dalam tikus BALB/c. Antibodi IgG yang disebabkan oleh VLP dalam sera murine diukur oleh ELISA yang disalut dengan protein HPV16 L1 rekombinan, P18I10, atau peptida T20, masing-masing. Perbezaan statistik dalam L1-IgG khusus pada titer serum 1:50 telah dikesan dalam kumpulan Gardasil-9 berbanding dengan kumpulan kawalan PBS (p=0.0039). Tindak balas anti-L1 antara Gardasil-9, L1:P18I10 dan L1:T20 tikus yang diimunisasi VLP adalah serupa dan tidak berbeza dengan ketara (Rajah 6C). Tikus rangsangan BCG.HIVA2auxo.int prime dan L1:P18I10 VLP menimbulkan tahap IgG anti-L1 yang sangat rendah. Keputusan ini mencadangkan bahawa HPV: tikus yang diimunisasi HIV VLP menghasilkan tahap IgG anti-L1 yang sama seperti{39}}tikus yang diimunisasi Gardasil (Rajah 6C). Walaupun kumpulan VLP L1:P18I10 secara berangka nampaknya mempunyai arah aliran ke arah tahap IgG khusus epitope P18I10 yang lebih tinggi daripada kumpulan imunisasi lain, perbezaan ini tidak ketara secara statistik (Rajah 6D). Dalam sesetengah tikus yang diimunisasi L1:P18I10 VLP (4 daripada 8, 50%), antibodi pengikatan anti-P18I10 yang lebih tinggi diperhatikan berbanding tikus yang diimunisasi Gardasil-9-. Sebagai alternatif, analisis ujian-T mendedahkan bahawa perbezaan antara kumpulan L1:P18I10 VLP dan Gardasil-9 adalah ketara (p=0.005) (data tidak ditunjukkan). Dalam kumpulan L1:T20 VLP, tindak balas antibodi yang jauh lebih tinggi terhadap peptida T20 telah dikesan berbanding kumpulan Gardasil-9 (p=0.0083). Seperti yang dijangkakan, titer anti-T20 tidak dapat dikesan dalam Gardasil-9, PBS, L1:P18I10 VLP dan BCG.HIVA prime digabungkan dengan kumpulan rangsangan VLP L1:P18I10 (Rajah 6E). Titer antibodi khusus peptida T20 adalah agak rendah. Ini mungkin disebabkan oleh: (1) T20 ialah peptida subdominan; (2) elisitasi antibodi peneutral MPER atau 2F5 memerlukan konjugat peptida-lipid (Rajah 6E). Secara keseluruhan, keputusan kami menunjukkan bahawa L1:P18I10 dan L1:T20 VLP boleh mendorong HPV16- tetapi tindak balas antibodi spesifik HIV-1-yang lemah dalam tikus.
cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun
Untuk menilai tindak balas imun sel T HPV dan HIV khusus pada tikus, kami mengikuti jadual imunisasi yang ditunjukkan dalam Rajah 7A. Selain itu, penyebuan BCG.HIVA2auxo.int heterolog dan penggalak VLP L1:P18I10 dibandingkan dengan prima L1:P18I10 VLP homolog dan imunisasi untuk menilai kekerapan tindak balas imun sel T-HPV16 dan HIV{12}} khusus. Tiada perbezaan antara kumpulan Gardasil-9 dan PBS berkaitan rembesan IFN selepas rangsangan splenosit dengan HPV16 L1 VLP. Perbezaan dalam rembesan IFN khusus L1- juga tidak ketara antara kumpulan L1:P18I10 VLP dan Gardasil-9. Kami menyimpulkan bahawa rembesan L1-khusus IFN yang lemah mungkin dikaitkan dengan kepekatan rendah (2 µg/mL) HPV16 L1 VLP yang digunakan sebagai rangsangan. Kumpulan BCG.HIVA2auxo.int prime dan L1:P18I10 VLP rangsangan mendorong kekerapan splenosit yang merembes IFN yang lebih tinggi dan perbezaan ketara dalam rembesan IFN diperhatikan apabila dibandingkan dengan tikus yang divaksin dengan kumpulan Gardasil-9 (p {{36 }}.0103). 3 daripada 8 tikus (~38%) memperoleh respons IFN khusus L{41}} tertinggi (Rajah 7B). Ini mungkin dikaitkan dengan adjuvantisitas BCG yang tidak spesifik mengikut kajian terdahulu kami [64-66]. Kesan penyebuan yang jelas, walaupun oleh BCG jenis liar, adalah selaras dengan keupayaan derivatif rBCG untuk bertindak sebagai adjuvant yang kuat untuk vaksin penggalak berikutnya [64,65]. Berkenaan dengan-1-tindak balas sel T khusus HIV, jumlah magnitud tertinggi sel pembentuk tompok IFN (SFC)/106 splenosit diperhatikan dalam tikus primed BCG.HIVA2auxo.int berbanding tikus yang menerima Gardasil{{54} } vaksin atau L1:P18I10 VLP. Tikus yang diberi BCG.HIVA dan dirangsang dengan L1:P18I10 VLP menghasilkan rembesan IFN- yang jauh lebih tinggi berbanding dengan tikus yang divaksin dengan L1:P18I10 VLP homologous prime-boost (p=0.0268). Di samping itu, rembesan IFN- yang jauh lebih tinggi diperhatikan pada tikus yang divaksin dengan L1:P18I10 VLP berbanding dengan tikus yang menerima vaksin Gardasil-9 (p=0.0157) (Rajah 7C). Seperti yang dijangkakan, rembesan IFN- tidak dapat dikesan dalam kumpulan Gardasil-9 dan PBS. Keputusan ini menunjukkan bahawa (1) L1:P18I10 VLP menimbulkan tindak balas imun-1-sel T HIV tertentu; (2) L1:P18I10 VLP menimbulkan tindak balas imun sel T khusus HPV dan (3) BCG.HIVA2auxo.int boleh meningkatkan-1-tindak balas imun sel T khusus HIV yang ditimbulkan oleh L1:P18I10 VLP.
Rajah 7. Induksi tindak balas sel T spesifik HPV16 dan HIV-1 oleh chimeric L1:P8I10 VLP dan BCG.HIVA dalam tikus BALB/c. Jadual imunisasi digambarkan dalam (A). Semua kumpulan tetikus mempunyai taburan jantina yang sama (lelaki n=4 dan perempuan n=4). Kumpulan A: imunisasi rangsangan perdana homolog dengan 10 µg L1:P18I10 VLP secara intramuskular (im); Kumpulan B: menyebu dengan 106 cfu rBCG.HIVA secara intradermal (id) dan meningkatkan dengan 10 µg L1:P18I10 VLP im; Kumpulan C: vaksin homologous prime-boost dengan Gardasil-9 mengandungi 10 µg HPV16 L1 VLPs im; Kumpulan D: imunisasi dua kali dengan penimbal PBS. Selang peningkatan perdana ialah 2 minggu. Titik akhir percubaan ini adalah pada hari ke 28. Splenosit telah diasingkan untuk ujian IFN- ELISpot. Tindak balas imun sel T terhadap HPV16 dan HIV-1 dinilai ex vivo oleh IFN- ELISpot selepas rangsangan splenosit dengan peptida HPV16 L1 VLP dan P18I10. (B, C) HPV16 L1- dan HIV-1 P8I10-tindak balas sel T khusus yang ditimbulkan oleh L1:P8I10 VLP dan BCG.HIVA prima digabungkan dengan rangsangan VLP L1:P18I10. Data ditunjukkan sebagai median ± SD Ujian ANOVA sehala telah dilakukan untuk membandingkan perbezaan antara kumpulan. Ns tidak ketara; * p < 0.05.
4. Diskusyen
Kedua-dua HPV16 dan HIV-1 adalah penyakit kelamin dan kini menjadi tumpuan banyak kajian vaksin. Walaupun vaksin profilaksis HPV telah dikomersialkan dan penularan HIV-1 telah dikawal dengan baik oleh rawatan anti-retroviral (ART) dan PrEP, HPV chimeric yang berkesan, selamat dan berpatutan: Vaksin HIV terhadap kedua-dua virus adalah keperluan segera. Dalam kajian ini, (1) kami menunjukkan bahawa sistem ekspresi 293F dan kaedah penulenan kromatografi boleh menjadi pendekatan yang boleh dilaksanakan untuk menghasilkan dan memurnikan chimeric L1:P18I10 dan L1:T20 VLP; (2) kami mengesahkan bahawa pemasukan peptida P18I10 atau T20 ke dalam gelung DE protein kapsid HPV16 L1 tidak menjejaskan kestabilan in vitro, pemasangan sendiri dan morfologi HPV chimeric: HIV VLP; (3) Peptida P18I10 atau T20 berjujukan dan konformasi yang terdedah kepada gelung DE HPV chimeric: VLP HIV boleh dikesan oleh antibodi peneutral anti-HIV-1 gp120 V3 dan 2F5 secara in vitro; (4) VLP chimeric L1:P18I10 dan L1:T20 boleh menimbulkan antibodi pengikat khusus HPV tetapi HIV{34}}yang lemah dalam BALB/c tikus. Tambahan pula, pemasukan peptida HIV-1 P18I10 atau T20 ke dalam protein HPV16 L1 tidak menjejaskan induksi antibodi spesifik HPV16 L1-dalam vivo; (5) L1:P18I10 VLP boleh mendorong kedua-dua HPV16 dan HIV{48}}tindak balas sel T tertentu; (6) BCG.HIVA prime dan L1:P18I10 VLP boost menimbulkan magnitud tertinggi IFN- menghasilkan splenocytes berbanding L1:P18I10 VLPs homologous prime-boost dalam BALB/c tikus. Penemuan ini menyokong pembangunan lanjut vaksin HIV-1 berdasarkan rBCG dan HPV chimeric: HIV VLP. Secara keseluruhannya, kajian ini menyediakan strategi asas yang mungkin layak untuk menyokong usaha global untuk membangunkan vaksin berasaskan VLP chimeric novel untuk mengawal jangkitan HPV dan HIV.
Dalam kajian ini, L1:P18I10 dan L1:T20 VLP boleh mendorong tahap antibodi pengikat anti-HPV16 L1 yang sama seperti vaksin HPV Gardasil-9. Walau bagaimanapun, L1:P18I10 dan L1:T20 VLP hanya menimbulkan tahap rendah tindak balas antibodi pengikat HIV khusus epitope P18I10 dan T20. Kami membuat hipotesis bahawa mungkin disebabkan oleh plat ujian ELISA yang disalut dengan protein HPV16 L1 rekombinan, peptida HIV-1 P18I10 dan peptida HIV-1 T20, masing-masing. Antibodi anti-L1 murine yang disebabkan oleh VLP L1:P18I10 dan L1:T20 kami mungkin menyasarkan berbilang epitop pengikat protein L1. Sebaliknya, antibodi anti-HIV{35}} murine yang ditimbulkan oleh VLP L1:P18I10 dan L1:T20 kami hanya menyasarkan satu peptida HIV (P18I10 atau T20) pada HPV: HIV VLP. Oleh itu, keseluruhan nilai maksimum OD450 antibodi pengikat anti-HIV-1 adalah jauh lebih rendah daripada antibodi anti-HPV16 L1.
Sebab kami memilih gelung DE protein kapsid HPV16 L1 sebagai kawasan sisipan awal imunogen HIV-1 merujuk kepada kajian terdahulu yang mengimunkan tikus dengan papillomavirus lembu (BPV): HIV VLP untuk mendorong tindak balas antibodi [20]. Adalah diketahui bahawa epitop yang terletak di dalam gelung DE dan FG yang terdedah permukaan bagi protein kapsid utama HPV L1 secara dominan menyumbang kepada antibodi peneutralan silang yang disebabkan oleh vaksin [67]. Tambahan pula, kajian terdahulu telah ditunjukkan bahawa pemasukan HIV-1 MPER ke dalam gelung BPV L1 DE boleh mendorong sebahagian antibodi peneutralan yang secara khusus mengenali konformasi asli MPER dalam HIV-1 Env [20]. Walau bagaimanapun, tiada data menunjukkan sama ada BPV L1:MPER VLP rekombinan menjejaskan imunogenik dan peneutralan terhadap BPV selepas memasukkan HIV{14}} MPER ke dalam protein BPV L1. Dalam kajian kami menggunakan HPV16 L1 VLPs sebagai vektor penghantaran antigen HIV, kami telah mendapati bahawa kemasukan peptida HIV{18}} tidak mengubah struktur HPV L1 dan bahawa HPV chimeric: protein HIV masih mempunyai kapasiti untuk membentuk VLP. Selain itu, kami menjalankan konsep imunobridging untuk menunjukkan tindak balas imun yang setanding antara HPV: calon HIV VLP (kami) dan vaksin HPV berasaskan VLP yang diluluskan (Gardasil berlesen-9). Data kami mendedahkan bahawa pemasukan peptida HIV-1 P18I10 atau T20 ke dalam HPV chimeric: HIV VLPs boleh menimbulkan titer yang serupa bagi antibodi pengikat HPV16 L1-khusus, berbanding HPV Gardasil-9 vaksin. Antibodi pengikat anti-HPV16 L1 khusus jenis yang diperhatikan dengan vaksin HPV Gardasil{33}} VLP berlesen berbanding dengan versi chimeric vaksin HPV Gardasil-9 VLP adalah selaras dengan data kami.
Panjang dan tapak antigen asing HIV{0}} optimum yang digabungkan ke dalam VLP HPV16 L1 dan kestabilan in vitro HPV chimeric yang terhasil: VLP HIV harus disahkan sebelum imunisasi tikus. Kajian semasa kami telah menunjukkan bahawa penyisipan peptida P18I10 atau T20 ke dalam protein HPV16 L1 tidak menjejaskan kestabilan in vitro, pemasangan sendiri, dan morfologi HPV chimeric: HIV VLPs. Keputusan ini adalah selaras dengan kajian terdahulu yang menunjukkan bahawa penyisipan domain HIV-1 MPER ke dalam jujukan gelung BPV L1 DE tidak mempengaruhi kapasiti BPV L1 kapsid protein terhimpun sendiri kepada VLP [20]. Pada asasnya, epitop yang terletak dalam gelung DE dan FG terdedah permukaan bagi protein kapsid HPV L1 secara dominan menyumbang kepada mendorong antibodi peneutralan silang L tertentu [67]. Di sini, kami menunjukkan bahawa pemasukan peptida HIV-1 P18I10 atau T20 ke dalam gelung HPV16 L1 DE tidak menjejaskan induksi antibodi spesifik L1-oleh HPV chimeric: HIV VLP selepas imunisasi tikus. Selain itu, epitop HIV-1 P18I10 atau T20 pada gelung HPV16 DE HPV chimeric: VLP HIV telah dikesan secara in vitro dan bersifat imunogenik dalam vivo. HPV16 L1 VLP membentuk perancah yang berpotensi untuk paparan permukaan epitope HIV{33}} yang menarik. Dalam kajian ini, kami telah melakukan ELISA tidak langsung untuk menunjukkan peptida P18I10 dan T20 konformasi yang dibentangkan pada permukaan HPV chimeric kami: HIV VLPs. Pada masa hadapan, mikroskopi elektron imun juga boleh menjadi pendekatan tambahan untuk menunjukkan penyetempatan dan organisasi struktur antigen P18I10 atau T20 dalam HPV: HIV VLP.
Pemasangan sendiri ialah indeks yang mewakili kestabilan in vitro VLP HPV16 L1. Telah diketahui bahawa pH, kekuatan ion, suhu [52], dan persekitaran redoks semuanya berkorelasi dengan ikatan disulfida protein kapsid HPV16 L1 [53]. Kerja-kerja terdahulu pada VLP papillomavirus mencadangkan kepentingan ikatan disulfida kepada pemasangan diri kapsid utama L1 [68,69]. Pembentukan disulfida menunjukkan sistein yang lebih tinggi daripada protein kapsid L1 dalam geometri yang sesuai [53]. Pautan silang disulfida ini menyambungkan sisa 175 dan 428 (untuk HPV16) yang menstabilkan virion HPV dan VLP [70]. Dalam kajian ini, kami menganalisis corak silang silang disulfida antara molekul sebagai bukti tidak langsung untuk membuktikan protein kapsid L1:P18I10 dan L1:T20 kami cenderung untuk dipasang sendiri secara in vitro. Dalam Rajah 3A, kami menunjukkan bahawa VLP L1:P18I10 dan L1:T20 yang telah disucikan membentangkan corak silang silang disulfida antara molekul yang sama seperti HPV16 L1 VLP di bawah pH, kekuatan ionik dan keadaan terma yang sama. Dalam Rajah 3B, kami selanjutnya menunjukkan bahawa protein L1:P18I10 dan L1:T20 yang telah disucikan mampu untuk memasang sendiri kepada zarah yang lebih besar (lebih besar daripada L1 pentamer MW 280 kDa) secara in vitro. Oleh itu, bersama-sama dengan corak VLP pemasangan diri morfologi (walaupun struktur icosahedral tidak begitu baik) diperhatikan dalam Rajah 4, kami membuat kesimpulan HPV chimeric kami yang telah dimurnikan: VLP HIV stabil secara in vitro. Selain kestabilan VLP, banyak faktor kritikal lain yang boleh menjejaskan imunogenisiti HPV chimeric: VLP HIV harus dipertimbangkan, seperti tapak sisipan imunogen di antara gelung VLP yang berbeza [71], dos, selang peningkatan perdana, dan laluan pentadbiran [22] , dan lain-lain.
Peptida P18I10 yang diperoleh daripada gelung HIV-1 gp120 V3 dibentangkan dalam sel yang dijangkiti HIV oleh molekul kelas I kompleks histokompatibiliti utama (MHC-I) [26]. CD8+, limfosit T sitotoksik (CTL), boleh mengecam antigen P18I10 yang disekat MHC-I dan merembeskan pelbagai sitokin, seperti IFN- untuk menghapuskan sel yang dijangkiti HIV [72–75]. DNA virus atau plasmid rekombinan ialah kenderaan vaksin yang baik untuk mengekspresikan peptida P18I10 dalam sel perumah dan mendorong tindak balas selular khusus P18I10-melalui laluan MHC-I [76–79]. Sebagai contoh, rejimen gabungan rangsangan DNA prima dan virus vaccinia diubahsuai Ankara (MVA) adalah mencukupi untuk induksi tindak balas IFN- dan CTL terhadap epitope P18I10 [79]. Sebaliknya, peptida P18I10 eksogen tidak dibentangkan dengan cekap kepada CD{30}} sel T oleh laluan MHC-I [80,81] dan memerlukan penyertaan adjuvant yang sesuai [82-85] atau pembawa antigen, seperti VLP. Sebagai contoh, imunogenisiti peptida P18I10 sintetik yang ditambah dengan adjuvant adalah kecil kerana ketiadaan penentu T-helper [82-85]. Telah dilaporkan sebelum ini bahawa HIV-1 Gag VLP [86], hepatitis B surface antigen (HBsAg) VLPs [87], parvovirus VP2 VLPs [88] dan papillomavirus L1 VLPs [17–19] boleh bertindak sebagai vektor penghantaran untuk persembahan epitope CTL terhad MHC-I dalam vivo. Walaupun mekanisme tindak balas sel T terhad MHC-I yang disebabkan oleh VLP masih tidak jelas, struktur zarah VLP mungkin memberi manfaat kepada pengambilan endositik makrofaj atau sel dendritik, dengan itu mengakses sitosol dan seterusnya memasuki laluan MHC-I biasa [89, 90]. Di samping itu, penentu P18I10 yang dihadkan MHC-I diperhatikan untuk mendorong tindak balas sel T penolong CD melalui laluan MHC-II [91,92]. VLP BPV1 L1 Hibrid boleh digunakan sebagai pembawa epitope antigen untuk mendapatkan tindak balas CTL khusus virus terapeutik melalui laluan MHC-I dan MHC-II [17,19], menyediakan strategi yang menjanjikan untuk reka bentuk vaksin untuk mengawal jangkitan virus. Beberapa kajian awal juga menunjukkan BPV L1 VLP menyatakan epitope HPV16 E7 atau P18I10 epitope HIV-1 permukaan mukosa yang disebabkan gelung V3 dan juga imuniti humoral dan sel T khusus epitop VLP sistemik [18]. Selaras dengan kajian terdahulu, kami telah menunjukkan secara awal bahawa HPV chimeric kami: HIV (L1: P18I10) VLP boleh mendorong tindak balas imun sel T khusus HIV dalam tikus BALB / c selepas rangsangan splenocyte dengan peptida P18I10. Selain itu, penyebuan BCG.HIVA meningkatkan{93}}tindak balas imun sel T khusus HIV pada tikus. Walau bagaimanapun, tindak balas imun sel T pelbagai fungsi yang disebabkan oleh L1: P18I10 VLP memerlukan kajian imunologi lanjut.
Respons sel T CD8+ yang lebih luas terhadap berbilang epitop CTL yang dipelihara bermanfaat untuk mengatasi-1 kepelbagaian genetik HIV dan melarikan diri [7,93–100]. Reka bentuk rasional imunogen sel T HIV-1, seperti HIVA, seharusnya mempunyai potensi untuk bertindak balas kepada berbilang epitop CTL [34]. Imunogen HIV-1 HIVA, yang direka oleh Dr. Tomas Hanke, terdiri daripada protein Gag HIV{11}} penuh yang digabungkan dengan berbilang epitop CTL termasuk epitop P18I10 di terminal-C [34]. DNA, MVA, dan rBCG telah dipilih sebagai kenderaan penghantaran imunogen HIVA dan mendorong magnitud tinggi dan keluasan tindak balas selular khusus epitope CTL dengan menggunakan rejim penggalak perdana heterolog dalam model tetikus dan primat bukan manusia (NHP) [34,101]. Kajian terdahulu kami telah menunjukkan bahawa BCG.HIVA prima dalam kombinasi dengan MVA.HIVA meningkatkan HIV-1-sel T penghasil CD8+ IFN khusus dalam tikus BALB/c [31–33,102]. Menariknya, VLP boleh menjadi penggalak yang berpotensi untuk meningkatkan tindak balas selular khusus HIV dalam imunisasi heterolog dengan rBCG [29,30] atau vaksin DNA [103,104]. Contohnya, rBCG yang mengekspresikan HIV-1 Protein Gag boleh meningkatkan sistem imun sel T dengan berkesan untuk rangsangan dengan Gag VLP dalam model NHP [29,30]. Dalam kajian semasa, kami telah menunjukkan bahawa penyebuan BCG.HIVA boleh meningkatkan tindak balas imun sel T yang disebabkan oleh HPV: HIV (L1:P18I10) VLP. Kami akan menyiasat lebih lanjut magnitud CD polifungsi 4+, CD8+ dan tindak balas sel T memori yang dijana oleh rBCG prima dan rejim rangsangan VLP ini.
cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun
Pada masa ini, kumpulan penyelidikan kami menumpukan pada pembangunan rBCG yang menjanjikan: vaksin HIV yang mengekspresikan imunogen sel T HIV-1 baru, seperti imunogen sel T tHIVconsvX dan HIVACAT (HTI), untuk meningkatkan HIV-1 padanan varian dan keluasan tindak balas sel T. Imunogen HIVconsvX generasi ke-2 telah direka bentuk dengan mentakrifkan semula kawasan terpelihara kumpulan M dan menggunakan reka bentuk mozek bivalen untuk memaksimumkan padanan 9-epitop sel T yang berpotensi dalam vaksin kepada varian global [64]. Imunogen HTI direka bentuk untuk menutup sasaran sel T yang mana tindak balas sel T kebanyakannya diperhatikan dalam-1-individu yang dijangkiti HIV dengan viral load-1 HIV yang rendah [65,66]. Oleh kerana VLP papilloma telah terbukti sebagai pembawa epitope CTL berbilang [17], kami menyasarkan untuk membina VLP HPV16 L1 chimeric yang membawa berbilang epitop HIV{19}} CTL terpelihara dalam kombinasi dengan rBCG mengekspresikan ThivconsvX atau imunogen sel T HTI untuk mendorong yang lebih luas. Tindak balas imun CTL terhadap HIV-1. Ketumpatan tinggi dan berbilang salinan epitope CTL HIV{22}} yang dibentangkan pada HPV chimeric: HIV VLP mungkin meningkatkan penghantaran antigen kepada sistem imun dan mendorong kekerapan tindak balas CTL yang lebih tinggi. Sebaliknya, BCG rekombinan lebih berkemungkinan menghasilkan kekerapan tindak balas CTL yang lebih rendah disebabkan replikasi yang perlahan dalam vivo. Oleh kerana BCG mempunyai pengaruh yang berbeza pada pembezaan sel T, yang bermaksud bahawa BCG boleh mendorong memori CD{23}} sel T melalui penyertaan CD4+ sel T-helper [105], sifat imunogenik ini mungkin menjadikan BCG sesuai sebagai agen penyebuan dalam rejimen peningkatan perdana heterolog. Oleh itu, kami menjangkakan bahawa HPV kami: VLP HIV mungkin kelihatan sebagai penggalak yang menjanjikan untuk meningkatkan magnitud dan keluasan tindak balas CTL HIV{28}} apabila menggunakan BCG rekombinan yang mengekspresikan HIV baru-1 imunogen sel T .
Peptida T20 mengandungi epitope linear 2F5 (ELDKWA) yang sangat terpelihara. Antibodi 2F5 yang dikumpul daripada pesakit yang dijangkiti HIV jangka panjang dilaporkan mempunyai keberkesanan meneutralkan secara meluas [106,107]. MPER gp41 dianggap kurang imunogenik, mungkin berkaitan dengan lokasinya berhampiran dengan dwilapisan fosfolipid selular dan virus [108]. Menggunakan vektor DNA yang mempersembahkan MPER dalam persekitaran lipid adalah berfaedah untuk mendorong gp41-nAbs khusus [109–111]. Sebagai contoh, vaksin DNA pengekodan-1 T{15}}HIV, yang direka oleh Dr. Britta Wahren, telah ditunjukkan untuk mendorong tindak balas antibodi peneutralan silang klad (nAb) [109]. Sebaliknya, banyak percubaan awal untuk mendorong nAbs menyasarkan gp41 dengan menggunakan strategi vaksin peptida atau subunit telah gagal [112-116]. Baru-baru ini, beberapa kajian menunjukkan BPV L1 VLP yang mengekspresikan epitope 2F5 atau MPER HIV-1 gp41 induksi 2F5-antibodi khusus dalam tikus mengakibatkan peneutralan silang klad [20,21]. Corak imunogenisiti yang serupa ditemui apabila antigen permukaan hepatitis B (HBsAg) digabungkan dengan HIV{31}}epitop F5 atau MPER [59,117–119]. Di sini, kami menunjukkan bahawa pembentangan peptida HIV-1 T20 dan P18I10 dalam HPV16 L1 VLP chimeric kami boleh mendorong tindak balas antibodi terhadap HIV-1 dan HPV16. Epitop peneutralan yang distabilkan pada perancah konformasi, seperti pancang fungsi HIV{44}} atau VLP, boleh menjadi aliran utama reka bentuk imunogen sel B untuk mencapai antibodi peneutralan luas (bnAbs) [93]. Walau bagaimanapun, kebanyakan epitop bnAb novel (kira-kira 90%) adalah kawasan tidak berterusan dan terbina disatukan dalam 3-konfigurasi dimensi [120]. Walaupun pembentangan epitop terputus pada perancah protein boleh diramalkan dengan pemodelan pengiraan [121], epitop bnAb ini mungkin dicabar untuk dibenamkan dalam perancah protein HPV16 L1 yang tidak bersampul. Sebaliknya, minoriti imunogen sel B HIV-1, seperti MPER (2F5) HIV-1 gp41 atau gelung V3 (P18IIB) gp120, mengandungi epitop peneutralan linear dan mungkin sesuai untuk HPV: Tulang belakang protein HIV. Oleh itu, kami memilih epitope peneutralan linear 2F5 yang disertakan dalam peptida T20 HIV lanjutan-1 MPER dari segi struktur yang menggalakkan untuk pembentukan -helix [122]. Peptida T20 boleh disatukan dan distabilkan pada perancah kapsid L1 untuk mendapatkan tindak balas antibodi meneutralkan jika konfigurasi asli epitope 2F5 dapat dibentangkan. Dalam kajian ini, kami mendapati bahawa 2F5 nAbs terikat kepada HPV chimeric: HIV (L1: T20) VLP secara in vitro. Selain itu, VLP L1:T20 juga boleh mendorong antibodi pengikat khusus T{80}} dalam tikus BALB/c. Terdapat bukti yang semakin meningkat bahawa antibodi yang disebabkan oleh peptida perencatan gabungan HIV (T20) mempunyai sifat yang sama seperti peptida gabungan anti-HIV Enfuvirtide untuk mengikat sisa T20 trans-membran hidrofobik yang terletak dalam MPER gp41 semasa Gabungan-1 HIV dan menyumbang kepada kawalan virus [109,123,124]. Menurut ulasan kami sebelum ini, reka bentuk rasional vaksin berasaskan VLP chimeric untuk mendorong antibodi peneutralan HPV dan HIV khusus dan tindak balas CTL sentiasa perlu dipertimbangkan dari segi pemilihan imunogen, vektor penghantaran antigen dan rejim rangsangan utama. Kesimpulannya, kajian ini telah menunjukkan platform ekspresi berasaskan sel mamalia alternatif dan kaedah penulenan kromatografi berskala untuk jurutera HPV chimeric: HIV VLP. Kami menganggap bahawa kaedah penulenan baharu kami akan membantu memulihkan HPV antigenik: HIV VLP daripada sel mamalia dengan matlamat mengurangkan masa, kos dan tenaga kerja sambil meningkatkan kapasiti pengeluaran perindustrian., Selain itu, kami menunjukkan HPV16 L1 VLP boleh berfungsi sebagai platform penghantaran untuk membawa antigen peptida HIV-1 kerana pemasukan peptida P18I10 atau T20 ke dalam gelung DE protein kapsid HPV16 L1 tidak menjejaskan kestabilan in vitro, pemasangan sendiri dan morfologi HPV chimeric: HIV VLP dan tidak tidak mengganggu induksi antibodi khusus HPV16 L{107}}dalam vivo. Sebaliknya, HPV chimeric: HIV VLP boleh menimbulkan tindak balas imun HPV16 dan sel B dan T khusus HIV terhadap kedua-dua virus. Laporan ini meneroka kemungkinan membangunkan vaksin HIV berdasarkan BCG rekombinan yang mengekspresikan imunogen HIV dan HPV: HIV VLP, yang boleh digunakan untuk imunisasi HIV kanak-kanak. Memandangkan pembangunan vaksin chimeric yang berkesan terhadap HPV16 dan HIV{115}} masih menjadi cabaran, kerja ini menyumbang satu langkah ke arah pembangunan HPV chimeric novel: platform vaksin berasaskan HIV VLP untuk mengawal HPV16 dan HIV{118 }} jangkitan, yang sangat diperlukan di negara membangun dan perindustrian.
Rujukan
1. Statistik HIV & AIDS Global UNAIDS-2018 Lembaran Fakta. 2019. Tersedia dalam talian: http://www.unaids.org/en/resources/fact sheet (diakses pada 15 Jun 2020).
2. Baeten, JM PrEP untuk HIV: Gred A untuk bukti tetapi menunggu untuk kesan. Nat. Rev. Urol. 2019, 16, 570–571. [CrossRef]
3. Rerks-Ngarm, S.; Pitsuttithum, P.; Nitayaphan, S.; Kaewkungwal, J.; Chiu, J.; Paris, R.; Premsri, N.; Namwat, C.; De Souza, M.; Adams, E.; et al. Pemvaksinan dengan ALVAC dan AIDSVAX untuk mencegah jangkitan HIV-1 di Thailand. N. Inggeris. J. Med. 2009, 361, 2209–2220. [CrossRef]
4. Ng'uni, T.; Chasara, C.; Ndhlovu, ZM Halangan saintifik utama dalam pembangunan vaksin HIV: Perspektif sejarah dan hala tuju masa depan. Depan. Immunol. 2020, 11, 590780. [CrossRef]
5. Robinson, HL vaksin HIV/AIDS: 2018. Clin. Pharmacol. Di sana. 2018, 104, 1062–1073. [CrossRef]
6. Wang, Q.; Zhang, L. Meneutralkan secara meluas antibodi dan reka bentuk vaksin terhadap jangkitan HIV-1. Depan. Med. 2020, 14, 30–42. [CrossRef]
7. Collins, DR; Gaiha, GD; Walker, BD CD8+ sel T dalam kawalan, penawar dan pencegahan HIV. Nat. Rev. Immunol. 2020, 20, 471–482. [CrossRef] [PubMed]
8. Pollard, AJ; Bijker, EM Panduan kepada vaksinologi: Dari prinsip asas kepada perkembangan baharu. Nat. Rev. Immunol. 2021, 21, 83–100. [CrossRef]
9. Shapiro, SZ Pelajaran untuk penyelidikan vaksinologi am daripada percubaan untuk membangunkan vaksin HIV. Vaksin 2019, 37, 3400–3408. [CrossRef]
10. Ahmed, HG; Bensumaidea, SH; Alshammari, FD; Alenazi, FSH; ALmutlaq, BA; Alturkstani, MZ; Aladani, IA Kelaziman subtipe papillomavirus manusia 16 dan 18 di kalangan pesakit Yaman dengan kanser serviks. Asia Pasifik J. Kanser Sebelum. 2017, 18, 1543–1548. [CrossRef]
11. Olcese, VA; Chen, Y.; Schlegel, R.; Yuan, H. Pencirian domain gelung HPV16 L1 dalam pembentukan epitope konformasi yang khusus jenis. Mikrobiol BMC. 2004, 4, 29. [CrossRef]
12. Dupuy, C.; Buzoni-Gate, D.; Touze, A.; Le Cann, P.; Bout, D.; Coursaget, P. Kekebalan pengantaraan sel yang diinduksi pada tikus oleh zarah seperti virus HPV 16 L1. Mikrob. Pathog. 1997, 22, 219–225. [CrossRef] [PubMed]
13. Schiller, J.; Lowy, D. Penjelasan untuk potensi tinggi vaksin prophylactic HPV. Vaksin 2018, 36, 4768–4773. [CrossRef] [PubMed]
14. Markowitz, LE; Schiller, JT Human Papillomavirus Vaccines. J. Jangkitan. Dis. 2021, 224, S367–S378. [CrossRef] [PubMed]
15. Chen, CW; Saubi, N.; Joseph-Munné, J. Reka bentuk konsep vaksin HIV-1 berasaskan zarah seperti virus. Depan. Immunol. 2020, 11, 573157. [CrossRef] [PubMed]
16. Eto, Y.; Saubi, N.; Ferrer, P.; Joseph, J. Mereka bentuk vaksin berasaskan zarah seperti virus chimeric untuk papillomavirus manusia dan HIV: Pelajaran yang dipelajari. AIDS Rev. 2019, 21, 218–232. [CrossRef]
17. Liu, WJ; Liu, XS; Zhao, KN; Leggatt, GR; Frazer, zarah seperti virus IH Papillomavirus untuk penghantaran pelbagai epitop sel T sitotoksik. Virologi 2000, 273, 374–382. [CrossRef]
18. Liu, XS; Abdul-Jabbar, I.; Qi, YM; Frazer, IH; Zhou, J. Imunisasi mukosa dengan zarah seperti virus papillomavirus menimbulkan imuniti sistemik dan mukosa pada tikus. Virologi 1998, 252, 39–45. [CrossRef]
19. Peng, S.; Frazer, IH; Fernando, GJ; Zarah seperti virus Zhou, J. Papillomavirus boleh menghantar epitop CTL yang ditentukan ke laluan kelas I MHC. Virologi 1998, 240, 147–157. [CrossRef]
20. Zhai, Y.; Zhong, Z.; Zariffard, M.; Lembing, GT; Qiao, L. Zarah seperti papillomavirus lembu yang membentangkan epitop terpelihara dari kawasan luar membran-proksimal HIV-1 gp41 yang disebabkan oleh antibodi mukosa dan sistemik. Vaksin 2013, 31, 5422–5429. [CrossRef]
21. Zhang, H.; Huang, Y.; Fayad, R.; Lembing, GT; Qiao, L. Induksi antibodi peneutral mukosa dan sistemik terhadap virus immunodeficiency manusia jenis 1 (HIV-1) melalui imunisasi oral dengan papillomavirus lembu-HIV-1 gp41 zarah seperti virus chimeric. J. Virol. 2004, 78, 8342–8348. [CrossRef]
22. Xiao, SL; Wen, JL; Kong, NZ; Yue, HL; Leggatt, G.; Frazer, IH Laluan pentadbiran chimeric BPV1 VLP menentukan sifat tindak balas imun yang disebabkan. Immunol. Biol Sel. 2002, 80, 21–29. [CrossRef]
23. Kirnbauer, R.; Taub, JANET; Greenstone, HEATHER; Roden, RICHARD; Dürst, M.; Gissmann, L.; Lowy, DR; Schiller, JT Perhimpunan Sendiri yang Cekap bagi Human Papillomavirus Jenis 16 LI dan L{3}}L2 ke dalam Zarah Seperti Virus. J. Virol. 1993, 67, 6929–6936. [CrossRef] [PubMed]
24. Zhao, Q.; Potter, CS; Carragher, B.; Lander, G.; Sworen, J.; Towne, V.; Abraham, D.; Duncan, P.; Washabaugh, MW; Sitrin, RD Pencirian zarah seperti virus dalam GARDASIL® oleh mikroskop elektron penghantaran cryo. Hum. Vaksin Immunother. 2014, 10, 734–739. [CrossRef] [PubMed]
25. Achour, A.; Lemhammedi, S.; Picard, O.; M'bika, JP; Zagury, JF; Moukrim, Z.; Willer, A.; Beix, F.; Burny, A.; Zagury, D. Limfosit T Sitotoksik Khusus untuk HIV-1 Antigen gp160 dan Peptida P18IIIB Sintetik dalam HLA-A11-Individu yang Diimunisasi. AIDS Re. Hum. Retrovirus 1994, 10, 19–25. [CrossRef]
26. Nakagawa, Y.; Kikuchi, H.; Takahashi, H. Analisis molekul TCR dan interaksi peptida/MHC menggunakan peptida terhasil P18-I10-dengan penggantian asid D-amino tunggal. Biophys. J. 2007, 92, 2570–2582. [CrossRef]
27. Qiu, Z.; Chong, H.; Yao, X.; Su, Y.; Cui, S.; He, Y. Pengenalpastian dan pencirian subpoket pada N-trimer HIV-1 Gp41: Implikasi untuk kemasukan virus dan sasaran dadah. Aids 2015, 29, 1015–1024. [CrossRef]
28. Peters, BS; Cheingsong-Popov, R.; Callow, D.; Foxall, R.; Patou, G.; Hodgkin, K.; Weber, JN Kajian perintis fasa II tentang keselamatan dan imunogenisiti HIV p17/p24:VLP (p24-VLP) dalam subjek seropositif HIV tanpa gejala. J. Jangkitan. 1997, 35, 231–235. [CrossRef]
29. Chege, GK; Burger, WA; Stutz, H.; Meyers, AE; Chapman, R.; Kiravu, A.; Bunjun, R.; Shephard, EG; Jacobs, WR; Rybicki, EP; et al. Kekebalan Teguh kepada Auxotrophic Mycobacterium bovis BCG-VLP Prime-Boost HIV Calon Vaksin HIV dalam Model Primat Bukan Manusia. J. Virol. 2013, 87, 5151–5160. [CrossRef]
30. Chege, GK; Thomas, R.; Shephard, EG; Meyers, A.; Bourn, W.; Williamson, C.; Maclean, J.; Kelabu, CM; Rybicki, EP; Williamson, AL Rejimen imunisasi rangsangan utama menggunakan vaksin BCG rekombinan dan Pr55gag virus zarah berdasarkan subjenis HIV jenis 1 C berjaya menimbulkan tindak balas khusus Gag dalam babun. Vaksin 2009, 27, 4857–4866. [CrossRef]
31. Joseph, J.; Saubi, N.; Saya, EJ; Fernández-Lloris, R.; Gil, O.; Cardona, PJ; Gatell, JM; Hanke, T. Pemvaksinan tikus yang baru lahir dengan BCG.HIVA222 + MVA.HIVA meningkatkan HIV-1-tindak balas imun khusus: Pengaruh umur dan laluan imunisasi. Clin. Dev. Immunol. 2011, 2011, 516219. [CrossRef]
32. Saubi, N.; Gea-Mallorquí, E.; Ferrer, P.; Hurtado, C.; Sánchez-Úbeda, S.; Eto, Y.; Gatell, JM; Hanke, T.; Joseph, J. Kejuruteraan reka bentuk vaksin mikobakteria baharu untuk vaksin pediatrik HIV-TB yang divektorkan oleh lysine auxotroph BCG. Mol. Di sana. Kaedah Clin. Dev. 2014, 1, 14017. [CrossRef]
33. Mahant, A.; Saubi, N.; Eto, Y.; Guitart, N.; Gatell, JM; Hanke, T.; Joseph, J. Pembangunan praklinikal BCG.HIVA2auxo.int, yang mengandungi vektor ekspresi integratif, untuk vaksin Pediatrik HIV-TB. Peningkatan kestabilan dan imuniti sel T HIV-1 khusus. Hum. Vaksin Immunother. 2017, 13, 1798–1810. [CrossRef] [PubMed]
34. Hanke, T.; McMichael, AJ Reka bentuk dan pembinaan vaksin HIV percubaan-1 selama setahun-2000 percubaan klinikal di Kenya. Nat. Med. 2000, 6, 951–955. [CrossRef] [PubMed]
35. Durocher, Y.; Perret, S.; Kamen, A. Pengeluaran protein rekombinan tahap tinggi dan daya pemprosesan tinggi melalui pemindahan sementara sel 293-EBNA1 manusia yang sedang berkembang penggantungan. Asid Nukleik Res. 2002, 30, E9. [CrossRef] [PubMed]
36. Kim, HJ; Kim, SY; Lim, SJ; Kim, JY; Lee, SJ; Kim, HJ Pembersihan kromatografi satu langkah bagi protein papillomavirus manusia jenis 16 L1 daripada Saccharomyces cerevisiae. Protein Expr. Purif. 2010, 70, 68–74. [CrossRef] [PubMed]
37. Eto, Y.; Saubi, N.; Ferrer, P.; Joseph-Munné, J. Ekspresi protein HPV-HIV chimeric L1P18 dalam pichia pastoris; penulenan dan pencirian zarah seperti virus. Farmaseutik 2021, 13, 1967. [CrossRef]
38. PRU. Penggunaan CaptoTM Core 700 dan Capto Q ImpRes dalam penulenan zarah seperti virus papilloma manusia. J. Asia's Pharm. Biopharm. Ind. 2014, 1–4.
39. McLean, CS; Churcher, MJ; Meinke, J.; Smith, GL; Higgins, G.; Stanley, M.; Minson, AC Pengeluaran dan pencirian antibodi monoklonal kepada papillomavirus manusia jenis 16 menggunakan virus vaccinia rekombinan. J. Clin. Pathol. 1990, 43, 488–492. [CrossRef]
40. Monograf Produk Merck Canada Inc. Gardasil®. Prod. Monogr. Monopril Prod. Monogr. 2015, 1–71.
41. Achour, A.; Persson, K.; Harris, RA; Sundbäck, J.; Sentman, CL; Lindqvist, Y.; Schneides, G.; Kärre, K. Struktur kristal H-2D(d) MHC kelas I dikomplekskan dengan HIV-1- peptida P18-110 pada resolusi 2.4 Å: Implikasi untuk sel T dan sel NK pengiktirafan. Kekebalan 1998, 9, 199–208. [CrossRef]
42. Pang, W.; Tom, SC; Zheng, YT Perencat gabungan jenis HIV{1}} peptida semasa. Antivir. Kimia. Chemother. 2009, 20. [CrossRef]
43. Chen, XS; Garcia, RL; Goldberg, I.; Casini, G.; Harrison, SC Struktur Zarah Kecil seperti Virus yang Dihimpun daripada Protein L1 Human Papillomavirus 16. Mol. Sel 2000, 5, 557–567. [CrossRef] [PubMed]
44. Hari, PM; Weisberg, AS; Thompson, CD; Hughes, MM; Pang, YY; Lowy, DR; Schiller, JT Human Papillomavirus 16 Capsids Mengantara Kemasukan Nuklear semasa Jangkitan. J. Virol. 2019, 93, e00454-19. [CrossRef]
45. Zhou, J.; Bar pintu, J.; Matahari, XY; Crawford, LV; McLean, CS; Frazer, IH Pengenalpastian isyarat penyetempatan nuklear protein papillomavirus manusia jenis 16 L1. Virologi 1991, 185, 625–632. [CrossRef] [PubMed]
46. Vlps, A.; Middelberg, APJ; Lua, LHL Pemprosesan zarah seperti Virus: Cabaran dan peluang. Pharm. Bioproses. 2013, 1, 407–409.
47. Bousarghin, L.; Touzé, A.; Combita-Rojas, AL; Coursaget, P. Urutan bercas positif bagi protein kapsid jenis papillomavirus manusia 16 mencukupi untuk mengantara pemindahan gen ke dalam sel sasaran melalui reseptor heparan sulfat. J. Jeneral Virol. 2003, 84, 157–164. [CrossRef]
48. Sasagawa, T.; Pushko, P.; Steers, G.; Gschmeissner, SE; Nasser Hajibagheri, MA; Finch, J.; Crawford, L.; Tommasino, M. Sintesis dan pemasangan zarah seperti virus bagi virus papilloma manusia jenis 6 dan Jenis 16 dalam yis pembelahan Schizosaccharomyces pombe. Virologi 1995, 206, 126–135. [CrossRef]
49. Biemelt, S.; Sonnewald, U.; Galmbacher, P.; Willmitzer, L.; Müller, M. Pengeluaran Zarah Seperti Virus Jenis 16 Human Papillomavirus dalam Tumbuhan Transgenik. J. Virol. 2003, 77, 9211–9220. [CrossRef]
50. Zahin, M.; Joh, J.; Khanal, S.; Sekam, A.; Mason, H.; Warzecha, H.; Ghim, SJ; Miller, DM; Matoba, N.; Jenson, AB Pengeluaran protein HPV16 L1 dan VLP yang boleh berskala daripada daun tembakau. PLoS ONE 2016, 11, e0160995. [CrossRef]
51. Aires, KA; Cianciarullo, AM; Carneiro, SM; Vila, LL; Boccardo, E.; Pérez-Martinez, C.; Perez-Arellano, I.; Oliveira, MLS; Ho, PL Pengeluaran zarah seperti virus papillomavirus manusia jenis 16 L1 oleh sel Lactobacillus casei rekombinan. Appl. alam sekitar. mikrobiol. 2006, 72, 745–752. [CrossRef]
52. Shank-Retzlaff, ML; Zhao, Q.; Anderson, C.; Hamm, M.; Tinggi, K.; Nguyen, M.; Wang, F.; Wang, N.; Wang, B.; Wang, Y.; et al. Penilaian kestabilan terma Gardasil®. Hum. Vaksin. 2006, 2, 147–154. [CrossRef] [PubMed]
53. Mukherjee, S.; Thorsteinsson, MV; Johnston, LB; DePhillips, PA; Zlotnick, A. Penerangan Kuantitatif Perhimpunan In Vitro bagi Zarah Seperti Virus Human Papillomavirus 16. J. Mol. biol. 2008, 381, 229–237. [CrossRef] [PubMed]
54. McCarthy, MP; Putih, WI; Palmer-Hill, F.; Koenig, S.; Suzich, JA Pembongkaran Kuantitatif dan Pengumpulan Semula Zarah Seperti Virus Jenis 11 Human Papillomavirus Secara In Vitro. J. Virol. 1998, 72, 32–41. [CrossRef] [PubMed]
55. Kirnbauer, R.; Booy, F.; Cheng, N.; Lowy, DR; Schiller, JT Papillomavirus L1 protein kapsid utama terhimpun sendiri menjadi zarah seperti virus yang sangat imunogenik. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 88, 12180–12184. [CrossRef]
56. Patel, MC; Patkar, KK; Basu, A.; Mohandas, KM; Mukhopadhyaya, R. Penghasilan zarah-zarah seperti virus papillomavirus manusia immunogenik-16 protein kapsid utama. India J. Med. Res. 2009, 130, 213–218.
57. Shi, L.; Sanyal, G.; Ni, A.; Luo, Z.; Doshna, S.; Wang, B.; Graham, TL; Wang, N.; Volkin, DB Penstabilan zarah seperti virus papillomavirus manusia oleh surfaktan bukan ionik. J. Pharm. Sci. 2005, 94, 1538–1551. [CrossRef]
58. Carter, JJ; Wipf, GC; Benki, SF; Christensen, ND; Galloway, DA Identification of a Human Papillomavirus Type 16-Specific Epitope on the C-Terminal Arm of Major Capsid Protein L1. J. Virol. 2003, 77, 11625–11632. [CrossRef]
59. Von Brunn, A.; Jenama, M.; Reichhuber, C.; Morys-Wortmann, C.; Deinhardt, F.; Schdelt, F. Domain peneutralan utama HIV-I adalah sangat imunogenik apabila dinyatakan pada permukaan zarah teras hepatitis B. Vaksin 1993, 11, 817–824. [CrossRef]
60. Dennison, SM; Anasti, K.; Scearce, RM; Sutherland, L.; Taman, R.; Xia, S.-M.; Liao, H.-X.; Gorny, MK; Zolla-Pazner, S.; Haynes, BF; et al. HIV yang tidak meneutralkan-1 gp41 Kluster II Antibodi Monoklonal Manusia Menunjukkan Polireaktiviti untuk Mengikat Fosfolipid dan Autoantigen Protein. J. Virol. 2011, 85, 1340–1347. [CrossRef]
61. Trkola, A.; Kuster, H.; Rusert, P.; Joos, B.; Fischer, M.; Leemann, C.; Manrique, A.; Huber, M.; Rehr, M.; Oxenius, A.; et al. Kelewatan HIV-1 melantun semula selepas pemberhentian terapi antiretroviral melalui pemindahan pasif antibodi peneutral manusia. Nat. Med. 2005, 11, 615–622. [CrossRef]
62. Shank-Retzlaff, M.; Wang, F.; Morley, T.; Anderson, C.; Hamm, M.; Brown, M.; Rowland, K.; Pancari, G.; Zorman, J.; Lowe, R.; et al. Korelasi antara potensi tetikus dan potensi relatif in vitro untuk zarah seperti virus papillomavirus manusia Jenis 16 dan sampel vaksin Gardasil. Hum. Vaksin. 2005, 1, 191–197. [CrossRef] [PubMed]
63. Kilpeläinen, A.; Maya-Hoyos, M.; Saubí, N.; Soto, CY; Joseph Munne, J. Kemajuan dan cabaran dalam pembangunan vaksin HIV berasaskan Mycobacterium bovis BCG rekombinan: Pelajaran yang dipelajari. Vaksin Rev. Pakar 2018, 17, 1005–1020. [CrossRef] [PubMed]
