Peranan Ujian Genetik dalam Proses Diagnostik Pesakit Pediatrik Dengan Penyakit Buah Pinggang: Pengalaman Sebuah Institusi Tunggal

AbstrakTujuanPenyakit buah pinggang yang diwarisi adalah antara punca utama kegagalan buah pinggang pada kanak-kanak, mengakibatkan peningkatan kematian, kos penjagaan kesihatan yang tinggi, dan keperluan untuk pemindahan organ. Teknologi penjujukan generasi akan datang boleh membantu dalam diagnosis keadaan monogenik yang jarang berlaku, membolehkan pengurusan perubatan dan pilihan terapeutik yang optimum.

Kaedah Penjujukan exome klinikal (CES) dilakukan pada kohort 191 pesakit pediatrik dari satu institusi, diikuti oleh penjujukan Sanger untuk mengesahkan varian yang dikenal pasti dan untuk kajian pengasingan keluarga. Keputusan Semua pesakit mempunyai diagnosis klinikal penyakit buah pinggang: kategori penyakit utama ialah penyakit glomerular (32.5%), ciliopathies (20.4%), CAKUT (17.8%), nefrolitiasis (11.5%) dan penyakit tiub (10.5%). 7.3% pesakit dikemukakan dengan keadaan lain. Ujian genetik konklusif, berdasarkan pengesahan CES dan Sanger, diperoleh dalam 37.1% pesakit. Kadar pengesanan tertinggi diperolehi untuk ciliopathies (74.4%), diikuti oleh nefrolitiasis (45.5%), dan penyakit tiub (45%), manakala kebanyakan penyakit glomerular dan CAKUT kekal tidak didiagnosis. Kesimpulan Keputusan menunjukkan bahawa ujian genetik yang digunakan secara konsisten dalam aliran kerja diagnostik kanak-kanak dengan penyakit buah pinggang kronik boleh (i) mengesahkan diagnosis klinikal, (ii) memberikan diagnosis awal dalam kes keadaan yang diwarisi, (iii) dan punca genetik yang tidak diketahui sebelum ini. penyakit dan (iv) program pemindahan khusus.

Kata kunci Penjujukan exome klinikal, Penjujukan generasi akan datang,Penyakit buah pinggang, Ujian genetik, kohort Pediatrik

KLIK DI SINI UNTUK MENDAPATKAN CISTANCHE UNTUKPENYAKIT PINGGANG TAHAP AKHIR

pengenalan

Nefropati pediatrik terdiri daripada entiti penyakit yang berbeza dari segi persembahan klinikal, evolusi, dan pilihan terapeutik [1-4]. Kira-kira 30% kanak-kanak dengan penyakit buah pinggang kronik (CKD) mengalami keadaan monogenik, peratusan meningkat apabila mempertimbangkan kanak-kanak dengan penyakit buah pinggang peringkat akhir (ESRD) [5, 6]. Kebanyakan kanak-kanak ini masih tidak didiagnosis pada masa pemindahan [4, 6, 7]. Mencapai diagnosis untuk pesakit ini bukan sahaja membayangkan pengakhiran pengembaraan diagnostik, tetapi memberikan beberapa kelebihan untuk prognosis, pengurusan, dan rawatan

Kajian perintis secara konsisten menunjukkan bahawa pelaksanaan teknik penjujukan generasi akan datang (NGS) telah meningkatkan hasil diagnostik dengan ketara pada pesakit dengan penyakit buah pinggang yang diwarisi (IKD) [8]. Baru-baru ini, penggunaan NGS yang meluas telah membuat diagnosis genetik yang tersedia dalam masa yang munasabah dan pada kos yang berpatutan, menimbulkan persoalan sama ada dan bila ia perlu disepadukan dalam aliran kerja diagnostik rutin [5].

Diagnosis genetik pada kanak-kanak adalah sangat penting untuk pelbagai aspek. Yang pertama ialah ia mungkin relevan dalam pendekatan klinikal kepada penyakit ini, contoh tipikalnya ialah sindrom nefrotik di mana pengenalpastian varian struktur dalam gen berkaitan podosit menentang terapi imunosupresif yang sebaliknya akan digunakan secara rutin dalam tempoh beberapa bulan [9]. Yang kedua ialah ia mungkin sangat relevan untuk keluarga kanak-kanak itu dan untuk mengenal pasti ahli lain yang membawa varian yang mungkin boleh ditularkan kepada generasi akan datang. Sebaik sahaja varian patogen dikenal pasti dalam proband, ujian lata ahli keluarga dan kaunseling genetik dalam pembawa varian mewakili amalan standard dalam genetik klinikal [5]. Yang ketiga ialah mengetahui varian patogenik adalah penting dalam konteks pemindahan di mana penderma mungkin saudara. Sesungguhnya, adalah penting untuk menolak kehadiran varian yang sama dalam penderma organ, serta penting untuk mengenal pasti semua ahli keluarga yang berpotensi memerlukan pemindahan. Keempat ialah sesetengah penyakit mempunyai risiko tinggi berulang selepas pemindahan organ, seperti glomerulosklerosis segmental fokus [10] atau hasilnya boleh diperbaiki dengan pilihan pemindahan yang lebih disesuaikan untuk dilakukan, seperti dalam kes utama. hiper oksaluria di mana gabungan pemindahan buah pinggang-hati boleh menghasilkan hasil yang lebih baik [11]. Akhirnya, mempunyai diagnosis penyakit yang jelas mungkin berguna untuk pesakit mengambil bahagian dalam ujian klinikal dan mendapat manfaat daripada pilihan rawatan baru [12, 13].

Pada penghujung 2018, dalam kerjasama antara pakar nefrologi pediatrik dan pakar genetik, kami mula menjalankan ujian genetik untuk keadaan monogenik yang berpotensi membawa kepada ESRD dan seterusnya pemindahan. Hospital kami adalah yang terbesar di Itali Barat Laut, mengalir dari kawasan kira-kira 5 juta orang. Kami memilih jenis analisis "satu saiz sesuai untuk semua", dengan penjujukan exome klinikal, iaitu, kira-kira 6700 gen yang dikaitkan dengan keadaan monogenik, memfokuskan analisis pada panel gen yang disesuaikan dengan syak wasangka klinikal dan oleh itu mengehadkan penemuan sampingan dan mengurangkan masa untuk analisis jujukan.

Secara keseluruhan, dengan menggunakan saluran paip ini, kami memperoleh hasil diagnostik selaras dengan data yang diterbitkan, dengan beberapa kepelbagaian antara syak wasangka klinikal yang berbeza, seperti yang dijangkakan. Keputusan yang diperolehi mengesahkan perkaitan termasuk ujian genetik rutin dan kaunseling dalam aliran kerja diagnostik pesakit kanak-kanak yang terjejas oleh nefropati. Sesungguhnya, pengenalpastian varian penyebab adalah penting untuk pengurusan klinikal mereka, dan berpotensi untuk pemilihan penderma hidup yang optimum.

Bahan dan kaedah

Pengambilan pesakit

Kajian ini berdasarkan kohort diagnostik 191 pesakit pediatrik berturut-turut (umur semasa pengambilan <18 tahun), direkrut oleh Unit Nefrologi, Dialisis dan Transplantasi Pediatrik di Hospital Kanak-kanak Regina Margherita dan merujuk kepada Perkhidmatan Biologi Imunogenetik dan Transplantasi untuk analisis genetik. Semua pesakit yang termasuk dalam kajian memberikan persetujuan bertulis yang ditandatangani oleh kedua ibu bapa, apabila mungkin.

Penyediaan sampel, penjujukan dan analisis bioinformatik

Pengekstrakan asid nukleik daripada darah periferal, analisis kualiti DNA, penyediaan perpustakaan, dan penjujukan telah dilakukan seperti yang dilaporkan sebelum ini [14]. Data mentah yang diperoleh daripada penjujukan telah ditukar dalam fail FASTQ dan kemudian diselaraskan dengan Enrichment 3.1.0 atau DRAGEN Enrichment tools (Illumina) dan dipetakan pada TruSight One Expanded v2.0 manifes menggunakan genom Homo Sapiens UCSC GRCh37 sebagai rujukan untuk mendapatkan varian nukleotida tunggal, varian nombor salinan (CNV) dan varian struktur fail. Untuk pengenalan nombor salinan, garis dasar yang dibuat daripada data penjujukan daripada 5 pesakit berbeza, semuanya negatif untuk CNV (mengikut data hibridisasi genomik perbandingan tatasusunan) telah digunakan. Pendekatan ini membolehkan pengesanan CNV walaupun dalam kromosom seksual kerana kumpulan rujukan dibuat kedua-dua individu perempuan dan lelaki dan jantina subjek yang akan dianalisis sentiasa dinyatakan semasa fasa penjajaran. Panggilan dan keutamaan varian telah dibuat mengikut kriteria yang ditetapkan. Penjajaran bacaan dan liputan ekson gen yang diminati telah disemak dan dipaparkan oleh Integrative Genomics Viewer IGV, tersedia secara percuma daripada UC San Diego—University of California dan Broad Institute of MIT dan Harvard University—Boston (https://software.broadinstitute. org/ perisian/igv/). Varian yang akan dimasukkan dalam laporan genetik akhir dikelaskan mengikut kriteria American College of Medical Genetics and Genomic (ACMG).

Penjanaan senarai penyakit gen dalam silico

Gen yang perlu dipertimbangkan untuk pengenalpastian varian dan keutamaan ditakrifkan berdasarkan syak wasangka klinikal. Senarai gen dalam silico dihasilkan padanan (i) data daripada pangkalan data yang berbeza, mengaitkan genotip kepada fenotip (OMIM, PanelApp England, ClinGen, Malacards), dan (ii) data daripada kesusasteraan. Senarai gen yang tersedia dikemas kini sekali setahun berdasarkan bukti novel persatuan penyakit gen.

Penjujukan Sanger dan amplifikasi probe bergantung ligation (MLPA)

Penjujukan Sanger dan/atau analisis MLPA dilakukan untuk mengesahkan varian yang dikenal pasti oleh NGS dan untuk kajian pengasingan keluarga. Secara ringkas, DNA telah diekstrak bermula daripada aliquot bebas kedua bagi darah periferal proband dan daripada ibu bapa. Kawasan DNA yang menarik telah dikuatkan oleh PCR menggunakan keadaan eksperimen tertentu. Ketulenan dan kekhususan kawasan yang dikuatkan telah diperiksa oleh 0.8 atau 1.5% gel agarose. Produk PCR yang dikuatkan kemudiannya dijujukan Sanger menggunakan primer yang sama. Untuk varian PKD1, pengesahan dilakukan menggunakan PCR jarak jauh diikuti dengan PCR bersarang untuk mengelakkan sebarang inferens daripada pseudogenes.

Keputusan

Definisi kriteria untuk mengembalikan keputusan analisis genetik

We previously reported on the design and set-up of a "kidney" gene panel that comprises>400 gen semuanya terlibat dalam pelbagai bentuk penyakit buah pinggang [14]. Untuk kajian ini, kami melaksanakan analisis dengan subpanel tertumpu pada kategori klinikal khusus syak wasangka (cth, CAKUT, glomerulopati, tubulopati, dll.) dan terlebih dahulu menetapkan kumpulan gen tertentu untuk dianalisis. Pendekatan ini mengehadkan bilangan gen yang dianalisis, memudahkan analisis, dan mengurangkan bilangan penemuan sampingan. Hanya apabila, pada penghujung medan analisis dengan panel yang berkaitan, keputusan genetik adalah negatif dan (i) fenotip klinikal tidak ditunjukkan dengan jelas atau (ii) bertindih kategori penyakit yang berbeza, analisis genetik diperluaskan kepada apa yang dipanggil "senarai penuh buah pinggang atau buah pinggang", panel super yang terdiri daripada semua gen yang termasuk dalam subpanel.

Sebagai langkah pertama, kami menentukan satu set kriteria untuk tafsiran keputusan NGS. Selepas melakukan penjujukan exome klinikal (CES) dan penjajaran data, saluran paip analisis ditentukan untuk menapis dalam varian yang berkaitan. Khususnya, berdasarkan syak wasangka klinikal, varian yang dikenal pasti telah ditapis berdasarkan senarai gen dalam silico, khusus untuk kategori makro penyakit yang berbeza. Varian sinonim yang tidak memberi kesan kepada mekanisme penyambungan atau varian intronik yang tidak dipetakan dalam kawasan penyambungan telah dikecualikan, dengan mengambil kira hanya varian yang tidak sinonim, karut, anjakan bingkai dan yang mempengaruhi penyambungan. Sepuluh, hanya varian yang jarang berlaku (kekerapan kurang daripada 1% dalam populasi) dan varian dengan kekerapan alel dalam pesakit sekurang-kurangnya 0.2 dan liputan sekurang-kurangnya 20 bacaan disertakan. Varian selebihnya telah diberi anotasi dan disusun selanjutnya berdasarkan (i) cara pewarisan, (ii) pemuliharaan nukleotida, (iii) kesan protein, mengeksploitasi pangkalan data yang berbeza untuk menyemak skor, dan (iv) literatur, jika ada. Pada ketika ini, varian yang ditapis telah disenaraikan dalam apa yang dipanggil "laporan teknikal". Laporan teknikal telah ditafsirkan oleh pakar genetik perubatan untuk menghasilkan laporan genetik akhir untuk pesakit dan keluarganya. Semasa perundingan genetik, kajian pengasingan keluarga telah dicadangkan untuk (i) mengesahkan varian dalam proband, dan (ii) untuk memasukkan / mengecualikan varian bukan penyebab berdasarkan pengasingan mereka dalam keluarga (Rajah 1).

Dengan mengguna pakai kriteria ini, kami dapat mentakrifkan tiga kategori berbeza laporan genetik. Pertama, "laporan muktamad" yang merangkumi varian patogenik (C5) dan kemungkinan patogenik (C4). Laporan varian yang tidak diketahui kepentingannya (C3) dianggap muktamad hanya jika serasi sepenuhnya dengan gambaran klinikal dan jika kajian pengasingan keluarga mengesahkan peranan mereka yang mungkin. Kedua, "laporan tidak pasti" yang termasuk varian C3 yang dikenal pasti oleh CES yang belum atau tidak boleh disahkan dalam konteks kajian pengasingan keluarga atau varian C4/C5 yang tidak selaras sepenuhnya dengan fenotip klinikal. Ketiga, "laporan tidak konklusif" yang merangkumi (i) analisis CES negatif, bermakna tiada varian dikenal pasti oleh NGS; (ii) varian tunggal dalam gen resesif; dan (iii) varian C3 tidak selaras dengan fenotip klinikal, dikenal pasti apabila analisis diperluaskan kepada semuagen yang berkaitan dengan penyakit buah pinggang(Rajah 1).

Ciri utama kohort yang diambil

Kajian ini menerangkan kohort 191 pesakit pediatrik (0–18 tahun) yang dirujuk berturut-turut oleh Unit Nefrologi Pediatrik untuk analisis genetik dari November 2018 hingga Mei 2022, dengan purata 50 pesakit baharu mendaftar setiap tahun . Kriteria untuk ujian genetik adalah (i) nefropati yang dikaitkan dengan sejarah keluarga positif penyakit buah pinggang atau (ii) syak klinikal yang disyaki terhadap keadaan monogenik atau (iii) perlu menolak keadaan monogenik (seperti dalam kes sindrom nefrotik, di mana membezakan penyakit monogenik berbanding bukan monogenik secara klinikal bermakna untuk prognosis dan rawatan).

Kohort dibahagikan berdasarkan syak wasangka klinikal, dengan mengambil kira 6 kategori makro penyakit yang berbeza: keabnormalan kongenital buah pinggang dan saluran kencing (CAKUT; n=34), ciliopathies (n=39), glomerulopati (n=62), nefrolitiasis (n=22), tauopati (n=20) dan penyakit lain yang termasuk juga fenotip sindrom (n=14). Kecuali CAKUT dan tubulopathies yang menunjukkan taburan yang sama antara perempuan dan lelaki, dalam semua kategori lain, terdapat kelaziman subjek lelaki (Rajah 2a). Apabila melihat umur pengambilan, tiada taburan berbeza yang ketara diserlahkan di kalangan kumpulan yang berbeza, dengan umur purata antara 6.7 hingga 10 tahun dalam "Penyakit lain" dan glomerulopati, masing-masing. Walau bagaimanapun, apabila melihat umur median, penyakit CAKUT menunjukkan nilai terendah (4.6 tahun), selaras dengan fenotip kongenital. Dari sudut pandangan etnik, tanpa mengira kategori makro penyakit, kebanyakan pesakit adalah Eropah, diikuti oleh Afrika, dengan hanya beberapa pesakit Asia, Amerika Latin atau kacukan (Rajah 2b). Di kalangan kohort, hanya 8 pesakit yang mempunyai ibu bapa seangkatan.

Rajah 1 Saluran paip analisis data genetik dan kriteria untuk kemasukan varian. Perwakilan skematik saluran paip analitik yang digunakan untuk pengenalpastian varian dan keutamaan, termasuk semua kriteria penapisan masuk dan penapisan. Varian yang terhasil dimasukkan dalam laporan genetik akhir. Apabila boleh, kajian pengesahan varian dan pengasingan keluarga telah dilakukan. Laporan genetik diklasifikasikan sebagai konklusif, tidak pasti, atau tidak konklusif berdasarkan kriteria yang ditunjukkan. Berdasarkan klasifikasi ini, kadar diagnostik aliran kerja penjujukan generasi seterusnya (NGS) kami telah dikira. 1 KG: 1000 pangkalan data genom; Alt fr: frekuensi diubah; C3: varian yang tidak diketahui kepentingannya; C4: kemungkinan varian patogenik; C5: varian patogenik; AR: resesif autosomal

Akhirnya, apabila mengambil kira sejarah keluarga untuk penyakit buah pinggang dengan mengambil kira subjek lelaki dan perempuan secara berasingan, heterogeniti dalam pengagihan antara kes positif dan negatif adalah jelas memandangkan kategori penyakit yang berbeza. Secara keseluruhan, kebanyakan kohort yang direkrut dan bebas daripada jantina tidak dicirikan oleh sejarah keluarga yang positif, seperti yang ditunjukkan untuk CAKUT, glomerulopati, tauopati dan gangguan buah pinggang yang lain. Walau bagaimanapun, dalam ciliopati dan nephrolithiasis, sebahagian besar kes yang dikemukakan dengan keluarga positif adalah kisahnya dengan taburan berbeza antara perempuan dan lelaki (13 daripada 22 untuk ciliopati dan 5 daripada 12 untuk nephrolithiasis; Rajah 2c).

Dari sudut pandangan klinikal, kohort adalah agak heterogen dengan penyakit utama yang berbeza dimasukkan (Rajah 2d). Antaranya, sus klinikal yang paling kerap berulang ialah penyakit buah pinggang polikistik (n=27), CAKUT (n=25), sindrom nefrotik (n=19), glomerulosklerosis segmental fokus (FSGS; n =14) dan sindrom Alport (n=13; Rajah 2d).

Perkhidmatan Sokongan Wecistanche-Pengeksport cistanche terbesar di China:

E-mel:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Beli Untuk Butiran Spesifikasi Lebih Lanjut:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

KLIK DI SINI UNTUK MENDAPATKAN EKSTRAK CISTANCHE ORGANIK SEMULAJADI DENGAN 25% ECHINACOSIDE DAN 9% ACTEOSIDE UNTUK JANGKITAN BUAH PINGGANG