Penstabilan serentak Actin Cytoskeleton dalam Berbilang Sel khusus Nefron Melindungi Buah Pinggang Daripada Pelbagai Kecederaan

Penyakit buah pinggang kronikdankecederaan buah pinggang akutadalah secara mekanikalpenyakit buah pinggang yang berbeza. Manakala penyakit buah pinggang kronik dikaitkan dengankecederaan podosit, kecederaan buah pinggang akutmenjejaskan sel epitelium tubular renal. Walaupun terdapat perbezaan ini,ciri kardinalkedua-duanyapenyakit buah pinggang akut dan kronikialah sitoskeleton aktin yang tidak terkawal. Kami telah menunjukkan itupengaktifan farmakologi dinamin GTPasememperbaiki kecederaan podosit dalammodel murine penyakit buah pinggang kronikolehmenggalakkan pempolimeran aktin. Di sini kami mewujudkan peranan dynamin dalam memodulasi kekakuan dan kekutubansel epitelium tiub buah pinggangdengan memaut silang filamen aktin ke dalam rangkaian bercabang. Pengaktifan keupayaan silang silang dinamin oleh agonis molekul kecil menstabilkan korteks actomyosin membran apikal terhadap kecederaan, yang seterusnyamemelihara fungsi buah pinggangdalam pelbagai model murine kecederaan buah pinggang akut. Terutamanya, agonis dinamin secara serentak melemahkan podosit dankecederaan tiubdalam model murine genetik sindrom Alport. Kajian kami menyediakan bukti untuk kebolehlaksanaan dan menyerlahkanfaedah terapi pelindung nefron holistik novel.

KLIK DI SINI UNTUK MENGETAHUI FORMULASI HERBA CISTANCHE YANG BAIK UNTUK KECEDERAAN BUAH PINGGANG AKUT

Thepunca utama kecederaan buah pinggang akut(AKI) ialahiskemia, hipoksia, ataunefrotoksisiti1. Walaupun ia boleh diterbalikkan, AKI mewakili masalah penjagaan kesihatan yang ketara dengan kematian yang tinggi dan tiada rawatan muktamad. Tanpa mengira etiologinya, AKI terutamanya mencederakan sel epitelium terpolarisasi tubulus renal yang mikrovili apikal membentuk sempadan berus tiub yang mengambil bahagian dalam menyelaraskan elektrolit penting dan pengangkutan air2. Ciri morfologi awal AKI ialah kehilangan sempadan berus dan kekutuban sel akibat pecahan korteks actomyosin pada membran apikal1.

Penubuhan dan penyelenggaraan kekutuban sel melibatkan lata isyarat, pemerdagangan membran, dan dinamik sitoskeletal, yang semuanya sangat diselaraskan3. Organisasi membran apikal sebahagian besarnya ditentukan oleh seni bina rangkaian actomyosin4, yang mewujudkan kekakuan korteks, dengan itu memudahkan pengelompokan protein polariti. Walaupun motor myosin II dianggap sebagai penjana utama kekakuan kortikal5,6, seni bina korteks actomyosin ditubuhkan oleh segudang protein pengikat aktin (ABP)7.

Sebagai tambahan kepada ABP yang diketahui, sempadan berus tubul renal sangat diperkaya dalam dynamin8, GTPase yang paling terkenal kerana peranannya dalam endositosis9. Dynamin mempunyai kecenderungan intrinsik untuk berhimpun menjadi berbilang keadaan oligomerisasi seperti dimer, tetramer, gelang dan lingkaran9. Kami mengenal pasti buat kali pertama interaksi langsung dinamin-aktin10 dan menunjukkan bahawa oligomerisasi dynamin mengawal pempolimeran aktin dalam podocytes11,12, sel khusus yang penting untuk selektiviti penapis buah pinggang. Menggunakan model murine CKD, kami telah menunjukkan bahawa pengaktifan pempolimeran aktin yang bergantung kepada dinamin membalikkan kecederaan podosit dengan memulihkan struktur dan fungsi uniknya12.

Di sini kami menunjukkan bahawa dalamsel epitelium tiub buah pinggang, dinamin memaut silang aktin berfilamen (F-aktin) ke dalam rangkaian bercabang. Keupayaan pemautan silang Dynamin ditakrifkan oleh keadaan oligomerisasinya dan panjang F-aktin. Pengaktifan farmakologi oligomerisasi dinamin mengatasi AKI dengan menstabilkan rangkaian aktin dan dengan itu integriti sel, yang sebahagiannya melindungi sel epitelium buah pinggang daripada kecederaan yang disebabkan oleh tekanan oksidatif. Kajian kami mengenal pasti korteks actomyosin membran apikal sel tubular renal sebagai sasaran dadah dalam AKI melalui dinamin sebagai proksi

Keputusan Oligomerisasi dinamin mewujudkan kekakuan dan morfologi membran apikal.

Untuk mengkaji peranan interaksi dinamin-aktin dalam sel epitelium tiub renal terpolarisasi, kami menggunakan Bis-T-23, pengaktif alosterik oligomerisasi dinamin yang bergantung kepada aktin dalam sistem terkonstitusi13, dalam sel11,13, dan dalam keseluruhan organisma12. Fenotip selular dinilai dalam sel Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) dengan mengikut status F-actin dan corak pewarnaan protein simpang ketat zonula occludens-1 (ZO-1), iaitu dianggap sebagai biomarker kekutuban sel. Cytochalasin D (CytoD) dan latrunculin A (LatA), perencat pempolimeran aktin yang diketahui, menurunkan tahap F-aktin dan menyebabkan pewarnaan ZO{12}} terputus (Tambahan Rajah 1a). Sebaliknya, Bis-T-23 mendorong sedikit peningkatan dalam tahap F-aktin tanpa sebarang kesan pada pewarnaan ZO-1. Penambahan Bis-T-23 sebelum tetapi tidak selepas LatA, tahap F-aktin dan kekutuban sel yang terpelihara sebahagiannya. Baik kenderaan DMSO mahupun dynamin inhibitor dynole14 tidak menunjukkan sebarang kesan (Tambahan Rajah 1a).

Mengimbas mikroskop elektron (SEM) membolehkan kami memvisualisasikan perubahan morfologi sel akibat dadah yang memfokuskan pada membran apikal (Rajah 1a). Purata ketinggian sel MDCK ialah 11 ± 2 µm, dan purata panjang mikrovili ialah 0.63 ± 0.2 µm (Jadual 1), yang berada dalam julat yang diperhatikan dalam buah pinggang15. LatA mengurangkan ketinggian sel dan panjang mikrovili dan mengalihkan mikrovili yang diedarkan secara seragam ke dalam kelompok, manakala Bis-T{11}} mendorong kesan yang bertentangan (Jadual 1, Rajah 1a). Apabila ditambahkan sebelum LatA, Bis-T{15}} sebahagiannya dipelihara ketinggian sel dan panjang mikrovili. Memandangkan mikrovili mempamerkan kawalan panjang yang indah yang ditakrifkan oleh aktin kortikal pada asasnya16, data ini memberikan bukti bahawa Bis-T-23 mengubah suai korteks actomyosin pada membran apikal.

Untuk menentukan kesan tepat Bis-T-23 pada aktin kortikal, kami memvisualisasikan korteks actomyosin dalam lamellipodia menggunakan mikroskop elektron replika platinum (PR-EM). LatA mengurangkan ketumpatan rangkaian aktin, dan kesan ini telah dimansuhkan sebahagiannya dengan penambahan Bis-T-23 sebelum LatA (Rajah 1b). Memandangkan LatA mempercepatkan penyahpolimeran filamen aktin dengan mengasingkan monomer aktin, kami seterusnya memeriksa sama ada pemeliharaan korteks actomyosin yang diperhatikan oleh Bis-T-23 adalah disebabkan oleh kesan positifnya terhadap pempolimeran aktin. Berbeza dengan rangsangan kuat pempolimeran aktin yang diperhatikan dalam ekstrak sel podocyte10,11, Bis-T{11}} hanya meningkatkan sedikit pempolimeran aktin dalam ekstrak sel MDCK (Tambahan Rajah 1b). Begitu juga, kekurangan imunodinamin endogen-2 (Dyn2) daripada ekstrak atau perencatan aktiviti GTPasenya oleh dynode mengakibatkan kerosakan kecil pempolimeran aktin (Tambahan Rajah 1c). Walaupun LatA dan CytoD menjejaskan pempolimeran aktin dengan ketara, penambahan Bis-T-23 sebelum LatA atau CytoD tidak dapat mengatasi kesan perencatannya (Tambahan Rajah 1d, e). Jasplakinolide, ubat yang mendorong pempolimeran aktin dengan merangsang nukleasi filamen aktin17, tidak meningkatkan tahap pempolimeran keseluruhan dengan ketara (Tambahan Rajah 1d), menunjukkan bahawa lisat sel MDCK mempamerkan tahap aktin terpolimer hampir maksimum. Bersama-sama, data ini menunjukkan bahawa kesan Bis-T-23 pada morfologi membran apikal dalam sel MDCK didorong oleh mekanisme selain daripada pempolimeran aktin.

Memandangkan pengetahuan umum tentang penyetempatan diperkaya Dyn2 dan F-aktin pada sempadan berus sel epitelium buah pinggang8, dan peranan dynamin dalam endositosis, kami seterusnya menyiasat jika Bis-T-23 telah mempengaruhi aktin secara tidak langsung melalui perubahan dalam endositosis. Seperti yang dijangkakan, kedua-dua Dyn2 dan F-actin disetempatkan bersama pada korteks actomyosin di bawah membran apikal, dalam mikrovili, dan pada lubang bersalut clathrin (CCP), yang ditakrifkan oleh bentuk dan saiz yang berbeza (Tambahan Rajah 1f). Kami mengkaji dinamik CCP menggunakan mikroskopi pendarfluor pantulan dalaman total (TIRF)18,19. Bis-T-23, walaupun pada kepekatan tertingginya, tidak mempunyai kesan ke atas taburan jangka hayat CCP, manakala dynole mengurangkan bilangan CCP produktif (Tambahan Rajah 1g). Kekurangan korelasi antara tahap endositosis dan perubahan dalam morfologi sel ini menegaskan bahawa Bis-T- 23 menyasarkan aktin kortikal tanpa mempengaruhi peranan dinamin dalam endositosis.

Oleh kerana polariti sel renal dikekalkan oleh seni bina dan pengecutan berterusan rangkaian actomyosin, yang mewujudkan kekakuan sel pada membran apikal20, kami seterusnya mengukur kekakuan sel menggunakan mikroskopi daya atom (AFM). Sistem Nanowizard IV dan perisian analisis JPK digunakan untuk menentukan perubahan dalam Modulus21 Young di bawah tetapan eksperimen yang berbeza (Tambahan Rajah 2a). Rawatan dengan LatA mengakibatkan penurunan ketara dalam kekakuan sentuhan sel-sel dan kekakuan sel apikal dalam sel MDCK (Rajah 1c-e). Sebaliknya, Bis-T-23 meningkatkan kekakuan sel dengan ketara berbanding kenderaan DMSO (Rajah 1c–e), selaras dengan kesan positifnya pada ketinggian sel, nombor mikrovili dan ketumpatan rangkaian aktin (Jadual 1 dan Rajah 1b)22. Penambahan Bis-T-23 sebelum LatA sangat mengurangkan kesan negatif LatA pada kekakuan sel (Rajah 1c–e), selaras dengan kesan positif Bis-T-23 pada rangkaian aktin dan morfologi sel apikal (Jadual 1, Rajah 1b).

Rajah 1 Oligomerisasi dinamin mentakrifkan kekakuan sel dengan mempengaruhi seni bina aktin dalam sel epitelium buah pinggang. imej SEM Perwakilan sel MDCK dirawat dengan DMSO (0.1%) atau Bis-T-23 (30 µM, 0.1% DMSO) untuk 1 0 min sebelum penambahan DMSO (0.1%) atau LatA (0.2 µM, 0.1% DMSO) untuk 2{{23} } min. Imej inset yang diperbesarkan (kawasan berkotak oren) menunjukkan susunan, pengedaran, dan ketumpatan mikrovili pada membran apikal. b Imej PR-EM perwakilan sel MDCK dirawat seperti yang dijelaskan dalam (a). Imej menunjukkan perubahan dalam organisasi korteks actomyosin dalam sel MDCK di bawah keadaan yang ditunjukkan. c Imej perwakilan peta Modulus Young sel MDCK dirawat seperti yang dijelaskan dalam (a). d, e Graf bar yang mewakili Modulus Muda yang menggambarkan kekakuan sel yang diukur pada persimpangan sel-sel (d) atau pada membran apikal (e). Setiap simbol mewakili purata kekakuan sel tunggal. Keputusan yang ditunjukkan dalam d, e dijana daripada sekurang-kurangnya 10 sel daripada sekurang-kurangnya tiga hidangan budaya. Bar ralat, min ± SD (*P Kurang daripada atau sama dengan 0.05, **P Kurang daripada atau sama dengan 0.01, ***P Kurang daripada atau sama dengan 0.001, ****P Kurang daripada atau sama dengan 0.0001, tidak berpasangan ujian-t dua ekor). ns, tidak penting.

Kami juga telah menentukan kekakuan sel menggunakan sistem BioScope II sebagai pendekatan eksperimen alternatif untuk AFM. Dalam keadaan ini, lengkung lekukan daya diperolehi mengikut model Discher dan rakan sekerja yang dikira dengan perisian Matlab23. Aliran yang sama berkenaan dengan kekakuan sel telah direkodkan untuk interaksi antara LatA dan Bis-T-23 (Tambahan Rajah 2b, 2c). Di samping itu, dynode tidak menunjukkan sebarang kesan ke atas kekakuan sel, manakala CytoD mengurangkan kekakuan sel dengan ketara (Tambahan Rajah 2d, e), selaras dengan fenotip aktinnya (Tambahan Rajah 1a). Bersama-sama, data ini mewujudkan korelasi antara status korteks actomyosin, kekakuan sel, morfologi membran apikal, dan kekutuban sel. Penemuan ini juga menunjukkan secara meyakinkan peranan oligomerisasi dinamin dalam menentukan parameter mekanikal kekutuban sel epitelium melalui kesannya pada korteks actomyosin.

Dynamin memaut silang filamen aktin ke dalam rangkaian bercabang yang mendasari kekutuban sel. Untuk menjelaskan mekanisme molekul yang mana oligomerisasi dinamin mempengaruhi seni bina korteks actomyosin, kami seterusnya mengkaji kesan dinamin pada filamen aktin dalam sistem yang disusun semula. Berdasarkan hipotesis semasa, panjang filamen aktin mentakrifkan cara pemautan silang6. Memandangkan panjang purata filamen aktin kortikal dalam rangkaian di pinggir utama adalah antara 100 dan 150 nm24, kami mengkaji kesan dinamin pada organisasi filamen yang lebih pendek yang dihasilkan dengan mengehadkan F-actin dengan gelsolin (Gsn-actin) (Rajah 1). 2a). Penambahan Dyn2 menghasilkan pembentukan rangkaian besar bercabang (Rajah 2b, c). Berdasarkan saiz dan bentuk Dyn2 rekombinan (Rajah 2d), rangkaian dibentuk terutamanya oleh dimer Dyn2 (Dyn2DIMER) dan tetramer (Dyn2TETRA) yang berinteraksi dengan beberapa filamen aktin (Rajah 2e): Dyn2DIMER terikat kepada dua filamen, Dyn2TETRA diikat sehingga empat filamen dan Dyn2RING diikat sehingga enam filamen. Pembesaran imej yang rendah mendedahkan bahawa rangkaian bergantung kepada dinamin membentuk corak bentuk seperti cincin yang lebih kecil dan lebih besar (Rajah 2c).

Untuk mengaitkan pemerhatian daripada sistem yang disusun semula dengan peranan dynamin dalam sel, kami seterusnya menentukan penyetempatan Dyn2 endogen pada rangkaian aktin kortikal menggunakan antibodi anti-Dyn2 monoklonal diikuti oleh antibodi sekunder terkonjugasi emas (Tambahan Rajah 3a-c). Seperti yang dilihat dalam sistem tersusun semula, dinamin dikaitkan dengan bilangan F-aktin yang berbeza dalam rangkaian bercabang (Rajah 2f). Bersama-sama, data ini mengenal pasti aktiviti baru dinamin, iaitu memaut silang F-aktin ke dalam rangkaian bercabang.

Untuk mengaitkan keupayaan pemautan silang dinamin dan kesan perlindungan Bis-T-23 pada korteks actomyosin dan morfologi membran apikal, kami seterusnya mengkaji kesan Bis-T-23 pada pengantara dinamin. rangkaian dalam sistem tersusun semula (Rajah 3a). Berdasarkan plot kontur, yang memberikan gambaran topografi ketumpatan filamen yang berbeza-beza, Bis T-23 meningkatkan ketumpatan rangkaian keseluruhan (Rajah 3a), yang boleh dijelaskan oleh peningkatan bilangan F-aktin yang terikat kepada dinamin disebabkan oleh peningkatan dalam oligomerisasinya. Di samping itu, dynamin lebih kuat bersilang filamen pendek berbanding F-aktin panjang (Rajah 3a–c), menunjukkan bahawa keupayaan dynamin untuk membentuk rangkaian bercabang ditakrifkan oleh status oligomerisasi dan panjang filamen aktin. Keupayaan untuk memaut silang filamen aktin ke dalam rangkaian dikongsi oleh dua isoform dinamin, Dyn2 yang dinyatakan di mana-mana dan dinamin khusus neuron-1 (Dyn1) (Gamb. 3b, c).

Perkhidmatan Sokongan Wecistanche-Pengeksport cistanche terbesar di China:

E-mel:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Kedai:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop