Hubungan Antara Cyclo-oxygenase(COX-2) Dan Penyakit Akibat Hipoksia

untuk maklumat lanjut:ali.ma@wecistanche.com

Prostaglandin E2 intraselular menyumbang kepada kematian sel tubular proksimal yang disebabkan oleh hipoksia

Coral Garcia-Pastorl, Selma Benito-Martinez, Ricardo J.Bosch1, Ana B. Fernandez-Martinez, Francisco J. Lucio-Cazana

Sel tubular proksimal (PTC) sangat terdedah kepada apoptosis yang disebabkan oleh hipoksia, faktor yang relevan untukpenyakit buah pinggang. Kami membuat hipotesis di sini bahawa kematian PTC di bawah hipoksia dimediasi oleh pengeluaran prostaglandin E,(PGE,) yang bergantung kepada siklo-oksigenase (COX{1}}), yang telah disahkan dalam sel HK tiub proksimal manusia-2kerana hipoksia (1 peratus O,) apoptosis yang disebabkan (i) telah dihalang oleh COX-2(siklo-perencat oxygenase) dan oleh antagonis reseptor prostaglandin (EP) dan (ii) telah dikaitkan dengan peningkatan PGE intraselular,(iPGE,)disebabkan oleh faktor hypoxia-inducible-1 -pendekatan transkrip COX yang bergantung kepada{{3 }}(cyclo-oksigenase). Apoptosis juga dihalang oleh perencat pengangkut pengambilan prostaglandin PGT, yang menunjukkan bahawa iPGE, menyumbang kepada apoptosis yang disebabkan oleh hipoksia (sebaliknya, kematian PTC yang disebabkan oleh hipoksia/reoksigenasi secara eksklusif disebabkan oleh PGE ekstraselular,). Oleh itu, iPGE adalah pelakon baru dalam patogenesis kecederaan tiub yang disebabkan oleh hipoksia dan PGT mungkin menjadi sasaran terapeutik baru untuk pencegahan lesi yang bergantung kepada hipoksia dalam penyakit buah pinggang.

Telah terbukti bahawa hipoksia tiub adalah faktor yang relevan untuk kedua-dua akut dan kronikpenyakit buah pinggang'2 Sel tubular proksimal (PTC) sangat aktif dari segi penggunaan oksigen kerana aktiviti penyerapan semula yang memerlukan tenaga dan, akibatnya, mereka terdedah kepada hipoksia. Telah ditunjukkan bahawa apoptosis memainkan peranan yang relevan dalam PTC berbudaya yang terdedah kepada hipoksia-, tetapi laluan isyarat yang bertanggungjawab untuk pengaktifan jentera apoptosis belum disiasat. Kami dan yang lain telah mendapati bahawa prostaglandin E, (PGE,), pengantara lipid penting dalam pelbagai proses fisiologi dan patologi dalambuah pinggang, memainkan peranan yang relevan dalam isyarat yang membawa kepada apoptosis PTC selepas rawatan dengan cisplatin7, albumin8 atau leptin, dan gentamycin. Dalam semua keadaan, peningkatan dalam PGE didapati bergantung pada ekspresi dipertingkatkan siklo-oksigenase-2(COX-2)(siklo-oksigenase), enzim boleh teraruh yang, bersama-sama dengan COX-1l, ialah langkah pengehad kadar dalam sintesis prostaglandin. Pada manusiabuah pinggang, COX basal-2(siklo-oksigenase)ungkapan kurang sengit daripada COX-1. COX-2(siklo-oksigenase)telah dikenal pasti dalam podosit dan bahagian gelung Henle dan vaskular buah pinggang di bawah keadaan fisiologi10. Dalam keadaan patologi, walau bagaimanapun, imunoreaktiviti COX{1}} boleh didapati dalam lebih banyak jenis sel dalambuah pinggangtermasuk PTC, dan mungkin menyumbang kepada kecederaan buah pinggang. Menariknya, hipoksia meningkatkan ekspresi COX-2(siklo-oksigenase)dan/atau penghasilan PGE,12-i7 dalam banyak jenis sel. Malah, kami sebelum ini telah mendapati bahawa hipoksia meningkatkan kandungan intraselular dalam PGE, serta pelepasannya ke medium ekstraselular8. Oleh itu, secara teorinya mungkin PGE mengantara kesan apoptosis hipoksia pada PTC.

Kebanyakan kajian mengenai apoptosis bergantung PGE pada asasnya tertumpu pada mekanisme yang melibatkan PGE ekstraselular kerana diterima secara meluas bahawa PGE, memberikan kesan biologinya melalui pengaktifan PGE yang merangkumi membran plasma G-protein, reseptor (reseptor prostaglandin siri E. EP1-4)1. Namun begitu, dalam sesetengah model, PGE intraselular,(iPGE,)berkaitan dalam kematian sel apoptosis720-22. Ini menunjukkan bahawa untuk mendorong apoptosis, PGE perlu mencapai medium intrasel sekali lagi dan mengaktifkan subset reseptor EP, yang terletak di dalam sel (reseptor iEP). Oleh kerana tugas menangkap PGE, dilakukan terutamanya oleh pengangkut pengambilan prostaglandin(PGT)23-26, perencatan PGT mengakibatkan pencegahan kematian sel apoptosis yang dimediasi iPGE7.

Dengan mengambil kira latar belakang ini, dalam kerja ini, kami mengkaji sama ada COX-2(siklo-oksigenase)-peningkatan bergantung pada iPGE, tahap mengantara apoptosis yang disebabkan oleh hipoksia dalam PTC.

Klik untuk Cistanche organik untuk penyakit buah pinggang

Kaedah

Reagen.

AG1478, Bromocresolgreen (BG), PGE, AH6809, GW627368X, kristal ungu, larutan biru trypan, Bromosulfophthalein (BRS), 3-(5'-Hydroxymethyl2'-furyl)-1-benzyl indazole (YC1), dan actinomycin D dibeli daripada Sigma (St. Louis, MO, Amerika Syarikat). Z-VAD-FMK dan celecoxib masing-masing berasal dari Calbiochem (Darmstadt, Jerman) dan Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, Amerika Syarikat). TriReagent telah dibeli daripada Vitro(Madrid, Sepanyol) dan membran PVDF dan reagen luminol Western blotting diperoleh daripada Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA. USA). Reagen antiluntur ProLong Gold dengan 4,6-diamidino{{14 }}phenyl indole (DAPI), annexin-V-FITC(fluorescein isothiocyanate)/propidium iodide (PI) kit pengesanan apoptosis dan probe 2',7'-dichlorofluorescein diacetate(DCFH-DA) telah dibeli daripada Invitrogen(Carlsbad, CA, USA), dan Molecular Probe (Oregon, USA), masing-masing. Antibodi diperoleh daripada sumber berikut: anti-PGE dan anti-COX-2(siklo-oksigenase)antibodi adalah dari Abcam (Cambridge, UK); anti-Bax dan anti-Bcl-2 adalah daripada Santa Cruz Technologies(Santa Cruz, CA.USA); antibodi anti-HIF-la dan -rabbit-Alexa-Fluor 488 masing-masing daripada BD Biosciences(Palo Alto, CA, USA) dan Invitrogen(Carlsbad, CA, USA); konjugat IgG peroksidase anti- -aktin dan arnab anti tikus telah dibeli daripada Sigma (St.Louis, MO, USA).

Kultur sel dan keadaan eksperimen.

Sel HK-2 proksimal tiub manusia telah dibeli daripada American Type Culture Collection(ATCC)(Rockville, MD, USA).Sel dikekalkan dalam 5 peratus CO, pada 37 darjah Cin DMEM/F12 ditambah dengan 10 peratus lembu janin serum(FBS), 1 peratus penisilin/streptomycin/amphotericin B dan 1 peratus glutamin(Invitrogen. Carlsbad, CA, USA) dan 1 peratus insulin-transferrin-selenium(ThermoFisher. Grand Island, NY, USA).Dalam semua eksperimen, sel disalut pada 70-90 peratus pertemuan, dan apabila dicantumkan sepenuhnya, ia dikultur dalam keadaan hipoksik(1 peratus oksigen) atau normoksik (21 peratus oksigen).Hipoksiaeksperimen telah dilakukan dalam In vivo200hipoksiastesen kerja (Teknologi Ruskin, West Yorkshire, United Kingdom). Untukhipoksia/eksperimen reoksigenasi, sel telah tertakluk kepadahipoksiaselama 24 jam, dan, selepas itu, sel diinkubasi dalam keadaan normoksik sehingga 3 jam (tempoh reoksigenasi).

Analisis imunofluoresensi iPGE dan analisis Western blot COX-2(siklo-oksigenase)dan HIF-1 .

Sel untuk analisis imunofluoresensi dan analisis Western blot masing-masing dipecahkan pada slip penutup kaca (4×104 sel/liputan kaca) atau ke dalam plat enam telaga (15×104sel/telaga) dan diinkubasi seperti yang diterangkan dalam "Hasil". Kemudian, analisis imunofluoresensi dan immunoblotting dilakukan secara asasnya seperti yang diterangkan sebelum ini. Pencairan kerja anti-badan ialah: 1/50 untuk PGE,, 1/1000 untuk COX-2(siklo-oksigenase)/HIF-1a/a-rabbit-Alexa-Fluor 568 dan 1/5000 untuk -actin. Pengesanan imunofluoresensi dilakukan menggunakan mikroskop confocal Leica SP5 (Leica Microsystems, Wetzlar, Jerman), melalui Perkhidmatan Mikroskop Konfokal (ICTS 'NANBIOSIS'U17) Pusat Rangkaian Penyelidikan Bioperubatan mengenai Kejuruteraan Bio, Biobahan dan Perubatan Nano (CIBER-BBN di Universiti Alcal, Madrid, Sepanyol)

Transfeksi sementara.

Transfeksi sementara dengan siRNA PGT(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), vektor ekspresi mamalia pcDNA3 yang mengandungi cDNA 15-hydroxy-prostaglandin dehydrogenase (p15-}PGDH) manusia jenis liar atau binaan plasmid wartawan luciferase untuk COX manusia-2(siklo-oksigenase)phpPES2-Luc, manusiahipoksiaelemen tindak balas (HRE)p9HIF1-Luc dan R. reniformis pRL-CMV(Promega, Madison, WI) dan penentuan aktiviti luciferase telah dilakukan seperti yang diterangkan di tempat lain27,28.

Kiraan sel dan morfologi sel/nukleus.

Bilangan sel yang melekat ditentukan secara spektrofotometri dengan kaedah pewarnaan kristal violet yang diubah suai2. Untuk mengesan bukti apoptosis, morfologi sel diperhatikan menggunakan mikroskop fasa kontras. Nukleus sel divisualisasikan selepas pewarnaan DNA dengan DAPI seperti yang diterangkan sebelum ini0, Morfologi apoptosis biasa yang diperiksa termasuk pengecutan selular, pemeluwapan dan pemecahan nuklear serta pembentukan badan apoptosis. Untuk kuantifikasi, enam medan telah diperiksa dalam setiap keadaan eksperimen secara buta untuk menganggarkan peratusan nukleus dengan penampilan seperti apoptosis.

Ujian apoptosis sitometri aliran dan ujian daya maju sel oleh ujian pengecualian pewarna biru trypan.

Sel-sel yang melekat pada plat telah ditanggalkan oleh trypsinization dan, bersama-sama dengan sel-sel yang terpisah yang sebelum ini pulih daripada medium kultur, digunakan untuk ujian.

Kit pengesanan apoptosis Annexin-V-FITC/PI dibenarkan untuk pengesanan sitometri aliran sel HK-2 apoptosis dan nekrotik, seperti yang diterangkan sebelum ini7. Sel apoptosis awal dan lewat adalah positif, masing-masing, kepada pewarnaan annexin V dan kedua-duanya dan annexin V mengotorkan. Sel nekrotik hanya positif kepada PI dan sel HK-2 hidup tidak menunjukkan sebarang pewarnaan.

Ujian pengecualian pewarna biru trypan digunakan untuk menilai daya maju sel. Sel berdaya maju (putih) dan sel mati (biru) dikira menggunakan mikroskop cahaya dan hemositometer.

Analisis statistik.

Setiap eksperimen diulang sekurang-kurangnya tiga kali. Keputusan dinyatakan sebagai min ± SEM. Mereka tertakluk kepada analisis varians sehala (ANOVA) diikuti oleh ujian Bonferroni untuk pelbagai perbandingan. Tahap keertian telah ditetapkan pada P Kurang daripada atau sama dengan 0.05.

Keputusan

Hipoksia mendorong kematian sel HK-2 tiub proksimal.

Hipoksiamengurangkan bilangan sel HK-2, seperti yang dinilai oleh ujian kristal violet(Rajah la), dan juga mendorong pembulatan dan detasmen sel daripada plat (Rajah lb, panel atas). Seperti yang diharapkan,hipoksiamencetuskan model kematian sel dengan ciri morfologi apoptosis yang jelas (lihat pewarnaan nuklear dengan DAPI dalam Rajah lb, panel bawah, kiri) seperti pengecutan sel dengan pemeluwapan nuklear yang ketara, pemecahan dan pembentukan badan seperti apoptosis.Hipoksia-apoptosis yang disebabkan telah disahkan lagi oleh peningkatan pewarnaan annexin V-FITC, seperti yang dinilai oleh sitometri aliran, dan pencegahannya dengan perencat pan-caspase Z-VAD-FMK (Rajah lc).Hipoksiajuga menentukan penurunan dalam bilangan sel yang berdaya maju tetapi tidak menyebabkan perubahan ketara secara statistik dalam bilangan sel nekrotik (Rajah lc, inset).

Rajah 1. Hipoksia mendorong kematian sel HK-2 tiub proksimal.(a) Kiraan sel berkurangan (ujian kristal violet). (b) Ciri-ciri morfologi apoptosis. Fotomikrograf kontras fasa perwakilan(panel atas, pembesaran asal, 10×)Fotomikrograf pewarnaan DAPI (panel bawah, pembesaran asal,40×). (c) Peningkatan dalam apoptosis (kajian sitometri aliran). Sel Annexin V plus terdiri daripada sel Annexin V plus /propidium iodide (iaitu sel apoptosis awal dengan integriti membran plasma yang terpelihara) dan sel annexin V plus /propidium iodide tambah (iaitu sel apoptosis lewat). Inset: Jenis populasi sel (Annexin V-/ propidium iodide plus sel ialah sel nekrotik dan annexin V-/ propidium iodide-sel hidup). Keputusan dinyatakan sebagai peratusan berkenaan dengan jumlah bilangan acara. Maklumat am:(1) Sel telah diinkubasi selama 24 jam dalam keadaan normoksik(21 peratus O2) atau hipoksik （1 peratus O,）, seperti yang ditunjukkan dalam "Kaedah?. perencat pan-caspase Z-VAD-FMK （25 μM） adalah ditambah 1 jam sebelum memulakan pendedahan kepadahipoksia. (2)Mikrofotograf ialah contoh mewakili tiga eksperimen bebas. Bar dan bar ralat dalam graf: Setiap bar mewakili min±SEM bagi 3 eksperimen berbeza *P<0.01 vs.=""><0.01 vs="">hipoksia;**P<0.01 vs.="" normoxia="" and="">hipoksiaditambah dengan ZVAD.

COX-2(siklo-oksigenase)/iPGE,/EP laluan reseptor mengantara kematian sel HK-2 tiub proksimal yang disebabkan oleh hipoksia.

Untuk menilai peranan COX-2(siklo-oksigenase)/iPGE2/EP laluan reseptor masukhipoksia-kematian sel HK-2 yang disebabkan, kami mula-mula mengeram sel dengan celecoxib, COX-2(siklo-oksigenase)perencat1; AH6809, antagonis reseptor EP1, EP2 dan EP3 atau GW627368X, antagonis reseptor EP433; atau dengan bromocresol green atau bromosul-fophthale dalam kedua-dua perencat PGT435.PGT juga telah dirobohkan melalui pemindahan dengan siRNA.

Rajah 2. COX-2(siklo-oksigenase)Laluan reseptor /iPGE,/EP mengantara kematian sel HK-2 tiub proksimal akibat hipoksia.(a) Pencegahan kematian sel oleh perencat laluan. Panel atas; Bar menunjukkan peratus daripada jumlah kematian sel (kiri) atau peratus apoptosis sel annexin V tambah (kanan). Sebelum terkenahipoksia, sel telah dipra-inkubasi selama 1 jam dengan 3 μM celecoxib（COX-2(siklo-oksigenase)perencat）;10 μuM AH6809, （EP1-3 antagonis reseptor）, 10 μM GW627368X（EP4 antagonis reseptor）; atau dengan 50 μM bromocresol green （BG） atau 25 μM bromosulfophthalein(BrS), dua perencat PGT. Panel bawah: Kiri: Pencegahan kematian sel dengan menumbangkan PGT melalui pemindahan dengan siRNA (ujian pengecualian menyelam biru trypan). Inset: Keberkesanan ketukan PGT(Western blot analysis) Kanan: Kebergantungan kepekatan kesan pencegahan hijau bromocresol (BG). (b) Pencegahan kematian sel melalui pemindahan dengan vektor ekspresi mamalia yang mengandungi enzim penyahaktif prostaglandin 15-hydroxy-prostaglandin dehydrogenase(15-PGDH) cDNA(ujian pengecualian pewarna biru trypan). Inset: Ungkapan {{ 11}}PGDH(Western blot analysis) dalam sel yang ditransfeksi. (c)Hipoksiamendorong peningkatan sensitif PGT dalam iPGE, Kiri: PGE, imunofluoresensi bergantung sahaja atau digabungkan dengan pewarnaan nuklear dengan DAPI ditunjukkan (pembesaran asal, 40×) Kanan: Pendekatan kuantitatif kepada imej yang dibentangkan dalam panel kiri menggunakan perisian Image J. (d) Perencat pengaktifan EGFR AG1478 tidak menghalang kematian sel HK-2 EGFR. Sel telah diinkubasi selama 1 jam dengan l μM AG1478 sebelum tertakluk kepadahipoksia. （e） PGT inhibitor BG tidak mengubah suai ungkapan Bax dan Bcl-2 dalam sel HK-2 di bawahhipoksia(analisis Western blot). (f) Pencegahanhipoksia/ kematian sel yang disebabkan oleh reoksigenasi oleh perencat laluan (ujian pengecualian pewarna biru trypan). Sel telah diinkubasi terlebih dahulu dengan perencat laluan dan tertakluk kepadahipoksiaseperti dalam (a). Kemudian, sel terdedah kepada normoxia selama 3 jam. Maklumat am:(1) Sel telah diinkubasi selama 24 jam dalam keadaan normoksik (21 peratus O,) atau hipoksik (1 peratus O,), seperti yang ditunjukkan dalam "Kaedah". (2)Mikrofotograf ialah contoh mewakili tiga eksperimen bebas. (3) Pelarut perencat(medium luL/mL) tidak mengubah suai kesan daripadahipoksiapada kematian sel (keputusan tidak ditunjukkan). (4) Analisis Western blot: Protein yang sama telah disahkan dengan menyelidik dengan anti- -aktin atau antibodi anti-GAPDH. (5)Bar dan bar ralat dalam graf: Setiap bar mewakili min±SEM bagi 3 eksperimen berbeza.*P<0.01><0.01>hipoksiaatauhipoksia/reoksigenasi.

Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2a,hipoksia-kematian sel tubular proksimal akibat dihalang dalam semua keadaan. Perencatan apoptosis oleh celecoxib menunjukkan bahawa COX-2(siklo-oksigenase)memainkan peranan yang relevan dalamhipoksia-kematian sel apoptosis yang disebabkan (Rajah 2a, panel atas, kanan). Lebih khusus lagi, fakta bahawa apoptosis dihalang oleh antagonisme reseptor EP menunjukkan bahawa apoptosis dimediasi oleh COX-2(siklo-oksigenase)-pengeluaran bergantung PGE.Sebaliknya, kemungkinan besar iPGE, menyumbang kepadahipoksia-mengakibatkan kematian sel HK-2 kerana ia dihalang oleh;(i) perencatan PGT(Rajah.2a) atau(i) ekspresi berlebihan 15-PGDH(Rajah 2b), yang menyahaktifkan iPGE2 melaluinya pengoksidaan25(perhatian, prosedur pemindahan itu sendiri meningkatkan sensitiviti sel HK-2 kepadahipoksia: kematian sel ialah 45-55 peratus untuk pemindahan dalam keadaan kawalan berbanding 15-20 peratus dalam sel tidak ditransfeksi). Sokongan selanjutnya kepada sumbangan iPGE, kepadahipoksia-kematian sel HK-2 yang disebabkan, adalah penemuan kami sebelum inihipoksiamenentukan peningkatan dalam kandungan sel iPGE,1 dan peningkatan ini telah dihalang oleh perencat PGT (Rajah 2c).

Laluan isyarat MAPK boleh mendorong apoptosis, Oleh kerana reseptor iEP mentransaktivasi reseptor faktor pertumbuhan epidermis (EGFR)36, yang membawa kepada pengaktifan MAP kinase ERK1/2 dan p38 dalam sel HK-20, kami bertanya sama ada pra -pengeraman sel HK-2 dengan perencat pengaktifan EGFR AG1478 dihalanghipoksia-kematian sel yang disebabkan. Kami mendapati keputusan negatif (Rajah 2d) dan oleh itu, tidak mungkin transaktivasi EGFR mengantara kematian sel HK-2 di bawahhipoksia.

Dalam beberapa model eksperimen, pengurangan ATP terbitan mitokondria semasahipoksiamenyebabkan peningkatan nisbah ekspresi protein pro-apoptosis Bax kepada protein anti-apoptosis Bcl-2, yang membawa kepada pembebasan sitokrom C ke dalam sitosol, pengaktifan caspase 9, dan pembelahan dan pengaktifan hiliran, efektor seterusnya. caspases37,38. Walau bagaimanapun, pra-pengeraman dengan perencat PGT BG dalam sel HK-2 di bawahhipoksiatidak menghasilkan perubahan yang serasi dengan anjakan anti-apoptosis dalam keseimbangan antara ungkapan Bc-2 dan Bax(Gamb.2e), yang tidak menyokong peranan protein ini dalam sel HK-2 kematian di bawahhipoksia.

Berikutan pendedahan hipoksik, episod reoksigenasi (iskemia/kecederaan reperfusi) boleh menyebabkan kerosakan sel tambahan. "Paradoks" kecederaan reoksigenasi boleh difahami dengan mengambil kira bahawa sel mengalami perubahan khusus dalam aktiviti enzim, fungsi mitokondria, struktur sitoskeletal, pengangkutan membran, dan pertahanan antioksidan sebagai tindak balas terhadaphipoksia, yang kemudian secara kolektif terdedah kepada kecederaan reoksigenasi39. Reoksi-genasi menyumbang kepada kecederaan buah pinggang akut semasa strok iskemia, pemindahan buah pinggang, kegagalan peredaran darah, atau pembedahan buah pinggang dan kardiovaskular. Dalam konteks ini, potensi nilai terapeutik perencatanhipoksia/kematian sel proksimal tubular proksigenasi akibat campur tangan dalam COX-2(siklo-oksigenase)Laluan reseptor /iPGE,/iEP adalah jelas. Oleh itu, kami bertanya sama ada iPGE secara khusus menjadi pengantarahipoksia-kematian sel yang disebabkan atau juga pengantarahipoksia/kematian sel yang disebabkan oleh reoksigenasi (model in vitro yang meniru iskemia renal in vivo/kecederaan reperfusi). Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah.2f, kematian sel (seperti yang dinilai oleh ujian pengecualian selam biru trypan) telah dihalang oleh COX-2(siklo-oksigenase)perencat celecoxib serta oleh antagonis reseptor EP AH6809 atau GW627368X. Sama seperti untuk Rajah.2a, keputusan ini menunjukkan bahawa COX-2 memainkan peranan yang relevan dalamhipoksia/kematian sel yang disebabkan oleh reoksigenasi dan, lebih khusus lagi, kematian sel itu dimediasi oleh COX-2(siklo-oksigenase)-pengeluaran PGE bergantung, kerana ia dihalang oleh antagonisme reseptor EP. Walau bagaimanapun, kerana kematian sel tidak dihalang oleh perencat PGT bromocresol green atau bro-mosulfophthalein (Rajah 2f dan Rajah Tambahan 2d), kemungkinan besarhipoksia/reoxygenation-induced HK-2 kematian sel dimediasi secara eksklusif oleh PGE ekstraselular.

HIF-1 -peraturan transkrip bergantung COX-2(siklo-oksigenase)ekspresi gen menyumbang kepada ahipoksia-peningkatan akibat iPGE, dalam sel HK-2 tiub proksimal. PGE, biosintesis melibatkan pembebasan daripada membran gliserofosfolipid asid arakidonik oleh fosfolipase A, diikuti oleh penukaran oleh isoenzim COX asid arakidonik kepada prostaglandin H, dan, akhirnya, oleh pengisomeran kelenjar prosta dalam H, kepada PGE, oleh sintase prostaglandin E. seperti sintase PGE mikrosomal-1 (mPGES-1)19. Kami telah menemuinyahipoksia-apoptosis teraruh dalam sel HK-2 berkemungkinan besar diantarkan oleh COX-2(siklo-oksigenase)-pertambahan bergantung dalam pengeluaran PGE,(Gamb.2). Memandangkan COX-2(siklo-oksigenase)ialah enzim yang ekspresinya mungkin disebabkan olehhipoksia, kami membuat hipotesis bahawa ahipoksia-peningkatan akibat PGE, pengeluaran dalam sel HK-2 mungkin akibat daripada peningkatan dalam ekspresi COX-2(siklo-oksigenase). Untuk mengesahkan hipotesis kami, kami mengkaji (i) kesan daripadahipoksiapada ungkapan COX-2(siklo-oksigenase)protein dan mRNA dan (ii) kesan COX-2(siklo-oksigenase)perencat celecoxib padahipoksia-induced peningkatan dalam iPGE, Keputusan kami menunjukkan bahawahipoksiaditentukan secara sementara peraturan naik transkrip COX-2(siklo-oksigenase)ungkapan(Rajah 3a,b)dan COX itu-2(siklo-oksigenase)perencatan menumpulkan peningkatan dalam iPGE, dalam HK-2 sel di bawahhipoksia(Gamb.3c). Menariknya,hipoksiajuga menentukan pengawalseliaan sementara bagi ekspresi protein mPGES-1(Rajah, 3a, inset), tetapi tidak menjejaskan ekspresi mRNA-1 mPGES (Rajah, 3b. inset). Keputusan ini menunjukkan bahawa peningkatan ekspresi COX-2(siklo-oksigenase)dan mPGES-1 bertanggungjawab untukhipoksia-kenaikan peningkatan dalam iPGE.

Rajah 3. Peraturan transkrip COX yang bergantung kepada HIF-2(siklo-oksigenase)ekspresi gen menyumbang kepada peningkatan akibat hipoksia dalam iPGE, dalam sel HK-2 tiub proksimal.(a) Ungkapan COX-2(siklo-oksigenase)protein meningkat secara sementara sebanyakhipoksia(analisis Western blot). Inset: Ungkapan mPGES-1 protein juga dikawal secara sementara olehhipoksia. (b)Ungkapan COX-2(siklo-oksigenase)mRNA meningkat secara sementara sebanyakhipoksia. Inset: Ungkapan mPGES-1 mRNA tidak terjejas olehhipoksia. (c)Pencegahan oleh celecoxib, COX-2(siklo-oksigenase)perencat, peningkatan dalam iPGE, disebabkan olehhipoksia. Sel telah diinkubasi selama 1 jam dengan 3 μM celecoxib. Left∶PGE, imunofluoresensi bergantung sahaja atau digabungkan dengan pewarnaan nuklear dengan DAPI ditunjukkan (pembesaran asal, 40 ×). Kanan: Pendekatan kuantitatif kepada imej yang dibentangkan dalam panel kiri menggunakan perisian Image J. (d) Sumbangan mekanisme transkrip. Kiri: Perencat transkripsi actinomycin D(Act. D) menghalang ahipoksia-peningkatan akibat COX-2(siklo-oksigenase)ekspresi protein (analisis Western blot). Sel telah dirawat terlebih dahulu untuk lh dengan 1 ug/ml Akta. D sebelum didedahkanhipoksiaselama 3 jam. Kanan: Peningkatan dalam aktiviti COX-2(siklo-oksigenase)konstruk wartawan. (e) Perencat HIF-la YC-1 menghalanghipoksia-COX transkripsi teraruh-2(siklo-oksigenase)up-regulation. Sel telah diprainkubasi selama 1 jam dengan 0.5 uM YC-1. Kiri: Pencegahan COX-2(siklo-oksigenase)up-regulation. Sel telah terdedah kepadahipoksiaselama 8 jam. Pusat: Pencegahan peningkatan dalam aktiviti COX-2(siklo-oksigenase)konstruk wartawan. Kanan: Perencatan aktiviti konstruk wartawan dipacu HRE. Sel telah terdedah kepadahipoksiaselama 8 jam.(f) perencat HIF-la YC-1 meningkatkan kematian sel apoptosis(kajian sitometri aliran). Sebelum terkenahipoksia, sel telah dipraeram selama 1 jam dengan 0.5 μM YC-1. Inset∶ YC-1 menghalanghipoksia-induksi peningkatan dalam HIF-1ungkapan (analisis Western blot). Maklumat am:(1)Sel telah diinkubasi selama 24 jam dalam keadaan normoksik (21 peratus O,) atau hipoksik(1 peratus O,), seperti yang ditunjukkan dalam "Kaedah". (2)Mikrofotograf ialah contoh mewakili tiga eksperimen bebas. (3)Analisis Western blot: Protein yang sama telah disahkan dengan menyelidik dengan anti- -antibodi aktin (4) Bar dan bar ralat dalam graf: Setiap bar mewakili min±SEM bagi 3 eksperimen berbeza *P<0.01 vs.="" other="">

Untuk mengkaji lebih lanjut sumbangan mekanisme transkripsi kepada peningkatan COX-2(siklo-oksigenase)ekspresi protein di bawahhipoksia, ungkapan COX-2(siklo-oksigenase)telah dinilai dalam sel HK-2, yang telah diinkubasi dengan perencat transkripsi actinomycin D sebelum tertakluk kepadahipoksiaselama 5 jam. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah.3d,hipoksia-peningkatan akibat COX-2(siklo-oksigenase)ekspresi protein telah dihalang oleh actinomycin D. Tambahan pula,hipoksiajuga menentukan peningkatan dalam aktiviti COX-2(siklo-oksigenase)binaan promoter yang sebelum ini ditransfeksi dalam sel HK-2 (Gamb.3d kanan). Diambil bersama, keputusan yang ditunjukkan dalam Rajah 3d mencadangkan bahawa mekanisme transkrip menyumbang kepada ahipoksia-peningkatan akibat COX-2(siklo-oksigenase)ekspresi protein. Namun begitu, terdapat percanggahan antara masa pengaktifan penganjur COX-2 dan masa COX maksimum-2(siklo-oksigenase)ungkapan mRNA: manakala peningkatan sementara dalam COX-2(siklo-oksigenase)Ekspresi mRNA adalah maksimum selepas 2 jam (Rajah 3b), penganjur COX-2 diaktifkan selepas 3 jam (Rajah.3d), yang mungkin mencerminkan sumbangan mekanisme pasca transkripsi kepada peningkatan COX{{6 }}(siklo-oksigenase)ungkapan4. Sehubungan itu, kami membuat spekulasi bahawa COX-2(siklo-oksigenase)mRNA distabilkan di bawahhipoksia, yang akan mengakibatkan peningkatan tahap COX-2(siklo-oksigenase)ekspresi mRNA tanpa sebarang sumbangan (pada masa itu) peningkatan aktiviti COX-2(siklo-oksigenase)promoter. Walau bagaimanapun, terdapat juga kemungkinan bahawa selang masa antara pengaktifan promoter dan pengumpulan substrat boleh diukur juga boleh menyumbang kepada percanggahan antara masa pengaktifan promoter COX-2 dan pemasaan COX maksimum{{1 }}(siklo-oksigenase)ungkapan mRNA.

HIF-1 ialah faktor transkripsi heterodimerik yang terdiri daripada -subunit yang bergantung kepada oksigen dan -subunit yang dinyatakan secara konstitutif. Di bawahhipoksia, HIF-l terkumpul dan memasuki nukleus, di mana ia menjana faktor transkripsi HIF-1 selepas dimerisasi dengan HIF-1 . HIF-1 kemudian mempromosikan ekspresi gen sasarannya dengan mengikathipoksia-elemen responsif (HRE) hadir dalam kawasan pengawalseliaan mereka dan seterusnya mengatur tindak balas penyesuaian selular untuk memerangihipoksia 3. Memandangkan ituhipoksiaboleh mengaktifkan COX-2(siklo-oksigenase)ungkapan dalam cara bergantung-1-HIF melalui HRE berfungsi yang terdapat dalam urutan promoter COX-22, kami telah mengkaji peranan HIF-l dalamhipoksia-peningkatan akibat COX-2(siklo-oksigenase)ungkapan. Kami juga melihat aktiviti binaan promoter COX-2 yang ditransfeksi dalam sel HK-2. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3e, pra-pengeraman dengan HIF-1perencat YC-1, yang tumpulhipoksia-peningkatan yang disebabkan dalam ekspresi HIF-la dan aktiviti konstruk wartawan HRE, mengakibatkan pencegahan peningkatan dalam kedua-dua ekspresi COX-2(siklo-oksigenase)dan aktiviti COX-2(siklo-oksigenase)binaan promoter di HK-2 tertakluk kepadahipoksia. Ringkasnya, keputusan ditunjukkan dalam Rajah,3a-e menyokong tanggapan bahawa HIF-1 -pendekatan naik transkripsi COX-2(siklo-oksigenase)bertanggungjawab ke atashipoksia-kenaikan peningkatan dalam iPGE2.

Walaupun akibat pengaktifan HIF-1a padahipoksia-apoptosis yang disebabkan adalah kontroversi (mungkin kerana ia mungkin bergantung kepada konteks), kami menganalisis (secara awal) peranan HIF-1a dalam sistem percubaan kami. Memandangkan kami sebelum ini telah menemui campur tangan dalam COX-2(siklo-oksigenase)/iPGE, laluan reseptor EP menghalang peningkatan dalam ekspresi HIF-la yang dicetuskan olehhipoksia8,56 kami bertanya sama ada perencatan HIF-la mengakibatkan pencegahanhipoksia-apoptosis sel HK-2 teraruh. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3f, pra-inkubasi dengan YC-1, perencat HIF-l, sebenarnya meningkathipoksia-apoptosis yang disebabkan. Oleh itu, tidak mungkin HlF-la

Perbincangan

Tisuhipoksiadianggap sangat relevan dalam patofisiologi kedua-dua penyakit buah pinggang kronik dan kecederaan buah pinggang akut, kerana PTC bahagian yang paling mudah terdedah kepada tubulus buah pinggang.hipoksia. Di sini kami mengkaji peranan PGE, dalam kerosakan yang ditimbulkan olehhipoksiakepada PTC manusia dan mendapati bahawa peningkatan pengeluaran iPGE berasal daripada pengawalseliaan tinggi COX yang bergantung kepada HIF-2(siklo-oksigenase)ekspresi gen dan peningkatan ekspresi mPGES-1, menyumbang kepadahipoksia-kematian sel apoptosis yang disebabkan dalam sel HK-2. Memandangkan hipoksia tiub ialah faktor yang berkaitan untuk penyakit buah pinggang akut dan kronik-2, keputusan ini menunjukkan PGT pengangkut prostaglandin sebagai sasaran terapeutik baharu dalam penyakit buah pinggang.

Hipoksiabukan sahaja meningkatkan iPGE tetapi juga pelepasannya ke medium ekstrasel8supaya yang dirembeskan (ekstra-selular)PGE, mungkin juga memainkan peranan dalamhipoksia-apoptosis yang disebabkan (contohnya, mencetuskan lata apoptosis melalui pengaktifan kanonik reseptor EP yang terletak pada membran sel). Dua kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa kematian sel di bawahhipoksiajuga disebabkan oleh COX-2(siklo-oksigenase)-pengeluaran bergantung PGE,1345. Sebaliknya, dalam jenis sel tertentu (fibroblas, mikroglia, neuron dan garisan sel leukemia limfoblastik akut), apoptosis yang disebabkan oleh PGE dimediasi oleh pengaktifan reseptor EP yang bergantung kepada PGE46-48. Kami telah mendapati di sini bahawahipoksia-apoptosis sel HK-2 teraruh telah dihalang oleh antagonisme reseptor EP juga (Gamb.2a, panel atas, kanan). Tetapi kerana reseptor EP telah digambarkan secara klasik sebagai reseptor membran plasma—supaya ia tidak boleh diakses untuk iPGE2-kami membuat spekulasi bahawa reseptor EP yang mengantara kesan apoptosis iPGE, dalam sel HK-2 hipoksik adalah subset terletak secara intraselular (iaitu reseptor iEP).

Berbeza dengan peranan iPGE2 dalamhipoksia-apoptosis teraruh dalam sel HK-2, kami mendapati bahawa hanya PGE ekstraselular yang menjadi pengantarahipoksia/reoxygenation-induced HK{1}} kematian sel kerana ia tidak dihalang oleh perencat PGT(Rajah 2f). Walaupun mekanisme patologi kecederaan selular selepashipoksia/reoxygenation tidak difahami sepenuhnya, diterima bahawa kematian sel sebahagian besarnya berlaku melalui penghasilan spesies oksigen reaktif berlebihan (ROS). Ini benar terutamanya untuk HK-2 sel49,50. Walau bagaimanapun, walaupunhipoksiajuga boleh meningkatkan pengeluaran ROS, sepanjang pengetahuan kami tiada bukti bahawa ROS memainkan peranan yang relevan dalamhipoksia-kematian sel HK-2 teraruh. Ini menunjukkan bahawa kesan maut hipoksia dan hipoksia/reoksigenasi dalam sel HK-2 dimediasi oleh mekanisme yang berbeza, yang mungkin menjelaskan sebab BG dan BS melindungi daripadahipoksiatetapi tidak menentanghipoksia/reoksigenasi. Akibatnya, perencatan PGT mungkin memberikan manfaat terapeutik dalam PTC terhadap kecederaan sel yang disebabkan oleh hipoksia tetapi tidak terhadap kesan merosakkanhipoksia/reoksigenasi.

HIF-1 -peraturan naik bergantung kepada COX-2(siklo-oksigenase)adalah peristiwa kritikal untukhipoksia-apoptosis sel HK-2 teraruh (Gamb.3e). Walau bagaimanapun, pemerhatian kami bahawa perencat HIF YC-1 meningkatkan kematian sel apoptosis (Rajah.3f) adalah membingungkan, walaupun laporan sebelum ini telah menunjukkan hasil yang serupa1. Satu penjelasan yang mungkin ialah senario hipotetikal di mana HIF-la bukan sahaja mengantara pengawalseliaan pro-apoptosis COX-2(siklo-oksigenase)tetapi juga pengawalseliaan molekul pelindung. Sesungguhnya, HIF-1-mengawal ekspresi molekul pelindung terhadaphipoksiaseperti RNA bukan pengekodan yang panjang DARS-AS1'dan mikroRNA-2103 telah ditemui secara khusus dalam sel HK-2. Walau bagaimanapun, walaupun cebisan bukti ini menyokong senario hipotetikal kami, eksperimen khusus harus dilakukan untuk mengesahkannya.

Penyiasatan tindak balas sel buah pinggang terhadaphipoksiaboleh meningkatkan pemahaman kita tentang patologi buah pinggang. Kami telah mengkaji, walaupun dalam cara awal, peranan peningkatan dalam nisbah ekspresi protein Bax pro-apoptosis kepada protein anti-apoptosis Bcl-2 dalamhipoksia-apoptosis teraruh dalam sel HK-2. Keputusan kami menunjukkan bahawa perencatan PGL tidak menghasilkan perubahan yang serasi dengan anjakan anti-apoptosis dalam keseimbangan antara ungkapan Bcl-2 dan Bax(Rajah.2e), yang tidak menyokong peranan protein ini dalam kematian sel HK-2 yang bergantung kepada iPGE di bawahhipoksia. Sepanjang pengetahuan kami, hanya terdapat dua kajian tentang implikasi paksi Bcl{{0}}/Bax dalam apoptosis akibat hipoksia dalam PTC dan kedua-duanya melibatkan anoksik" atau hampir anoksik O, kepekatan5 . Apabila PTC terdedah kepada 0.2 peratus O., ungkapan Bax kekal tidak berubah dan apoptosis dikaitkan dengan tahap ekspresi Bcl-2 yang menurun. Walau bagaimanapun, ungkapan Bcl-2 tidak terjejas oleh 1 peratus O, walaupun kehadiran apoptosis, yang bertepatan dengan keputusan kami. Oleh itu, mekanisme lain yang tidak semestinya melibatkan perubahan kuantitatif dalam Bcl-2 atau ungkapan Bax perlu dipertimbangkan: contohnya, induksi apoptosis dalam sel glioma berbudaya oleh iPGE2 hanya memerlukan perkaitan fizikalnya dengan Bax, yang mencetuskan pemindahan Bax kepada mitokondria202. Oleh itu, mekanisme yang melaluinya iPGE, menyumbang kepada apoptosis sel HK-2 patut dikaji lebih lanjut.

Kumpulan kami telah mendapati bahawa COX-2(siklo-oksigenase)-peningkatan bergantung pada iPGE, mengantara kematian apoptosis dalam sel HK-2 yang terdedah kepada cisplatin', badan apoptosis7" danhipoksia(hasil semasa kami). Oleh kerana PGE, dilepaskan dengan cepat ke luar sel selepas disvnthesize2, pengangkutan masuknya oleh PGlmemainkan peranan penting dalam iPGE, apoptosis yang disebabkan oleh HK-2 sel. Oleh itu, apabila kerosakan PTC itu dimediasi oleh iPGE, rawatan dengan perencat PGT mungkin merupakan pendekatan terapeutik yang berguna dengan aplikasi yang berpotensi seperti pencegahan kerosakan PTC yang disebabkan oleh cisplatin, perencatan pembiakan kecederaan tiub melalui badan apoptosis, atau pengehadan kesan merosakkanhipoksiapada PTC.