AbstrakWalaupun penuaan adalah faktor risiko terbesar bagi penyakit kronik manusia (kanser, diabetes, kardiovaskular, dan neurodegeneratif), beberapa intervensi diketahui selain sekatan kalori dan sebilangan kecil ubat (dengan kesan sampingan yang besar) yang secara langsung menangani penuaan. Oleh itu, terdapat keperluan mendesak untuk pilihan baharu yang secara amnya boleh melambatkan proses penuaan dan mencegah penyakit berkaitan usia. Penuaan selular adalah asas proses penuaan. Jangka hayat kronologi (CLS) yis Saccharomyces cerevisiae ialah sistem model yang mantap untuk menyiasat campur tangan penuaan selular selepas mitosis manusia. CLS ditakrifkan sebagai bilangan hari sel kekal berdaya maju dalam fasa pegun. Kami membangunkan kaedah kuantitatif baharu, murah dan pantas untuk mengukur CLS dalam kultur sel yang diinkubasi bersama pelbagai agen kimia dan kawalan pada 96-plat perigi. Protokol PICLS kami dengan (1) penggunaan propidium iodide untuk bacaan survival sel berasaskan pendarfluor dalam pembaca plat mikro dan (2) jumlah ukuran kiraan sel melalui penyerapan OD600nm dari plat yang sama memberikan kapasiti pemprosesan tinggi yang sebenar. Bergantung kepada logistik, sejumlah besar plat boleh diproses secara selari supaya penyaringan beribu-ribu sebatian dapat dilaksanakan dalam masa yang singkat. Kaedah ini telah disahkan dengan mengukur kesan rapamycin dan sekatan kalori pada yis CLS. Kami menggunakan pendekatan ini untuk pemeriksaan agen kimia. Kami menemui potensi antipenuaan/neuroprotektif 2,5-anhydro-D-mannitol (2,5-AM) dan mencadangkan penggunaannya secara individu atau digabungkan dengan campur tangan antipenuaan yang lain.

Glikosida cistanche juga boleh meningkatkan aktiviti SOD dalam tisu jantung dan hati, dan dengan ketara mengurangkan kandungan lipofuscin dan MDA dalam setiap tisu, dengan berkesan menghilangkan pelbagai radikal oksigen reaktif (OH-, H₂O₂, dll.) dan melindungi daripada kerosakan DNA yang disebabkan oleh OH-radikal. Glikosida phenylethanoid cistanche mempunyai keupayaan penghapusan radikal bebas yang kuat, keupayaan pengurangan yang lebih tinggi daripada vitamin C, meningkatkan aktiviti SOD dalam penggantungan sperma, mengurangkan kandungan MDA, dan mempunyai kesan perlindungan tertentu pada fungsi membran sperma. Polisakarida cistanche boleh meningkatkan aktiviti SOD dan GSH-Px dalam eritrosit dan tisu paru-paru tikus senescent eksperimen yang disebabkan oleh D-galaktosa, serta mengurangkan kandungan MDA dan kolagen dalam paru-paru dan plasma, dan meningkatkan kandungan elastin, mempunyai kesan penghapusan yang baik pada DPPH, memanjangkan masa hipoksia pada tikus senescent, meningkatkan aktiviti SOD dalam serum, dan melambatkan degenerasi fisiologi paru-paru dalam tikus senescent secara eksperimen Dengan degenerasi morfologi selular, eksperimen telah menunjukkan bahawa Cistanche mempunyai keupayaan antioksidan yang baik. dan berpotensi menjadi ubat untuk mencegah dan merawat penyakit penuaan kulit. Pada masa yang sama, echinacoside dalam Cistanche mempunyai keupayaan yang ketara untuk menghilangkan radikal bebas DPPH dan mempunyai keupayaan untuk mengais spesies oksigen reaktif dan menghalang degradasi kolagen yang disebabkan oleh radikal bebas, dan juga mempunyai kesan pembaikan yang baik pada kerosakan anion radikal bebas timin.

Klik untuk Lihat Produk Anti-penuaan

【Untuk maklumat lanjut: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Kata kunciSaccharomyces cerevisiae · Jangka hayat kronologi · Pemeriksaan kimia · Kompaun antipenuaan · 2,5-anhydro-D-manitol

pengenalan

The growing fraction of the elderly (>65 tahun) dalam kalangan jumlah penduduk (dari~ 10 peratus di seluruh dunia (melebihi 20 peratus di negara dunia pertama) pada 2020 kepada diekstrapolasi 16 peratus pada 2050), serta jangka hayat mereka yang meningkat (sehingga ~ 10 tahun sejak 1960 di negara dunia pertama ), menghadapi dunia dengan masalah yang semakin sukar [1, 2]. Selain secara amnya mengurangkan aktiviti kehidupan, penuaan kekal sebagai faktor risiko terbesar untuk perkembangan penyakit kronik yang, seterusnya, menjejaskan kehidupan manusia yang bebas dan akhirnya membawa kepada kematian [3-7]. Pendekatan perubatan semasa untuk mencegah patologi berkaitan usia adalah cadangan untuk gaya hidup sihat, termasuk senaman dan diet. Walau bagaimanapun, campur tangan ini sahaja tidak mencukupi untuk mencegah timbulnya penyakit berkaitan usia.

Penuaan dicirikan oleh kehilangan progresif integriti fisiologi, kecekapan dalam fungsi selular, dan isyarat metabolik [8]. Peningkatan usaha diarahkan untuk memahami proses penuaan selular yang mempengaruhi rangkaian interaksi gen dan protein yang sangat saling berkaitan dan berfungsi secara berlebihan [8, 9]. Walaupun kerumitan penuaan, penyelidikan baru-baru ini dalam sistem model yang berbeza, termasuk mamalia, telah menunjukkan bahawa penuaan tertunda dan peningkatan jangka masa kesihatan boleh dilaksanakan dengan campur tangan anti-penuaan seperti aplikasi pentadbiran ubat rapamycin dan sekatan kalori (glukosa) [10-15]. Oleh itu, memperluaskan himpunan sebatian anti-penuaan yang boleh digunakan sebagai terapeutik pelindung gero dan mengurangkan kesan sampingan yang tidak diingini adalah salah satu strategi yang menjanjikan yang boleh melambatkan penuaan dan memanjangkan tempoh kesihatan.

Penyelidikan terkini telah menunjukkan bahawa mekanisme molekul yang diperhatikan dalam penuaan manusia dipelihara dalam organisma yang berbeza, termasuk yis sel tunggal [8, 10, 16, 17]. Yis tunas Saccharomyces cerevisiae ialah salah satu organisma model yang paling banyak dikaji untuk mendedahkan proses biologi yang terlibat dalam penuaan selular. Faedah mengkaji penuaan dalam yis termasuk masa penjanaan yang singkat, jangka hayat yang boleh dikendalikan, dan kebolehpercayaannya terhadap ujian pemprosesan tinggi. Oleh itu, organisma ini menjadi alat yang berkuasa untuk mengenal pasti campur tangan anti-penuaan. Yis biasanya digunakan untuk mengkaji penuaan dalam dua cara yang berbeza: jangka hayat replikatif (RLS) dan jangka hayat kronologi (CLS) [18]. RLS mengukur bilangan kali sel individu membahagi, model penuaan untuk sel mitosis seperti sel stem. CLS mengukur tempoh masa sel tidak membahagi kekal berdaya maju dalam fasa pegun, model penuaan untuk sel selepas mitosis seperti neuron. Daya maju sel yis penuaan di bawah keadaan fasa pegun yang kekurangan nutrien berkurangan, dan akhirnya mati.

CLS secara tradisional diukur dengan menganggarkan bilangan unit pembentuk koloni (CFU) pada plat agar [18]. Sel yis dalam kelalang dengan jumlah media ( Lebih daripada atau sama dengan 20 ml) terdedah kepada sebatian kimia tunggal. Pada titik masa yang berbeza (cth, selepas 2, 5, dan 8 hari), alikuot kecil kultur penuaan kronologi daripada fask dicairkan secara bersiri, disalut pada plat agar nutrien, dan diinkubasi selama 2-3 hari untuk pembentukan dan pengiraan koloni. Pecahan kelangsungan hidup menentukan daripada CFU untuk setiap titik umur kronologi berbanding hari 1 (dianggap 100 peratus kemandirian sel). Pendekatan CFU adalah kuantitatif tetapi dikaitkan dengan banyak kelemahan. Ia memerlukan berbilang pencairan bersiri, langkah penyaduran, dan tempoh inkubasi untuk muncul koloni. Pengiraan koloni dilakukan sama ada dengan alat manual atau mahal. Selain itu, kaedah ini tidak sesuai dan terlalu mahal untuk penapisan pemprosesan tinggi (HTS) ribuan sebatian kerana ia memerlukan sejumlah besar ubat yang diuji, kultur kelalang volum besar dan banyak plat agar. Malangnya, kaedah CFU dan semua varian terkini untuk mengukur CLS sangat bergantung kepada keupayaan sel pasca-mitotik untuk memasuki semula fasa mitosis. Pada dasarnya, metodologi ini tidak dapat membezakan yis dalam penangkapan mitosis daripada sel mati.

Kemajuan teknikal semasa dalam kaedah yang diperolehi CFU mengukur kemandirian dan pertumbuhan sel berdasarkan pertumbuhan yis fasa pegun yang terdedah kepada ubat dalam kultur yang kaya dengan nutrien sama ada dalam medium cecair atau dengan ujian tompok pada plat agar [17, 19-21] . Selepas 24 jam, pertumbuhan sel tua dalam medium cecair diukur dengan penyerapan pada OD600nm, manakala dalam ujian tompok, hasil kultur tua berbintik ke medium agar dikenal pasti secara visual selepas 48 jam. Penambahbaikan logistik termasuk penggunaan 96-plat perigi yang membenarkan penyaringan terikan penghapusan kimia atau genom yang terhad. Untuk strain pemadaman yis teg terkumpul, sitometri aliran diperlukan untuk mengukur daya maju terikan individu [22].

Propidium iodide (PI) ialah pewarna pendarfluor yang hanya memasuki sel mati dan, dengan itu, merupakan penanda yang kuat untuk pengiraan langsung daya maju sel [23-25]. Sebelum ini, kajian menggunakan pendekatan berasaskan PI untuk mengukur CLS dan mengukur daya maju sel dengan menganalisis imej yang diperoleh oleh pembilang sel pendarfluor, transilluminator UV, atau sitometri aliran [26, 27]. Walau bagaimanapun, pemprosesan sampel berbilang, pengimejan dan keperluan perisian untuk analisis data adalah mahal dan memakan masa, yang menghalang kaedah ini dalam aplikasi pemprosesan tinggi sebenar. Pengenalan pewarna alternatif seperti hijau SYTOX mempunyai nilai terhad dalam tetapan pemprosesan tinggi kerana kos yang mahal [26].

Oleh itu, kaedah baru diperlukan untuk mengukur daya maju sel yang berumur untuk mengelakkan batasan yang berkaitan dengan metodologi sedia ada. Dalam kerja ini, kami menerangkan PICLS, kaedah pengukuran CLS berasaskan PI yang tidak bergantung kepada pertumbuhan. Pendekatan baharu kami bergantung pada mengeram sel yis dengan pelbagai sebatian ujian atau keadaan media ujian yang berbeza dalam 96-plat perigi. Kami menggunakan PI untuk mengukur kemandirian sel. Pembacaan yang pantas dan cekap (dalam masa~15 min) disediakan oleh pembaca plat mikro, peranti kos rendah yang sedia ada di kebanyakan makmal. Metodologi murah ini sangat sesuai untuk pemeriksaan berskala besar bagi agen kimia untuk mengenal pasti sebatian anti-penuaan kerana banyak sebatian, kawalan, atau pencairan yang berbeza boleh diletakkan dengan mudah pada satu plat dan sejumlah besar plat boleh diproses secara selari. Tambahan pula, kami mengesahkan kaedah kami dengan menentukan lanjutan CLS yis menggunakan campur tangan anti-penuaan yang diketahui seperti pentadbiran rapamycin dan sekatan kalori. Skrin pantas bahan kimia yang tersedia di makmal kami secara tidak dijangka mendedahkan 2,5-anhydro-D-manitol (2,5-AM) memanjangkan jangka hayat yis. Kami juga mengesahkan aktiviti antipenuaan 2,5-AM dengan kaedah tumbesaran tradisional. Analog gula lain yang diuji tidak memberikan kesan yang sama.

Keputusan

Pembangunan kaedah untuk mengukur daya maju sel menggunakan ukuran pendarfluor propidium iodide dalam pembaca plat mikro

Protokol baharu kami bermula dengan mendedahkan sel yis jenis liar atau mutannya yang diletakkan ke dalam media yang kaya dengan nutrien dalam 96-plat perigi bersama-sama dengan kepekatan khusus sebatian kimia yang menarik. Kami menggunakan PI sebagai penanda untuk kematian sel kerana pewarna pendarfluor ini hanya memasuki sel yang tidak hidup [23-25]. Daya maju sel dalam budaya fasa pegun dikira selepas beberapa hari yang ditentukan dengan membaca pendarfluor PI dalam pembaca plat mikro yang, seterusnya, menyediakan hamparan yang boleh dibaca secara elektronik untuk analisis data.

Sebagai pengesahan pertama, kami menunjukkan bahawa bekerja dengan jumlah kecil dalam telaga mikroplat memberikan hasil yang serupa dengan pendekatan berasaskan kuvet dan pembaca plat mikro cukup sensitif untuk menangkap data kemandirian sel. Oleh itu, kami menganalisis pewarnaan PI sel yis. Sel yis telah ditanam dalam kelalang kaca dan direbus selama 15 minit pada 100 darjah . Sel hidup dan mati telah dibasuh dan diinkubasi dalam 1×PBS (garam buffer fosfat) tanpa dan dengan PI (5 µg/ml) selama 15 minit. Selepas pengeraman, sel dibasuh dan digantung semula dalam PBS. Sel telah divisualisasikan oleh mikroskop dan keamatan pendarfluor diukur oleh pembaca plat mikro (Tambahan Rajah S1). Selepas pengesahan bahawa PI adalah penanda yang sesuai untuk kematian sel, analisis seterusnya dilakukan untuk membangunkan kaedah tersebut. Sel mati yang diwarnai PI telah digantung semula dalam PBS kepada 48 OD600nm terakhir yang diukur dalam kuvet menggunakan spektrofotometer. Seterusnya, sel telah dicairkan secara bersiri dalam PBS (OD600nm 48 hingga 0.05) dan dipindahkan ke 96-plat perigi hitam (costar 3603). Untuk ambil perhatian, plat mikro hitam adalah empat kali lebih mahal daripada plat jernih dan kurang mudah didapati, tetapi kami menggunakannya kerana ia lebih sesuai untuk bacaan pendarfluor disebabkan oleh pendarfluor yang melembapkan yang berasal daripada sampel dan permukaan plat mikro. Dengan sistem pengimejan GelDoc (Rajah 1A), kami menggambarkan tahap penggabungan pewarnaan PI dalam sel yis mati pada pelbagai pencairan. Menggunakan plat yang sama, kami mengukur keamatan pendarfluor PI dengan pembaca plat mikro pada pengujaan 535 nm dan pancaran 617 nm panjang gelombang. Kami mendapati korelasi linear yang tinggi antara keamatan pendarfluor PI dan penyerapan selular pada OD600nm (Rajah 1B). Keputusan ini menunjukkan bahawa varian kami kaedah berasaskan pendarfluor PI berkesan untuk mengukur daya maju sel.

As a next step, we determined the optimal range of cell density (quantified by OD600nm) so that cell density could be directly measured in 96-well   plates instead of in cuvettes. Using the black microplates with dead yeast cells from the previous experiment, we determined the correlation of  OD600nm measurements taken from the cuvettes and from the microplate directly. We found a high linear correlation between the two series of measurements in the OD600nm range of 0.05 to 12 of the cuvette (Fig.  1C). However, the trend is no longer maintained for higher OD600nm values>12 daripada kuvet (Gamb. 1D). Seterusnya, kami menentukan hubungan antara keamatan pendarfluor PI dan sel OD600nm bagi 96-plat telaga dalam julat OD600nm optimum 0.05–12. Kami melihat korelasi linear yang hampir sempurna (Rajah 1E). Oleh itu, protokol kami mewakili kaedah yang teguh untuk mengukur daya maju sel.

Kesan jenis plat mikro pada kuantifikasi daya maju sel menggunakan ukuran pendarfluor propidium iodide dalam pembaca plat mikro

Kesan rapamycin pada jangka hayat kronologi yis

Rapamycin adalah salah satu intervensi anti-penuaan yang terkenal yang ditunjukkan untuk memanjangkan jangka hayat beberapa organisma model, termasuk yis, nematod, lalat buah, dan tikus [10, 14, 15, 28-30]. Ia menghalang kompleks pengesan nutrien TORC1 (sasaran kompleks rapamycin 1). TORC1 ialah kompleks protein berbilang subunit yang dipelihara dalam sel eukariotik yang menggabungkan nutrien dalam persekitaran dengan pertumbuhan dan percambahan sel [19, 29, 31-34].

Kami telah mengkaji kesan rapamycin pada jangka hayat kronologi (CLS) strain yis untuk mengesahkan protokol kami yang baru dibangunkan. Di sini dan di bawah, kami menggunakan terikan yis prototropik (CEN.PK113- 7D) dalam eksperimen kami untuk mengelakkan kesan kuat auxotrophy asid amino pada kemandirian sel dalam kultur fasa pegun [35, 36]. Sel-sel telah berumur dengan kepekatan rapamycin yang berbeza dalam medium yang ditakrifkan sintetik (SD). Pertumbuhan sel diukur pada titik masa yang berbeza (24 jam, 48 jam, dan 72 jam). Kami mendapati bahawa pertumbuhan sel mencapai ketepuan kira-kira 24 jam selepas mengeram dengan rapamycin 5 nM atau kurang (Rajah 4A). Walau bagaimanapun, pemberian rapamycin 10 nM memperlahankan pertumbuhan sel, dan ketepuan dicapai hanya selepas 48 jam (Rajah 4A). Sebelum ini, trend yang sama diperhatikan untuk sel yang tumbuh dengan rapamycin dalam eksperimen CLS [37].

Sebagai langkah seterusnya, CLS sel yang tumbuh dalam kepekatan rapamycin yang berbeza diukur. Kami menentukan survival sel menggunakan pendarfluor PI pada titik masa umur kronologi yang berbeza. Titik masa pertumbuhan 72 jam dianggap sebagai hari 1. Kita boleh menyimpulkan daripada graf survival bahawa kepekatan penambahan rapamycin yang berbeza memanjangkan CLS yis (Rajah 4B). Kemandirian sel tua yang ditambah dengan rapamycin (5 nM dan 10 nM) pada hari ke-4 ialah~75 peratus ; walau bagaimanapun, tanpa rapamycin ialah~50 peratus . Pada hari ke-7, kemandirian sel-sel berumur yang ditambah dengan rapamycin adalah 70 peratus; walau bagaimanapun, tanpa rapamycin dikurangkan kepada kurang daripada 20 peratus . Lanjutan CLS sel tua juga boleh diperhatikan pada kepekatan yang lebih rendah (0.62-2.5 nM) rapamycin (Rajah 4B).

Kami telah mengesahkan protokol kami dengan membandingkannya secara langsung dengan dua pendekatan pertumbuhan tradisional yang mengukur CLS yis. Pertama, kami menjalankan ujian pertumbuhan dalam medium cecair untuk mengukur kesan rapamycin pada jangka hayat. Kemandirian sel penuaan kronologi dipantau pada titik umur yang berbeza dengan memindahkan kultur 3-µl ke dalam 200μL medium YPD dalam 96-plat perigi yang segar. Pertumbuhan keluar sepadan dengan bilangan sel yang berdaya maju dalam inokulum (Rajah 4C). Pertumbuhan sel tua yang didaftarkan melalui penyerapan OD600nm ditentukan menggunakan pembaca plat mikro. Pecahan kelangsungan hidup dikira daripada penyerapan OD600nm pertumbuhan untuk setiap titik umur berbanding hari 1 (dianggap 100 peratus kelangsungan hidup sel). Graf kemandirian ditunjukkan dalam Rajah 4D.

Begitu juga, kami menjalankan hasil dengan mengesan ujian pada medium agar. Kami melihat kultur penuaan 3-µl pada plat agar YPD dan mengeramkannya selama 48 jam. Pertumbuhan sel tua pada plat agar YPD divisualisasikan oleh sistem pengimejan GelDoc (Rajah 4E). Seperti yang dijangkakan, kita boleh melihat trend lanjutan jangka hayat oleh rapamycin di bawah kedua-dua cecair YPD dan ujian pertumbuhan agar yang selari dengan yang ditentukan dengan protokol baharu kami.

Keputusan ini menunjukkan bahawa protokol HTS kami menghasilkan semula bahawa rapamycin memanjangkan jangka hayat selular. Tambahan pula, kami menilai faktor Z untuk menilai kualiti kaedah ini [38]. Secara amnya, faktor-Z dalam julat 0.5–1.0 adalah menunjukkan ujian HTS yang sangat baik. Faktor Z ditentukan untuk kepekatan rapamycin yang berbeza dengan pendarfluor PI sel tua (Tambahan Rajah S2). Pembiayaan kami, faktor Z {{10}}.70 untuk rapamycin 5 nM dan 0.74 untuk rapamycin 10 nM meletakkan kaedah HTS ini ke dalam kategori berkualiti tinggi. Oleh itu, protokol kami cukup teguh untuk mengenal pasti potensi sebatian anti-penuaan.

Untuk meneroka sama ada kaedah itu berkesan dalam latar belakang genetik yis yang berbeza, kami menguji kesan rapamycin pada CLS strain BY4743. Strain Saccharomyces cerevisiae BY4743 adalah auxotrophic untuk histidine, leucine, dan uracil. Strain BY4743 telah ditanam dalam kepekatan rapamycin yang berbeza dalam medium SD ditambah dengan konstituen auxotrophic. Kemandirian sel tua dikira menggunakan pendarfluor PI (Tambahan Rajah S3). Kami mendapati bahawa rapamycin meningkatkan daya maju sel BY4743 secara kuantitatif dengan cara yang sama seperti CEN.PK113-7D. Oleh itu, keputusan ini mendedahkan bahawa kaedah kami berkesan dalam strain yis yang berbeza.

Kesan Glukosa pada jangka hayat kronologi Yis

Kami juga mengesahkan kaedah kami dengan mengkaji kesan sekatan kalori pada jangka hayat kronologi yis. Sekatan kalori adalah salah satu intervensi yang telah ditetapkan untuk melambatkan penuaan dan memanjangkan jangka hayat di seluruh organisma model, termasuk yis dan sel mamalia [11, 13, 16]. Untuk menentukan kesan sekatan kalori pada CLS yis, kami mengurangkan kandungan glukosa dalam medium kultur. Kami mengembangkan sel dalam tiga keadaan sederhana SD berbeza yang mengandungi 0.25 peratus , 0.5 peratus dan 2 peratus glukosa. Kami mengukur pertumbuhan sel pada titik masa yang berbeza (24 jam, 48 jam, dan 72 jam). Semua kultur mencapai ketepuan pertumbuhan selepas 24 jam (Rajah 5A). Pertumbuhan sel lebih rendah pada 0.25 peratus dan 0.5 peratus berbanding 2 peratus glukosa (Rajah 5A). Kami mengukur kemandirian penuaan kronologi untuk sel yang ditanam di bawah kepekatan glukosa yang berbeza menggunakan kaedah pendarfluor PI (Rajah 5B). Kami membuat kesimpulan daripada graf kelangsungan hidup bahawa sekatan glukosa memanjangkan CLS yis. Kami juga secara serentak mengesahkan pelanjutan CLS melalui ujian hasil (Rajah 5C, D, dan E), seterusnya mengesahkan kaedah baharu kami untuk menentukan CLS yis. Kesan sekatan glukosa pada sambungan CLS bagi strain BY4743 juga ditunjukkan oleh kaedah PICLS (Tambahan Rajah S3). Oleh itu, pendekatan kami untuk mengukur CLS yis mewakili kaedah baru, cepat dan kos rendah untuk menyaring agen kimia dan keadaan pengkulturan untuk mengenal pasti campur tangan anti-penuaan.

Menyaring agen kimia menggunakan kaedah yang baru dibangunkan mengenal pasti 2,5‑anhydrous‑D‑manitol sebagai sebatian anti-penuaan baru

Selepas membangunkan dan mengesahkan protokol baharu, kami menggunakan kaedah ini untuk menyaring beratus-ratus agen kimia untuk mengenal pasti sebatian anti-penuaan (Tambahan Rajah S4 dan Jadual Tambahan 1). Sebagai salah satu keputusan yang mengejutkan, kami menemui petunjuk untuk sebatian 2,5-anhydro-D-manitol (2,5-AM) untuk memanjangkan CLS yis. Dalam Rajah 6, kami membentangkan hasil eksperimen susulan terperinci untuk sebatian ini. Kami menguji aktiviti antipenuaan 2,5-AM pada kepekatan berbeza pada 96-plat perigi. Mula-mula, kami menentukan kesan 2,5-AM pada pertumbuhan sel. Sel yis telah diinkubasi dengan pelbagai kepekatan 2,5-AM dalam medium SD. Pertumbuhan sel diukur pada titik masa yang berbeza (24 jam, 48 jam, dan 72 jam). Kami mendapati bahawa pertumbuhan sel mencapai tahap tepu yang sama selepas 24 jam untuk semua kepekatan yang diuji 2,5-AM (Rajah 6A). Kemudian, kami mengukur kemandirian sel berumur secara kronologi ditambah dengan kepekatan 2,5-AM yang berbeza menggunakan kaedah pendarfluor PI. Seperti sebelum ini, budaya pertumbuhan 72 jam dianggap hari 1 untuk analisis CLS. Graf kelangsungan hidup diplot untuk titik masa umur kronologi yang berbeza (Rajah 6B). Kami mendapati bahawa 2,5-AM memanjangkan CLS dalam cara yang bergantung kepada kepekatan. Kemandirian sel tua ditambah dengan 2,5-AM (8 mM) pada hari ke-4 ialah ~ 80 peratus ; namun, tanpa 2,5- PG ialah ~ 50 peratus . Pada hari ke-7, kemandirian 2,5-sel umur tambahan AM ialah ~ 75 peratus ; namun, tanpa 2,5-AM dikurangkan kepada kurang daripada 20 peratus . Aktiviti antipenuaan 2,5-AM juga telah disahkan oleh ujian pertumbuhan (Rajah 6C, D dan E).

2,5-AM ialah molekul gula yang boleh memasuki laluan glikolisis. Ia terhidrolisis hanya pada langkah-langkah glikolitik huluan yang menyebabkan pengumpulan 2,5-AM-1,6-bifosfat (2,5-) yang tidak dimetabolismekan dalam sel [39–41 ]. Untuk menguji sama ada 2,5-AM pada kepekatan yang serupa dengan percubaan CLS telah diproses oleh enzim glikolisis, kami telah memeriksa sensitiviti yang semakin meningkat bagi ketegangan pemadaman gen SNF1. SNF1 ialah sensor tenaga selular dan kinase protein diaktifkan AMP (AMPK) yang sangat terpelihara dalam eukariota [42, 43]. Sel yis yang kekurangan aktiviti AMPK dikaitkan dengan fenotip pertumbuhan hipersensitif dengan kehadiran perantara glikolitik yang tidak dimetabolismekan [44]. Kami mengukur pertumbuhan terikan pemadaman snf1Δ dengan kepekatan berbeza 2,5-AM. Kami mendapati bahawa 2,5-AM menghalang pertumbuhan terikan pemadaman snf1Δ berbanding terikan jenis liar (Tambahan Rajah S5). Fenotip pertumbuhan yang diperhatikan ini menunjukkan bahawa 2,5-AM menjalani glikolisis dan dihidrolisiskan kepada perantaraan glikolitik yang tidak dimetabolismekan.

2,5-AM ialah analog fruktosa gugusan gula [39]. Untuk menjelaskan sama ada gula lain juga mempengaruhi CLS, kami mengkaji kesan fruktosa, manitol, dan maltosa pada penuaan yis. Kami juga memasukkan sorbitol yang merupakan gula tidak termetabolisme yang dilaporkan meningkatkan CLS sel yis dengan meningkatkan osmolariti medium kultur [20, 45]. Pertama, kami menguji kesan fruktosa, manitol, maltosa, dan sorbitol pada pertumbuhan sel. Sel yis telah diinkubasi dengan pelbagai kepekatan fruktosa, manitol, maltosa dan sorbitol serupa dengan 2,5-AM dalam medium SD. Seperti sel yang diinkubasi 2,5-AM, fruktosa, manitol, maltosa dan sorbitol mencapai ketepuan pertumbuhan selepas 24 jam (Rajah 7A). Seterusnya, kami mengukur kemandirian sel yang berumur secara kronologi pada hari 1, hari 7, hari 14 dan hari 21. Tidak seperti 2,5-AM, suplemen fruktosa, manitol, maltosa dan sorbitol tidak memanjangkan jangka hayat yis (Rajah 7B, C, D, E, dan Rajah Tambahan S6). Hebatnya, 2,5-AM memanjangkan jangka hayat walaupun pada peringkat akhir penuaan kronologi. Sel-sel berumur ditambah dengan 2,5-AM (8 mM) bertahan (~65 peratus ) pada hari ke-21. Walau bagaimanapun, kemandirian sel-sel berumur tanpa suplemen 2,5-AM adalah kurang daripada 10 peratus .

Amat mengejutkan kami, kami mendapati bahawa sorbitol pada kepekatan rendah yang diuji tidak dapat meningkatkan CLS (Rajah 7B, C, D, E, dan Rajah Tambahan S6). Kami membuat hipotesis bahawa kepekatan sorbitol yang lebih tinggi mungkin diperlukan untuk meningkatkan CLS. Kami menguji julat kepekatan yang lebih tinggi termasuk 1 M sorbitol, kepekatan yang dilaporkan sebelum ini menjejaskan CLS (18 peratus bersamaan dengan 1 M) [20, 45]. Selaras dengan laporan terdahulu, kami juga mendapati bahawa kepekatan sorbitol yang sangat tinggi (antara 0.5 dan 1 M) meningkatkan CLS yis (Tambahan Rajah S7), nampaknya dengan meningkatkan osmolariti medium. Menariknya, peningkatan CLS sebanyak 2,5-AM pada kepekatan yang sangat rendah (2 mM) menunjukkan mekanisme aktiviti antipenuaannya berbeza daripada yang osmotik. Keputusan ini menunjukkan bahawa aktiviti antipenuaan 2,5-AM adalah khusus untuk sebatian gula ini dan tidak diperhatikan untuk beberapa bahan kimia lain yang berstruktur serupa.

【Untuk maklumat lanjut: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】