Pengawal Selia Epigenetik BRD4 Terlibat dalam Tindak Balas Radang yang dicetuskan oleh Kadmium dalam Buah Pinggang Tikus

untuk maklumat lanjut:ali.ma@wecistanche.com

Zhongguo Gong et al

Cistanche tubulosa mencegah penyakit buah pinggang, klik di sini untuk mendapatkannyaproduk dan Cistanche DHT

ABSTRAK

Kadmium (Cd) telah digambarkan sebagai induksi keradangan yang berpotensi manakala bukti yang semakin meningkat menunjukkan bahawa keradangan yang tidak sesuai adalah faktor penyumbang kepadakecederaan buah pinggang. Oleh itu, penyelidikan mengenai tindak balas keradangan yang dicetuskan oleh Cd adalah sangat penting untuk menjelaskan mekanisme nefrotoksisiti yang disebabkan oleh Cd. Bromodomain yang mengandungi 4(BRD4) ialah pengawal selia epigenetik penting yang terlibat dalam pembangunan banyak penyakit radang, tetapi peranan pengawalseliaannya dalam tercetus Cd.radangmaklum balas masih perlu dijelaskan. Di sini, kami mendapati bahawa rawatan dengan Cd dalam tikus Sprague-Dawley (2 mg/kg BW, ip, 5 hari berturut-turut) dan dalam tikussel buah pinggangtalian (NRK{{0}}E, 0–10 μM, 12 h) mendorong transkripsi sitokin radang, yang boleh dikurangkan oleh JQ1 (perencat BRD4, 25 mg/kg BW, ip , 3 hari berturut-turut dalam vivo; 0.5 μM, 12 jam in vitro) atau RNA gangguan kecil BRD4 (siRNA, in vitro), menunjukkan bahawa BRD4 mengambil bahagian dalam tindak balas keradangan yang dicetuskan oleh Cd. Seterusnya, kajian kami menjelaskan peranan BRD4 dalam tindak balas keradangan yang dicetuskan oleh Cd. Perencatan BRD4 menurunkan translokasi dan pengaktifan nuklear NF-κB yang digalakkan Cd dalam vivo dan in vitro. Cd meningkatkan tahap asetilasi RelA K310 dan meningkatkan pengikatan BRD4 kepada asetilasi NF-κB RelA in vivo dan in vitro, yang telah dimansuhkan dengan menghalang BRD4. Ringkasnya, kajian kami mencadangkan bahawa BRD4 terlibat dalam transkripsi sitokin radang yang dicetuskan oleh Cd dengan mengantarkan pengaktifan laluan isyarat NF-κB dan meningkatkan dirinya mengikat kepada NF-κB RelA asetilasi dalam tikus.buah pinggang,oleh itu, BRD4 boleh menjadi sasaran terapeutik yang berpotensi untuk penyakit buah pinggang yang disebabkan oleh Cd.

Kata kunci: BRD4KadmiumKeradangan Buah Pinggangsitokin NF-κB JQ1

1. Pengenalan

Kadmium (Cd) ialah bahan pencemar logam berat dengan ketoksikan tinggi dan separuh hayat yang panjang. Dengan perkembangan pengeluaran perindustrian, peningkatan ancaman pencemaran Cd terhadap keselamatan alam sekitar dan kesihatan manusia telah menimbulkan kebimbangan (Wang et al., 2020; Horiguchi dan Oguma, 2016). Selepas ia diserap oleh badan, Cd mendorong kerosakan pelbagai organ danbuah pinggangmerupakan organ sasaran utama (Fernando et al., 2020; Zhao et al., 2021). Sebelum ini, kami secara sistematik mengesahkan bahawa perencatan autophagy, tekanan oksidatif, dan apoptosis secara sinergistik menyumbang kepada nefrotoksisiti yang disebabkan oleh Cd dalam tikus (Liu et al., 2017; Wang et al., 2017). Keradangan ialah tindak balas fisiologi yang bertindak sebagai tindak balas pertahanan terhadap jangkitan atau kecederaan, tetapi tindak balas keradangan yang tidak terkawal dan tidak sesuai yang disebabkan oleh Cd boleh menyebabkan kemudaratan seperti merosakkan tisu normal orang yang melihat dan menggalakkan penyakit autoimun (Hossein-Khannazer et al., 2020; Zhang et. al., 2020). Tindak balas keradangan yang dicetuskan oleh Cd memburukkan lagi penyakit kardiovaskular, dan kerosakan hati, menunjukkan bahawa keradangan mungkin memainkan peranan penting dalam pengantaraan Cd.buah pinggangproses patologi (Fagerberg et al., 2017; Almeer et al., 2019).

Epigenetik merujuk kepada pengubahsuaian yang diwarisi dalam ekspresi gen berdasarkan perubahan urutan bukan DNA, dan keterbalikan pengubahsuaian ini membolehkan penemuan sasaran terapeutik baru (Vendetti dan Rudin, 2013). Keluarga bromodomain dan domain terminal tambahan (BET) termasuk bromodomain yang mengandungi 2 (BRD2), BRD3, BRD4, dan bromodomain testis-specific (BRDT), yang dicirikan oleh dua bromodomain dan mengikat lisin asetilasi histon dan bukan histon ( Lochrin et al., 2014; Chatterjee dan Bohmann, 2018). Protein BET bertindak sebagai pengaktif bersama transkrip bagi banyak gen, dengan itu mengawal kitaran sel, tindak balas keradangan, tekanan oksidatif, dan proses fisiologi lain dalam pelbagai model patologi (Jiao et al., 2020; Wang et al., 2019b). BRD4 ialah ahli keluarga protein BET yang dikaji dengan baik, dan penyiasatan terkumpul telah melaporkannya sebagai sasaran epigenetik baru dalam mengawal selia pelbagaipenyakit buah pinggang, termasuk nefritis kronik, nefropati diabetik, dan kerosakan buah pinggang percubaan (Zeng dan Zhou, 2002; Morgado-Pascual et al., 2019). BRD4 telah disahkan untuk mengambil bahagian dalam proses transkripsi yang bergantung kepada faktor nuklear-κB (NF-κB) untuk mengawal tindak balas keradangan dalam banyak penyakit (Xu dan Vakoc, 2014; Suarez-Alvarez et al., 2017). BRD4 boleh direkrut oleh RelA asetilasi (subunit NF-κB, gen pengekodan protein) pada lisin 310 (RelA-K310ac) melalui bromodomainnya, dengan itu mengaktifkan kinase 9 (CDK9) yang bergantung kepada cyclin dan memfosforilasi RNA polimerase II untuk mempromosikan transkripsi gen sasaran NF-κB (Hajmirza et al., 2018). Kajian baru-baru ini mencadangkan bahawa perencat BRD4 boleh menjadi pilihan terapeutik yang berpotensi untuk penyakit radang. Dalam model kecederaan saraf tunjang tikus, perencatan BRD4 melemahkan tindak balas keradangan dan menggalakkan pemulihan fungsi mikroglia (Dey et al., 2019). Juga, perencatan BRD4 memansuhkan keradangan buah pinggang eksperimen dalam model murine halangan ureter unilateral, GN basal anti membran, dan penyerapan Angiotensin II (Suarez-Alvarez et al., 2017).

Memandangkan potensi kesan pro-radang Cd dan kesan pengawalseliaan BRD4 pada keradangan, kami membuat hipotesis bahawa BRD4 terlibat dalam tindak balas keradangan yang dicetuskan oleh Cd. Seperti yang dijangkakan, BRD4 mengantara proses transkripsi sitokin radang dalam model buah pinggang tikus terdedah Cd. Kajian kami mendedahkan mekanisme yang berpotensi dalam tindak balas keradangan yang dicetuskan oleh Cd dan memberikan pandangan baharu tentang terapi nefrotoksisiti yang disebabkan oleh Cd.

2. Bahan-bahan dan cara-cara

2.1. Bahan kimia dan antibodi

Kadmium klorida (CdCl2, anhydrous, 439800) telah dibeli daripada Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, USA). ( tambah )-JQ1 (HY-13030) diperoleh daripada MedChemExpress (Monmouth Junction, NJ, USA). Kit pengekstrakan protein nuklear telah dibeli dari Beyotime Institute of Biotechnology (Shanghai, China, P0027). Kit chemiluminescence yang cekap (ECL, 32209) dan reagen assay protein asid bicinchoninic (BCA, 23225) diperoleh daripada Thermo Fisher Scientific (Madison, WI, USA). Antibodi utama terhadap protein berikut telah digunakan: NF-κB p65 (10745-1- AP), IL-1 (26048-1-AP), TNF- (17590-1-AP) telah dibeli daripada Kumpulan Proteintech (Wuhan, China); -actin (3700 s), Histone H3 (His3, 4499), Sirtuin 1 (Sirt1, 8469), IgG arnab biasa (IgG, 4394) telah dibeli daripada Teknologi Isyarat Sel (Danvers, MA, Amerika Syarikat); BRD4 (ab128874), K (lisin) acetyltransferase 3 (KAT3B/Ep300, ab14984), NF-κB RelA (asetil K310) (RelA-K310ac, ab19870), Alexa Fluor® 488-konjugasi keldai anti-rabbited (3 anti-rabbit ab150) dari Abcam (Cambridge, UK). Antibodi kedua: IgG Anti-Tetikus Kambing (H tambah L) (115-035-003) dan IgG Anti-Arnab Kambing (H tambah L) (111-035-003) telah dibeli daripada Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, Amerika Syarikat ).

2.2. Haiwan dan eksperimen

Dua puluh empat tikus Sprague-Dawley (jantan, 6 minggu, 110–120 g) telah dibeli daripada Pengyue Experimental Animal Breeding Co., Ltd (Jinan, Shandong, China). Tikus-tikus itu dibenarkan akses percuma kepada makanan dan air di dalam bilik terkawal alam sekitar (24 ± 5 ​​darjah, 12 jam kitaran cahaya/gelap). Prosedur percubaan telah digunakan pada Arahan Majlis Komuniti Eropah 2010/63/EU untuk eksperimen haiwan, dan semua prosedur telah diluluskan oleh Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Universiti Yangzhou. Selepas satu minggu penyesuaian, tikus dibahagikan secara rawak kepada empat kumpulan: (1) Kumpulan kawalan: disuntik secara intraperitoneal dengan pelarut yang sepadan (salin fisiologi atau 2-hydroxypropyl- -larutan siklodekstrin). (2) Kumpulan Cd: CdCl2 (2 mg/kg berat badan, dilarutkan dalam garam fisiologi) disuntik secara intraperitoneal selama 5 hari berturut-turut untuk mewujudkan model mabuk Cd. (3) Kumpulan Cd tambah JQ1: CdCl2 (2 mg/kg berat badan) disuntik secara intraperitoneal selama 5 hari berturut-turut untuk mewujudkan model mabuk Cd, dan JQ1 (25 mg/kg berat badan, dilarutkan dalam 2-hidroksipropil{{ 25}} larutan siklodekstrin) disuntik secara intraperitoneal pada hari 6–8. (4) Kumpulan JQ1: JQ1 (25 mg/kg berat badan) disuntik secara intraperitoneal pada hari 6–8. Statistik kandungan Cd dalam serum tikus dan tisu buah pinggang disenaraikan dalam Jadual S1, mencerminkan kejayaan penubuhan model tikus terdedah Cd.

Selepas 8 hari rawatan, tikus dibunuh oleh dislokasi serviks di bawah bius dalam selepas 12 jam berpuasa. Tisu buah pinggang telah dibedah dan 1 g tisu setiap buah pinggang disimpan dengan cepat pada -80 ◦C untuk mengikuti analisis western blot dan PCR (qPCR) kuantitatif. Jumlah tisu yang selebihnya telah diperbaiki dengan cepat dalam 4 peratus paraformaldehid (PFA) untuk pewarnaan imunohistokimia (IHC).

2.3. Kultur dan rawatan sel

Talian sel buah pinggang tikus (NRK{{0}}}E) diperoleh daripada Akademi Sains Shanghai Cell Bank of China. NRK-52Sel E telah dikultur dengan medium Eagle's modified Dulbecco (DMEM, Gibco, 12800-017) yang mengandungi 5 peratus serum lembu janin (FBS, Gibco, 10437-028), penisilin dan streptomycin (1 00 U/mL) dalam keadaan lembap sebanyak 5 peratus CO2 dan 95 peratus udara pada 37 darjah . CdCl2 (ultrapur air-terlarut) dan JQ1 (dimetil sulfoksida terlarut) disimpan secara berasingan pada 4 darjah dan -20 darjah, dan dicairkan ke dalam larutan yang berfungsi sebelum digunakan. Reka bentuk eksperimen adalah seperti berikut: (1) Sel telah dirawat dengan 0, 2.5, 5, 10 μM Cd selama 12 jam, atau 5 μM Cd selama 0, 6, 12, 24 jam untuk melakukan ujian seterusnya. (2) Sel telah dirawat dengan 5 μM Cd dan / atau 0.5 μM JQ1 selama 12 jam untuk melakukan ujian seterusnya. (3) Sel telah ditransfeksi dengan siBRD4 dan/atau dirawat dengan 5 μM Cd selama 12 jam lagi untuk melakukan ujian seterusnya.

2.4. Transfeksi RNA yang mengganggu kecil

Kami memindahkan RNA gangguan kecil 20 nM BRD4 (siBRD4, Invitrogen, CA, USA) ke dalam sel NRK-52E oleh reagen transfeksi Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific, Cat# 13778150) selama 24 jam mengikut manual produk. SiRNA deria berikut digunakan:

siBRD4, dengan jujukan sasaran 5′-CCGTCAAGCTGAACCTCCCTGATTA-3′;

siCt (kawalan negatif siRNA), dengan jujukan sasaran 5′- UUCUCCGAACGUGUUCACGUTT-3′.

2.5. Western blotting

Sampel tisu buah pinggang dan sel NRK-52E telah dilisiskan dalam penimbal RIPA yang mengandungi perencat protease untuk mengekstrak jumlah protein. Protein nuklear telah disediakan daripada tisu dan sel segar terlebih dahulu dan disimpan pada −80 darjah. Sampel protein (20-30 ug setiap sampel) dipisahkan oleh elektroforesis SDS-PAGE, kemudian dipindahkan ke membran polivinilidena fluorida (Millipore, ISEQ00010). Membran telah disekat dengan susu skim 5 peratus selama 90 minit, dan diinkubasi 12 jam pada 4 darjah dengan antibodi utama berikut: -actin (1:5000), NF-κB p65 (1:1000), IL-1 ( 1:600), TNF- (1:600), BRD4 (1:1000), Ep300 (1:1000), Sirt1 (1:1000), His3 (1:1000), RelA-K310ac (1:1000). Kemudian membran dibasuh dengan TBST dan diinkubasi dengan antibodi sekunder yang sepadan (1: 10000) selama 90 minit pada suhu bilik (RT). Membran diinkubasi dengan electrochemiluminescence (ECL, ThermoFisher Scientific) dan ditentukan pada Chemidoc XRS (Bio-Rad, Marnes-La Coquette, Perancis), dan ketumpatan optik dianalisis menggunakan ImageJ (NIH, Bethesda, MD, Amerika Syarikat).

2.6. Pewarnaan imunofluoresensi (IF).

NRK{{0}}Sel E yang disemai dalam 24-plat telaga telah ditanam kepada kira-kira 60 peratus pertemuan. Sel-sel telah dirawat dengan 5 μM Cd dan/atau 0.5 μM JQ1 selama 12 jam, kemudian dibetulkan dengan PFA (4 peratus , 10 min), diperbolehkan dengan Triton X- 100 (0.1 peratus , 15 min), disekat dengan BSA (2 peratus , 90 min) di RT, dan diinkubasi dengan antibodi primer (NF-κB p65, pencairan 1:50) semalaman pada 4 darjah. Selepas dibasuh dengan PBS tiga kali, sel-sel telah diinkubasi dengan antibodi sekunder (pencairan 1: 500) selama 90 minit, dan dengan DAPI selama 5 minit di RT, kemudian sel-sel itu diperhatikan di bawah mikroskop confocal. Translokasi nuklear NF-κB dianalisis dalam tiga kajian bebas.

2.7. qPCR

Jumlah RNA tisu buah pinggang dan sel NRK-52E telah diekstrak dengan kit RNAiso Plus (Takara Bio, Shiga, Jepun). 1 ug daripada jumlah RNA telah digunakan untuk mensintesis cDNA rantaian pertama mengikut manual pengilang (Roche, Basel, Switzerland). 2 μL DNA pelengkap (cDNA) setiap telaga telah diambil untuk mengesan tahap mRNA relatif menggunakan Sistem PCR Masa Nyata LightCycler® 96 (Roche). Kira tahap mRNA relatif mengikut persamaan 2-△△CT. Primer disenaraikan dalam Jadual S2. -aktin ialah gen rujukan tikus.

2.8. Co-imunoprecipitation (Co-IP)

Tisu buah pinggang dan sel NRK-52E telah dilisiskan dalam penimbal lisis sel yang disediakan segar (20 mM HEPES–KOH pH 7.5, 150 mmol/L NaCl, 2 mmol/L EDTA, 1 peratus Triton X{{8} }) mengandungi PMSF. Manik Protein G (100 μL setiap sampel, Bio-Rad, Hercules, CA, Amerika Syarikat) dicampur dengan 2 ug BRD4, RelA-K310ac, atau antibodi IgG setiap sampel, dan diputar selama 10 minit di RT. Kemudian, jumlah lisat protein diinkubasi dengan kompleks manik-antibodi semalaman pada 4 darjah . Selepas dibasuh dengan penimbal lisis sel tiga kali, immunoprecipitates digantung semula dengan penimbal sampel 1 × SDS PAGE untuk mengkonfigurasi sampel. Protein sasaran dikesan menggunakan western blotting dengan antibodi utama anti-BRD4 dan anti-RelA K310ac.

2.9. Analisis statistik

Semua data diperoleh daripada sekurang-kurangnya tiga eksperimen bebas dan dinyatakan sebagai min ± SEM melainkan dinyatakan sebaliknya. Kumpulan eksperimen dibandingkan dengan ujian t Pelajar dua ekor yang tidak berpasangan atau analisis varians sehala (ANOVA) menggunakan SPSS 22.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Kepentingan telah ditetapkan pada p <>

3. Keputusan

3.1. Cd mendorong ekspresi sitokin radang dalam vivo dan in vitro

Sebagai bahan pencemar alam sekitar, Cd telah terbukti menyebabkan kerosakan buah pinggang dengan mengawal selia satu siri proses biologi (Wang et al., 2019c). Dalam kajian ini, perubahan dalam tahap transkripsi sitokin radang telah diperiksa selepas pendedahan Cd untuk menyiasat sama ada keradangan terlibat dalam nefrotoksisiti yang disebabkan oleh Cd. Data menunjukkan bahawa pendedahan Cd meningkatkan tahap protein interleukin (IL)-1 dan tumor necrosis factor (TNF)- dalam sel NRK-52E (Rajah 1A-B) dan tisu buah pinggang tikus dengan ketara (Rajah 1C) dengan ketara. -D). Sementara itu, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1E-F, pendedahan Cd meningkatkan tahap transkrip sitokin radang (IL-1 , IL-6, TNF- dan (Monocyte chemoattractant protein-1) MCP -1) dalam vivo dan in vitro. Penemuan ini menunjukkan bahawa Cd mendorong ekspresi sitokin radang dalam buah pinggang tikus.

3.2. BRD4 mengambil bahagian dalam proses transkripsi yang disebabkan oleh Cd sitokin radang

BRD4 ialah pengawal selia epigenetik yang baru diterangkan yang mengikat histon asetilasi atau bukan histon untuk mengawal proses keradangan dalam banyak penyakit. Di sini, perencat BRD4 JQ1 dan BRD4-siRNA telah digunakan untuk mengkaji peranan BRD4 pada tindak balas keradangan yang dicetuskan oleh Cd. Data menunjukkan bahawa paras protein IL-1 dan TNF yang dinaikkan Cd dikawal ke bawah oleh rawatan JQ1 in vivo dan in vitro (Rajah 2A–D) dan oleh BRD4 knockdown in vitro (Rajah S1A-B). Sementara itu, rawatan JQ1 dengan ketara menghalang tahap transkripsi Cd dipertingkatkan bagi IL-1 , IL-6, TNF- dan MCP-1 dalam sel NRK-52E (Rajah 2E) dan tisu buah pinggang tikus (Rajah 2F). Selain itu, knockdown BRD4 telah menurunkan tahap transkripsi Cd-peningkatan sitokin dalam sel NRK-52E dengan ketara (Rajah S1C). Secara kolektif, penemuan ini mencadangkan bahawa BRD4 adalah pengawal selia kritikal tindak balas keradangan yang dicetuskan oleh Cd dalam buah pinggang tikus.

3.3. Tahap ekspresi BRD4 kekal tidak berubah selepas pendedahan Cd

Seterusnya, perubahan dalam tahap ekspresi BRD4 dikesan selepas pendedahan Cd. Sel NRK-52E telah dirawat dengan Cd di bawah kecerunan kepekatan, dan tikus disuntik secara intraperitoneal dengan Cd selama 5 hari untuk menjelaskan kesan Cd pada ekspresi BRD4 dalam buah pinggang secara in vivo dan in vitro. Keputusan menunjukkan bahawa paras protein BRD4 tidak berubah dalam kedua-dua sel NRK-52E yang terdedah Cd (Rajah 3A-B) dan tisu buah pinggang tikus (Rajah 3C-D). Juga, tahap mRNA BRD4 tidak berubah selepas pendedahan Cd (Rajah 3E-F). Keputusan ini menunjukkan bahawa BRD4 mengantara tindak balas keradangan yang dicetuskan oleh Cd tidak bergantung pada perubahan dalam tahap ekspresi.

3.4. BRD4 mengawal pemindahan nuklear NF-κB yang digalakkan Cd

Peranan BRD4 dalam tindak balas keradangan yang dicetuskan oleh Cd telah diterokai dalam kajian kami. Pengubahan laluan isyarat NF-κB berkait rapat dengan transkripsi sitokin radang (Chi et al., 2021). Kajian kami mendapati bahawa BRD4 terlibat dalam translokasi nuklear terkawal Cd dan pengaktifan NF-κB. Pertama, penyetempatan subselular NF-κB ditentukan oleh pewarnaan IF dan pewarnaan IHC. Data dalam Rajah 4A dan D menunjukkan bahawa JQ1 menghalang translokasi nuklear NF-κB yang digalakkan Cd dalam sel NRK-52E dan tisu buah pinggang tikus. Sementara itu, keputusan western blot menunjukkan bahawa JQ1 menurunkan dengan ketara paras protein nuklear Cd-peningkatan NF-κB in vivo (Rajah 4B-C) dan in vitro (Rajah 4E-F). Begitu juga, ketukan BRD4 juga dengan ketara menghalang translokasi nuklear NF-κB yang digalakkan Cd (Rajah S2A) dan menurunkan tahap protein nuklear Cd-peningkatan NF-κB (Rajah S2B-C) dalam sel NRK-52E. Diambil bersama, perencatan BRD4 boleh mengurangkan translokasi nuklear NF-κB yang digalakkan Cd, menunjukkan bahawa BRD4 mengantara pengaktifan laluan isyarat NF-κB dalam buah pinggang selepas pendedahan Cd.

3.5. Cd meningkatkan tahap asetilasi RelA K310

Kajian telah mengesahkan bahawa BRD4 mengikat kepada RelA K310 asetilasi melalui domain brominnya untuk mengawal transkripsi yang bergantung kepada NF-κB (Morgado-Pascual et al., 2019; Zhong et al., 2018). Oleh itu, tahap asetilasi RelA K310 dan ungkapan dua enzim telah dikesan. Data menunjukkan bahawa tahap protein RelA-K310ac dan asetilase Ep300 telah menurun secara berterusan dengan peningkatan kepekatan Cd, manakala tahap protein deasetilase Sirt1 secara beransur-ansur meningkat dalam sel NRK-52E (Rajah 5A-B) dan tisu buah pinggang tikus (Rajah). 5C-D). Juga, tahap mRNA Ep300 dan Sirt1 menunjukkan arah aliran yang sama (Rajah 5E-F). Keputusan ini menunjukkan bahawa Cd menggalakkan tahap asetilasi RelA K310, oleh itu BRD4 mungkin terlibat dalam transkripsi sitokin radang yang dicetuskan oleh Cd dalam buah pinggang.

3.6. Cd meningkatkan pengikatan BRD4 kepada RelA-K310ac untuk meningkatkan fungsi transkripnya

Mengikat ke tapak asetilasi adalah asas untuk peraturan transkrip BRD4 (Huang et al., 2009). Untuk mengesahkan sama ada Cd mengawal fungsi BRD4 dengan meningkatkan pengikatan BRD4 kepada RelA-K310ac, interaksi antara RelA-K310ac dan BRD4 telah dikesan melalui Co-IP. Data dalam Rajah 6A menunjukkan bahawa Cd telah meningkatkan interaksi antara RelA-K310ac dan BRD4 dengan ketara dalam sel NRK{14}}E, yang telah dikurangkan dengan rawatan JQ1 atau BRD4 knockdown. Juga, trend yang sama diperhatikan dalam tisu buah pinggang tikus (Rajah 6B). Keputusan ini menunjukkan bahawa Cd meningkatkan pengikatan BRD4 kepada RelA-K310ac, yang menggalakkan transkripsi yang bergantung kepada NF-κB dan seterusnya menyumbang kepada tindak balas keradangan yang dicetuskan oleh Cd.

4. Perbincangan

Cd telah dilaporkan sebagai pencetus keradangan yang berpotensi kerana ketoksikannya yang tinggi, manakala mekanisme yang tepat masih belum difahami sepenuhnya (Arab-Nozari et al., 2020; Ghosh, 2018). Kajian kami mengesahkan bahawa Cd mendorong ekspresi sitokin radang dalam sel buah pinggang tikus, dan mendapati bahawa BRD4, sasaran epigenetik yang mempunyai fungsi kritikal dalam satu siri proses selular termasuk keradangan, menyumbang kepada tindak balas keradangan yang dicetuskan oleh Cd. Eksperimen lanjut menunjukkan bahawa BRD4 terlibat dalam pengaktifan laluan isyarat NF-κB yang digalakkan Cd. Selain itu, Cd meningkatkan tahap asetilasi RelA K310, dengan itu meningkatkan pengikatan BRD4 kepada NF-κB RelA asetilasi untuk mempromosikan transkripsi sitokin inflamasi yang bergantung kepada NF-κB.

Keradangan adalah salah satu mekanisme pertahanan semula jadi terhadap bahan kimia eksogen, manakala tindak balas keradangan yang tidak terkawal dan tidak sesuai boleh merosakkan tisu normal dan menyebabkan penyakit autoimun (Jian et al., 2018). Penanda biologi inflamasi yang meningkat Cd sering dikaitkan dengan pelbagai penyakit. Kajian telah menunjukkan bahawa keradangan yang disebabkan oleh Cd terlibat dalam atherogenesis (Tinkov et al., 2018). Selain itu, Cd menggalakkan ekspresi sitokin radang, yang menyumbang kepada kerosakan tisu paru-paru dan testis dan mendorong hepatotoksisiti (Koopsamy Naidoo et al., 2019; Arafa et al., 2014). Kesan berbahaya ini konsisten dengan keputusan kami, bahawa tindak balas keradangan terlibat dalam kecederaan buah pinggang yang disebabkan oleh Cd. Peningkatan penyelidikan telah memberi tumpuan kepada mekanisme kejadian keradangan yang disebabkan oleh Cd. Sebagai ahli keluarga protein BET yang dikaji dengan baik, BRD4 memainkan peranan penting dalam banyak proses biologi termasuk keradangan. Di sini, JQ1 (inhibitor BRD4) dan siRNA digunakan untuk menyahkawal selia aktiviti fungsional BRD4 dan mendapati bahawa perencatan BRD4 mengurangkan transkripsi sitokin radang yang disebabkan oleh Cd dalam buah pinggang tikus, menunjukkan bahawa BRD4 mengambil bahagian dalam tindak balas keradangan yang dicetuskan oleh Cd. . Secara amnya dipercayai bahawa disregulasi ekspresi BRD4 adalah peristiwa penting dalam kejadian tindak balas keradangan. Dalam kecederaan saraf tunjang, hipertrofi jantung patologi, dan penyakit berkaitan keradangan lain, ekspresi BRD4 yang tidak teratur menyumbang kepada ekspresi sitokin radang (Zhu et al., 2020; Marazzi et al., 2018; Ren et al., 2019). Walau bagaimanapun, Cd tidak mempunyai kesan ke atas tahap ekspresi BRD4 di bawah keadaan eksperimen semasa, yang membawa kami untuk mempertimbangkan sama ada BRD4 mengantara tindak balas keradangan yang dicetuskan oleh Cd melalui laluan lain.

NF-κB adalah faktor pengawalseliaan penting dalam proses keradangan dan bertanggungjawab untuk mengawal ekspresi banyak mediator keradangan (Lawrence, 2009). Kajian telah dilaporkan bahawa BRD4 terlibat dalam pengawalseliaan laluan isyarat NF-κB. Huang et al. (2017) mencadangkan bahawa BRD4 mengawal pengaktifan NF-κB yang dimediasi IKK melalui laluan p38 dan JNK-MAPK. Wang et al. (2019a) mendapati bahawa BRD4 knockdown atau rawatan JQ1 menyekat laluan isyarat NF-κB yang diaktifkan lipopolysaccharide (LPS) dalam mikroglia. Meng et al. (2014) menunjukkan bahawa rawatan JQ1 menyekat ekspresi sitokin radang dengan menghalang pengaktifan NF-κB dalam sel RAW 264.7 yang dirawat LPS. Laporan ini menunjukkan bahawa BRD4 mengantara pengaktifan NF-κB dalam banyak model keradangan sambil menghalang BRD4 adalah pendekatan terapeutik yang berkesan untuk anti-keradangan. Dalam kajian semasa, perencatan BRD4 menyekat translokasi nuklear NF-κB dalam tisu buah pinggang tikus terdedah Cd dan sel NRK-52E, menunjukkan bahawa BRD4 mengantara laluan isyarat NF-κB yang diaktifkan Cd.

Biasanya, selepas NF-κB diaktifkan oleh pelbagai rangsangan dan translokasi ke dalam nukleus, BRD4 mengikat kepada asetilasi NF-κB RelA di tapak K310, yang meningkatkan kestabilan dan aktiviti transkrip dalam nukleus (Hajmirza et al., 2018). Oleh itu tahap asetilasi RelA K310 mempengaruhi fungsi pengawalseliaan BRD4 pada tindak balas keradangan. Dalam neuron hippocampal, deacetylase Sirt1 mengantarkan deasetilasi RelA K310 untuk mengawal ekspresi BACE1, yang menyumbang kepada pengeluaran amiloid neuron (Flores-Leon et al., 2019). Dalam sel glioblastoma, tekanan terapi fotodinamik menurunkan deacetylase Sirt1 dan mengaktifkan asetilase Ep300, yang meningkatkan tahap RelA-K310ac dan membawa kepada peningkatan pengeluaran nitrik oksida pro-survival (Fahey et al., 2019). Kajian kami mendapati bahawa Cd menggalakkan tahap asetilasi RelA K310 dengan meningkatkan ekspresi Ep300 dan mengurangkan ungkapan Sirt1, menunjukkan bahawa Cd mempengaruhi fungsi pengawalseliaan BRD4 dengan meningkatkan tahap asetilasi RelA K310.

Terutama, keputusan kami menunjukkan bahawa rawatan JQ1 lebih berkesan daripada knockdown BRD4 dalam mengurangkan tindak balas keradangan yang dicetuskan oleh Cd. JQ1 mempunyai pertalian pengikatan yang tinggi dengan BRD4 dan hampir sepenuhnya boleh menyekat pengikatan BRD4 pada kromosom, manakala siBRD4 hanya boleh mengganggu ekspresi protein BRD4 untuk mengurangkan pengikatan BRD4 ke tapak sasaran, menunjukkan bahawa BRD4 mengantara tindak balas keradangan yang dicetuskan oleh Cd mungkin bergantung pada mengikat dengan asetilasi NF-κB RelA. Kajian terkini telah menunjukkan mekanisme pengawalseliaan yang serupa: selepas translokasi dan pengaktifan nuklear NF-κB, BRD4 kemudian berinteraksi dengan RelA asetilasi untuk mengaktifkan pengaktifan transkrip NF-κB (Huang et al., 2009). RelA-BRD4 telah direkrut untuk penganjur sasaran NF-κB dalam pelbagai keadaan rangsangan keradangan, manakala rawatan JQ1 bertindak dengan menghalang BRD4 mengikat kepada asetilasi NF-κB RelA, sekali gus mengurangkan aktiviti transkrip NF-κB (Zou et al., 2014). Keputusan kami menunjukkan bahawa perencatan BRD4 menyekat interaksi Cd yang dipertingkatkan antara BRD4 dan RelA-K310ac dalam buah pinggang tikus, menyokong keputusan kami di atas yang menghalang BRD4 menindas aktiviti transkrip yang disebabkan oleh Cd NF-κB, menunjukkan bahawa Cd meningkatkan pengikatan BRD4 kepada asetilasi. NF-κB RelA untuk meningkatkan transkripsi sitokin radang.

Ringkasnya, kajian kami mendedahkan mekanisme pengawalseliaan BRD4 dalam tindak balas keradangan yang dicetuskan oleh Cd dalam buah pinggang tikus: (1) BRD4 mengantara pemindahan dan pengaktifan nuklear NF-κB yang disebabkan oleh Cd. (2) Cd meningkatkan tahap asetilasi RelA K310 dan meningkatkan pengikatan BRD4 kepada NF-κB RelA asetilasi, yang menggalakkan transkripsi sitokin radang yang bergantung kepada NF-κB. Di samping itu, perencatan BRD4 dengan ketara mengurangkan tahap sitokin inflamasi yang meningkat Cd, menunjukkan bahawa BRD4 yang disasarkan berpotensi untuk dibangunkan sebagai cara yang berkesan untuk merawat penyakit radang termasuk nefritis yang disebabkan oleh Cd.

penyata sumbangan pengarang CRedit

Zhongguo Gong: Pengkonsepan, Metodologi, Visualisasi, Analisis formal, Pengesahan, Penyiasatan, Analisis formal, Kurasi data, Penulisan – draf asal. Gang Liu: Pengkonsepan, Metodologi, Visualisasi, Penyusunan data, Penulisan – draf asal, Pentadbiran projek, Pemerolehan pembiayaan. Wenjing Liu: Perisian, Sumber, Metodologi, Analisis formal. Hui Zou: Pentadbiran projek, Penyeliaan. Lagu Ruilong: Perisian, Analisis formal, Penyeliaan. Hongyan Zhao: Perisian, Analisis Formal, Penyeliaan. Yan Yuan: Penyeliaan. Jianhong Gu: Pengawasan. Jianchun Bian: Pemerolehan pembiayaan, Penyeliaan. Jiaqiao Zhu: Penulisan – semakan & penyuntingan, Penyeliaan. Zongping Liu: Penulisan – semakan & penyuntingan, Penyeliaan,

Pentadbiran projek, Pemerolehan pembiayaan, Pengkonsepan.

Pengisytiharan Kepentingan Bersaing

Penulis mengisytiharkan bahawa mereka tidak mempunyai kepentingan kewangan yang bersaing atau hubungan peribadi yang mungkin kelihatan mempengaruhi kerja yang dilaporkan dalam kertas kerja ini.

Pengakuan

Kerja ini disokong oleh Yayasan Sains Semula Jadi Kebangsaan China (No. 31872533, 31902329, 32072933), Program Penyelidikan dan Pembangunan Utama Negara China (No. 2016YFD0501208), dan projek Pembangunan Program Akademik Keutamaan Pendidikan Tinggi Jiangsu Institusi (PADP). Manuskrip telah diedit untuk bahasa Inggeris, tatabahasa, tanda baca, ejaan dan gaya keseluruhan yang betul oleh satu atau lebih editor berbahasa Inggeris asli yang berkelayakan tinggi di ELIXIGEN.

Rujukan

Almeer, RS, AlBasher, GI, Alarifi, S., Alkahtani, S., Ali, D., Abdel Moneim, AE, 2019. Jeli diraja melemahkan nefrotoksisiti akibat kadmium pada tikus jantan. Sci. Rep. 9 (1), 5825.

Arab-Nozari, M., Mohammadi, E., Shokrzadeh, M., Ahangar, N., Amiri, FT, Shaki, F., 2020. Pendedahan bersama kepada tahap bukan toksik kadmium dan fluorida mendorong hepatotoksisiti pada tikus melalui mencetuskan kerosakan oksidatif mitokondria, apoptosis, dan laluan NF-kB. alam sekitar. Sci. mencemarkan. Res. Int. 27 (19), 24048–24058.

Arafa, MH, Mohammad, NS, Atteia, HH, 2014. Serbuk biji Fenugreek mengurangkan kerosakan testis yang disebabkan oleh kadmium dan hepatotoksisiti pada tikus jantan. Exp. Toksik. Pathol. 66 (7), 293–300.

Chatterjee, N., Bohmann, D., 2018. BET-ting pada Nrf2: bagaimana isyarat Nrf2 boleh mempengaruhi aktiviti terapeutik perencat protein BET. Bioessay 40 (5), 1800007.

Chi, Q., Zhang, Q., Lu, Y., Zhang, Y., Xu, S., Li, S., 2021. Peranan selenoprotein S dalam pembentukan perangkap ekstraselular neutrofil bergantung spesies oksigen reaktif yang disebabkan oleh selenium- kekurangan arteritis. Biol Redoks. 44, 102003 Dey, A., Yang, W., Gegonne, A., Nishiyama, A., Pan, R., Yagi, R., Grinberg, A.,Finkelman, FD, Pfeifer, K., Zhu, J ., Singer, D., Zhu, J., Ozato, K., 2019. BRD4 mengarahkan pembangunan sel stem hematopoietik dan memodulasi tindak balas keradangan makrofaj. EMBO J. 38 (7)

Fagerberg, B., Lahir, Y., Barregard, L., Sallsten, G., Forsgard, N., Hedblad, B., Persson, M., Engstrm, G., 2017. Pendedahan kadmium dikaitkan dengan reseptor pengaktif plasminogen urokinase larut, penanda keradangan dan penyakit kardiovaskular masa depan yang beredar. alam sekitar. Res. 152, 185– 191.

Fahey, JM, Korytowski, W., Girotti, AW, 2019. Peristiwa isyarat huluan membawa kepada peningkatan pengeluaran nitrik oksida pro-survival dalam sel glioblastoma yang dicabar secara fotodinamik. Radic Percuma. biol. Med. 137, 37–45.

Fernando, TD, Jayawardena, BM, Mathota Arachchige, YLN, 2020. Variasi metabolit dan logam berat yang berbeza dalam Oryza sativa L., berkaitan dengan penyakit buah pinggang kronik etiologi yang tidak diketahui di Sri Lanka. Chemosphere 247, 125836.

Flores-Leon, M., Perez-Dominguez, M., Gonzalez-Barrios, R., Arias, C., 2019. Pengurangan NAD(tambah) akibat asid palmitik dikaitkan dengan pengurangan fungsi SIRT1 dan peningkatan ekspresi BACE1 dalam neuron hippocampal. Neurokim. Res. 44 (7), 1745– 1754.

Ghosh, KNI, 2018. Rawatan kadmium mendorong echinococcosis, kerosakan DNA, keradangan, dan apoptosis dalam tisu jantung tikus albino Wistar. alam sekitar. Toksik. Pharmacol. 59, 43–52. keradangan dan kanser. Bioperubatan 6 (1), 16.

Horiguchi, H., Oguma, E., 2016. Pendedahan akut kepada kadmium mendorong neutrofilia yang berpanjangan bersama-sama dengan induksi kelewatan faktor perangsang koloni granulosit dalam hati tikus. Gerbang. Toksik. 90 (12), 3005–3015.

Hossein-Khannazer, N., Azizi, G., Eslami, S., Alhassan Mohammed, H., Fayyaz, F.,Hosseinzadeh, R., Usman, AB, Kamali, AN, Mohammadi, H., Jadidi-Niaragh, F., Dehghanifard, E., Noorisepehr, M., 2020. Kesan pendedahan kadmium dalam induksi keradangan. Immunopharmacol. Immunotoxicol. 42 (1), 1–8.