Jam Circadian Mengawal Ungkapan Erythropoietin Berirama dalam Buah Pinggang Murine

Untuk maklumat lanjut:ali.ma@wecistanche.com

Lina K. Sciesielsk et al

Cistanche tubulosa mencegah penyakit buah pinggang, klik di sini untuk mendapatkannyaproduk dan Cistanches

Penjanaan irama sirkadian adalah autonomi sel dan bergantung pada gelung maklum balas transkripsi/terjemahan yang dikawal oleh keluarga pengaktif faktor transkripsi jam sirkadian termasuk CLOCK, BMAL1 dan penindas sepertiCRY1 dan CRY2. Matlamat kajian ini adalah untuk mengkaji kedua-dua mekanisme molekul dan implikasi hemopoietik ekspresi erythropoietin sirkadian. Tikus mutan dengan pemadaman homozigot gen jam sirkadian teras cryptochromes 1 dan 2 (Cry-null) telah digunakan untuk menjelaskan peraturan erythropoietin sirkadian. Tikus kawalan jenis liar menunjukkan perbezaan yang ketara dalambuah pinggangekspresi mRNA erythropoietin antara masa sirkadian 06 dan 18. Secara selari, bilangan sel penghasil erythropoietin yang jauh lebih tinggi dalambuah pinggang(byRNAscope ) dan paras protein erythropoietin beredar yang jauh lebih tinggi (oleh ELISA) dikesan masa sirkadian 18. Perubahan sedemikian telah dimansuhkan dalam Cry-null tikus dan bebas daripada ketegangan oksigen, ketepuan oksigen, atau ekspresi faktor 2alpha yang boleh disebabkan oleh hipoksia, yang menunjukkan bahawa ekspresi erythropoietin sirkadian dikawal secara transkripsi oleh CRY1 dan CRY2. Ujian gen wartawan menunjukkan bahawa heterodimer CLOCK/BMAL1 mengaktifkan unsur E-box dalam promoter erythropoietin 5'. Hibridisasi in situ RNAscope mengesahkan kehadiran Bmal1 dalam sel penghasil erythropoietinbuah pinggang. Dalam tikus Cry-null, bilangan retikulosit yang berkurangan dengan ketara didapati manakala nombor eritrosit dan hematokrit tidak berubah. Oleh itu, peraturan erythropoietin sirkadian dalam murine dewasa normoksikbuah pinggangdikawal secara transkripsi oleh pengaktif sirkadian indukCLOCK/BMAL1, dan penekan CRY1/CRY2. Penemuan ini mungkin mempunyai implikasi untukfisiologi buah pinggangdan penyakit, diagnostik makmal, dan terapi anemia.

KATA KUNCI:kronobiologi; irama sirkadian; jam; cryptochrome; erythropoietin; hematopoiesis; faktor yang boleh menyebabkan hipoksia

Pernyataan Translasi Jam molekul dalam hampir semua jenis sel memacu transkripsi gen dengan kerjasama faktor khusus tisu. Setakat ini, mekanisme ayunan sirkadian dalambuah pinggangtidak dikaitkan dengan biologi erythropoietin (Epo). Di sini, telah dijelaskan bahawa ungkapan Epo sirkadian dikawal oleh protein jam induk (cryptochromes 1 dan 2, Clock, dan Bmal1). Memandangkan EPO bertindak secara tersendiri dalam rangkaian pengawalseliaan kompleks erythropoiesis, penggunaan optimum Epo manusia rekombinan pada pesakit denganbuah pinggangkekurangan mungkin termasuk penggunaannya hanya sebelum maksimum sirkadian fisiologi sekitar tengah malam.

Irama sirkadian dalam nefrologi sebahagian besarnya belum diterokai tetapi sangat relevan kerana gangguannya oleh kerja syif, pilihan gaya hidup dan penuaan dikaitkan dengan peningkatan risiko pelbagai penyakit, termasuk gangguan kardiovaskular.^1–4Model haiwan jam sirkadian yang terganggu memberikan bukti pertama kesan negatif disregulasi sirkadian pada sistem hematopoietik (cth, dengan peningkatan bilangan eritrosit yang berumur).^5,6

Berkenaan dengan erythropoiesis, bukan sahaja kesan selular tetapi juga ritmik pengawal selia utamanya, erythropoietin (Epo), amat diminati kerana atlet telah berulang kali dituduh melakukan doping darah dengan Epo manusia rekombinan (yang) kerana perbezaan bergantung pada masa hari dalam kepekatan Epo yang beredar dan parameter hematologi.7,8 Variasi harian dalam paras Epo serum manusia (S-Epo) pertama kali diterangkan pada tahun 1981 pada pesakit dengan paru-paru kronik dan penyakit pernafasan pekerja arang,⁹dan seterusnya dalam mata pelajaran yang sihat.^10,11Sehingga kini, beberapa laporan menunjukkan paras S-Epo yang tinggi pada waktu malam (8 malam hingga 4 PG) dan paras S-Epo yang rendah pada awal pagi (4 PG hingga 8 PG). Fasa dan amplitud ayunan S-Epo, jika ada sama sekali, adalah berubah-ubah antara individu manusia.^9,10,12,13Secara purata, tahap S-Epo berubah kira-kira 1.5-kali ganda berbanding minimumnya.^14–22Irama diurnal ini terbukti tidak terjejas oleh penuaan,20 latihan,16, atau pendedahan ketinggian.17 Sebaliknya, ayunan diurnal S-Epo dimansuhkan pada pesakit dengan penyakit pulmonari obstruktif kronik yang rumit oleh hipoksemia siang hari, dalam myeloma dengan kegagalan buah pinggang , dan dalam myelodysplasia.^15,21,23

Pada tahun 2009, kami menerangkan ekspresi mRNA Epo sirkadian dalam buah pinggang murine dalam analisis berskala besar bagi penganjur gen terkawal jam tetapi tidak dapat mengenal pasti sama ada unsur genetik yang berbeza dalam gen EPO atau faktor transactivating yang bertanggungjawab untuk ayunan sirkadian. 24 Baru-baru ini, model tikus kejutan hemoragik mencadangkan, mengikut corak ekspresi selari, bahawa gen jam (Bmal1 dan Per2) terlibat dalam pengawalan rembesan EPO semasa hipoksia/iskemia.²⁵

Penjanaan irama sirkadian adalah autonomi sel dan bergantung pada gelung maklum balas transkripsi-terjemahan yang dikawal oleh keluarga faktor transkripsi jam sirkadian, termasuk CLOCK, BMAL1, PER1, PER2, CRY1 dan CRY2.26 CLOCK/BMAL1 heterodimer mengaktifkan transkripsi daripada gen jam sirkadian PER1/2 dan CRY1/2 melalui pengikatan kepada elemen kotak E dalam penganjurnya. Protein PER dan CRY, bagaimanapun, memberikan maklum balas negatif dengan menghalang aktiviti CLOCK/BMAL1, dengan itu mengurangkan ekspresi mereka sendiri. Keputusan bersih membawa kepada corak ayunan ekspresi gen sirkadian dan perubahan berirama dalam fisiologi selular dan organ.²⁷

Untuk memahami implikasi jam biologi, pelbagai jenis tikus mutan dengan faktor transkripsi jam teras tunggal yang terganggu atau ablated telah dikaji setakat ini.28,29 Di sini, kami mengambil kesempatan daripada Cry1–/–/Cry2–/– mutant berganda tikus (Cry-null), yang tidak mempunyai keupayaan untuk menyatakan irama sirkadian endogen.^26,30Data in vivo dan in vitro digabungkan menunjukkan bahawa Cry1/2 mengawal ekspresi Epo sirkadian melalui transkripsi CLOCK/BMAL1-dalam buah pinggang normoksik.

KAEDAH

Eksperimen haiwan

Homozigot Cry1–/– /Cry2–/– haiwan (Cry-null; jantan dan betina; berasaskan C57BL/6J)31 dan kawalan jenis liar (WT) dibiakkan (For-schungseinrichtungen für Experimentelle Medizin Charité) dan dibesarkan selama 5 hingga 7 bulan. Tikus WT berasal dari pembiakan koloni Cry-null.

Genotip Cry-null telah disahkan oleh tindak balas rantai polimerase (Jadual Tambahan S1). Untuk entrainment, tikus ditempatkan dalam kumpulan dan diberi makanan dan air secara ad libitum pada 12-jam:12-kitaran jam terang/gelap selama 14 hari. Pada hari ke-2 selepas dibebaskan ke dalam kegelapan yang berterusan, haiwan dikorbankan pada masa sirkadian (CT) 06 atau 18 (n ¼ 13-15 untuk setiap kumpulan dan titik masa). Tisu (hati dan buah pinggang) diperoleh dengan cepat dan dibekukan dalam cecair nitrogen. Subkumpulan haiwan WT dan Cry-null jantan dan betina dianalisis secara terperinci untuk berat badan dan hemogram pembezaan.

Untuk analisis gas darah, haiwan telah dibius (fentanyl, {{0}}.075 mg/kg, midazolam, 1.5 mg/kg, dan medetomidine, 0.75 mg/kg), tracheotomized, intubated dan ventilated (tidal). isipadu, 9 ml/kg; kadar pernafasan, 160 min- 1; tekanan hembusan akhir positif, 2 cm H2O), seperti yang diterangkan.32 Kateter polietilena dimasukkan melalui pembedahan ke dalam arteri karotid kiri. Selepas 5 minit penstabilan, percubaan telah ditamatkan melalui exsanguination pantas melalui kateter karotid, gas darah dianalisis (ABL-800; Radiometer; suhu dikawal) dan buah pinggang dikeluarkan untuk analisis post hoc.

Semua prosedur telah dibenarkan oleh Jawatankuasa Penjagaan Haiwan Tempatan (T0307/08; G0100/17 dengan tambahan dari Januari 2021) dan dilakukan mengikut garis panduan dan peraturan undang-undang perlindungan haiwan Jerman.

Penyediaan RNA dan analisis tindak balas rantai polimerase kuantitatif

Jumlah RNA telah diekstrak seperti yang diterangkan.33 Sebanyak 1000 ng jumlah RNA telah ditranskripsi terbalik dengan transkripase terbalik SuperScript III (Thermo Fisher; No. 18080085) dan heksamer rawak (Thermo Fisher; No. SO142), mengikut arahan pengilang. Tindak balas rantai polimerase kuantitatif dijalankan pada kitar StepOnePlus (Life Technologies) dengan primer span intron atau ujian TaqMan (Jadual Tambahan S2). Kuantifikasi mRNA mutlak dicapai dengan perbandingan dengan lengkung piawai daripada pencairan bersiri templat tindak balas rantai polimerase.

Pengesanan ekspresi mRNA Epo dalam teknik RNAscope buah pinggang

Ujian RNAscope dilakukan mengikut protokol pengeluar (ACD; nota teknikal 320536). Krioseksi melintang buah pinggang pertengahan 10-mm telah diwarnakan dengan probe C1 terhadap DapB(kawalan negatif; ACD; No. 310043) atau Epo (ACD; No. 315501). Langkah penghibridan menggunakan Amp 4-6 dan pengesanan isyarat merah telah ditinggalkan. Dua penyelidik bebas, buta mengira sel positif Epo pada 200 pembesaran asal, pada 3 hingga 8 haiwan cryosectionsper pada sistem pengimejan Axioplan 2 (Zeiss).

Imej kuantifikasi Epo wakil dan pewarnaan pendarfluor berganda telah dilakukan menggunakan Kit V2 Reagen Pendarfluor Multiplex RNAscope (ACD; No. 323110), mengikut protokol pengeluar. Bahagian para melintang buah pinggang pertengahan 1.5-mm telah diwarnakan dengan probe C1 terhadap Bmal1 (ACD; No.438741) dan probe C2 terhadap Epo (ACD; No. 315501-C2). Opaleye 520 (Akoya BioSciences; No. FP1487001KT) telah digunakan dengan probe C1, dan pewarna opal 650 (Akoya BioSciences; No. FP1496001KT) telah digunakan dengan probe C2. Pada - 400 pembesaran asal, sel Epo positif telah diimejkan untuk pengkolokalisasian Bmal1 pada sistem pengimejan Eclipse Ti2 (Nikon). 40,6-diamidino-2-phenylindole telah digunakan sebagai pewarna balas.

Kepekatan serum EPO

Sampel darah dibenarkan membeku selama 1 jam pada suhu bilik sebelum mengempar selama 20 minit pada 2000 - g. Serum dikeluarkan dan serta-merta dibekukan pada –80 C sehingga menjalankan ujian imunosorben berkaitan enzim untuk Epo (Quantikine; Sistem R&D; No. MEP006) dengan sampel yang tidak dicairkan. Serapan dibaca dengan Pembaca Penyerapan Plat Mikro iMARK (Bio-Rad) pada 450 nm, dengan pembetulan panjang gelombang pada 570 nm dan 4-lengkung piawai muat parameter, seperti yang diterangkan sebelum ini.³³

Kiraan sel darah

jumlah dan jumlah sel yang dibezakan daripada darah antikoagulasi EDTA diukur oleh Synlab. doktor haiwan Berlin dengan kaunter sel automatik ADVIA2120i(Siemens) untuk darah murine.

Ujian gen wartawan

Buah pinggang embrio manusia 293 sel (DSMZ; No. ACC305; nombor laluan 3–10; mycoplasma negatif) telah ditanam dalam medium Eagle's Modified Dulbecco/Ham F12 (Biochrom; No. FG4815) ditambah dengan 10 peratus serum lembu janin (Merck; No. F7524). Pemindahan sel telah dilakukan dalam 12-plat perigi yang mengandungi 1.67 - 105 sel/telaga. Setiap telaga telah ditransfeksi dengan 333 ng DNA plasmid (1 daripada 10 daripadanya adalah konstruk vanila) dan 1 ml reagen pemindahan Fugene 6 (Promega; No. E2691) seperti yang diterangkan.34 Semua konstruk yang digunakan disenaraikan dalam Jadual Tambahan S3. Sel-sel telah dilisiskan 48 jam selepas pemindahan dengan penimbal Lisis Pasif (Promega; No. E1941). Aktiviti Luciferase ditentukan dengan kit Beetle-Juice dan Renilla-Juice (kedua-dua pjk GmbH; Nos. 102511/102531, masing-masing), pada luminometer Lumat LB9501. Setiap percubaan dilakukan dalam pendua teknikal, dan nilai min digunakan untuk pengiraan.

Analisis statistik

In all animals, the circadian gene expression was analyzed; 2 animals were excluded as they showed outlier values (>1.5-lipat julat antara kuartil) dalam 4 daripada 6 gen yang dinyatakan sirkadian. Data dianalisis menggunakan IBM SPSS Statistics 27 dan dibentangkan sebagai titik individu dengan median atau sebagai bar dengan min dan SD. Ujian Mann-Whitney U atau Kruskal-Wallis dengan Bonferroni sebagai ujian post hoc telah dilakukan.

KEPUTUSAN

Ablasi ungkapan Epo sirkadian dalam tikus Cry-null

Untuk menjelaskan mekanisme molekul peraturan Epo sirkadian, kami menganalisis mRNA Epo dan ekspresi protein dalam tikus mutan WT dan Cry-null. Dalam buah pinggang WT, gen jam kanonik menunjukkan ekspresi bergantung pada masa hari, manakala ini telah dimansuhkan dalam tikus Cry-null, seperti yang dijangkakan (Tambahan Rajah S1). Kami sebelum ini melaporkan ayunan sirkadian ekspresi mRNA Epo selama 24 jam untuk buah pinggang murine WT dewasa.24 Dengan memfokuskan sekarang pada nilai minimum dan maksimum, kami melihat perbezaan ketara, w9-kali ganda antara CT06 (tempoh tidur tetikus; jangkaan minimum ) dan CT18 (fasa aktiviti; maksimum dijangka; Rajah 1a). Walau bagaimanapun, dalam buah pinggang tikus Cry-null, tiada perbezaan ketara dalam ekspresi mRNA Epo buah pinggang dikesan. Terutama, dalam tikus Cry-null, jumlah mutlak tahap transkrip Epo buah pinggang pada kedua-dua masa berada di antara paras mRNA WT Epo median pada CT06 dan CT18 (Rajah 1a). MRNA EPO dalam hati yang sepadan berada di bawah had pengesanan (data tidak ditunjukkan).

Perubahan harian dalam kepekatan serum Epo

Untuk menganggarkan terjemahan ekspresi mRNA Epo sirkadian ke dalam protein Epo yang beredar, kami menganalisis sampel serum dengan ujian imunosorben berkaitan enzim. Sampel darah diambil sebelum spesimen organ. Serum Epo meningkat w2.3- kali ganda antara CT06 dan CT18 dalam tikus WT, tetapi perbezaan ini telah dimansuhkan dalam tikus Cry-null (Rajah 1b). Terutamanya, kepekatan median S-Epo yang dipuratakan dari semasa ke semasa (CT06 dan CT18) adalah serupa dalam tikus WT dan Cry-null (22 mU/ml [julat, 3–59 mU/ml] berbanding 21 mU/ml [julat, 7 –50 mU/ml]).

Ekspresi Epo sirkadian berhubung dengan parameter gas darah arteri dan oksimetri nadi

Untuk menyiasat sama ada perubahan diurnal yang berpotensi dalam darah dan paras oksigen tisu boleh menyebabkan ayunan sirkadian ekspresi Epo, spesimen darah arteri diperoleh dan analisis gas darah dilakukan dalam bius, tracheotomized, dan tikus Cry-null dan WT yang dibius secara mekanikal dan di CT06 atau CT18, yang sepadan dengan paras mRNA Epo sirkadian terendah dan tertinggi, masing-masing (Rajah 1a). Kami tidak mengesan perbezaan yang ketara dalam pH arteri, tekanan separa CO2, atau tekanan separa O2 mahupun dalam lebihan asas standard atau kepekatan laktat (Rajah 2a-e) antara CT06 dan CT18 atau WT dan Cry-null tikus. Tahap ketepuan oksigen, diukur dengan oksimetri nadi, juga tidak menunjukkan sebarang perbezaan (Rajah 2f). Ekspresi gen faktor penyebab hipoksia (HIF) 2a pengawal selia induk EPO tidak berbeza antara CT06 dan CT18, sama ada dalam tikus WT atau Cry-null (Rajah 3). Oleh itu, dalam keadaan normoksik, peraturan Epo sirkadian tidak disebabkan oleh perubahan dalam ketegangan oksigen.

Suis hidup-mati sirkadian bagi ekspresi Epo dalam sel penghasil Epo buah pinggang

Untuk mengkaji sama ada ekspresi mRNA Epo sirkadian dimediasi dengan menghidupkan sel penghasil Epo buah pinggang tambahan (REPC) atau semata-mata dengan meningkatkan ekspresi Epo setiap sel, RNAscope in situ hibridisasi digunakan pada bahagian tengah melintang buah pinggang (contoh dalam Rajah Tambahan S2). Dalam tikus WT, bilangan REPC meningkat dengan ketara antara CT06 (median, 5; julat, 0–25) dan CT18 (median, 22; julat, 5–82; 4.{{ 11}}kali ganda; P ¼ 0.010). Sebaliknya, buah pinggang Cry-null memaparkan bilangan REPC yang sama pada CT06 (median, 18; julat, 2-33) dan CT18 (median, 15; julat, 4-87; tidak ketara; Rajah 1c). Kami menganggap bahawa tikus Cry-null mempamerkan sekatan pertumbuhan disebabkan oleh isyarat terjejas faktor pertumbuhan seperti insulin 1 (IGF1), yang mengakibatkan perbezaan yang terus meningkat dalam berat badan dan saiz organ antara Cry-null dan tikus WT.30 Seperti yang kami gunakan haiwan yang agak muda, berat buah pinggang mutlak tikus Cry-null hanya sedikit lebih rendah daripada tikus WT (-12 peratus dalam tikus Cry-null), tetapi nisbah berat buah pinggang-ke-badan relatif tidak berbeza (Tambahan Rajah S3) . Oleh itu, peningkatan sirkadian dalam ekspresi mRNA Epo nampaknya dikawal oleh suis REPC tambahan.

Pengaktifan promoter EPO minimum oleh CLOCK/BMAL1

Untuk mengenal pasti urutan pengawalseliaan yang bertanggungjawab untuk ekspresi Epo sirkadian (Rajah 4a), ujian gen reporter luciferase dilakukan dalam buah pinggang embrio manusia 293 sel. Barisan sel buah pinggang embrio manusia 293 dipilih bukan kerana asal buah pinggangnya tetapi kerana kekurangan jam sirkadian endogen. Oleh itu, kesan rangsangan CLOCK/BMAL1 boleh diuji dalam latar belakang CLOCK/BMAL1 yang rendah dan tidak berosilasi. Ekspresi berlebihan CLOCK/BMAL1 dengan ketara merangsang aktiviti penganjur EPO manusia minimum (Rajah 4b, I vs. II). Jika motif E-box (–36 hingga –31 bp berbanding tapak permulaan transkrip) bermutasi,35 kesan ini tumpul (Rajah 4b, III).

Untuk mengkaji sama ada peraturan sirkadian yang diperhatikan adalah bergantung kepada jenis sel, kami menyaring beberapa garisan sel yang mengekspresikan EPO untuk aktiviti jam endogen dengan memantau ayunan pengantara promoter Bmal1 seorang wartawan luciferase. Mereka yang mempunyai irama endogen termasuk sel HEP3B yang berasal dari hepatoma manusia, sel KELLY yang berasal dari neuroblastoma manusia dan sel buah pinggang tikus PDGFRbþ (dahulunya EPO mengekspresikan garis sel tetikus FAIK1-10).36,37 Antara 3 garisan sel, hanya Sel KELLY mempamerkan ayunan luciferase yang didorong oleh promoter EPO (Rajah Tambahan S4A). Walaupun sel PDGFRbþ mempamerkan irama sirkadian yang kuat bagi aktiviti promoter Bmal1, kami tidak mengesan ayunan pengantara promoter EPO, mencadangkan amplitud yang lebih rendah daripada konstruk wartawan yang didorong oleh promoter EPO (Rajah Tambahan S4B).

Kolokalisasi Bmal1 dan Epo dalam buah pinggang Cry-null berbanding tikus WT

Untuk menjelaskan lebih lanjut (i) peraturan sirkadian pengeluaran Epo buah pinggang dengan merekrut sel penghasil Epo buah pinggang dan (ii) kolokalisasi ekspresi Bmal1 dan Epo, kami melakukan hibridisasi RNAscope in situ. Epo dan Bmal1 dikolokalkan, dan mikroskopi pada pembesaran rendah mewakili perbezaan dalam pengambilan REPC (Rajah 5), seperti yang dikira dalam Rajah 1c.

Penemuan hematologi dalam kekurangan Cry1/Cry2 Untuk menilai (i) kesan hematopoietik kekurangan ekspresi Epo sirkadian dan (ii) kemungkinan keabnormalan hematologi lain pada tikus tanpa jam berfungsi, kiraan sel darah dianalisis. Perbezaan masa hari ekspresi mRNA Epo dan kepekatan S-Epo tidak dicerminkan oleh perbezaan ketara dalam kiraan retikulosit periferal pada CT06 berbanding CT18 dalam tikus WT. Kiraan retikulosit, bagaimanapun, jauh lebih rendah pada kedua-dua CT06 dan CT18 dalam haiwan Cry-null berbanding dengan tikus WT (Rajah 6a). Tiada perbezaan yang ketara dalam nombor eritrosit atau nilai hematokrit dalam WT berbanding tikus Cry-null. Kedua-dua parameter, bagaimanapun, tidak berbeza antara CT06 dan CT18 dalam kedua-dua strain (Rajah 6b dan c) dan tidak sepadan dengan nombor retikulosit periferal yang lebih rendah dalam tikus Cry-null (Rajah 6a). Untuk menguji sama ada kekurangan nutrisi (cth, besi dan folat) akibat isyarat IGF1 terjejas terlibat dalam percanggahan retikulosit berkurangan tetapi nombor eritrosit normal dalam Cry-null tikus, saiz dan bentuk sel darah merah telah dianalisis tetapi tidak menunjukkan sebarang perbezaan yang ketara antara Cry-null dan tikus WT (Tambahan Rajah S5).

Terutama, kiraan platelet median dalam tikus Cry-null cenderung lebih tinggi daripada tikus WT, tetapi bilangan platelet tidak berbeza dengan ketara antara CT06 dan CT18 dalam kedua-dua strain (Rajah 6d). Sebaliknya, kiraan sel darah putih (WBC) berbeza dengan ketara antara CT06 dan CT18 dalam WT tetapi tidak dalam tikus Cry-null. Nombor WBC median dalam tikus Cry-null adalah sama tinggi, seperti dalam tikus WT di CT06 (Rajah 6e).

PERBINCANGAN

Di sini, kami menunjukkan bahawa ekspresi Epo sirkadian dikawal pada tahap transkrip. Analisis kepekatan mRNA Epo dan S-Epo dalam tikus kekurangan Cry1 dan Cry2 aritmik mengalihkan carian kami untuk "jam Epo" kepada faktor transkripsi sasaran hiliran CLOCK dan BMAL1, yang ditindas oleh CRY1 dan CRY2.26 Ablasi petunjuk Cry1/Cry2 kepada kehilangan penindasan berirama CLOCK / BMAL1, mengakibatkan tahap transkrip Epo yang berterusan yang berada di antara tahap median pada CT06 dan CT18 dalam tikus WT (Rajah 1a). Hibridisasi in situ oleh RNAscope menunjukkan bahawa ayunan sirkadian dicapai dengan menghidupkan ekspresi mRNA Epo dalam sel interstisial (Rajah 1c), dan hibridisasi in situ oleh RNAscope juga mendedahkan ungkapan Bmal1 dalam REPC (Rajah 5).

Lebih penting lagi, paras S-Epo yang jauh lebih tinggi pada CT18 mengesahkan bahawa peraturan Epo transkripsi sirkadian diterjemahkan ke dalam ayunan sirkadian protein Epo yang beredar di bawah keadaan normoksik (Rajah 1b). Paras maksimum S-Epo sebenar dijangka lewat sedikit daripada CT18 kerana sintesis de novo protein EPO memerlukan w80 hingga 120 minit,38 dan masa sirkadian dipilih berdasarkan tahap mRNA Epo maksimum. 24 Kami mendapati bahawa peraturan Epo sirkadian mungkin dimediasi oleh pengaktifan transkrip motif E-box dalam promoter 5' EPO oleh CLOCK / BMAL1 (Rajah 4 dan Rajah Tambahan S4), yang konsisten dengan korelasi positif yang diterangkan antara protein BMAL1 dan Tahap S-Epo dalam model tikus pendarahan akut.²⁵

Terdapat bukti untuk peraturan dua arah antara CLOCK/BMAL1 dan laluan HIF melalui interaksi protein-protein langsung.^39,40Penyelarasan HIF2a, pengaktif utama penganjur EPO, 41,42 mengakibatkan tahap ekspresi gen jam yang diubah dalam sel hepatoma manusia.43 Tambahan pula, BMAL1 dimerisasi dengan protein HIF1a dan HIF2a,^44,45,dan kawalan jam sirkadian aktiviti HIF dikawal dengan cara khusus tisu.39 Pada tikus, terdedah kepada hipoksia akut (4 jam pada 6 peratus berbanding 21 peratus O2), mRNA EPO telah meningkat secara berlebihan tetapi tidak lagi menunjukkan perbezaan sirkadian .46 Oleh itu, keadaan normoksik mungkin paling sesuai untuk membedah mekanisme molekul peraturan Epo sirkadian. Dalam tikus, walau bagaimanapun, perubahan harian dalam darah dan paras oksigen tisu telah dilaporkan.39,47 Pada tikus, terdapat julat rendah perubahan harian berirama dalam pengoksigenan buah pinggang sebanyak zD3 peratus , dengan puncak dalam gelap (¼ aktiviti tikus) .47 Perbezaan sedemikian tidak dapat dikesan dalam eksperimen kami, di mana hanya tikus bius, trakeotomi, dan pengudaraan mekanikal boleh dikaji atas sebab pengawalseliaan haiwan. Walau bagaimanapun, analisis pH arteri, tekanan separa CO2, dan tekanan separa O2, lebihan asas standard atau laktat serta ketepuan oksigen tidak menunjukkan perbezaan utama antara tikus WT dan Cry-null pada kedua-dua CT (Rajah 2). Tambahan pula, tahap transkrip Hif2a dalam buah pinggang juga serupa dalam semua keadaan (Rajah 3). Oleh itu, dalam keadaan normoksik, peraturan Epo sirkadian nampaknya bebas daripada perubahan diurnal dalam ketegangan oksigen. Walau bagaimanapun, persoalan sejauh mana altitud tinggi atau hipoksia (pO2 rendah) mempengaruhi ayunan sirkadian pengeluaran Epo patut diberi perhatian selanjutnya. Tahap S-Epo manusia secara amnya lebih tinggi pada altitud tinggi, manakala fasa dan amplitud tidak berubah,17,22 dan dalam sukarelawan sihat yang terdedah kepada hipoksia normobarik, kepekatan S-Epo menunjukkan ayunan yang ketara.⁴⁸

Peraturan Circadian Epo mungkin paling relevan untuk nefrologi klinikal dan hematologi, tetapi juga mengenai diagnostik makmal, seperti ujian darah untuk doping dengan agen perangsang erythropoiesis. Untuk penilaian kepekatan Epo yang beredar dalam analisis doping, masa hari (masa luaran) pada pengumpulan darah dan kronotip orang (masa dalaman) perlu dipertimbangkan.49,50

Dalam erythropoiesis, unit pembentuk pecah-erythroid ialah sel khusus keturunan pertama, diikuti oleh unit pembentuk koloni- erythroid, yang menunjukkan ekspresi reseptor Epo yang banyak. Selepas 2 hari dalam kultur dengan Epo, unit pembentuk koloni murine–erythroid menghasilkan koloni erythroblast. Sebaik sahaja peringkat eritroblas ortokromatik dicapai selepas 7 hari, sel-sel menyemperit nukleusnya menjadi retikulosit yang tidak mempunyai ekspresi reseptor Epo.51 Memandangkan masa yang diperlukan untuk unit pembentuk koloni–eritroid matang menjadi retikulosit atau eritrosit matang sepenuhnya, ia mungkin tidak menghairankan bahawa tiada perbezaan diperhatikan antara CT06 dan CT18 dalam tikus WT (Rajah 6a-c). Terutama, bilangan retikulosit keseluruhan jauh lebih tinggi dalam WT berbanding tikus Cry-null (Rajah 6a), menunjukkan bahawa pembezaan ke dalam retikulosit terjejas dalam tikus Cry-null. Data sebelumnya menunjukkan bahawa sel progenitor erythroid awal juga mempamerkan corak sirkadian sintesis DNA. Pentadbiran in vivo rhEpo meningkatkan irama sirkadian nombor koloni erythroid.52 Bilangan retikulosit yang lebih rendah, walaupun kepekatan S-Epo keseluruhan yang agak tinggi dalam tikus Cry-null, boleh terhasil daripada pemansuhan sintesis DNA sirkadian pada tahap progenitor erythroid. Buruj S-Epo yang tinggi dan erythropoiesis yang dikurangkan telah diperhatikan pada tikus dengan ablasi genetik pengeluaran melatonin pineal (tikus C3H/HeN yang tidak mempunyai pemindahan N-acetyl transferase yang mengehadkan kadar),53 dengan alasan untuk aktiviti sirkadian intrinsik pada sel progenitor erythroid. tahap.

Terutamanya, tikus Cry-null menunjukkan pengurangan kira-kira 80 peratus dalam tahap IGF1, yang membawa kepada pengurangan isyarat IGF1 dan pengurangan 30 peratus berat badan dan saiz organ berbanding dengan WT, kesan yang memburukkan lagi sepanjang hayat.30 Walaupun haiwan digunakan dalam kita eksperimen adalah agak muda (umur median,^21–29 minggu), mereka menunjukkan kesan sederhana pada jumlah badan dan berat buah pinggang mutlak dalam tikus Cry-null, tetapi nisbah berat buah pinggang-ke-badan adalah normal (Tambahan Rajah S3). Fakta terakhir mungkin relevan untuk kapasiti sintesis protein Epo (Rajah 1b).

Walau bagaimanapun, analisis saiz atau bentuk sel darah merah (MCV, MCH, dan MCHC; Tambahan Rajah S5) tidak mencadangkan kekurangan nutrisi (contohnya, besi dan folat) sebagai penjelasan untuk percanggahan antara bilangan retikulosit yang berkurangan dan eritrosit normal dalam Cry- tikus null (Rajah 6a dan b). Terutamanya, isyarat Epo dan IGF1 menyegerakkan percambahan dan pembezaan sel semasa erythropoiesis melalui interaksi dengan GATA-1/rakan kompleks transkrip GATA-1.54 Dalam proses ini, Epo mengaktifkan laluan AKT selular dan dengan itu meningkatkan pertalian GATA-1, pengawal selia transkripsi utama erythropoiesis, kepada rakan kofaktornya GATA-1. Mekanisme ini dihalang, walau bagaimanapun, jika isyarat IGF1 dimansuhkan.54 Oleh itu, kesan positif Epo yang agak tinggi dalam tikus Cry-null pada pembezaan sel merah mungkin melebihi aktiviti IGF1 yang berkurangan dalam tikus Cry-null yang agak muda yang dikaji di sini.

Implikasi umum aritmia sirkadian lengkap pada hematopoiesis dijelaskan lebih lanjut oleh analisis kami terhadap nombor platelet dan WBC. Keputusan sebelumnya daripada tikus yang menyatakan bentuk Jam yang dominan-negatif (ClockD19/D19) menunjukkan bahawa gangguan ekspresi trombopoietin (pengatur utama megakaryopoiesis) dan Mpl reseptornya mengakibatkan peningkatan bilangan megakaryosit sumsum matang dan nombor platelet yang beredar. 55 Ayunan sirkadian ketara nombor platelet yang diterangkan dengan puncak pada masa zeitgeber (ZT) 20 dalam tikus WT serta nombor platelet yang lebih tinggi pada ZT08 dalam tikus ClockD19/D19,55 mengakibatkan kekurangan ayunan sirkadian nombor platelet, tidak dapat disahkan dalam model tetikus kami (Rajah 6d). Satu lagi penemuan penting ialah kehilangan perbezaan masa dalam hari WBC yang beredar dalam tikus Cry-null berbeza dengan tikus WT (Rajah 6e), yang konsisten dengan aktiviti CLOCK / BMAL1 yang dilaporkan pada pengeluaran WBC matang.^56,57

Untuk tafsiran data kami, perbezaan dalam aktiviti siang-malam pada tikus dan manusia perlu dipertimbangkan: Masa CT06 pada manusia kira-kira sepadan dengan tengah malam (fasa tidur), manakala CT18 kira-kira sepadan dengan tengah hari (fasa aktiviti). Perkara sebaliknya berlaku untuk tikus malam, tetapi kedua-dua organisma menunjukkan corak ekspresi Epo sirkadian yang sama (rendah pada CT/ZT06, tinggi pada CT/ZT18). Ini menunjukkan bahawa mekanisme tambahan (cth, faktor metabolik) boleh mengubah suai irama ekspresi Epo dalam kedua-dua organisma. Penyegerakan antara tahap puncak Epo dan ekspresi reseptor Epo dalam progenitor erythroid awal (unit pembentuk pecah–erythroid dan juga unit pembentuk koloni– sel erythroid)⁵² mencadangkan bahawa pesakit yang menerima rawatan rhEpo (cth, dalam anemia buah pinggang peringkat akhir atau gangguan hematologi) akan mendapat manfaat daripada meniru fisiologi sirkadian biasa dengan menggunakan hypo pada waktu malam. Gangguan hematopoietik belum dilaporkan pada manusia dengan mutasi kehilangan fungsi CRY1 (Warisan Mendelian Dalam Talian dalam Lelaki *601933) atau CRY2 (Warisan Mendelian Dalam Talian dalam Lelaki *603732). Laporan klinikal mengaitkan varian CRY1 terutamanya dengan gangguan kekurangan perhatian/hiperaktif, yang kerap disertai dengan insomnia, kebimbangan, kemurungan atau gangguan fasa tidur yang tertangguh.^58,59Ini patut disiasat lebih lanjut kerana penyakit sebegini boleh menjadi lebih teruk oleh anemia atau gangguan hematopoietik.

Kesimpulannya, kajian ini memberikan bukti pertama bahawa ekspresi Epo sirkadian dalam buah pinggang murine dewasa normoksik dikawal pada tahap transkrip oleh CLOCK/BMAL1-pengaktifan pengantara unsur E-kotak dalam promoter 5'EPO. Memandangkan EPO bertindak secara tersendiri dalam rangkaian pengawalseliaan kompleks erythropoiesis, penggunaan repo yang optimum pada pesakit dengan kekurangan buah pinggang mungkin termasuk penggunaannya hanya sebelum maksimum sirkadian fisiologinya pada waktu malam.