Kesan Faedah Verbascoside Daripada Herba Cistanche

Hubungi: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mel:audrey.hu@wecistanche.com

Verbascoside Melindungi Tikus Daripada Gangren Gas Clostridial dengan Menghalang Aktiviti Alpha Toxin dan Perfringolysin O

Gangren gas, disebabkan terutamanya oleh bakteria anaerobik Clostridium perfringens (C. perfringens), menyebabkan kematian dalam masa 48 jam dari permulaan. Strategi terapeutik terhad tersedia, dan ia dikaitkan dengan kematian yang sangat tinggi. Kedua-dua C. perfringens alpha-toxin (CPA) dan perfringolysin O (PFO) adalah faktor virulensi penting dalam perkembangan gangren gas, menunjukkan bahawa ia adalah sasaran terapeutik. Di sini, kami mendapatinyaverbascoside, a fenilpropanoid glikosidadiedarkan secara meluas dalam Ubat herba Cina Cistanche, berkesan boleh menghalang aktiviti biologi kedua-dua CPA dan PFO dalam ujian hemolitik.

Oligomerisasi PFO sangat dihalang oleh verbascoside. Walaupun tiada aktiviti antibakteria diperhatikan,verbascosiderawatan melindungi sel Caco-2 daripada kerosakan yang disebabkan oleh CPA dan PFO. Selain itu, tikus yang dijangkiti dirawat denganverbascosidemenunjukkan dengan ketaramengurangkan kerosakan, mengurangkan beban bakteria, dankematian menurun. Secara ringkasnya,verbascoside mempunyai kesan terapeutik yang berkesan terhadap virulensi C. perfringens kedua-dua in vitro dan in vivodengan menyasarkan CPA dan PFO secara serentak. Keputusan kami menyediakan strategi yang menjanjikan dan sebatian plumbum yang berpotensi untuk jangkitan C. perfringens, terutamanya gangren gas.

Kata kunci: alfa-toksin, anti-jangkitan, Clostridium perfringens, gangren gas, perfringolysin O, verbascoside

Clostridium perfringens (C. perfringens) ialah bakteria anaerobik gram positif yang tersebar secara meluas di alam semula jadi dan di dalam usus manusia (Fraser dan Collee, 1975). C. perfringens boleh merembeskan empat toksin utama ( , , ε, dan Ì) dan dengan itu dibahagikan kepada lima serotype, A–E (Titball, 2005). Pada manusia, C. perfringens boleh menyebabkan pelbagai penyakit, seperti keracunan makanan dan gas gangren, yang terakhir juga boleh berlaku pada haiwan, seperti kucing, lembu, anjing, biri-biri, kuda, dan kambing (Verherstraeten et al. , 2015). Tempoh inkubasi gangren gas adalah pendek, dan jangkitan boleh terbentuk dalam masa 6-8 jam (Uzal et al., 2015). Lebih serius, lebih daripada 50 peratus daripada mereka yang dijangkiti akan terus mengalami toksemia sistemik, akhirnya membawa kepada kematian; Oleh itu, tanpa pentadbiran rawatan yang tepat pada masanya dan berkesan, gangren gas boleh membawa kepada kerugian ekonomi yang serius (Low et al., 2018). Walau bagaimanapun, rawatan biasa, seperti rawatan antibiotik dan rawatan pembedahan untuk gangren gas, semuanya mempunyai kelemahan tertentu termasuk tetapi tidak terhad kepada rintangan antibiotik dan kecederaan amputasi kepada pesakit (Park et al., 2010; Osman dan Elhariri, 2013). Oleh itu, adalah perlu untuk mencari kaedah atau idea baru untuk rawatan gangren gas.

Gangren gas clostridial ialah penyakit berjangkit fulminan yang disebabkan terutamanya oleh interaksi toksin C. perfringens (CPA) dan perfringolysin O (PFO) (Hifumi et al., 2018). CPA, kepunyaan keluarga enzim zink-Metallo phospholipase bakteria, dihasilkan oleh semua C. perfringens, dikodkan oleh kromosom, merupakan toksin utama dalam C. perfringens, dan mempamerkan kedua-dua aktiviti fosfolipase C dan sphingomyelinase (van Bunderen et al. , 2010; Masataka et al., 2015). Pada tahun 1990-an, Awad et al. (1995) menggunakan mutan CPA untuk menguji model tikus gangren gas dan mendapati bahawa strain yang tidak mempunyai gen CPA menunjukkan penurunan patogenik dan kerosakan tisu yang kurang selepas jangkitan. Kerja ini mengesahkan bahawa CPA adalah toksin utama dalam gangren gas. Pada tahun 2000, Alberto menjalankan kajian mendalam dengan membina model molekul a-toksin dan mutan tiga gelung dalam domain terminal C, dan aktiviti hemolitik dan sitotoksisiti mutan telah menurun berbanding dengan jenis liar. Telah ditunjukkan bahawa aktiviti sphingomyelinase dan domain C-terminal diperlukan untuk myotoxicity in vivo (Alape-Giron et al., 2000). PFO, sitolisin yang bergantung kepada kolesterol (CDC), berinteraksi dengan membran sel sebagai monomer, dan kompleks yang disediakan kemudian dimasukkan ke dalam dwilapisan membran dengan oligomerisasi, akhirnya melisiskan sel perumah (Johnson dan Heuck, 2014). Walaupun PFO tidak diperlukan untuk kematian, ia boleh menyebabkan sitotoksisiti makrofaj pada peringkat awal myonecrosis dan penting untuk pembentukan trombus pada peringkat akhir jangkitan, menyumbang kepada patogenesis gangren gas (Verherstraeten et al., 2015). CPA boleh bergabung dengan PFO untuk merosakkan neutrofil yang terkumpul di tapak yang dijangkiti dan menyebabkan disfungsi sel endothelial, edema, dan iskemia, akhirnya membawa kepada hipoksia tisu dan menyediakan persekitaran anaerobik yang baik untuk pertumbuhan dan pembiakan C. perfringens (Bryant dan Stevens, 1996). ). Oleh itu, kajian ini mensasarkan CPA dan PFO dan bertujuan untuk mendedahkan kaedah baru untuk merawat gangren gas.

Dalam kajian ini, dua perencat toksin telah disaring daripada 17 sebatian semula jadi oleh hemolisis untuk mencari perencat potensi gangren gas. Data hemolitik untuk pelbagai sebatian ditunjukkan dalam Jadual 1. Antara 17 jenis sebatian semula jadi, verbascoside mempunyai kesan perencatan terbaik ke atas kedua-dua toksin, dan kami memilih verbascoside sebagai sebatian sasaran untuk kajian ini. Verbascoside diedarkan secara meluas dalam pelbagai herba ubat herba Cina seperti cistanche dan telah diasingkan dan diekstrak daripadaVerbascosideoleh seorang saintis Itali pada tahun 1963 (Speranza et al., 2010; Zhu et al., 2016). Kajian telah menunjukkan bahawaverbascoside mempunyai banyak kesan biologi dan farmakologi, sepertisifat anti-radang, antioksidan, antibakteria, antitumor, antikulat, dan kelat, danboleh digunakan dalam kosmetik kulitdanpersediaan topikal.Laporan lain menunjukkan bahawa verbascoside boleh diserap sepenuhnya dalam masa 1 jam dan mencapai kepekatan darah tinggi dan bioavailabiliti semasa penghantaran melalui pelbagai kaedah suntikan tidak melebihi 25 peratus (Dai et al., 2017; Feng et al., 2018). Berdasarkan aktiviti farmakologi yang disebutkan di atas, kajian ini mendapati dan mengkaji perencatankesan verbascosidepada gangren gas melalui satu siri eksperimen in vitro dan in vivo.

Verbascoside Menghalang Aktiviti Hemolitik PFO dan CPA

Beberapa flavonoid telah dilaporkan sebagai perencat yang berkesan terhadap toksin pembentuk liang (Li et al., 2013; Wang et al., 2017; Zhou et al., 2017). Di sini, verbascoside, fenilpropanoid, didapati menghalang aktiviti hemolitik kedua-dua toksin PFO dan CPA yang dirembes oleh C. perfringens. Apabila kepekatan verbascoside berjulat dari 2 hingga 32 |ig/mL, rawatan verbascoside dengan ketara menghalang aktiviti hemolitik toksin ini dalam cara yang bergantung kepada dos, menunjukkan bahawa verbascoside adalah perencat berkesan kedua-dua PFO dan CPA.

Verbascoside Tidak Menjejaskan Pertumbuhan C. perfringens

We further performed MIC and bacterial growth curve studies to determine the antibacterial activity of verbascoside against C. perfringens, revealing a MIC assay result (Figure 2A) >256 |ig/mL. Begitu juga, keputusan keluk pertumbuhan bakteria (Rajah 2B) menunjukkan bahawa verbascoside tidak menjejaskan pertumbuhan normal bakteria. Bersama-sama, keputusan kami menunjukkan bahawa rawatan verbascoside tidak mempunyai pengaruh ke atas daya maju C. perfringens pada kepekatan yang diperlukan untuk perencatan aktiviti PFO dan CPA.

Verbascoside Melindungi Sel Daripada Kerosakan Yang Disebabkan oleh PFO atau CPA

Clostridium perfringens alpha-toxin dan PFO dalam C. perfringens adalah toksin utama yang menyebabkan gangren gas; Oleh itu, sama ada verbascoside boleh melindungi sel daripada kedua-dua toksin ini juga diperiksa. Pertama, kami menjalankan ujian sitotoksisiti dengan verbascoside ubat, yang tidak merosakkan sel (Rajah 3A). Kemudian, sebatian ini ditambah kepada sistem kultur bersama sel dan PFO atau CPA. Verbascoside menghalang sitotoksisiti kedua-dua toksin inidalam sel Caco{{0}}. Berbanding dengan sampel yang tidak dirawat dengan verbascoside, kerosakan yang disebabkan oleh toksin pada sel Caco-2 yang dirawat dengan verbascoside pada 0.5 Jig/mL telah dikurangkan dengan ketara mengikut cara yang bergantung kepada dos. Khususnya untuk protein PFO, sel-sel telah dilindungi dengan berkesan pada kepekatan ubat sebanyak 0.25 ig/mL (P < 0.05).="" ujian="" daya="" maju/kematian="" sel="" berikutnya="" (rajah="" 3d-k)="" digunakan="" selanjutnya="" untuk="" membuktikan="" kesan="" perlindungan="" ini.="" seperti="" yang="" dijangkakan,="" rawatan="" verbascoside="" jelas="" dilindungi="" daripada="" kecederaan="" sel="" yang="" disebabkan="" oleh="" pfo="" atau="" cpa.="" diambil="" bersama,="" keputusan="" kami="" mendapati="" bahawa="" verbascoside="" dengan="" ketara="" menghalang="" kerosakan="" sel="" yang="" disebabkan="" oleh="" pfo="" atau="" cpa="" dalam="" cara="" yang="" bergantung="" kepada="">

Verbascoside Menghalang Aktiviti Hemolitik PFO dengan Mengurangkan Oligomerisasinya

Aktiviti hemolitik PFO mesti disertai dengan berlakunya oligomerisasi dan pembentukan liang (Johnson dan Heuck, 2014). Di sini, oligomerisasi PFO telah diinduksi oleh KCl dan darah arnab, dan oligomerisasi PFO dikesan (Rajah 4), mendedahkan keamatan jalur oligomerisasi yang menurun apabila kepekatan verbascoside meningkat. Bersama-sama, keputusan kami mencadangkan bahawa rawatan verbascoside menghalang oligomerisasi PFO dan dengan itu mengurangkan aktiviti hemolitik toksin ini.

Verbascoside Melindungi Tikus Daripada Jangkitan C. perfringens

Model otot kaki tikus gangren telah ditubuhkan untuk menentukan sama ada perlindungan yang diperhatikan secara in vitro juga boleh diperhatikan dalam vivo. Kaki tikus ATCC13124-yang dijangkiti adalah Sebaliknya, bilangan sel radang dalam kumpulan ubat telah berkurangan dengan ketara dan tisu itu utuh selepas rawatan dengan verbascoside. Di samping itu, bilangan bakteria yang dijajah dalam otot kaki berkurangan dengan ketara selepas rawatan dengan verbascoside. Seperti yang ditunjukkan dalam keputusan eksperimen, 93.33 peratus tikus yang dijangkiti mati selepas 32 jam selepas jangkitan. Seperti yang dijangkakan, kadar kemandirian tikus yang menerima verbascoside meningkat sebanyak 33.33 peratus , kerana hanya 60 peratus daripada tikus yang dijangkiti mati (P ​​= 0.015 melalui ujian peringkat log). Tambahan pula, rawatan verbascoside melambatkan puncak tempoh kematian hampir 8 jam (dari 32 jam untuk ATCC 13124-tikus yang dijangkiti kepada 40 jam untuk tikus yang dirawat verbascoside) dan dengan itu boleh memanjangkan masa berharga yang diperlukan untuk penyelamatan klinikal. Secara keseluruhan, keputusan kami menunjukkan bahawa pada tikus, verbascoside boleh memberikan perlindungan sistemik yang berkesan terhadap gangren gas yang disebabkan oleh C. perfringens.

Sebagai bakteria anaerobik gram-positif, C. perfringens diedarkan secara meluas dalam alam semula jadi dan boleh merembeskan pelbagai toksin, yang boleh membawa kepada pelbagai penyakit pada manusia dan haiwan, termasuk gangren gas (Fraser dan Collee, 1975; Verherstraeten et al ., 2015). Gangren gas disebabkan terutamanya oleh gabungan toksin a dan theta yang dirembeskan oleh C. perfringens, yang boleh menyebabkan kematian haiwan yang dijangkiti, mengakibatkan kerugian ekonomi yang besar. Walau bagaimanapun, sehingga kini, kaedah berkesan untuk merawat gangren gas termasuk oksigen hiperbarik, pembedahan, dan antibiotik. Antaranya, pembedahan boleh menyebabkan kerosakan fizikal yang besar kepada pesakit dan mempunyai kesan yang sangat menyusahkan kepada kehidupan selepas pembedahan. Banyak gen rintangan tetracycline telah ditemui dalam pencilan C. perfringens dari Sweden, Norway, Denmark, dan tempat lain. Oleh itu, strategi atau agen baru diperlukan untuk melawan jangkitan bakteria ini (Park et al., 2010; Osman dan Elhariri, 2013). Dalam kajian ini, verbascoside fenilpropanoid, yang berbeza daripada rawatan antibakteria tradisional (antibiotik), boleh menghalang aktiviti hemolitik kedua-dua CPA dan PFO, dua toksin pembentuk liang penting yang menyumbang secara kritikal kepada patogenik C. perfringens. Pada peringkat selular, verbascoside juga boleh melindungi sel Caco-2 secara berkesan daripada kedua-dua toksin ini pada kepekatan rendah (0.25-2 ig/mL). Khususnya, verbascoside boleh mengurangkan aktiviti toksin dengan menghalang oligomerisasi PFO. Keputusan ini boleh memberikan data asas yang mencukupi untuk penyelidikan in vivo.