Analisis Fitokimia, In-vitro Anti proliferatif, Anti-oksidan Bahagian 1

Sila hubungioscar.xiao@wecistanche.comuntuk maklumat lanjut

latar belakang:Rumex rothschildianus ialah ahli tunggal bahagian unik genus Rumex, dalam keluarga Polygonaceae. Spesies ini adalah tahunan dioecious kecil yang sangat jarang berlaku, endemik kepada Palestin yang secara tradisinya digunakan sebagai makanan dan untuk rawatan pelbagai penyakit. Oleh itu, penyiasatan semasa bertujuan untuk menyaring juzuk kimia, antioksidan, anti-a-amilase, anti-a-glukosidase, menjangka, dan kesan sitotoksik empat pecahan pelarut daun R. rothschildianus.

Kaedah:Serbuk kering daun R. rothschildianus diekstrak dalam empat pelarut dengan kekutuban yang berbeza. Beberapa ujian fitokimia kualitatif dan kuantitatif telah dilakukan untuk menentukan komponen ekstrak. Analisis kolorimetri digunakan untuk penentuan kuantitatif fenol, flavonoid, dan tanin. Ujian in-vitro dilakukan untuk menilai ekstrak untuk antioksidan, anti-a-amilase, anti-a-glukosidase, dan menjangka aktiviti perencatan, serta sitotoksisiti oleh ujian MTS terhadap saluran sel karsinoma serviks (HeLa) dan saluran sel kanser payudara (MCF7).

immunity2

Sila klik di sini untuk mengetahui lebih lanjut

Keputusan:Pecahan aseton daun R. rothschildianus menunjukkan yang paling ketaraantioksidanaktiviti, kerana mempunyai kandungan flavonoid dan fenolik yang paling tinggi, dengan nilai ICso 6.3±0.4 ug/ml, berbanding 3.1±0.9 ug/ml untuk Trolox dan berkenaan aktiviti perencatan lipase pecahan aseton menunjukkan aktiviti paling mujarab dengan nilai ICso 26.3±{{10}}.6 ug/ml, berbanding dengan kawalan positif orlistat ICso 12.3 ug/ml. Ekstrak yang sama ialah perencat a-amilase dan a-glukosidase yang paling kuat, dengan nilai ICso 19.1±0.7 ug/ml dan 54.9±0.3 ug/ml, masing-masing, berbanding kepada 28.8, 37.1±0.3 ug/dan acarbose, masing-masing. Pecahan heksana menunjukkan 99.9 peratus perencatan sel HeLa dan 97.4 peratus perencatan untuk sel MCF7.

Kesimpulan:Pecahan aseton daun R. rothschildianus mungkin menyediakan sumber sebatian bioaktif untuk rawatan tekanan oksidatif. Begitu juga, pecahan heksana menunjukkan potensi antitumor R. rothschildianus yang menjanjikan. Jelas sekali, petunjuk awal ini memerlukan penulenan lanjut bagi sebatian yang berpotensi aktif, dan akhirnya, kajian in-vivo untuk menentukan keberkesanannya.

Kata kunci:Rumex rothschildianus, Antioksidan, Lipase, Amilase, Trolox, Fitokimia, Aktiviti anti-proliferatif

Latar belakang

Tumbuhan telah digunakan sebagai terapi sejak zaman purba. Akar, biji, kulit kayu, daun, dan bunga semuanya telah digunakan untuk tujuan pemulihan. Pada masa kini, ubat-ubatan sintetik boleh didapati dan berkesan dalam rawatan pelbagai jenis penyakit; Walau bagaimanapun, sesetengah orang masih lebih suka ubat herba kerana ia dilihat sebagai kurang berbahaya kepada tubuh manusia [1,2]. Tumbuhan ubatan mengikut definisi sumber sebatian fitokimia yang mempunyai aktiviti terapeutik. Sifat-sifat ini bergantung pada kehadiran metabolit sekunder yang berbeza, seperti fenolik, terpenoid, dan alkaloid [3]. Rumex rothschildianus Aarons. adalah ahli tunggal bahagian unik genus Rumex, dalam keluarga Polygonaceae. Spesies ini adalah spesies dioecious kecil yang jarang ditemui, endemik di Palestin. Ia mempunyai ketinggian purata 45 cm dan dicirikan oleh batang tegak yang memegang daun petiolate radikal, yang pendek-hastate di pangkal dan pendek-acuminate di puncak. Bunga mempunyai diameter 3-4 mm, manakala bunga pistillate berdiameter kira-kira 2mm dengan lapisan bermembran coriaceous [4]. Rumex spp. tersebar luas di kawasan yang berbeza di Turki, dan diwakili oleh 22 spesies. Beberapa spesies yang paling biasa ialah R. patientia L, R. Crispus L, R. acetosa LR caucasicus rech, R. alpinus LR alpinus, dan R. caucasicus ialah tumbuhan saka yang tersebar di Anatolia tengah dan timur pada ketinggian {{10 }} m di atas paras laut. Genus Rumex telah digunakan secara meluas dalam perubatan tradisional di Turki untuk merawat gangguan, seperti sembelit, cirit-birit, dan ekzema [5, 6]. Genus ini juga mempunyai beberapa kesan julap, diuretik, antipiretik, penyembuhan luka, dan anti-radang. Ramai orang di bahagian timur Turki menggunakan daun muda Rumex spp. sebagai pengawet dalam keju, serta memberi aroma makanan [7].

immunity4

Pelbagai penyelidikan telah dijalankan ke atas spesies Rumex, seperti aktiviti antimikrob yang dilaporkan untuk sesetengah spesies. Beberapa fitokimia bioaktif sebelum ini telah ditemui dalam Rumex vicarious L, seperti karotenoid, tokoferol, polifenol, flavonoid, dan asid askorbik, yang mempunyai peranan sebagai antioksidan dan agen penyahtoksin semula jadi. Pengambilan diet fitokimia antioksidan, seperti karotenoid,fenolik, danflavonoidboleh melindungi daripada penyakit tidak berjangkit pada manusia, seperti kanser, gangguan kardiovaskular, dan masalah kesihatan lain yang berkaitan dengan tekanan oksidatif [5, 8]. Radikal bebas yang berbahaya diketahui memainkan peranan penting dalam banyak masalah kesihatan utama, seperti kanser, penyakit kardiovaskular, rheumatoid arthritis, katarak,Penyakit Alzheimer, dan penyakit degeneratif lain yang berkaitan dengan penuaan. Antioksidan adalah komponen berfaedah yang meneutralkan radikal bebas ini sebelum ia boleh menyerang sel, dan dengan itu ia menghalang kerosakan pada protein sel, lipid, dankarbohidrat. Pelbagai jenis antioksidan semulajadi dan sintetik telah dicadangkan untuk rawatan penyakit manusia. Minat sedemikian terhadap peranan antioksidan dalam kesihatan manusia telah mendorong penyelidikan dalam bidang sains makanan dan herba perubatan, menilai fungsi herba sebagai antioksidan. Tindakan antioksidan termasuk kapasiti penghapusan radikal bebas, perencatan peroksidasi lipid, keupayaan pengkelat ion logam dan juga mengurangkan kapasiti [9,10].

Kanser adalah salah satu masalah penjagaan kesihatan yang paling global. Perkembangan dan penemuan ubat antikanser novel kekal sangat penting kerana pelbagai faktor. Faktor-faktor ini termasuk rawatan yang boleh menyebabkan kesan sampingan yang besar atau mungkin agak mahal. Alternatif yang lebih selamat dari segi biologi dan lebih berpatutan masih sangat diingini [11-14].

immunity3

Beberapa spesies tumbuhan dianggap sebagai sumber molekul bioaktif yang berpotensi seperti atropin dari daun Belladonna, kokain dari daun koka, vincristine dari tumbuhan Vinca, dan banyak lagi yang masih memainkan peranan penting dalam perubatan moden [15,16].

Kesan terapeutik yang berguna boleh datang daripada mencampurkan produk sekunder yang terdapat dalam tumbuhan ubatan. Sebatian ini kebanyakannya adalah metabolit sekunder, seperti alkaloid, steroid, tanin, flavonoid, dan fenolik, yang disintesis dan disimpan di bahagian tertentu tumbuhan ini [17,18]. Kajian ini menyiasat aktiviti in-vitro anti-a-amilase, anti- -glukosidase, anti-lipase, anti-proliferatif dan antioksidan daripada pecahan berbeza yang diekstrak daripada daun R. rothschildianus.

Kaedah

Bahan tumbuhan, bahan kimia, dan instrumen

Daun R. rothschildianus dituai dari wilayah Barat Palestin, antara Februari dan Mac 2018. Ia dikenal pasti oleh Dr. Nidal Jaradat, dari Makmal Farmakognosi di Universiti Kebangsaan An-Najah, di bawah kod spesimen baucar Pharm-PCT{{3} }. Semua bahan kimia dibeli daripada Sigma-Aldrich. Spektrofotometer-UV/Visible(Jenway darjah 7135, Stafford-shire, UK), kertas penapis (Whitman No. 1, Washington, Amerika Syarikat), peranti shaker (Memmert 531-25-1, Stockholm, Sweden), radas rotavap (Heidolph -VV 2000, Schwa-bach, Jerman), pengisar (Pengisar Pengadun Aero Plus 500 W, I01, Wan Chai, China), imbangan elektronik (Radwag, AS 220/c/2, Torunska, Poland), pengering beku-BT85 (Millrock Technology, China) dan cryo-desiccator (Mill-rock technology, BT85, Kingston, USA) telah digunakan.

Penyediaan ekstrak dan pecahan

Serbuk kering daun R. rothschildianus diekstrak dengan menambahkan pelarut secara berurutan berdasarkan kekutubannya, bermula dengan pelarut non-polar heksana, dan kemudian aseton (pelarut organik aprotik polar), metanol (alkohol polar), dan akhirnya air suling(a). pelarut protik polar). Untuk setiap pengekstrakan, kira-kira 25g daun kering yang dikisar diletakkan di dalam 0.51 heksana selama 72j dalam peranti penggoncang pada 100 putaran seminit pada 25 darjah . Pertama, heksana digantikan dengan 0.5L aseton, dan kemudian penggantian melibatkan isipadu metanol dan air yang setara. Pengeraman dalam pelarut adalah seperti yang diterangkan di atas untuk heksana. Setiap pecahan organik ditapis dan ditumpukan di bawah vakum pada penyejat berputar, manakala pecahan akueus dikeringkan menggunakan pengering beku. Akhirnya, semua pecahan mentah disimpan pada 4 darjah [19,20].

Hasil setiap pecahan dikira menggunakan formula berikut:

Penilaian fitokimia awal

Ujian saringan fitokimia daun R. rothschildianus dalam empat pecahan telah dijalankan untuk mengenal pasti metabolit sekunder yang aktif. Keputusan kualitatif dinyatakan sebagai ( tambah ) untuk kehadiran dan (-) untuk ketiadaan fitokimia bioaktif [10,21].

Penentuan jumlah kandungan fenolik (TPC)

Prosedur untuk menentukan TPC adalah berdasarkan prosedur Cheung et al. TPC dinyatakan dalam miligram bersamaan asid gallik per gram berat kering daun (mg GA/g berat kering). Larutan natrium karbonat 7.5 peratus yang baru disediakan telah dibuat dengan meletakkan 7.5g Na2CO3 dalam kelalang volumetrik dan melaraskan isipadu kepada 100ml dengan air suling. Larutan rujukan piawai (larutan asid gallik) telah disediakan dengan melarutkan 100mg asid gallik dalam air suling kepada isipadu akhir 100ml. Daripada ini, pencairan bersiri telah dilakukan untuk mendapatkan larutan asid gallik pada 100,70,50,40, dan 10ug/ml）. Penyelesaian stok pecahan daripada daun disediakan dengan melarutkan 100mg ekstrak tumbuhan dalam air suling, dan diselaraskan kepada jumlah isipadu 100ml. Campuran tindak balas disediakan dengan mencampurkan 0.5 ml setiap larutan pecahan dengan 2.5 ml 10 peratus reagen Folin-Ciocalteu, yang dilarutkan dalam air dengan 2.5 ml natrium bikarbonat 7.5 peratus. Tiub sampel diinkubasi selama 45 minit pada suhu 45 darjah . Kemudian, penyerapan setiap satu diukur dalam spektrofotometer pada panjang gelombang 765 nm. Sampel kerja disediakan dalam tiga kali ganda untuk setiap percubaan analitik, dari mana nilai min dan sisihan piawai dikira [21].

Penentuan jumlah kandungan flavonoid (TFC)

TFC dalam empat pecahan daun R. rothschildianus dinilai menggunakan lengkung penentukuran rutin (sebatian rujukan standard). Keputusan dinyatakan sebagai miligram rutin bersamaan setiap gram berat kering ekstrak daun (mg RU/g berat kering). Keluk penentukuran untuk rutin telah diwujudkan menggunakan pencairan bersiri yang dihasilkan daripada larutan stok sebanyak 1{{10}}0 ug/ml. Untuk membuat larutan stok, 10 mg rutin dilarutkan dalam 10ml air suling dan kemudian dicairkan kepada 100ml. Selepas itu, larutan stok dicairkan untuk menyediakan rutin pada kepekatan 10, 30, 40,50,70, dan 100 ug/ml. Untuk penyediaan penyelesaian kerja, 0.5ml setiap larutan pecahan dicampur dengan 3 ml metanol, 0.2ml 10 peratus AlCl3,0.2ml 1M kalium asetat, dan 5ml air suling, dan kemudian diinkubasi pada suhu bilik selama 30 minit. Langkah sebelumnya telah diulang untuk setiap pecahan, selepas itu, penyerapan diukur pada panjang gelombang 415 nm. Untuk kawalan kosong, penyelesaian yang berfungsi telah disediakan dengan air suling sebagai ganti ekstrak sampel. Sampel disediakan dalam tiga kali ganda untuk setiap percubaan analitik, dari mana nilai min dan sisihan piawai dikira [22].

Improve immunity

Penentuan jumlah kandungan tannin (TTC) Protokol Sun et al. digunakan untuk menentukan TTC dalam empat pecahan daun R. rothschildianus, sebagai prosedur yang paling biasa digunakan. Catechin digunakan sebagai sebatian rujukan untuk membina lengkung penentukuran. Stok 100ug/ml dalam metanol telah disediakan, yang daripadanya siri pencairan dihasilkan untuk memberikan kepekatan katekin 10, 30, 50,70 dan 100 ug/ml. Larutan 4 peratus vanillin dalam metanol telah disediakan baru. Penyelesaian stok pecahan pada 100 ug/ml disediakan menggunakan metanol sebagai pelarut. Untuk penyelesaian kerja, 0.5ml setiap larutan pecahan dicampur dengan larutan vanillin 3ml dan 1.5ml HCl pekat. Campuran dibiarkan selama 15 minit, dan kemudian penyerapan pada 500 nm diukur, menggunakan penyelesaian kerja yang ditetapkan dengan metanol sebagai pengganti ekstrak sampel sebagai kosong. Semua sampel kerja dianalisis dalam tiga kali ganda, dari mana nilai min dan sisihan piawai dikira. Jumlah tannin dalam setiap pecahan dinyatakan dalam bentuk setara katekin (mg CAE/g berat kering daun)[23].

Kaedah aktiviti antioksidan

Ujian penghapusan radikal 2,2-diphenyl-picrylhydrazyl (DPPH) percuma telah digunakan untuk mengukur aktiviti antioksidan dalam pecahan berbeza daun R. rothschildianus. Larutan stok 1000ug/ml bagi setiap pecahan tumbuhan telah disediakan dalam metanol. Di samping itu, penyelesaian 1000 ug/ml Trolox juga disediakan (standard rujukan). Satu siri pencairan telah disediakan daripada larutan stok untuk setiap pecahan, memberikan enam pencairan bersiri pada 2, 5, 10,20, 50, dan 100 ug/ml. Satu ml setiap pencairan ekstrak dicampur dengan 1 ml 0.002 g/ml DPPH dalam metanol. Satu ml metanol telah ditambah untuk memberikan isipadu kerja akhir sebanyak 3 ml. Penyelesaian DPPH baru disediakan, kerana ia sangat sensitif kepada cahaya. Kawalan kosong bagi kepekatan siri ialah DPPH dalam metanol dalam nisbah 1:2, tanpa penambahan ekstrak. Semua larutan yang berfungsi diinkubasi pada suhu bilik (25 darjah) dalam gelap selama kira-kira 30 minit. Ketumpatan optik kemudiannya diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 517 nm. Persamaan berikut digunakan untuk mengira peratus perencatan DPPH bagi setiap pecahan tumbuhan, dengan Trolox sebagai sebatian piawai:

di mana, Ag ialah penyerapan direkodkan bagi larutan kosong, dan Ats ialah penyerapan direkodkan bagi larutan sampel yang diuji [21].

Ujian perencatan lipase pankreas babi

Penyelesaian stok sebanyak 500 ug/ml dibuat daripada setiap pecahan tumbuhan dalam 10 peratus DMSO. Daripada ini, satu siri pencairan lima kepekatan 50,100,200, 300, dan 400 ug/ml telah dibuat. Larutan stok 1 mg/ml lipase pankreas babi dalam penimbal Tris-HCl telah disediakan baru sebelum digunakan. Substrat, p-nitrophenyl butyrate (PNPB) telah disediakan dengan melarutkan 20.9mg dalam 2ml asetonitril. Bagi setiap larutan yang berfungsi, 0.1ml lipase pankreas babi dicampur dengan 0.2ml pecahan tumbuhan daripada setiap ahli siri pencairan. Tris-HCl telah ditambah untuk menjadikan isipadu akhir penyelesaian kerja 1ml, dan mereka diinkubasi pada 37 darjah C selama 15 minit. Selepas pengeraman, 0.1 ml larutan p-nitrophenyl butyrate telah ditambah ke dalam setiap tabung uji. Campuran kemudiannya diinkubasi selama 30 minit lagi pada suhu 37 darjah. Aktiviti lipase pankreas ditentukan dengan mengukur hidrolisis PNPB menjadi p-nitrophenolate pada 410 nm, menggunakan spektrofotometer UV. Prosedur yang sama diulang menggunakan orlistat sebagai sebatian rujukan standard. Peratusan perencatan lipase oleh pecahan tumbuhan dikira dengan persamaan berikut:

di mana, Ap ialah penyerapan direkodkan bagi larutan kosong, dan Ats ialah penyerapan direkodkan bagi larutan sampel yang diuji [24]. Ujian perencatan a-Amilase

A100 mg setiap pecahan telah dibubarkan dalam beberapa milimeter 10 peratus DMSO, dan kemudian dilarutkan lagi sehingga 100ml dalam 0.02 M Na HPOq/ NaH-PO4,0.006M NaCl, pH 6.9 untuk memberikan penyelesaian stok akhirnya dengan kepekatan 1000 ug/ml. Daripada ini, pencairan berikut disediakan daripada 10,50,70,100, dan 500 ug/ml, menggunakan 10 peratus DMSO sebagai pelarut. Isipadu 0.2ml 2unit/ml pankreas babi -amilase dicampur dengan 0.2ml

pecahan tumbuhan dan diinkubasi selama 10min pada 30 darjah . Selepas pengeraman, 0.2ml larutan kanji 1 peratus yang baru disediakan dalam air ditambah, dan tiub itu kemudiannya diinkubasi selama sekurang-kurangnya tiga minit lagi. Pada ketika ini, tindak balas telah dihentikan dengan penambahan 0.2ml 3,5-reagen warna asid salisilik (DNSA) dan dicairkan dengan 5ml air suling, sebelum dipanaskan pada 90 darjah selama 10 minit dalam air. mandi. Campuran kemudiannya disejukkan ke suhu bilik, dan penyerapan diukur pada 540 nm. Kawalan kosong disediakan menggunakan kuantiti yang sama yang diterangkan di atas, tetapi menggantikan pecahan tumbuhan dengan penimbal 0.2ml. Acarbose digunakan sebagai rujukan standard mengikut prosedur yang diterangkan di atas. Aktiviti perencatan a-amilase dikira menggunakan persamaan berikut: