Anti-Apoptosis Podocytes Dan Pro-Apoptosis Sel Mesangial Untuk Telmisartan dalam Mengurangkan Kecederaan Buah Pinggang Diabetik

ABSTRAK

Kerosakan podocyte dan pengembangan sel mesangial adalah dua manifestasi patologi penting kecederaan glomerular dalam diabetes awal. Telmisartan, sebagai perencat reseptor angiotensin jenis 1 (AT1), boleh meningkatkan produk akhir glikasi lanjutan (AGE) atau kecederaan podosit yang disebabkan oleh angiotensin Ⅱ (Ang Ⅱ) termasuk detasmen atau apoptosis. Dalam kertas semasa ini, kami mula-mula mengesahkan kesan perlindungan telmisartan pada kecederaan buah pinggang diabetes awal dalam tikus diabetes jenis 1. Telmisartan mengurangkan kehilangan podocin dan menghalang ekspresi -SMA, mencerminkan kesan perlindungannya terhadap kecederaan podosit dan percambahan mesangial, masing-masing. Lebih menarik lagi, kami melihat kesan bertentangan telmisartan pada daya maju sel dan apoptosis podosit dan sel mesangial dalam persekitaran glukosa tinggi secara in vitro. Kesan anti-apoptosis telmisartan pada podosit mungkin berkaitan dengan perencatan swiprosin-1 (protein yang boleh mengantara ekspresi apoptosis podosit yang disebabkan oleh glukosa tinggi). Walaupun telmisartan mendorong ekspresi PPAR yang tinggi dalam sel mesangial, dan GW9662 (antagonis PPAR) sebahagiannya menghalang apoptosis yang disebabkan oleh telmisartan dan mengurangkan daya maju sel mesangial. Di samping itu, ekspresi PKC 1/TGF 1 yang disebabkan oleh glukosa tinggi dalam sel mesangial boleh disekat oleh telmisartan. Data ini menyediakan mekanisme selular yang lebih tepat untuk mendedahkan kesan perlindungan telmisartan dalam kecederaan buah pinggang diabetes.

KATA KUNCI

penyakit buah pinggang kencing manis, podosit (MeSH: D050199), sel mesangial, telmisartan (PubChem CID: 65, apoptosis

Klik di sini untuk membeli produk Cistanche

PENGENALAN

Penyakit buah pinggang diabetes (DKD), yang terkenal sebagai penyakit buah pinggang kronik yang disebabkan oleh diabetes mellitus (DM) jenis 1 atau 2 (Podgórski et al., 2019), boleh memburukkan lagi kadar penapisan glomerular (GFR) menurun secara progresif, kemudian akhirnya berkembang menjadi akhir. -penyakit buah pinggang peringkat (Hou et al., 2018; Ruiz-Ortega et al., 2020; Kumpulan Pakar Persatuan Nefrologi Cina, 2021). Terdapat dua mekanisme yang menjadi pengantara hiperglikemia melalui kecederaan podosit buah pinggang dan perubahan membran bawah tanah glomerular (GBM) yang disebabkan oleh pengembangan atau percambahan sel mesangial (Anders et al., 2018).

Podocytes, adalah sel epitelium visceral khusus, melapisi lapisan luar GBM, yang proses kaki interdigitate membentuk penghalang muktamad untuk mencegah kehilangan protein dalam air kencing (Podgórski et al., 2019). Bilangan dan/atau ketumpatan setiap glomerulus telah dikaji pada pesakit DM (Papadopoulou-Marketou et al., 2017). Kecederaan pada podosit menyumbang kepada kehilangan sifat pelekatnya dan merupakan punca utama perkembangan DKD (Podgórski et al., 2019). Satu lagi ciri penting podosit ialah podosit matang adalah sel proliferatif terhad (Podgórski et al., 2019), (Griffin et al., 2003). Kehilangan podosit membawa percambahan sel mesangial, namun, kehilangan yang lebih besar membawa kepada fibrosis glomerular dan peningkatan proteinuria sebagai dendaasi seterusnya GBM (Fukuda et al., 2012). Kawalan glisemik yang lemah mengakibatkan podocytopathy (Anders et al., 2018), perubahan morfologi yang dicirikan oleh hipertrofi podosit, transdifferentiation epithelial-mesenchymal podocyte (Chang et al., 2017), detasmen podocytes (Zhang et al., 2020), Wang et al., 2018a) dan kehilangan podosit, yang membawa kepada penyimpangan podosit progresif mengakibatkan detasmen GBM dengan akibat glomerulosklerosis.

Sel mesangial mempunyai kesan yang ketara bukan sahaja pada pelarasan peredaran glomerular dan intraglomerular tetapi juga pemuliharaan glomeruli, seperti pertahanan sel endothelial glomerulus dan aliran keluar bahan daripada serum dan cecair daripada mikrovessel (Wakisaka et al., 2021). GBM yang menebal dan mesangial yang berkembang adalah gangguan glomerular yang ketara dalam diabetes (Papadopoulou-Marketou et al., 2017). Penebalan GBM adalah histopatologi awal dalam DKD dan dipengaruhi oleh pendapatan menyimpang dan variasi matriks ekstraselular yang dirembes oleh sel endothelial dan podosit (Anders et al., 2018). Hiperglisemia merangsang sel mesangial untuk membiak dan menghasilkan matriks (Kriz et al., 2017) melalui pengaktifan faktor pertumbuhan yang berubah- (TGF), yang secara langsung menyebabkan pengaktifan transkrip kolagen matriks (Ziyadeh et al., 2000) menyebabkan mesangial berkembang. matriks.

Intervensi awal dengan rawatan hipoglisemik dan antihipertensi adalah berfaedah untuk melambatkan kejadian dan perkembangan DKD (Martins dan Norris, 2001). Terutama disyorkan pada orang dewasa tekanan darah normal dengan DM dan albuminuria ialah perencat enzim penukar angiotensin (ACEI) atau penyekat reseptor angiotensin (ARB) (Liew et al., 2020). Sekatan sistem renin-angiotensin memperbaiki ekspresi ANGPTL2 dan integrin yang mengekalkan halangan glomerular (Tawfik et al., 2021). Sebab telmisartan dipilih adalah kerana ia digambarkan sebagai lebih cekap daripada ubat ARB lain dalam mengurangkan proteinuria (Naruse et al., 2019; Guo et al., 2020). Selain itu, telmisartan boleh mengurangkan nefrotoksisiti yang disebabkan oleh cisplatin seperti apoptosis podocyte dan tahap ekspresi protein yang berkaitan dengan autophagy (Malik et al., 2015). Menariknya, telmisartan mempunyai ciri-ciri sedemikian dengan mengambil kira peranan kembarnya iaitu tindakan menyekat reseptor AT1 dan sifat agonis separa reseptor proliferator peroksisom (PPAR) (Balakumar et al., 2012). Matlamat kertas ini adalah untuk mengkaji pengaruh perlindungan telmisartan pada kecederaan podosit dan pengembangan mesangial pada peringkat awal DM jenis 1, masing-masing.

Serbuk cistanche

BAHAN DAN KAEDAH

1. Haiwan

Tikus jantan SD telah dibeli daripada SLRC Laboratory Animal Ltd. (Shanghai, China). Tikus ditempatkan pada suhu terkawal 22 ± 2 darjah C, kelembapan relatif 50–60 peratus , 12-j kitaran cahaya dan 12-j gelap (cahaya, 08:00–20 :00, kegelapan, 20: 00–08:00), dan membenarkan akses percuma kepada diet kering standard dan air paip. Semua haiwan menerima penjagaan yang berperikemanusiaan, dan protokol eksperimen telah diluluskan oleh Jawatankuasa Penjagaan Haiwan di Universiti Perubatan Tentera Laut.

2. Model dan Rawatan Diabetes

Weight 180–200 g male rats were treated with STZ (Sigma, Deisenhofen, Germany) to induce type 1 diabetes. STZ was dissolved in sterile citrate buffer (pH 4.5) and injected intraperitoneally (65 mg/kg body weight) within 10 min of preparation. The non-diabetic rats initially injected with STZ vehicles served as controls (group Con, n = 10). Diabetes mellitus was confirmed by measuring glucose levels in tail venous blood using a B-glucose analyzer (HemoCue, Angelholm, Sweden) 7 days later. Rats with random blood glucose levels>16.7 mmol/L dimasukkan ke dalam eksperimen.

Tikus diabetes kemudiannya menerima telmisartan (Merck, PHR 1855, 10 mg kg−1 ·d−1 po, kumpulan DM tambah Tel, n=10) atau kenderaan (kumpulan DM, n=10) secara gavage selama 4 minggu. Telmisartan yang digunakan dalam kertas kerja ini diperoleh daripada Sigma-Aldrich Germany, Inc., yang ketulenannya adalah 98 peratus tambah (HPLC). Secara berkala, glukosa darah dan berat badan diukur, dan sampel air kencing untuk pengukuran kuantitatif albuminuria dikumpulkan dalam sangkar metabolik. Tikus dikorbankan di bawah bius selepas 4 minggu, buah pinggang dikeluarkan dan ditimbang untuk analisis histologi dan pengekstrakan protein.

3. Albumin kencing

Sampel air kencing telah disentrifugasi pada 10,000 rpm selama 5 minit untuk mengeluarkan bahan tidak larut. Supernatan telah diasingkan dan disimpan pada suhu -80 darjah C sehingga digunakan. Kit ELISA untuk albumin kencing tikus dari Chondrex (Redmond, WA) telah digunakan mengikut arahan pengilang.

4. Kadar Pembersihan Kreatinin

Kit Ujian Kreatinin (Nanjing Jiancheng, C011-2-1) digunakan untuk penentuan kreatinin dalam darah dan air kencing. Ccr dikira mengikut formula: Ccr=(kreatinin kencing*isipadu air kencing 24 jam)/(kreatinin darah*24j*60 min/j)/berat akhir (kg).

5. Pewarnaan Imunohistokimia dan TUNEL

Buah pinggang dipotong dalam mikrotom penghirisan pada 7–8 μm, dan dibetulkan dengan 4 peratus paraformaldehid dalam PBS selama 10 min. Penyekatan telah dilakukan dengan penimbal (PBS, 2 peratus BSA, 10 peratus FBS) selama 1 jam diikuti dengan pengeraman 10 minit dengan penimbal kedua (PBS, 0.4 peratus Triton). Antibodi utama terhadap -SMA (Servicebio, GB13044) atau NPHS2 (Abcam, ab229037) telah diinkubasi selama 3 jam pada suhu bilik di dalam ruang lembap. Selepas mencuci, bahagian tersebut diinkubasi dengan Cy3 goat anti-Mouse IgG (H plus L) (Servicebio, GB21301), HRP conjugated goat anti-Arbbit IgG (H plus L) (Servicebio, GB23303), atau TUNEL immunofluorescent (Servicebio, G1501). ) tindak balas dalam ruang lembap (gelap, 37 darjah, 1 jam). Bahagian tersebut kemudiannya diwarnakan dengan DAPI (Servicebio, G1012) untuk pengesanan nukleus. Akhirnya, bahagian yang bernoda telah tertanam dalam rintangan kepada cecair pengedap pelindapkejutan pendarfluor dan digambarkan menggunakan mikroskop pendarfluor (NIKON ECLIPSE C1, Jepun).

Ekstrak cistanche

6. Kultur Sel

Sel mesangial buah pinggang manusia (HRMC) diperoleh daripada Makmal Penyelidikan ScienCell, Santiago, CA, dan dikultur dalam Medium Sel Mesangial (MsCM, Makmal Penyelidikan ScienCell). HRMC disalut pada kelalang bersalut poli-L-lisin (2 ug/cm2 ), dan ditanam pada 37 darjah dalam suasana lembap yang mengandungi 5 peratus CO2. Sel-sel dalam eksperimen ini digunakan dalam 3-4 petikan dan telah diperiksa untuk memastikan ia menunjukkan ciri-ciri khusus sel mesangial. Barisan sel podosit tetikus MPC-5 diperoleh daripada ATCC, Maryland, Amerika Syarikat. Sel-sel telah ditanam pada kolagen jenis I dalam RPMI 1640 (10 peratus FBS) dengan 50 U/ml IFN- pada 33 darjah hingga 85 peratus pertemuan dan kemudian dipindahkan ke 37 darjah tanpa IFN- selama 10-14 hari untuk pembezaan.

7. Ujian Daya Tahan Sel dan Percambahan

Kit Pengiraan Sel-8 (CCK-8) telah digunakan untuk mengukur percambahan sel dan daya maju sel. Sel telah disemai dalam setiap telaga 96-plat kultur telaga (5 × 103 /telaga). Selepas rawatan, 10 ul CCK-8 (Beyotime, Shanghai, China) ditambah dan diinkubasi selama 1 jam pada 37 darjah C. Penyerapan diukur menggunakan pembaca plat mikro (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Amerika Syarikat) pada panjang gelombang 450 nm.

8. Pewarnaan Annexin V dan Propidium Iodide

Sel disalut dan dibesarkan sehingga mencapai 60 peratus pertemuan, dan kemudian dirawat dengan glukosa tinggi (50 mmol/L) atau telmisartan. Selepas 96 jam, sel yang dikumpul dibasuh dengan PBS sejuk dan digantung semula dalam penimbal yang mengikat. Annexin V-FITC dan PI (eBioscience, Santiago, CA, Amerika Syarikat) telah ditambahkan pada penggantungan selular mengikut arahan pengilang dan sampel pendarfluor 10,000 sel telah dianalisis dengan sitometri aliran yang dijalankan dengan FACScan ( Becton, Dickinson, and Company, Franklin, NJ, Amerika Syarikat).

9. Western Blotting

Korteks buah pinggang, HRMC dan MPC-5 telah dihomogenkan dalam Tisu atau Reagen Pengekstrakan Protein Sel (Beyotime) ditambah dengan perencat protease dan fosfatase (Merck, Whitehouse Station, NJ, Amerika Syarikat). Sampel dipisahkan pada 10 peratus SDS PAGE dan dipindahkan ke membran nitroselulosa (Pall Corporation, NY, Amerika Syarikat). Membran telah disekat dengan 5 peratus albumin serum lembu dan disapu dengan antibodi. Anti-PKC 1 (Teknologi Isyarat Sel, 46,809), anti-swiprosin-1 (Abcam, ab24368), TGF- 1 (Abcam, ab215715), Tubulin (Beyotime, AT819) dan GAPDH (Beyotime, AF5009 ) telah digunakan pada kepekatan 1:1,000. Protein divisualisasikan menggunakan antibodi sekunder anti-tikus atau anti-arnab terkonjugasi IRDye (Rockland, Limerick, PA, Amerika Syarikat) pada 1: 5,000. Menggunakan ODYSSEY INFRARED IMAGING SYSTEM (LI-COR) untuk menganalisis keputusan.

10. Analisis Statistik

Pemprosesan data dianalisis oleh Origin 6.1 (OriginLab, Northampton, MA) dan dinyatakan sebagai min ± SD sekurang-kurangnya tiga eksperimen bebas. Kepentingan statistik ditentukan menggunakan ANOVA. Nilai p < 0.05 dianggap signifikan secara statistik.

Cistanche tubulosa

PERBINCANGAN

Telmisartan ialah penyekat reseptor AT1 terpilih yang telah digunakan secara klinikal untuk mengurangkan tekanan darah tinggi dan perkumuhan protein kencing dalam pesakit hipertensi (Baden et al., 2008; Mann et al., 2009). Beberapa ujian klinikal telah mencadangkan bahawa telmisartan berkesan untuk mengurangkan proteinuria pada pesakit dengan makroalbuminuria dan melambatkan permulaan dan perkembangan nefropati diabetik (Makino et al., 2005; Nakamura et al., 2010; Fujita et al., 2011; Schmieder et al. ., 2011). Dalam kajian ini, rawatan oral dengan telmisartan dalam tikus diabetes yang disebabkan oleh STZ menghalang permulaan keabnormalan awal dalam buah pinggang dan secara keseluruhan termasuk penurunan berat badan, glukosa darah dan protein air kencing. Keputusan ini mengesahkan bahawa telmisartan mempunyai renoprotection pada tikus nefropati diabetes peringkat awal. Lebih penting lagi, kajian ini mendapati bahawa kesan perlindungan telmisartan pada glomeruli diabetik dicerminkan dalam kesan anti-apoptosis dan pro-apoptosis pada podosit dan sel mesangial, masing-masing.

Produk akhir glikasi lanjutan (AGE) boleh menyebabkan kecederaan dan detasmen DNA podosit sebahagiannya melalui rangsangan paksi Ang II-AT1R, sekali gus membekalkan ciri berfaedah inovatif telmisartan dalam DKD (Fukami et al., 2013). Dalam penyakit glomerular proteinurik normotensif gred rendah, rawatan dengan telmisartan pada peringkat awal penyakit, melemahkan kerosakan glomerular dan tubulointerstitial (Villa et al., 2011). Dan beberapa laluan mungkin dikaitkan dengan akibat pleiotropik termasuk isyarat faktor pertumbuhan, sasaran mamalia isyarat rapamycin, ubiquitination protein, laluan Wnt-beta catenin, dan isyarat hipoksia (Villa et al., 2011).

Baru-baru ini, kami melaporkan bahawa swiprosin-1 (Wang et al., 2018b), nama lain untuk domain tangan EF yang mengandungi 2 (EFhd2), memainkan peranan penting dalam perkembangan DKD yang dimulakan selepas induksi, sementara ia terletak dalam podosit glomerulus tikus. Ketiadaan swiprosin-1 memperbaiki apoptosis podosit yang bergantung kepada mitokondria yang dirangsang oleh hiperglisemia atau glukosa tinggi melalui laluan isyarat p38 MAPK. Di sini, kami juga mendapati bahawa telmisartan menghalang hiperglisemia atau ekspresi swiprosin yang disebabkan oleh glukosa tinggi-1 dalam vivo dan in vitro, yang menunjukkan kesan anti-apoptosis telmisartan pada podosit mungkin berkaitan dengan peraturan swiprosin{ {12}} ungkapan.

Proliferasi sel mesangial dan pemendapan berlebihan protein matriks ekstraselular telah dipastikan sebagai penyumbang kepada perkembangan DKD (Lee et al., 2004). Kajian terdahulu menunjukkan bahawa glukosa tinggi boleh mendorong ekspresi protein matriks ekstraselular mesangial di bawah hiperglikemia (Taniguchi et al., 2013). -SMA biasanya digunakan untuk membezakan sel mesangial daripada sel glomerular lain dalam tikus diabetes yang disebabkan oleh STZ, dan peningkatan -Ekspresi SMA boleh menjadi penanda anjakan fenotip sel mesangial daripada fasa tidak diaktifkan kepada fasa proliferatif, rembesan diaktifkan (Niu et al., 2014). Di sini, kami mendapati bahawa telmisartan menurunkan ekspresi -SMA dalam glomerulus diabetes. Di samping itu, telah dilaporkan bahawa percambahan sel mesangial mempunyai kesan yang signifikan terhadap patogenesis DKD (Zeng et al., 2013). Keputusan kami dalam kajian ini mencerminkan kesan tertekan yang bergantung kepada masa dan dos telmisartan pada percambahan sel mesangial yang berkaitan dengan ciri proapoptotik.

Bukti klinikal mengesyorkan bahawa telmisartan adalah lebih cekap daripada losartan dalam memulihkan proteinuria pada orang hipertensi dengan DKD, yang mungkin berkaitan dengan keupayaannya untuk menyiksa sebahagian PPAR (Bichu et al., 2009). Tambahan pula, perubahan yang bermanfaat seperti pencegahan atrofi buah pinggang dan fibrosis telmisartan dikaitkan dengan pengurangan dalam ekspresi TGF 1 dan gen sitokin proinflamasi dan profibrotik lain melalui pengaktifan PPAR / HGF (Kusunoki et al., 2012), bebas. sekatan reseptor Ang II jenis 1. Di sini, kami juga mendapati telmisartan secara khusus mengaktifkan ekspresi gen PPAR dalam sel mesangial, dan kesan pro-apoptosis yang disebabkan oleh telmisartan kepada sel mesangial boleh dikurangkan oleh perencat PPAR.

PKC 1 adalah salah satu daripada keluarga kinase serine-threonine yang dinyatakan secara meluas yang memindahkan pelbagai perkembangan selular dengan fosforilasi khusus substrat (Newton, 1995). Telah dilaporkan bahawa bukan sahaja peningkatan aktiviti PKC tetapi juga tahap mRNAnya diperhatikan dalam biopsi nefropati diabetik manusia (Langham et al., 2008). Ekspresi dan pengaktifan PKC yang disebabkan oleh hiperglikemia mempunyai kesan pleiotropik dalam sel mesangial, termasuk menggalakkan pengumpulan berlebihan protein ECM (Brownlee, 2001). Kajian telah menunjukkan bahawa perencatan PKC melemahkan hiperselular glomerular dan pengembangan matriks ekstraselular dalam tikus db/db dan disfungsi glomerular dalam STZ-tikus (Ishii et al., 1996; Koya et al., 2000). Begitu juga, perencat PKC melemahkan faktor pertumbuhan terhasil platelet (PDGF) yang didorong oleh percambahan sel mesangial dan pengeluaran kolagen (Tokuyama et al., 2011). Dalam kajian kami, telmisartan mengurangkan regulasi mRNA PKC 1 dan ekspresi protein dalam sel mesangial yang dirangsang hiperglikemia. Di samping itu, ekspresi TGF 1 dalam sel mesangial yang disebabkan oleh glukosa tinggi juga boleh dihalang oleh telmisartan.

Kedua-dua reseptor AT1 dan AT2, yang terkenal sebagai tujuh reseptor gabungan protein G yang merangkumi transmembran, telah diklon dan digambarkan secara farmakologi (Touyz dan Berry, 2002). Reseptor AT1 boleh menjadi antagonis secara selektif oleh telmisartan, manakala penyekat reseptor AT1 boleh mendorong ekspresi reseptor AT2 (Touyz dan Berry, 2002). Kajian telah menunjukkan bahawa reseptor AT1 memberi pengaruh mereka dengan menghalang pertumbuhan sel, dan dengan memprovokasi apoptosis (Horiuchi et al., 1997; Touyz et al., 1999). Selain itu, reseptor AT2 mendorong apoptosis sel dalam konformasi tertentu melalui isyarat apoptosis yang dimediasi p38 MAPK (Miura dan Karnik, 2000). Dalam kertas kerja kami sekarang, ekspresi mRNA AT1 dan AT2 tidak berubah dalam sel mesangial berbudaya yang dirangsang dengan telmisartan atau hiperglikemia. Oleh itu, apoptosis sel mesangial yang disebabkan oleh telmisartan dan penurunan ekspresi PKC 1 mungkin tidak dimediasi oleh reseptor AT1 dan AT2.

Kapsul cistanche

Kesimpulannya, telmisartan melemahkan kecederaan glomerular awal dalam tikus diabetes jenis 1 dengan menghalang apoptosis podosit dan menggalakkan apoptosis mesangial. Kesan antiapoptosis telmisartan dalam podosit mungkin berkaitan dengan perencatan ekspresi swiprosin-1, sementara itu, kesan proapoptotik pada sel mesangial sebahagiannya dikaitkan dengan kesan agonisnya pada PPAR . Selain itu, telmisartan secara selektif menyekat ekspresi PKC 1/TGF 1 dalam sel mesangial tetapi tidak dalam podosit. Kajian lanjutan diperlukan untuk menjelaskan kesan telmisartan yang bertentangan tetapi bermanfaat pada podosit dan sel mesangial dan mekanisme molekul yang mendasari.

Xin Wei 1, Yabin Ma2, Ya Li 3 , Wenzhao Zhang4 , Yuting Zhong5 , Yue Yu6 , Li-Chao Zhang5, Zhibin Wang4 dan Ye Tu2

1 Jabatan Farmasi Klinikal, Hospital Xinhua, Pusat Pengajian Perubatan Universiti Jiaotong Shanghai, Shanghai, China,

2 Jabatan Farmasi, Hospital Timur Shanghai, Universiti Tongji, Shanghai, China,

3 Jabatan Farmasi Klinikal, Pusat Percubaan Klinikal, Hospital Gabungan Pertama Universiti Perubatan Pertama Shandong dan Hospital Qianfoshan Wilayah Shandong, Jinan, China,

4 Jabatan Perubatan Penjagaan Kritikal, Pusat Pengajian Anestesiologi, Universiti Perubatan Tentera Laut, Shanghai, China,

5 Jabatan Farmasi, Hospital Perbandaran Shanghai Perubatan Tradisional Cina, Shanghai, China,

6 Institut Penyakit Vaskular, Hospital Bersepadu TCM Shanghai, Shanghai, China