Menyasarkan Laktat Dehidrogenase A Dengan Catechin Meresensikan Sel Kanser Gastrik SNU620/5FU Kepada 5-Fluorouracil Bahagian 2

Sila hubungioscar.xiao@wecistanche.comuntuk maklumat lanjut

2.5. CA dan 5Fu Cotreatment Menginduksi Apoptosis Bergantung ROS Mitokondria

Oleh kerana perencatan LDHA secara langsung meningkatkan ROS mitokondria dan kehilangan potensi membrannya, seterusnya mendorong apoptosis [16,29], faktor-faktor yang berkaitan dengan apoptosis pengantara ROS mitokondria telah diperiksa. Rawatan tunggal CA atau 5FU sedikit meningkatkan tahap ROS mitokondria dalam sel SNU620/5FU apabila diukur dengan sitometri aliran menggunakan MitoSOX. Walau bagaimanapun, rawatan bersama dengan CA dan 5FU meningkatkan pengeluaran ROS mitokondria dengan ketara. Peningkatan pengeluaran ROS ini telah diterbalikkan oleh Mito-TEMPO, antioksidan yang disasarkan mitokondria (Rajah 5A-C). Perencatan pertumbuhan selepas rawatan dengan CA dan 5FU juga dipulihkan selepas rawatan Mito-TEMPO dalam sel SNU620/5FU (Rajah 5D). Selanjutnya, apoptosis dinilai melalui pewarnaan Annexin V-FITC / PI dalam sel SNU620 / 5FU. Rawatan bersama dengan CA dan 5FU meningkatkan bilangan sel apoptosis di kalangan sel SNU620/5FU (Rajah 6A, B). Pemecahan morfologi nuklear muncul semasa apoptosis, dan ia boleh diperhatikan dengan pewarnaan 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI) [30,31]. Pemecahan DNA didapati telah meningkat dengan ketara dalam kumpulan rawatan bersama, berbanding dengan kumpulan kawalan (Rajah 6C). Akhir sekali, penanda bio apoptosis termasuk Bcl-2, Bax, Caspase-9, Caspase-3 dan PARP telah diperiksa. Lata proapoptotik meningkat berikutan rawatan bersama dengan CA dan 5FU dalam sel SNU620/5FU (Rajah 6D). Penemuan ini menunjukkan bahawa rawatan bersama dengan CA dan 5FU mendorong apoptosis dalam sel SNU620 / 5FU.

Rajah 5. Cotreatment dengan catechin(CA)dan 5-fluorouracil(5FU)meningkatkan pengeluaran mitokondria ROS:(A)SNU620/5FU sel telah dirawat dengan kepekatan CA,5FU（10μM） dan Mito yang ditunjukkan -TEMPO（20 μM） selama 48 jam. ROS mitokondria sel diukur melalui analisis FACS menggunakan MitoSOXTM Red; (B) graf bar menunjukkan kadar sel yang positif untuk pewarnaan MitoSOX; (C) imej mikroskop pendarfluor (X100) sel SNU620/5FU yang diwarnai dengan MitoSOX telah dibentangkan; (D) daya maju sel diukur melalui ujian MTT. Keputusan ditunjukkan sebagai min ± SEM.*p<><0.001, and=""><0.001, compared="" to="" the="" respective="" control.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

Rajah 6. Peningkatan apoptosis oleh rawatan bersama catechin(CA) dan 5-fluorouracil(5FU); Sel SNU620/5FU dirawat dengan CA （10 uM） dan/atau 5FU （10 μM） untuk 48 h∶（A） bilangan sel apoptosis dianalisis melalui FACSanalysis menggunakan pewarnaan PI-Annexin V;(B) graf bar menunjukkan peratusan sel dalam fasa apoptosis awal dan lewat. Keputusan ditunjukkan sebagai min ± SEM.**p<0.001, compared="" to="" the="" control;(c)="" the="" nuclei="" of="" the="" cells="" were="" stained="" with="" dapl,="" and="" fluorescence="" microscopic="" images="" were="" taken="" (x200).="" the="" white="" arrowhead="" indicates="" apoptotic="" cells.="" scale="" bar,="" 10="" um;="" (d)the="" expression="" levels="" of="" proteins="" related="" to="" the="" apoptotic="" pathway="" were="" measured="" by="" western="" blot="" analysis.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

Sila klik di sini untuk mengetahui lebih lanjut

3. Perbincangan

Dalam kajian ini, untuk mencirikan dan menilai kemoresistance kepada 5FU, kami menggunakan sel SNU620/5FU, yang ditubuhkan melalui pendedahan jangka panjang kepada 5FU dengan peningkatan bersiri kepekatan dadah [32]. Sel SNU620 ibu bapa telah dilaporkan mempunyai mutan p53 dengan penghapusan homozigot dalam exon 5[33]. Berdasarkan microarray DNA, beberapa gen yang terlibat dalam kemoresistan, termasuk thymidylate synthetase, protein pengikat DNA spesifik kerosakan 2, clusterin, dan midkine, dinaikkan dalam sel SNU620/5FU [32]. Beberapa kajian terdahulu telah menggunakan talian SNU620/5FUcell sebagai model untuk menilai keberkesanan in vitro ubat terhadap rintangan kepada 5FU melalui anti-mitosis, pengaktifan AMPK dan isyarat reseptor cannabinoid [34-36]. Walau bagaimanapun, ciri-ciri metabolik dan tahap ekspresi gen yang berkaitan dengan metabolisme dalam sel SNU620/5FU dan peranannya dalam chemoresistance belum banyak disiasat.

Di sini, kami menunjukkan bahawa sel SNU620/5FU mempunyai fenotip glikolitik yang maju, termasuk pengeluaran laktat yang tinggi dan ekspresi enzim yang berkaitan dengan penukaran piruvat kepada laktat, seperti LDHA. Fosforilasi PDHA1, mewakili aktiviti PDH yang dikurangkan oleh PDK2 dan PDK3 yang tinggi, juga meningkat dalam sel tahan SNU620/5FU, berbanding dengan sel induk SNU620. Walau bagaimanapun, OCR tidak berkurangan dengan ketara dalam sel tahan. Penjelasan yang mungkin untuk percanggahan ini ialah keplastikan nutrien sel kanser untuk kitaran TCA, iaitu, asid amino atau asetil-KoA yang diperolehi asid lemak, bukan sahaja asetil-KoA yang berasal dari glukosa, boleh membekalkan substrat kepada kitaran TCA [37]. ].Sehubungan dengan ini, sel-sel kanser gastrik yang tahan 5FU menggalakkan stemness melalui pengoksidaan asid lemak mitokondria [38]. Di samping itu, rintangan 5FU telah dikaitkan dengan peningkatan jisim dan aktiviti mitokondria, termasuk ekspresi enzim rantai pengangkutan elektron (ETC) dan penggunaan oksigen [39,40]. Oleh itu, kami menumpukan pada modulasi LDHA untuk meresensikan rintangan 5FU. Berdasarkan keputusan kami, perencatan aktiviti LDHA dengan oksamat atau CA berjaya menyekat pertumbuhan sel tahan SNU620/5FU dan meresensikannya kepada rawatan 5FU. Penemuan ini menunjukkan korelasi yang baik dengan kajian terdahulu, yang melaporkan bahawa perencatan genetik atau farmakologi LDHA berjaya mengurangkan ketahanan terhadap kemoterapi, termasuk 5FU [19,41,42]. Oleh itu, kami menganggap bahawa perencatan LDHA mungkin mencukupi untuk menyekat rintangan terhadap 5FU dalam sel SNU620/5FU.

Cistanche boleh meningkatkan imuniti

Beberapa molekul sintetik, seperti oksamat, FX11, PSTMB dan GNE{1}} telah ditetapkan sebagai perencat LDHA molekul kecil [11,43]. Antaranya, FX11 telah dilaporkan sebagai pemeka kepada kemoterapi dalam sel tumor yang tahan [44]. Walau bagaimanapun, walaupun banyak perencat LDHA sedang dalam penelitian untuk kelulusan sebagai ubat antikanser baru, tiada satu pun daripada mereka telah diluluskan lagi. Oleh itu, lebih banyak calon seperti dadah diperlukan untuk menghasilkan perencat LDHA baharu [45]. Sebatian semula jadi telah dianggap sebagai sumber yang berpotensi untuk ubat antikanser, terutamanya dalam mengatasi kemoresistance sebagai terapi gabungan [46,47]. Oleh itu, mensasarkan metabolisme kanser, terutamanya metabolisme glukosa dengan produk semula jadi yang berasal dari tumbuhan adalah trend penyelidikan yang baru muncul untuk pembangunan terapeutik kanser novel [48].

Selanjutnya, beberapa laporan telah mencadangkan bahawa produk semulajadi, seperti gossypol, galloflavin, crocetin, mesin A, dan EGCG, adalah perencat LDHA yang kuat [43,49,50]. Walaupun antara ini, gossypol mempunyai tindakan perencatan yang paling kuat pada LDHA (IC50=9.8 uM), ia juga menghalang aktiviti LDHB, yang menukar laktat kepada piruvat [51]. Keputusan kami menunjukkan bahawa EGCG, perencat LDHA yang mantap dan pemeka kepada kemoterapi 5FU [22-25], memberikan kesan perencatan pada kedua-dua aktiviti LDHA dan LDHB. Antara perencat LDHA terbitan produk semula jadi yang menunjukkan aktiviti perencatan khusus LDHA, seperti mesin A(IC{10}} μM), crocetin （IC50 =54.9 μM） dan CA （IC{{13} }.69 μM）【49,50】, CA menunjukkan kesan penindasan terbaik ke atas aktiviti LDHA berkenaan dengan nilai ICsn. Walaupun struktur kimia CA dan EGCG sangat serupa kecuali bahagian asid gallik tambahan, selektiviti perencatan mereka adalah Tidak sama. Di samping itu, walaupun CA merupakan sebatian paling ringkas, berbanding dengan terbitannya, ia menunjukkan tindakan perencatan terbaik pada kedua-dua pengeluaran laktat dan aktiviti LDHA. Oleh itu, kajian perhubungan struktur-aktiviti yang meluas perlu dijalankan untuk menunjukkan CA sebagai tulang belakang baru yang berpotensi untuk pembangunan perencat LDHA yang spesifik dan kuat.

EGCG telah diketahui sebagai perencat kompetitif NADPH. Selain itu, EGCG menghalang translokasi dan pembiakan NADPH oksidase [52-54]. Walau bagaimanapun, menurut keputusan pemodelan molekul, CA dan EGCG terletak secara struktur di tempat yang berbeza (Rajah 3A, B). Selain itu, mereka tidak menunjukkan korelasi dalam kekhususan dalam perencatan aktiviti LDHA dan LDHB, yang menggunakan NADH. dan NAD tambah sebagai kofaktor, masing-masing. Daripada data ini, kami mengandaikan bahawa CA tidak mempunyai korelasi langsung dengan EGCG dalam mekanisme bersaing dengan NAD(P)H. Sebenarnya, perencatan LDHA oleh beberapa perencat, seperti FX11, GSK 2837808A, NCI-737 dan NCI-006, mengurangkan pengeluaran NADt dan meningkatkan pengumpulan NADH, dengan itu mengurangkan nisbah NAD tambah /NADH[16,17,55]. Apoptosis yang disebabkan oleh laluan kerosakan DNA yang bergantung kepada p53/NAD juga dinaikkan oleh perencatan LDHA menggunakan siRNA atau perencat kimia, NH-2 [56]. Laluan isyarat GCN2-ATF4 juga dilaporkan sebagai satu lagi mekanisme yang bertanggungjawab untuk kematian sel apoptosis yang disebabkan oleh perencat LDHA, GSK 2837808A [17]. Memandangkan nisbah NAD/NADH memainkan peranan penting dalam homeostasis redoks dan percambahan sel [5758], CA sebagai perencat LDHA mungkin menjejaskan sel kanser tahan 5FU melalui modulasi nisbah NAD tambah /NADH.

Kematian sel teraruh CA dalam kedua-dua sel SNU620/5FU ibu bapa dan SNU620/5FU yang tahan 5FU. Walau bagaimanapun, kematian sel yang disebabkan oleh CA adalah bergantung kepada LDHA melalui pengurangan shRNA dalam sel SNU620/5FU. Di samping itu, rawatan bersama CA dan 5FU menunjukkan kesan antikanser tambahan pada sel tahan 5FU. Seperti yang dilaporkan sebelum ini [16,59], perencatan LDHA meningkatkan ROS dan seterusnya menyekat pertumbuhan sel-sel kanser. Apabila LDHA dihalang, metabolisme tenaga ditukar daripada glikolisis kepada kitaran TCA dan fosforilasi oksidatif mitokondria [60]. Oleh itu, sel-sel kanser membuat lebih banyak pengeluaran ROS, mengakibatkan kerosakan membran mitokondria dan apoptosis yang disebabkan oleh mitokondria [61,62]. Dalam persetujuan yang baik dengan kajian terdahulu, CA mendorong kematian sel apoptosis melalui laluan yang bergantung kepada ROS mitokondria. Peningkatan keupayaan pertahanan ROS dan isyarat apoptosis yang berkurangan adalah sifat biasa sel kanser kemotahan, terutamanya dalam sel tahan 5FU 3,63]. Selanjutnya, perubahan dalam metabolisme kanser, terutamanya dalam metabolisme glukosa, juga membawa kepada ketahanan terhadap kemoterapi melalui perubahan aktiviti selular, seperti pembaikan DNA yang menyimpang, autophagy dipertingkatkan, pengurangan apoptosis, pertahanan terhadap ROS, dan peningkatan rembesan exosomes [9,64,651 . Oleh itu, menyasarkan enzim glikolitik, termasuk LDHA, dengan CA mungkin merupakan strategi alternatif untuk mengatasi rintangan kemoterapi, terutamanya dalam kanser gastrik yang tahan 5FU. Secara amnya, tumor malignan yang membahagi dengan pantas adalah sangat sensitif terhadap perencat sintesis DNA termasuk 5FU, berbanding dengan tisu biasa. Walau bagaimanapun, sesetengah sel kanser boleh membina daya tahan terhadap rawatan melalui beberapa mekanisme, seperti yang diterangkan sebelum ini [34-36]. Rawatan bersama sebatian bioaktif dan kemoterapi konvensional mempunyai kesan yang lebih tinggi, berbanding dengan sebatian tunggal, dalam memperlahankan perkembangan rintangan |66. Oleh itu, kesan biologi fitokimia tertentu dengan kesan sitotoksik terbukti yang diiklankan dengan kemoterapi konvensional untuk menyasarkan rangkaian yang lebih luas laluan isyarat dalam sel kanser, termasuk metabolisme kanser dan fungsi mitokondria, harus lebih baik daripada sebatian tunggal dalam pengurusan kanser kerana ia mungkin melambatkan perkembangan rintangan [67]. Dalam kajian ini, gabungan CA dan 5FU menunjukkan perencatan yang lebih tinggi pada daya maju sel, berbanding dengan rawatan tunggal. Selain itu, kami menunjukkan bahawa perencatan aktiviti LDHA dan apoptosis ROS-mediate mitokondria berikutnya mungkin merupakan mekanisme yang mendasari kesan pemekaan CA pada sel tahan 5FU (Rajah 7).

Sebagai tambahan kepada potensi dan kekhususan perencatan LDHA, CA lebih selamat daripada perencat LDH terbitan produk semula jadi yang telah ditubuhkan sebelum ini. Selain itu, CA ialah bahan kimia yang terkenal dalam teh hijau, dan keselamatan serta sifat farmakodinamiknya telah disahkan dalam kajian terdahulu [68-70]. Walau bagaimanapun, penilaian ketoksikan yang tepat terhadap pentadbiran bersama CA dan 5FU masih belum dijalankan. Di samping itu, keberkesanan in vivo CA dalam sel kanser tahan 5FU tidak diperiksa dalam kajian ini. Walau bagaimanapun, kajian terdahulu melaporkan tentang keberkesanan antikanser in vivo CA dan derivatifnya untuk mengatasi rintangan kemoterapi, termasuk rintangan 5FU dalam kanser perut dan kolon manusia [71-77]. Dalam kajian ini, kami memberi tumpuan kepada perencatan LDHA sebagai mekanisme molekul utama CA untuk mengatasi rintangan kepada 5FU. Oleh itu, untuk membangunkan CA sebagai pembantu baru untuk sel kanser kemotahan, keberkesanan in vivo dan keselamatan rawatan bersama CA dan 5FU harus dinilai melalui kajian haiwan yang meluas, termasuk model xenograf dan penilaian ketoksikan makmal yang baik.

4. Bahan dan Kaedah

4.1.Bahan

Antibodi terhadap poli (ADP-ribose)polimerase, caspase-3 dan caspase-9 telah dibeli daripada Teknologi Isyarat Sel (Teknologi Isyarat Sel, Danvers, MA, Amerika Syarikat). Antibodi terhadap LDHA, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH), dan PDHA1 telah dibeli daripada Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), dan antibodi terhadap fosfor-PDHA1 dan PDK3 telah dibeli daripada Abcam ( Abcam, Cambridge, MA, Amerika Syarikat). Selanjutnya, antibodi terhadap PDK2 dan PDK4 dibeli daripada Signalway Antibody (Signalway Antibody, Dallas, TX, USA), antibodi terhadap PDK1 diperoleh daripada Enzo Life Sciences (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA), dan antibodi terhadap B-cell. limfoma-2(Bcl-2) dan Bcl-2-protein X yang berkaitan telah dibeli daripada Novus Biologicals (Novus Biologicals, Littleton, CO, USA). MitoSOX telah dibeli daripada Invitrogen (Invitrogen, Carlsbad, CA, Amerika Syarikat). Bahan kimia dan reagen, termasuk 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT),4',{{22} }diamidino-2-phenylindole, oxamate, nicotinamide adenine dinucleotide, CA dan derivatif CA (EC GC, EGC dan EGCG) telah dibeli daripada Merck(Merck, Darmstadt, Jerman). -nicotinamide adenine dinucleotide(bentuk teroksida) telah dibeli dari Tokyo Chemical Industry (Tokyo Chemical Industry, Tokyo, Jepun).

4.2.Budaya Sel

Kanser gastrik manusia SNU620, SNU620/5FU dan AGS, kanser pankreas Panic-1 dan MIA PaCa-2, dan kanser kolon LS174T dan sel RKO diperoleh daripada Korean Cell Line Bank(KCLB, Seoul, Korea ).SNU620, SNU620/5FU, AGS dan LS174T sel telah dikultur dalam medium Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640)(Welgene, Daegu, Korea), ditambah dengan 10 peratus serum lembu janin yang tidak diaktifkan haba (FBS )(Gibco, New York, NY, Amerika Syarikat)dan 1 peratus penisilin/streptomycin (Invitrogen), dan sel Panc-1, MIA PaCa-2 dan RKO telah dikultur dalam medium Eagle's diubah suai Dulbecco (Welgene ) mengandungi 10 peratus FBS yang tidak diaktifkan haba dan 1 peratus penisilin/streptomisin. Semua sel telah dibiakkan dalam CO yang dilembapkan, inkubator pada 37 darjah, dan 5 peratus CO2.

4.3. Ujian Daya Tahan Sel

Tahap sitotoksisiti CA dan 5FU dalam sel SNU620 dan SNU620/5FU diukur menggunakan ujian MTT. Sel telah dikultur dalam 24-plat perigi(2× 104 sel/telaga) dengan kepekatan CA dan 5FU yang ditunjukkan untuk hari yang dinyatakan. Larutan MTT (2.0 mg/mL) kemudiannya ditambah ke dalam setiap telaga, diikuti dengan 3-4 h pengeraman pada 37 darjah dan 5 peratus CO, dalam inkubator kultur sel. Medium kultur kemudiannya dikeluarkan, dan penyerapan kristal formazan dibuat daripada sel hidup. DMSO telah ditambah untuk melarutkan kristal formazan, dan ia diukur pada 540 nm menggunakan Pembaca Microplate Spectramax M2 (Peranti Molekul, Sunnyvale, CA, Amerika Syarikat).

4.4. Kadar Pengasidan Ekstraselular(ECAR) dan Kadar Penggunaan Oksigen(OCR)

ECAR dan OCR, yang menunjukkan kadar selular glikolisis dan fosforilasi oksidatif, masing-masing, dipantau dengan penganalisis Seahorse XF (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, Amerika Syarikat), seperti yang diterangkan sebelum ini [78,79]. Secara ringkas, 60,000 sel SNU620 atau SNU620/5FU setiap telaga telah disemai dalam plat enam telaga Seahorse XF dalam medium RPMI ditambah dengan 1 peratus penisilin/streptomycin. Selepas pengeraman selama 30 minit, medium dari setiap telaga digantikan dengan 80 uL medium bebas serum yang telah dipanaskan terlebih dahulu dengan 5 mM oksamat, perencat LDH standard [11]. Sel-sel kemudian diinkubasi pada 37 darjah C selama 24 jam. Selepas pengeraman, medium dari setiap telaga digantikan dengan 180 μL medium XFbase prapanas (mengandungi 10 mM glukosa, 2 mM glutamin, dan 1 mM natrium piruvat; pH 7.4) untuk mengukur ECAR dan OCR. Keputusan dianalisis menggunakan perisian Wave 2.6.0.31 (Agilent Technologies).

4.5.Kuantiti Reverse transcription-polimerase Chain Reaction (qRT-PCR)

Jumlah RNA diekstrak menggunakan Kit Pengekstrakan RNA Jumlah RiboEx (GeneAll Biotechnology, Seoul, Korea), dan cDNA disintesis menggunakan kit transkripase terbalik (Promega, Madison, WI, USA). Dalam transkripsi terbalik, 1 ug daripada jumlah RNA telah digunakan , dan jumlah keseluruhan cDNA yang disintesis ialah 20 μL. Setiap kit telah digunakan mengikut arahan pengilang. PCR kuantitatif dilakukan menggunakan Sistem PCR Masa Nyata StepOneTM (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), dengan Real HelixgPCR Kit (NanoHelix, Daejeon, Korea), untuk 40 kitaran yang terdiri daripada 15 s pada 95 darjah Cand 1 min pada 60 darjah . Tahap mRNA relatif telah dinormalisasi kepada tahap RNA ribosom 18S, yang berfungsi sebagai kawalan endogen. Urutan primer digunakan untuk qRT-PCR disenaraikan dalam Jadual 1.

4.6.Analisis Blot Barat".

Sel-sel telah dibasuh dengan 1 × PBS, dan jumlah protein diekstrak daripada sel menggunakan penimbal RIPA dan penimbal lisis NP-40 1 peratus yang mengandungi tablet koktel perencat protease (Roche, Basel, Switzerland). Setiap kepekatan protein diukur menggunakan ujian protein Bio-Rad. Jumlah protein yang sama telah dipecahkan daripada setiap sampel melalui 8-15 peratus SDS-PAGE, dan kemudian protein tersebut dipindahkan ke membran nitroselulosa(GE Healthcare, Munich, Jerman) melalui elektroforesis. Membran telah disekat pada suhu bilik (20-25 darjah ) selama 1 jam menggunakan 5 peratus susu kering tanpa lemak dan diinkubasi dengan antibodi primer pada 4 darjah semalaman. Selepas itu, membran ini dibasuh tiga kali dengan 1× Tris-buffered saline selama 10 minit. Jalur spesifik protein diukur dengan sistem pengimejan chemiluminescence (ImageQuant LAS 4000; GE Healthcare). Ekspresi protein telah diselaraskan oleh GAPDH. 4.7.Ujian Pengeluaran Laktat

Pengeluaran laktat diukur dalam media kultur sel SNU620, SNU620/5FU, AGS, Panc-1, MIA PaCa-2, LS174T dan RKO. Sel-sel ini diinkubasi selama 1d pada 37 darjah, dan media kultur kemudiannya digantikan dengan medium bebas fenol merah, diikuti dengan pengeraman selama 1 jam pada 37 darjah. Medium setiap sel kemudiannya dinilai menggunakan kit ujian fluorometrik laktat komersial (BioVision, Milpitas, CA, Amerika Syarikat).

4.8. Ujian Aktiviti LDHA dan LDHB

Untuk mengesan aktiviti LDHA, kepekatan CA yang ditunjukkan telah diinkubasi selama 2{10}} min dalam penimbal yang mengandungi 2 mM piruvat, 20 μM NADH dan 20 mM HEPES-K tambah （pH7.2）. Untuk LDHBactivity, penimbal yang mengandungi 1 M Tris-HCl(pH8.0), 25 mM NAD plus, dan 2 M natrium L-laktat telah digunakan. Secara ringkas, 10 nanogram bagi setiap protein LDHA dan LDHB rekombinan yang telah dimurnikan telah digunakan untuk ujian aktiviti LDHA dan LDHB in vitro. Satu mikrogram jumlah protein daripada lisat sel telah digunakan untuk ujian aktiviti LDHA dan LDHB intrasel sebagai sumber enzim. Pendarfluor NADH pada panjang gelombang pengujaan 340 nm dan panjang gelombang pelepasan 460 nm telah dikesan menggunakan spektrofluorometer (Spectramax M2; Peranti Molekul), seperti yang diterangkan sebelum ini [80]. Aktiviti LDHA diukur dengan penurunan jumlah NADH, manakala aktiviti LDHIB dinilai dengan mengukur jumlah NADH yang ditukar daripada NAD tambah .

4.9. Interaksi Protein-Molekul Kecil

Interaksi antara protein dan molekul kecil telah diramalkan menggunakan program Pyrex. Molekul LDHA (PDB ID:1l10) dan struktur 2D CA dan EGCG yang diperoleh daripada pangkalan data kompaun NCBI PubChem telah digunakan dalam Pyrex. ID CA ialah 9064 dan EGCG ialah 65064. Taburan relatif cas permukaan ditunjukkan dengan kawasan berasid berwarna merah, kawasan asas berwarna biru dan kawasan neutral berwarna putih. Ikatan hidrogen dalam kompleks LDHA dengan CA atau EGCG, masing-masing, ditunjukkan sebagai garis putus-putus hitam. Jujukan diperoleh daripada UniProt (https://www.uniprot.org, diakses pada 9 November 2020) dengan nombor penyertaan P00338(LDHA).

4.10.Pemindahan RNA Jepit Rambut Pendek (shRNA)

Vektor olok-olok pLKO.1 dan shRNA mensasarkan vektor LDHA telah digunakan, seperti yang diterangkan sebelum ini [50]. Sel telah disemai pada plat enam telaga (2 × 10 darjah sel / telaga) dan diinkubasi semalaman. Sel SNU620/5FU telah ditransfeksi menggunakan polyethyleneimine (PED) (Polyplus-transfection, llkirch, Perancis), gen, dan nisbah PEI ialah 1:3. Kemudian, sel yang ditransfeksi dirawat dengan 1 ug/mL puromycin selama 1 minggu. Garisan sel kawalan dijana berikutan jangkitan dengan plasmid yang hancur.

4.11. Ekspresi Terlebih LDHA

Plasmid pDEST27-LDHA telah dibina melalui subkloning LDHA cDNA (dibeli daripada Korea Human Gene Bank, Daejeon, Korea) ke dalam vektor pDEST27(Invitrogen). Dua set subklon untuk LDHA telah dijalankan. Untuk pembinaan semula LDHA, sel SNU620/5FU-shLDHA telah ditransfeksi dengan pDEST27-LDHA dan plasmid pDEST27 kosong. Secara ringkas, sel-sel telah dibiakkan sehingga 70 peratus pertemuan. Kemudian, sel-sel telah dirawat dengan campuran termasuk 3ug DNA dan Lipofectamine 2000 (Invitrogen) selama 48 jam. Selepas pengeraman, sel telah dipilih dengan 200 ug/mL G418 selama 1 minggu. Kemudian, untuk mengesahkan keberkesanan pemindahan, kami melakukan ujian Western blot.

4.12.Analisis Apoptosis

Sel apoptosis dikesan menggunakan Kit Pengesanan Apoptosis Annexin V-FITC (BD Biosciences, San Jose, CA, Amerika Syarikat), mengikut arahan pengilang. Secara ringkasnya, sel telah disemai pada plat enam telaga (2×10 darjah sel/telaga) dan dirawat dengan kepekatan CA dan 5FU yang ditunjukkan selama 2 hari. Selepas 2 hari rawatan, sel itu dibasuh dengan 1 × PBS. Sel-sel tersebut digantung dalam 500 μL penimbal pengikat dan dirawat dengan 5 uL annexin V-FITC dan 5 μL propidium iodide （Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）, diikuti dengan pengeraman selama 15 minit pada suhu bilik dalam gelap. Keamatan pendarfluor telah diperiksa menggunakan BD FACS CANTO ⅡI (BD Biosciences).

4.13. Ujian Pengesanan Spesies Oksigen Reaktif (ROS) Mitokondria

Pengeluaran ROS mitokondria dikesan menggunakan Penunjuk Superoksida MitoSOX Red Mitochondrial (Thermo Fisher Scientific). Sel-sel telah disemai pada plat enam telaga （2× 10 darjah sel/telaga） dan Mito-TEMPO（20 μM; Sigma-Aldrich） telah dirawat selama 1 jam sebelum rawatan dadah. Sel-sel telah digantung semula dalam 1 mL 1× phosphate-buffered saline （PBS）, selepas itu 5 μM MitoSOX ditambah. Sel-sel tersebut kemudiannya diinkubasi selama 10 minit pada 37 darjah . Keamatan pendarfluor dianalisis menggunakan BD FACS CANTO II (BD Biosciences). Imej pendarfluor dikesan oleh mikroskop pendarfluor (pembesaran, 100×)(mikroskop Axioimager M1, Carl Zeiss, Oberkochen, Jerman).

4.14.Pewarnaan DAPI Nukleus

SNU620/5FU telah disemai dalam 24-plat perigi (5× 104 sel/telaga) dan dirawat dengan kepekatan CA dan 5FU yang ditunjukkan selama 48 jam. Selepas mencuci dengan 1× PBS, sel digantung semula dalam 1-mL 1× PBS. Sel-sel itu kemudiannya diwarnai dengan 4ug/mL DAPI selama 30 minit pada suhu bilik dan diperiksa di bawah mikroskop pendarfluor (pembesaran, 200 ×) (Carl Zeiss).

4.15. Analisis statistik

Keputusan daya maju sel, pengeluaran laktat, ECAR, OCR, qRT-PCR, LDHA, aktiviti LDHB, apoptosis, dan ROS mitokondria ditunjukkan secara relatif kepada nilai kawalan dan dinyatakan sebagai min ± ralat piawai min bagi tiga eksperimen bebas. Perbezaan di atas nilai min setiap kumpulan telah dianalisis oleh ujian-t Pelajar, manakala perbezaan antara kumpulan dianalisis dengan analisis varians sehala dengan ujian post hoc Tukey menggunakan GraphPad Prism (Versi5.0, GraphPad Software, San Diego, CA, Amerika Syarikat).

5. Kesimpulan

Diambil bersama, sel SNU620/5FU kanser gastrik yang tahan mempunyai fenotip glikolitik, termasuk peningkatan pengeluaran laktat dan ekspresi LDHA yang lebih tinggi daripada sel SNU620 ibu bapa. Mengehadkan glikolisis dengan CA, sebagai perencat khusus LDHA, memekakan sel SNU620/5FU kepada 5FU. Selain itu, rawatan bersama dengan CA dan 5FU meningkatkan ROS mitokondria dan kematian sel apoptosis dalam sel tahan 5FU. Penemuan kami mencadangkan bahawa CA mungkin calon yang menjanjikan untuk pembangunan ubat pembantu yang mengurangkan daya tahan terhadap kemoterapi berasaskan 5FU dengan menyekat aktiviti LDHA.

Bahan Tambahan: Perkara berikut boleh didapati dalam talian di https://www.mdpi.com/article/10 .3390/ijms22105406/s1, Rajah S1: Kesan 5FU terhadap daya maju SNU620/5FU clls, Rajah S2: Pertumbuhan SNU620 dan sel SNU620/5FU diukur dengan pengiraan sel, Rajah S3:Tahap pengeluaran laktat SNU620 dan SNU620/5FUcells, Rajah S4: Ungkapan isotaip PDK dalam sel SNU620 dan SNU620/5FU, Rajah S5: Kesan oksamat pada daya maju dan SNU620 Sel SNU620/5FU, Rajah S6: Kesan EGCG pada aktiviti LDHA dan LDHB, Rajah S7: Kesan catechin (CA) pada tahap ekspresi protein p-PDHA1, PDHA1 dan PDKs, Rajah S8: Analisis kalorimetri titrasi isoterma (ITC) daripada LDHA dan CA, Rajah S9: ekspresi LDHA dalam sel SNU620/5FU yang ditransfeksi dengan shLDHA, Rajah S10: Pengukuran fenotip glikolitik dan daya maju sel dalam pelbagai sel kanser, Rajah S11: Data mentah ujian Western blot.

Artikel ini dipetik daripada Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 5406. https://doi.org/10.3390/ijms22105406 https://www.mdpi.com/journal/ijms