Menyasarkan Cathepsin B Oleh Cycloastragenol Meningkatkan Kekebalan Antitumor Sel CD8 T Melalui Menghalang Degradasi MHC-I Bahagian 1

ABSTRAK

Latar belakangKehilangan antigen tumor dan kehabisan sel T CD8 yang disebabkan oleh laluan PD-1/PD-L1 merupakan faktor penting untuk melarikan diri imun tumor. Dalam beberapa tahun kebelakangan ini, terdapat peningkatan penyelidikan mengenai perubatan tradisional Cina dalam rawatan tumor. Cycloastragenol (CAG), molekul aktif yang berkesan dalam Astragalus membranaceus, didapati mempunyai fungsi antivirus, antipenuaan, anti-radang dan lain-lain. Walau bagaimanapun, kesan dan mekanisme antitumornya tidak jelas.

Glikosida cistanche juga boleh meningkatkan aktiviti SOD dalam tisu jantung dan hati, dan dengan ketara mengurangkan kandungan lipofuscin dan MDA dalam setiap tisu, dengan berkesan menghilangkan pelbagai radikal oksigen reaktif (OH-, H₂O₂, dll.) dan melindungi daripada kerosakan DNA yang disebabkan oleh OH-radikal. Glikosida phenylethanoid cistanche mempunyai keupayaan penghapusan radikal bebas yang kuat, keupayaan pengurangan yang lebih tinggi daripada vitamin C, meningkatkan aktiviti SOD dalam penggantungan sperma, mengurangkan kandungan MDA, dan mempunyai kesan perlindungan tertentu pada fungsi membran sperma. Polisakarida cistanche boleh meningkatkan aktiviti SOD dan GSH-Px dalam eritrosit dan tisu paru-paru tikus senescent eksperimen yang disebabkan oleh D-galaktosa, serta mengurangkan kandungan MDA dan kolagen dalam paru-paru dan plasma, dan meningkatkan kandungan elastin, mempunyai kesan penghapusan yang baik pada DPPH, memanjangkan masa hipoksia pada tikus senescent, meningkatkan aktiviti SOD dalam serum, dan melambatkan degenerasi fisiologi paru-paru dalam tikus senescent secara eksperimen Dengan degenerasi morfologi selular, eksperimen telah menunjukkan bahawa Cistanche mempunyai keupayaan antioksidan yang baik. dan berpotensi menjadi ubat untuk mencegah dan merawat penyakit penuaan kulit. Pada masa yang sama, echinacoside dalam Cistanche mempunyai keupayaan yang ketara untuk menghilangkan radikal bebas DPPH dan mempunyai keupayaan untuk mengais spesies oksigen reaktif dan menghalang degradasi kolagen yang disebabkan oleh radikal bebas, dan juga mempunyai kesan pembaikan yang baik pada kerosakan anion radikal bebas timin.

Klik pada kebaikan dan keburukan cistanche

【Untuk maklumat lanjut:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】

KaedahKesan antitumor CAG telah disiasat dalam model tumor yang dipindahkan tetikus MC38 dan CT26. Kesan antitumor CAG selanjutnya dianalisis melalui penjujukan multi-omik sel tunggal. Teknologi pemprofilan kebolehcapaian responsif sasaran telah digunakan untuk mencari protein sasaran CAG. Selepas itu, mekanisme antitumor CAG telah diterokai menggunakan mikroskop confocal, immunoprecipitation, dan pemindahan plasmid mutan. Akhirnya, kesan antitumor gabungan antibodi CAG dan PD-1 dalam tikus atau organoid telah disiasat.

KeputusanKami mendapati bahawa CAG berkesan menghalang pertumbuhan tumor dalam vivo. Atlas multi-omik sel tunggal kami menunjukkan bahawa CAG mempromosikan pembentangan antigen permukaan sel tumor dan dicirikan oleh fungsi pembunuhan yang dipertingkatkan bagi sel T CD8 ditambah. Secara mekanikal, CAG terikat kepada protein sasarannya cathepsin B, yang kemudiannya menghalang degradasi lisosom kompleks histokompatibiliti utama I (MHC-I) dan mempromosikan agregat n MHC-I ke membran sel, meningkatkan pra-stesen antigen tumor. . Sementara itu, gabungan CAG dengan antibodi PD-1 berkesan meningkatkan pembunuh tumor membunuh tumor CD8 ditambah sel T dalam tikus xenograf dan organoid kanser kolorektal. Kesimpulan Data kami melaporkan buat kali pertama bahawa cathepsin B downregulation memberikan imuniti antitumor dan tarikh exp mekanisme antitumor produk CAG semulajadi.

PENGENALAN

Kanser kolorektal adalah salah satu kanser yang paling biasa di seluruh dunia. Kadar kejadian dan kadar kematiannya berada di antara tiga teratas, mengancam nyawa dan kesihatan manusia secara serius.1 Kaedah rawatan biasa termasuk kemoterapi pembedahan dan radioterapi, ubat yang disasarkan dan imunoterapi.2–4 Walau bagaimanapun, sel-sel kanser biasanya menunjukkan kehilangan antigen permukaan dan ekspres. tahap tinggi molekul menghalang untuk melarikan diri dari pengawasan sel imun. Oleh itu, untuk menyelesaikan masalah pelarian imun tumor, penyelidik telah membangunkan perencat pusat pemeriksaan imun dan terapi neoantigen untuk menyekat penyekat sel kanser kepada sel imun.5–8 Walaupun perencat pusat pemeriksaan imun boleh memulihkan sel imun yang telah habis, antigen permukaan kanser sel-sel belum didedahkan dengan ketara. Oleh itu, amat penting untuk mencari ubat yang boleh menggalakkan pembentangan antigen permukaan tumor Pengiktirafan sel kanser oleh sel T CD8 tambah sitotoksik bergantung pada laluan kompleks histokompatibiliti utama (MHC-I) TCR/CD3/utama. TCR menerima antigen yang hadir oleh protein membran sel dendritik/sel kanser CI dan menghantar isyarat untuk menyambung ketat CD3, yang kemudiannya meluas lebih dalam ke dalam sitoplasma.9 10 Pada masa yang sama, dengan pengaktifan isyarat CD28/B7 , CD8 plus sel T boleh diaktifkan bersama untuk mengenali dan membunuh sel kanser.11 Kajian terkini mendapati, dalam proses perkembangan tumor, lisosom mengakibatkan pengurangan pengagregatan MHC-I pada permukaan sel kanser, yang tidak berkesan. antigen hadir.12 13 Liu et al melaporkan bahawa perencatan PCSK9 boleh menghalang degradasi MHC-I dalam lisosom dan membolehkan MHC-I kembali ke membran sel untuk membentangkan antigen.12 Oleh itu, memulihkan fungsi pembentangan antigen MHC-I amat penting untuk menghalang pelepasan imun tumor.

Semakin banyak kajian mendapati bahawa penggunaan molekul aktif perubatan tradisional Cina n campur tangan antitumor mempunyai prospek yang hebat.14 15 Cycloastragenol (CAG) ialah molekul aktif Astragalus membranaceus yang berkesan, yang mempunyai antivirus, antibakteria, anti- keradangan, dan kesan farmakologi lain, tetapi kesan antitumornya jarang dilaporkan.16–19 Dalam kajian ini, kami mendapati bahawa CAG menghalang pertumbuhan tumor tran anted tumor kanser kolonMekanisme terutamanya melibatkan menghalang kemerosotan MHC-I, dimediasi oleh cathepsin B (CTSB), menggalakkan pembentangan antigen sel kanser, dan kemudian meningkatkan keupayaan membunuh sel T CD8 plus.

BAHAN DAN KAEDAH

Antibodi dan reagen

CAG was obtained from Yongjian Pharmaceutical Technology (Jiangsu, China, purity >99 peratus). Antibodi CTSB (Cat#12216-1-AP, PRID: AB_2086929 ), HLA (Cat#15240-1-AP, PRID: AB_1557426 ), Actin (Cat#{{ 5}}Ig, PRID: AB_2782959 ), Tubulin (Cat#10094-1-AP, PRID: AB_2210695 ), dan Kit Pengesanan Imunohistokimia Anti-tikus/arnab (Cat#PK10006) telah dibeli daripada Proteintech. Antibodi H2-Kd (Cat#sc-53852, PRID: AB_784514), LAMP1 (Cat#sc- 20011, PRID: AB_626853), dan CTSB (Cat#sc-365558, PRID: AB_10842446) telah dibeli daripada Santa Cruz Biotechnology. Antibodi Ki-67 (Cat#12202, PRID: AB_2620142 ) telah dibeli daripada Teknologi Isyarat Sel. Antibodi Na/K ATPase (Cat# ab3528, RRID: AB_303877) telah dibeli daripada Abcam. Antibodi sitometri aliran CD45-V500 (Cat#561487, RRID: AB_1069704 6), CD3-APC (Cat#345767, RRID: AB_2833003 ) dan CD{ {31}}PerCP (Cat#345774, RRID: AB_2868802 ) telah dibeli daripada BD Bioscience. Antibodi sitometri aliran Gzmb-FITC (Cat# 515403, RRID: AB_2114575 ) telah dibeli daripada BioLegend. Antibodi sitometri aliran NK1.1-PE-Cy7 (Cat#25-5941-81, RRID:AB_469664) dan IFN- -PE (Cat#12-7311-81, RRID :AB_466192) telah dibeli daripada Thermo Fisher Scientific. Medium DMEM (Cat#01-052-1ACS), PenicilinStreptomycin (Cat#15140122) dan Fetal Bovine Serum (Cat#C04001-500) telah dibeli daripada Biological Industries. Serum kambing (Cat#88RNG001) dan Kit ujian protein Pierce BCA (Cat#23225) telah dibeli daripada Thermo Fisher Scientific. Antibodi PD anti-manusia-1 (Cat#BE0188, RRID: AB_1095031 8) dan PD anti-tikus-1 (Cat#BE0146, RRID: AB_1094905 3) telah dibeli daripada sel Bio X. Kit Dissosiasi Tisu Tumor MACS (Cat#130-095-929) telah dibeli daripada Miltenyi Biotec.

Kultur sel

Talian sel kanser kolon tikus MC38 dan CT26 telah dikekalkan di makmal kami.20 Garis l kanser kolon manusia HCT-116 diperoleh daripada Koleksi Budaya Jenis Akademi Sains China (Shanghai, China). Sel MC38, CT26 dan HCT-116 telah dikultur dalam medium DMEM yang mengandungi 10 peratus serum lembu janin dan 1 peratus penisilin/streptomisin pada 37 darjah dalam inkubator CO2 5 peratus.

Eksperimen tumor pemindahan

Tikus C57BL/6JGpt betina enam lapan minggu, tikus BALB/c dan BALB/,c tikus bogel telah dibeli dari GemPharmatech (Nanjing, China). Sel kanser MC38 atau CT26 (1 × 106) telah disuntik secara subkutan ke dalam setiap tetikus. Pada tumor yang membesar hingga 100 mm3, mikrofon dibahagikan secara rawak kepada kumpulan salin buffer fosfat (PBS) (cth, sekali sehari) dan kumpulan CAG (cth, 50mg/kg sekali sehari). Isipadu tumor ditentukan dengan ukuran angkup menggunakan formula V=panjang×lebar2 /2. Apabila jumlah tumor tikus kumpulan PBS mencapai 1000 mm3, tumor tikus telah dibawa keluar, difoto, dan ditimbang.

Pemisahan sel tunggal dari tetikus untuk RNA sel tunggal/ATACseq

Tumor pepejal daripada tikus telah dicerna menggunakan Kit Dissosiasi Tumor untuk mendapatkan sel tunggal sel tunggal. Sel tunggal sel tunggal dengan kepekatan 1000 sel/1000 sel dimuatkan pada 10×genomik pengawal kromium sel tunggal sel tunggal mengikut protokol pengeluar 10×genomik. Reagen transkripsi terbalik, manik gel berkod bar, dan minyak pembahagian telah dicampur dengan sel untuk gen untuk menghasilkan manik gel dalam emulsi (GEM) untuk transkripsi terbalik. prapemprosesan data scRNA-seq dan kawalan qua y.

Berdasarkan genom rujukan tetikus GRCm38 (mm10), saluran paip CellRanger V.4.{0.0 (10×Genomics) untuk memproses RNA sel tunggal data jujukan untuk setiap eksperimen (GSE197229). Matriks ekspresi gen digital telah dized dalam R (V.4.0.4) menggunakan pakej Seurat (V.4.0.0).21 Sebelum analisis dBeforem, sel telah ditapis oleh nombor UMI (<100,000 UMIs), gene number (<6500 genes), and mitochondrial gene percentage ('percentage. MT'less than 10%). Normalization was performed with the SCTransform function with regression of percentage the of mitochondrial genes.22 For integration, 2000 shared highly variable genes were identified using the t SelectIntegrationFeatures function.23 Integration anchors were identified based on these genes using the FindIntegrationAnchors34 function with an'SCT'normalization method. The data were then integrated using the IntegrateData function. Principal component analysis (PCA) and t-distributed stochastic neighbor embedding (t-SNE) dimension reduction with the top 30 principal components were performed. A nearest-neighbor graph using the 30 dimensions of the PCA reduction was calculated using FindNeighbors, followed by clustering using FindClusters with a resolution of 0.8. Candidate Marker genes for each cell cluster were identified by the FindAllMarkers function. For each cluster of cells, up-specific differentially expressed genes were identified using the Wilcoxon Rank Sum test as implemented in FindAllMarkers.

Prapemprosesan data SeaTac-seq dan kawalan kualiti

Data ATAC-seq sel tunggal (GSE197229) telah dipraproses oleh renjer sel (V.2.0.0) dengan baris arahan kiraan. Untuk pemprosesan dan analisis data scATAC-seq seterusnya, kami menggunakan pakej ArchR (V.1.{0.1).24 Kemudian, kami menggunakan fungsi addArchRGethe nome ('mm10') untuk anotasi genom dan mencipta fail anak panah dengan fungsi cre ArrowFiles dengan parameter lalai. Seterusnya, kami menggunakan fungsi filterDoublets untuk memadamkan doublets yang berpotensi dan mencipta projek ArchR menggunakan fungsi ArchRProject dengan parameter lalai. Kami kemudian menggunakan pakej Harmony untuk mengalih keluar kesan kelompok oleh fungsi addHarmony.25 Untuk pengurangan dimensi, kami menggunakan fungsi addIterativeLSI dalam ArchR untuk dijalankan dengan parameter def t. Untuk pembenaman sel tunggal, kami memilih objek reducedDims dengan harmoni dan menggunakan fungsi addTSNE dengan parameter 'perplexity=30' untuk visualisasi.

Analisis bersepadu data siRNA-seq dan scATAC-seq

To integrate scATAC-seq data with matched scRNA-seq data, we first used the FindTransferAnchors function from the Seurat package and aligned the data with the addGeneIntegrationMatrix function in ArchR with  'unconstrained integration' mode. From the result, we found that most of the predicted scores were>0.5. Untuk meningkatkan ketepatan ramalan untuk mengintegrasikan kedua-dua set data dengan lebih baik, kami sekali lagi menyepadukan data scATAC-seq dan scRNA-seq menggunakan mod 'integrasi terhad'. Secara ringkas, kami menganotasi data scATAC-seq dengan jenis sel berdasarkan skor gen scATAC-seq. Kemudian, kami mencipta senarai terhad supaya persamaan ekspresi gen dikira hanya dalam jenis sel yang sama untuk kedua-dua scATAC-seq dan scRNA-seq. Pengelompokan tanpa pengawasan dengan t-SNE mendedahkan 13 kelompok sub-sel, yang telah dijelaskan oleh penanda yang diketahui atau diduga dalam Jadual tambahan dalam talian 1.

Trajektori keturunan pseudotime

Trajektori keturunan sel sel kanser telah disimpulkan dengan menggunakan pakej Monocle2 (V.2.18.0) R.26 Monosit mempelajari graf induk eksplisit daripada data genomik sel tunggal melalui Pembenaman Graf Terbalik untuk mengisih sel, sekali gus menyelesaikan kompleks proses biologi dengan mantap dan tepat.27 Kami menggunakan fungsi ''differentialGeneTest'' untuk memperoleh DEG daripada setiap kelompok, dan selepas membina trajektori sel, kami mengesan gen yang dinyatakan secara berbeza dalam masa pseudo. Semua gen bergantung masa pseudo telah divisualisasikan oleh fungsi peta haba_masa pseudo{10}}plot yang mengambil objek CellDataSet. Plot trajektori garis keturunan dan lengkung ekspresi lancar berdasarkan CellDataSet telah dijana oleh_sel{12}}plot dan gen_plot_dalam_masa pseudo, masing-masing.28

Panggilan variasi nombor salinan sel tunggal

Untuk mengenal pasti sel malignan dengan variasi nombor salinan kromosom skala besar (CNV), kami menggunakan pakej inferCNV R untuk membuat kesimpulan profil genetik setiap sel berdasarkan ekspresi purata set gen besar dalam setiap kawasan kromosom genom tumor berbanding dengan sel normal.29 Berdasarkan sampel demi sampel, sel imun digunakan sebagai rujukan untuk menganggar CNV dalam sel berkaitan kanser.

Analisis pengayaan

Analisis anotasi laluan KEGG dan GO telah dilakukan menggunakan pakej R clusterProfiler (V.3.11.1) dengan parameter PValueCutoff=0.05, PAdjustMethod=BH, QValueCutoff{{6} }.05, MingsSize=10 dan MaxGSSize=500.20Analisis pengayaan set gen (GSEA) telah digunakan menggunakan 50 set gen ciri (h.all.V.7.4.simbol. gmt) untuk mengenal pasti diperkaya dengan ketara laluan berfungsi melalui perisian GSEA (V.4.1.0), dengan kriteria penyaringan nilai P nominal<0.05and false discovery rate q<0.250.30

Analisis PCR masa nyata kuantitatif

Sel MC38 dan HCT-116 telah disemai dalam plat enam telaga selama 6 jam dan kemudian dirawat dengan CAG selama 24 jam lagi. Sel-sel telah dibasuh tiga kali dengan PBS sejuk dan disentrifugasi pada 18{18}}g selama 5 minit pada 4 darjah . Pada masa yang sama, selepas mengisar tisu tumor. Jumlah RNA telah diekstrak daripada sel MC38, HCT-116 dan tisu tumor menggunakan reagen TRIzol, mengikut arahan pengilang. Isipadu tindak balas ialah 20µL yang mengandungi: 1µg RNA, 5µL 5×Hiscript III qRT SuperMix, dan RNase Free dH2 O. cDNA telah tertakluk kepada PCR kuantitatif, dengan isipadu tindak balas 10µL dengan 1µL cDNA, 5µL qPCR campuran primer, 5µL qPCR 0. (Forward and Reverse), dan 3.25µL RNase-free dH2 O. Primer telah disintesis oleh GenScript Biotech Corporation (Nanjing, China) mengikut urutan berikut (jadual tambahan dalam talian 2).

Penemuan sasaran melalui pendekatan pemprofilan kebolehcapaian responsif sasaran

Penyaringan protein pengikat CAG telah dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini.31 32 Secara ringkas, pendekatan pemprofilan kebolehcapaian responsif sasaran (TRAP) digunakan untuk menemui protein pengikat untuk CAG dalam persekitaran sel dengan memantau lisin yang disebabkan oleh penglibatan ligan perubahan kebolehaksesan pada tahap proteome. Secara ringkas, dua hidangan sel telah dirawat dengan 10µM CAG dan dimetil sulfoksida (DMSO), masing-masing. Selepas 1-jam inkubasi, sel-sel telah diresapkan oleh penimbal M-PER (Thermo Scientific) dan lisat yang terhasil dilabelkan secara kovalen dengan penambahan kompleks formaldehid dan borane piridin yang bersama-sama secara khusus melabel residu lisin berprotein pada suhu bilik untuk profil kebolehaksesan . Kemudian, lisat telah dimendakkan oleh pelarut organik, dan pelet yang dikumpul telah dilarutkan semula dalam 8mol/L urea, dikurangkan dengan dithiothreitol (DTT) pada 56 darjah selama 30 minit, diikuti dengan alkilasi menggunakan iodoacetamide (IAA) dalam gelap selama 30 minit. Jumlah penyelesaian DTT yang sesuai telah ditambah sekali lagi untuk bertindak balas dengan lebihan IAA. Selepas itu, proteom dicairkan dengan larutan ammonium bikarbonat sehingga kepekatan akhir urea mencapai 1mol/L. Pencernaan protein yang dikumpul telah dinyahgaram pada lajur C18 HLB (Waters, Milford, Massachusetts, Amerika Syarikat), dan peptida yang diperkaya telah dikeringkan dan disusun semula dalam larutan akueus asid formik (FA) 0.1 peratus. Sistem AnanoLCSYNAPT G2 Si Q-TOF (Waters) digunakan untuk menganalisis sampel bagi pemprofilan kuantitatif perubahan kebolehcapaian lisin sebagai tindak balas kepada pengikatan CAG untuk penemuan sasaran. Pemerolehan pergantungan data dalam mod positif digunakan untuk pemerolehan data. Analisis data dilakukan menggunakan PEAKS Studio V.8.5 (BSI Solutions, Waterloo, Kanada). Khususnya, alkilasi cys dipilih sebagai pengubahsuaian tetap, dan pengoksidaan metionin dan dimetilasi lisin, yang dicapai oleh pelabelan TRAP, ditetapkan sebagai pengubahsuaian berubah-ubah. Secara ringkas, peptida yang mengandungi dimetilasi yang disebabkan oleh TRAP dan mempamerkan banyak perubahan yang ketara dengan dan tanpa pengeraman CAG telah ditetapkan sebagai peptida responsif sasaran. Nisbah kelimpahan setiap peptida berlabel TRAP menunjukkan tahap perubahan kebolehaksesan dan berkait rapat dengan pertalian pengikat ligan. Ujian-t pelajar telah dijalankan untuk menilai sama ada perubahan kebolehcapaian yang dikesan bagi peptida berlabel adalah signifikan secara statistik. Nilai p antara kumpulan (m.s<0.001) and R-value (TRAP ratio > 2 or <0.5) were set as the cut-off to screen the target responsive peptides belonging to the CAG binding proteins from the whole quantified proteome.

Budaya organoid

Organoid kanser kolorektal manusia telah dibina dan ditanam oleh Chongqing Kingbiotech.33 Sampel tisu pesakit yang diperolehi melalui pembedahan telah dicincang menjadi kepingan sekecil mungkin dengan gunting steril. Kepingan tisu telah dicampur dengan teliti dengan Matrigel (Corning, Cat#356231) pada nisbah anggaran 1:4 pada ais. Pemprosesan seterusnya merujuk kepada protokol yang diterbitkan. Secara ringkas, suspensi kepingan-Matrigel telah disemai dengan cepat dalam plat multiwell untuk membentuk titisan hemisfera dan dipindahkan ke 37 darjah selama 15-20 minit, membolehkan titisan menjadi pejal. Menambahkan jumlah medium kultur yang sesuai (Medium Pertumbuhan Organoid KingcultureTM, Cat#KCW-2) ​​pada setiap telaga dan menukar medium setiap 2–4 hari.

Pengasingan dan budaya sel T CD8 manusia

Tambah jumlah garam biasa yang sama kepada darah periferi orang sihat yang mengandungi antikoagulan untuk mencairkan keseluruhan darah. Tambahkan isipadu larutan pengasingan tertentu ke dalam tiub emparan 15mL, perlahan-lahan masukkan seluruh darah yang telah dicairkan di sepanjang dinding tiub ke bahagian atas larutan pengasingan, dan sentrifuge pada 750g selama 20min. Selepas sentrifugasi, gunakan pipet untuk menghisap monosit dengan teliti di lapisan putih tengah ke dalam tiub emparan 15mL, tambahkan isipadu PBS tertentu untuk ditangguhkan semula, sentrifuge 250g selama 5min, dan buang supernatan. Selepas menambah manik magnet CD8 manusia pada mendakan sel, sel CD8 T diisih mengikut lajur pengisihan LS. Sel T CD8 telah ditambahkan pada plat berlubang yang diprasalut dengan antibodi 5µg/mL CD3 (Thermo Fisher Scientific Cat# 16-0032-38, RRID: AB_2865578) dan kemudian 10ng/mL IL{{15} } (Peprotech Cat# 212-12) dan 5µg/mL CD28 (Thermo Fisher Scientific Cat# 16-0281-81, RRID: AB_468920) telah ditambah dengan kultur selama 24 jam.

Kokultur

Selepas organoid diinkubasi dengan CAG selama 24 jam, medium kultur segar digantikan, dan kemudian organoid dan sel T CD8 yang diaktifkan digantung dalam gel matriks, kemudian penggantungan ditambah ke plat enam telaga dan diletakkan di dalam 37. inkubator darjah selama 15 minit, dan kemudian 2mL medium kultur lengkap bebas serum ditambah selama 24 jam.

penghapusan Barat

Sel MC38 dan HCT-116 telah disemai dalam plat enam telaga selama 6 jam dan kemudian dirawat dengan CAG selama 24 jam lagi. Sel-sel telah dibasuh tiga kali dengan PBS sejuk, dan disentrifugasi pada 180g selama 5 minit pada 4 darjah. Jumlah protein dilisiskan dengan lisis WB-IP yang mengandungi 1 peratus perencat protease selama 30 minit di atas ais. Jumlah protein dinilai menggunakan kit kuantiti protein BCA. Sampel protein diasingkan sebanyak 10 peratus –12 peratus elektroforesis gel poliakrilamida SDS dan dipindahkan ke membran PVDF (polyvinylidene fluoride) pada 350 mA selama 90 minit. Membran PVDF telah disekat dengan 5 peratus BSA selama 1 jam, jalur dengan antibodi primer yang ditunjukkan semalaman, dan dengan antibodi sekunder diinkubasi selama 90 minit pada suhu bilik. Akhirnya, jalur telah dikesan menggunakan sistem substrat chemiluminescent LumiGLO (KPL, Gaithersburg, Maryland, Amerika Syarikat).

Sitometri aliran

Selepas penghadaman tisu tumor dan penggantungan sel tunggal disediakan. Pewarnaan permukaan dilakukan dengan antibodi antigen permukaan dalam penimbal FCM (Flow Cytometry) (PBS yang mengandungi 1 peratus FBS) dan diwarnakan pada ais dengan antibodi yang sesuai selama 30 minit. Pewarna reaktif (eBiosains) digunakan untuk menghapuskan sel mati. Pewarnaan sitokin intraselular dilakukan dengan larutan fiksatif sel BD/larutan membran ekstraselular, dan sel-sel telah ditetapkan dan meresap, dan kemudian diwarnai dengan antibodi terhadap sitokin dalam penimbal Perm/Wash (BD Biosciences).

Plasmid mutan CTSB ditransfeksi

Sel HCT-116 telah disemai dalam 6-plat perigi selama 12 jam dan kemudian ditransfeksi dengan plasmid mutan CTSB-WT-EGFP atau CTSB (Y75A, A77V dan G198A) selama 36 jam.

Gangguan pemindahan atau plasmid ekspresi berlebihan CTSB ke dalam sel MC38 atau sel HCT-116

Sel MC38 (1×106 /telaga) telah diinokulasi dalam 6-plat perigi selama 6 jam, kemudian ditransfeksi dengan RNA yang mengganggu CTSB (jujukan: Hadapan-GGACAUAGAUCUACCUGAATT dan Balik-UUCAGGUAGAUCUAUGUCCTT) selama 48 jam, dan tahap ekspresi mRNA atau protein daripada Ctsb dan H2-k1 telah dikesan. Sel HCT-116 (1×106 /telaga) telah diinokulasi dalam 6-plat perigi selama 6 jam, kemudian ditransfeksi dengan gangguan CTSB (jujukan: GCTGGTCA ACTATGTCAACAA) atau plasmid ekspresi berlebihan selama 48 jam dan mRNA atau tahap ekspresi protein CTSB dan HLA-A telah dikesan.

Teknologi dok

Struktur 3D CTSB telah dimuat turun daripada Pangkalan Data Protein (PDB ID: 2iPP), dan struktur CAG telah dimuat turun dari PubChem. Proses dok dilakukan dalam Autodock 2 dengan dok kasar menggunakan algoritma penyepuhlindapan simulasi dan penghalusan seterusnya menggunakan algoritma genetik.

Ujian anjakan haba selular

Sel MC38 telah disemai dalam plat 10sm semalaman dan kemudian dirawat dengan CAG atau 0.1 peratus DMSO selama 2 jam lagi. Sel-sel telah dikumpulkan, dibasuh dengan PBS sejuk, dan disentrifugasi pada 180g selama 5 minit. Sel-sel kemudiannya dibahagikan sama rata ke dalam tiub sentrifugasi (70μL setiap tiub) dan dipanaskan selama 3 minit pada suhu berikut: 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, dan 67 darjah, sampel disejukkan selama 3 minit pada suhu dan kemudian terus di atas ais. Kemudian, sampel diletakkan di dalam peti sejuk pada suhu -80 darjah semalaman. Sampel dicairkan pada suhu bilik selama 30 minit dan kemudian disejukkan pada suhu -80 darjah selama 4 jam. Akhir sekali, sampel telah disentrifugasi pada 12, 000g selama 25min, supernatan ditambah pada penimbal pemuatan dan dianalisis dengan Western blotting.

Pewarnaan imunohistokimia

Bahagian parafin tisu tumor direndam dalam xilena selama 20 minit hingga dewax, dan kemudian dalam etanol 100 peratus, 75 peratus dan 50 peratus selama 10 minit. Selepas hirisan tertakluk kepada pembaikan antigen dengan larutan pembaikan antigen natrium sitrat, hidrogen peroksida endogen dinyahaktifkan dengan 3 peratus hidrogen peroksida. Selepas menyekat dengan 5 peratus serum kambing selama 1 jam, antibodi anti-Ki67 (1:200) ditambah dan diinkubasi semalaman pada suhu 4 darjah . Polimer berlabel HRP anti-tikus/arnab (100µL) telah ditambah dan sampel diinkubasi pada 37 darjah selama 30 minit, diikuti dengan 100µL larutan kerja DAB, dan pengeraman pada suhu bilik selama 5 minit. Selepas 1 minit pewarnaan dengan hematoxylin, sampel telah dibasuh dalam 50 peratus, 75 peratus, dan 100 peratus etanol dan xilena selama 5 minit, dan gusi neutral digunakan untuk mengelak filem. Filem itu diperhatikan dan diambil gambar di bawah mikroskop.

Statistikanalisis

Analisis statistik telah dilakukan menggunakan perisian GraphPad Prism (V.8.0). Semua keputusan dinyatakan sebagai min ± SEM bagi tiga eksperimen bebas. Analisis varians sehala diikuti oleh ujian post hoc Dunnett digunakan untuk menilai perbezaan apabila terdapat lebih daripada dua kumpulan. Ujian-t Pelajar digunakan untuk menilai perbezaan yang signifikan antara kedua-dua kumpulan. Kepentingan statistik telah ditetapkan pada p<0.05.

KEPUTUSAN

Analisis multi-omik sel tunggal CAG menghalang pertumbuhan kanser kolon yang dipindahkan pada tikus

Untuk menyiasat sama ada CAG mempunyai kesan antitumor, kami mula-mula memindahkan sel kanser MC38 ke dalam tikus C57BL/6. Kami menyatakan bahawa CAG dengan ketara menghalang pertumbuhan tumor (angka tambahan dalam talian S1A, B). Selepas itu, kami memindahkan sel CT26 ke dalam tikus BALB / c dan mendapati bahawa CAG juga menghalang pertumbuhan tumor (angka tambahan dalam talian S1C, D).

Untuk mendedahkan lagi mekanisme khusus yang mana CAG menghalang pertumbuhan tumor, kami menganalisisnya menggunakan teknik scRNA-seq dan scATAC-seq (rajah 1A). Kami membahagikan populasi sel kepada empat kumpulan: sel kanser, fibroblas, sel myeloid, dan limfosit (angka 1B, angka tambahan dalam talian S2A, B). Kami mendapati bahawa sel-sel kanser (52 peratus) dan fibroblas (41 peratus) terutamanya menyusup dalam tisu tumor, manakala sel imun menyumbang hanya 7 peratus. Kami kemudian membahagikan sel kanser kepada lapan subset dan fibroblas kepada tiga subset (angka 1C-E). Selepas itu, analisis pengayaan gen yang sangat dinyatakan dalam setiap populasi sel menunjukkan bahawa laluan molekul MHC-I dalam sel kanser telah diperkaya, seperti isyarat antitumor sel T dan sel NK (angka tambahan dalam talian S2C). Kemudian, empat kumpulan sel juga ditemui menggunakan analisis integrasi scATAC-seq dan scRNA-seq (angka 2D-G). Berikutan perbandingan, kami mendapati bahawa sel-sel kanser (C01, sel C03), sel CD8 ditambah T, Spp1 ditambah sel TAM, dan fibroblas (sel F01 dan F02) muncul dalam penjujukan ATAC (angka 1F, G), dan seterusnya, sangat dinyatakan. faktor transkripsi diperkaya dalam sel-sel ini (rajah 1H). Melalui analisis ini, kami membuat spekulasi bahawa perencatan pertumbuhan tumor oleh CAG berkait rapat dengan perubahan dalam sel-sel ini.

Cag menggalakkan pembentangan antigen sel tumor

Untuk menganalisis mekanisme antitumor CAG, kami mula-mula menganalisis populasi sel tumor dan membahagikan sel-sel kanser kepada lapan subkumpulan (angka 2A, B, angka tambahan dalam talian S3A). Keputusan menunjukkan bahawa, berbanding dengan kumpulan PBS, sel kumpulan C05 menurun dengan ketara manakala sel kumpulan C07 meningkat (angka 2C). Sementara itu, untuk mengesahkan ketepatan pengelompokan sel tumor kami, kami membandingkan CNV limfosit dan sel myeloid sebagai sel rujukan. Keputusan menunjukkan bahawa CNV sel kanser adalah jauh lebih tinggi daripada sel imun (angka tambahan dalam talian S3B). Apabila menganalisis subset sel kanser, kami mendapati bahawa gen tindak balas interferon Isg15, Irf7, Ifit3, dan Ifi47 sangat dinyatakan dalam populasi sel C07 dan C08 kumpulan CAG berbanding dengan kumpulan PBS (angka tambahan dalam talian S3C). Analisis populasi sel tumor mendapati bahawa laluan berkaitan pembentangan antigen diperkaya dengan ketara dalam berbilang populasi sel. Oleh itu, kami membuat spekulasi bahawa CAG boleh menggalakkan pembentangan antigen sel kanser untuk memainkan peranan antitumor (angka 2D). Kemudian, kami memilih gen yang berkaitan dengan pembentangan antigen dan mendapati bahawa tahap ekspresi dalam kumpulan CAG jauh lebih tinggi daripada kumpulan PBS (angka 2E, angka tambahan dalam talian S3D). Kami juga mendapati bahawa CAG menggalakkan pembentangan antigen dalam tisu tumor (angka 2F, G).

Seterusnya, kami menggunakan scATAC-seq untuk menganalisis sebab khusus di sebalik pembentangan antigen sel tumor yang menggalakkan CAG. Kami mendapati bahawa populasi sel tumor sangat menyatakan faktor transkripsi Fos, Junb, Jund, Fosb, dan Fosl1 (angka 2H, I). Selepas itu, kami membina peta interaksi antara faktor transkripsi dan gen yang sepadan untuk menjelaskan bahawa CAG mempromosikan ekspresi gen berkaitan antigen yang berkaitan dengan sel tumor (angka 2J). Dalam tisu tumor, kami juga mendapati bahawa faktor transkripsi Junb, Fos, Jund, dan Fosb telah diekspresikan dengan ketara dalam kumpulan PBS di bawah rawatan CAG (angka 2K-N, angka tambahan dalam talian S3E-I). Setakat ini, kami telah mendapati bahawa CAG boleh menggalakkan ekspresi faktor transkripsi gen yang berkaitan dengan pembentangan antigen, dengan itu meningkatkan fungsi pembentangan antigen sel kanser. Walau bagaimanapun, bagaimana sel-sel kanser ini bertindak balas terhadap tindak balas sel imun masih tidak jelas.

Untuk mendedahkan fenomena yang CAG menggalakkan pembentangan antigen sel kanser, kami melakukan analisis trajektori untuk menyiasat cara sel kanser mengubah satu sama lain sebagai tindak balas kepada tindak balas sel imun. Kami mendapati bahawa, dari masa ke masa, sel kanser C07 berubah menjadi sel C05, C06, dan C08, dan pengayaan gen juga menunjukkan bahawa sel kanser akan berubah kepada pembentangan antigen (angka 3A-E).

CAG meningkatkan fungsi membunuh sel imun

Keputusan ini menunjukkan bahawa CAG boleh membentangkan antigen sel tumor, jadi adakah mempertingkatkan pembentangan antigen sel tumor membawa kepada peningkatan fungsi sel imun? Untuk mengetahui ini, kami menganalisis limfosit dan sel myeloid, masing-masing. Keputusan menunjukkan bahawa CAG menggalakkan penyusupan CD8 ditambah sel T dalam tisu tumor, dan penyusupan CD8 ditambah sel T dan sel NK juga meningkat, dikesan oleh sitometri aliran (angka tambahan dalam talian S4A-F). Kami juga memerhatikan bahawa CAG meningkatkan ekspresi gen Ifitm2, Cxcr6, dan S100a6 dalam sel T CD8 plus,

Gen Fcer1g, Gzmb, AW112010, dan Zfp36i2 dalam sel NK, dan gen Nfkbia dan Junb dalam sel T CD4 ditambah (angka tambahan dalam talian S4G). Ekspresi Ifng dan Gzmb dalam sel CD8 ditambah T juga dipertingkatkan dengan ketara, seperti yang dikesan oleh sitometri aliran (angka tambahan dalam talian S4H, I). Tambahan pula, kami mendapati bahawa selepas rawatan CAG, ekspresi reseptor perencatan Lag3, Tigit, dan Havcr2 pada permukaan CD8 ditambah sel T menurun, dan ekspresi gen Cd28, Cd69, Gzmk, Ccl5, dan Pdcd1, mencirikan pengaktifan sel T CD8 tambah, meningkat dengan ketara (angka tambahan dalam talian S4J). Untuk mengesahkan lagi bahawa CAG meningkatkan fungsi membunuh sel T CD8 ditambah dengan mempromosikan persembahan antigen tumor yang dipertingkatkan, kami memindahkan sel CT26 ke dalam tumor yang dipindahkan dalam tikus bogel dan memerhatikan bahawa CAG tidak dapat menghalang pertumbuhan tumor dengan berkesan (angka tambahan dalam talian S4K-M ).

Berikutan ini, kami menganalisis sel myeloid dan mendapati bahawa sel TAM Spp1 ditambah selepas rawatan CAG, manakala bilangan sel C1qc ditambah TAM menurun dan bilangan monosit Il1b ditambah (angka tambahan dalam talian S5A-D). Selepas rawatan CAG, sel Spp1 plus TAM dan C1qc plus TAM lebih terdedah kepada transformasi TAM pro-radang. Analisis pengayaan mendapati bahawa ia tertumpu terutamanya pada Tnf-, Ifn-g, dan laluan isyarat tindak balas keradangan (angka tambahan dalam talian S5E-H). Berdasarkan keputusan yang dinyatakan di atas, kami membuat kesimpulan bahawa CAG meningkatkan pengiktirafan dan fungsi membunuh sel imun dengan menggalakkan pembentangan antigen dalam sel kanser. Walau bagaimanapun, bagaimana CAG dikawal tidak jelas.

Penemuan protein sasaran CAG CTSB melalui perangkap

Seterusnya, kami akan menyiasat protein sasaran CAG khusus yang memainkan peranan antitumor. Kami memilih sel kanser sebagai objek kajian kerana kami mendapati bahawa CAG boleh meningkatkan persembahan antigen sel kanser, dengan itu meningkatkan fungsi membunuh sel imun. Kami mula-mula mensintesis derivatif biotin CAG dan mendapati bahawa hanya 3-OH boleh bertindak balas (angka tambahan dalam talian S6A). Kami kemudian menyiasat sama ada CAG-biotin juga menggalakkan ekspresi gen berkaitan pembentangan antigen dalam sel tumor MC38 tetikus. Keputusan menunjukkan bahawa CAG-biotin tidak menjejaskan ekspresi gen H2-K1, Cd74 dan Anxa1 (angka tambahan dalam talian S6B-D).

Oleh itu, kami menggunakan kaedah carian sasaran TRAP sebelumnya di makmal.32 CAG dan DMSO kedua-duanya diinkubasi dengan garisan sel MC38 (rajah 4A). Kami memilih protein dengan FC Lebih Besar daripada atau sama dengan 2 dan ap Kurang daripada atau sama dengan 0.05 sebagai protein sasaran calon CAG. Mengikuti prinsip bahawa pengikatan molekul kecil kepada protein akan membawa kepada kecekapan pelabelan lisin yang rendah, kami memilih CTSB untuk kajian (angka 4B). Seterusnya, kami menggunakan ujian peralihan haba selular (angka 4C) dan termoforesis skala mikro (MST) (angka 4D) untuk mengesahkan pengikatan antara CAG dan CTSB, dan mendapati bahawa pertalian antara CAG dan CTSB ialah 26.6nM (angka 4D). Selepas itu, kami meramalkan tapak pengikatan antara CAG dan CTSB mengikut struktur kristal protein CTSB di perpustakaan PDB. Kami mendapati bahawa kumpulan hidroksil pada kedua-dua hujung CAG dan tapak ALA77 dan GLY198 CTSB terikat oleh ikatan hidrogen, manakala tapak TYR75, PRO76, dan ALA173 CAG dan CTSB terikat oleh daya van der Waals (rajah 4E) . Untuk mengesahkan tapak pengikatan antara CAG dan CTSB, kami mengalihkan plasmid mutan CTSB dalam sel HCT{18}}. Keputusan menunjukkan bahawa pertalian antara plasmid mutan pada A77V dan G198A dan CAG adalah beratus-ratus kali lebih tinggi daripada plasmid WT (angka 4F, G). Dalam bahagian seterusnya, kami meneroka mekanisme khusus yang CAG memainkan peranan antitumor melalui CTSB.

【Untuk maklumat lanjut:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】