Kesan Anti-radang Sinergis Laminaria Japonica Fucoidan Dan Ekstrak Cistanche Tubulosa

Sebagai tindak balas imun terhadap antigen asing, makrofaj mengeluarkan sitokin pro-radang seperti tumor necrosis factor- (TNF- ), interleukin-1 (IL- 1 ), IL-6 dan lain-lain. Sitokin sedemikian mendorong kemasukan kemotaktik granulosit, monosit, limfosit dan sel mast ke tisu rosak yang menggalakkan penyingkiran antigen dan pemulihan tisu. Walau bagaimanapun, penyusupan dan pengaktifan sel yang berlebihan memburukkan lagi kecederaan tisu, yang membawa kepada edema (eksudasi vaskular) dan kesakitan yang merupakan fenomena keradangan yang terkenal.

TNF- ialah faktor penting untuk mendorong ekspresi gen nitric oxide synthase (iNOS) dalam beberapa garisan sel. Pengaktifan iNOS membawa kepada pengeluaran nitrik oksida (NO) yang bukan sahaja memodulasi beberapa fungsi fisiologi seperti bakteria dan vasodilatasi tetapi juga menyebabkan keradangan. Selepas kecederaan tisu, degradasi oleh fosfolipase fosfolipid membran sel menghasilkan asid arakidonik. Asid arakidonik selanjutnya diuraikan oleh siklooksigenase (COX) kepada prostaglandin (PGs). Jumlah PGE2 yang berlebihan yang dibentuk oleh COX-II mendorong beberapa sitokin untuk keradangan. Oleh kerana kedua-dua NO dan PGE2 bertindak sebagai faktor utama untuk keradangan dan induksi kesakitan, laluan TNF--NO dan COX-II-PGE2 adalah aliran utama proses keradangan, yang dihalang oleh kortikosteroid dan bukan steroid.ubat anti-radang(NSAIDs), masing-masing.

Walaupun terdapat beberapa steroid dan NSAID untukterapi penyakit radang, ubat-ubatan ini boleh menimbulkan kesan buruk pada sistem imun, saluran gastrousus, buah pinggang, hati, sistem saraf pusat, tekanan darah dan sistem kardiovaskular. Oleh itu, adalah perlu untuk meminimumkan kesan buruk terapeutik kimia dengan menggantikannya atau menggunakannya dalam kombinasi dengan produk semula jadi.

Fucoidan, kompleks polisakarida sulfat daripada rumpai laut seperti Laminaria japonica dan Cladosiphon okamuranus yang diedarkan secara meluas di banyak negara, telah digunakan sebagai terapeutik dalam perubatan Oriental untuk tempoh yang lama. Dalam kajian terdahulu, ia telah menunjukkan bahawa fucoidan mempunyai anti-oksidatif, anti-koagulatif, anti-kanser, danaktiviti anti-radang. Sehubungan itu, kesan berfaedah fucoidan pada penyakit radang, iskemia, disfungsi imun, dan tumor menarik perhatian penyiasat. Sebaliknya,Cistanche tubulosa(CT) juga telah digunakan secara meluas sebagai ubat tradisional di China. Telah dilaporkan bahawa ekstrak CT menurunkan pengeluaran TNF-á dan IL- 4 yang merupakan faktor utama untuk pengeluaran NO dalam laluan keradangan [19].

Penemuan sebelum ini membawa kami untuk menyiasat keberkesanan gabungan fucoidan dan ekstrak CT pada 2 laluan utama keradangan. Untuk menjelaskan mekanisme tindakan, kami menganalisis NO dan PGE2 dalam eksudat daripada keradangan kantung udara yang disebabkan oleh karagenan.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA UNTUK MENCEGAHAKTIVITI RADANGPHGS75% ECH 30% ACT 12%

Bahan dan Kaedah

Bahan

Fucoidan separuh tulen dan ekstrak air CT diperoleh daripada Misuba RTech Co., Ltd. (Asan, Korea). Ekstrak Fucoidan dan CT disimpan pada 4 darjah, dicampur (1:3) dilarutkan dalam air yang telah disucikan sebelum digunakan, dan diberikan secara lisan dalam jumlah 5 mL/kg.

Kultur sel dan kuantiti NO

Barisan sel makrofaj murine RAW 264.7 telah dibeli daripada American Type Culture Collection (Manassas, USA), dan dikultur dalam medium Eagle's modified Dulbecco (Sigma, St. Louis, USA) yang mengandungi 10% serum lembu janin dan antibiotik [100 U/mL penisilin (Sigma) dan 100 µg/mL streptomycin (Sigma)]. Sel-sel telah diinkubasi dalam suasana CO2 5% yang dilembapkan pada 37 darjah.

Untuk menilai kesan ekstrak fucoidan dan CT pada rembesan NO, sel RAW 264.7 (1×106 sel/mL) diinkubasi dengan ekstrak fucoidan atau CT (1–320 µg/mL) selama 5 minit , diikuti dengan interferon- (IFN-, 10 U/mL) dan lipopolisakarida (LPS, 10 µg/mL) selama 24 jam. Dalam kajian awal kami, telah disahkan bahawa rawatan dengan IFN-plus LPS untuk pengaktifan sel RAW 264.7 tidak menjejaskan daya maju sel sehingga 24 jam dan ekstrak fucoidan dan CT bukan sitotoksik sehingga 1 mg/mL. Kepekatan nitrit (NO2 – ), hasil teroksida NO, diukur sebagai penunjuk NO. Medium kultur dicampurkan dengan jumlah reagen Griess yang sama (1% sulfanilamide, 0.1% naphthyl ethylenediamine dalam 2.5% asid fosforik) [21], dan diinkubasi pada suhu bilik selama 10 minit. Kepekatan nitrit dianalisis pada 540 nm, di mana NaNO2 digunakan untuk menghasilkan lengkung piawai.

Haiwan dan rawatan

Tikus ICR jantan (7 minggu) telah dibeli daripada Daehan Biolink (Eumseong, Korea) dan ditempatkan di dalam bilik dengan keadaan persekitaran yang tetap (22±2ºC; 40-70% kelembapan relatif; 12-jam cahaya -kitaran gelap; 150-300 kecerahan lux). Suapan pelet dan air tulen boleh didapati secara ad libitum. Semua eksperimen haiwan telah diluluskan oleh Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Institusi (IACUC) Universiti Kebangsaan Chungbuk (CBNU), Korea, dan dijalankan mengikut Prosedur Operasi Standard (SOP) Pusat Penyelidikan Haiwan Makmal, CBNU.

Tikus (n=8/kumpulan) telah dirawat secara lisan dengan fucoidan (18 atau 54 mg/kg), ekstrak CT (54 atau 162 mg/ kg), atau campurannya (18+54, {{6 }} atau 90+270 mg/kg) sekali sehari selama 7 hari. Dos rendah fucoidan (18 mg/ kg) dan ekstrak CT (54 mg/kg) adalah daripada anggaran dos manusia sebanyak 100 mg/badan (70 kg) dan 300 mg/badan selepas terjemahan luas permukaan berat badan (Km{{14 }} untuk manusia/Km=3 untuk tetikus), masing-masing. Dos tinggi fucoidan dan ekstrak CT ditetapkan pada 3 lipatan, bersendirian atau dalam campuran, dan campuran dos tertinggi telah ditetapkan pada 5 lipatan untuk menilai kesan sinergistik maksimum.

Pada hari pertama rawatan ekstrak fucoidan dan CT, tikus disuntik secara subkutan dengan 10 mL udara steril ke bahagian belakang untuk membentuk kantung [22,23]. Selepas 2 dan 5 hari, kantung itu disuntik semula dengan 5 mL udara. Satu jam selepas rawatan akhir, 1 mL karagenan (1% dalam garam; Sigma) atau kenderaannya (salinan) disuntik ke dalam kantung.

Analisis eksudat

Kantung udara telah dibasuh dengan 1 mL garam sejuk 6 jam selepas suntikan karagenan, dan isipadu bersih cecair lavage direkodkan. Jumlah bilangan sel radang, neutrofil, monosit, dan limfosit, ditentukan menggunakan kaunter coulter. Kepekatan NO dan PGE2 ditentukan oleh reagen Griess (Sigma) dan immunoassay enzim (EIA) menggunakan kit Correlate-EIA (Reka Bentuk Assay, Ann Arbor, Ann ArboUSA), masing-masing.

CISTANCHE TUBULOSA SEMULAJADI UNTUK TINDAKAN MENYEKAT KE ATAS KEMOTAKSIS SEL inflamasi PHGS75% ECH 30% BERAKTA 12%

Pemeriksaan histopatologi

Tisu pelapik kantung dikeluarkan dan diperbaiki dalam larutan formalin neutral. Slaid tisu tertanam parafin telah diwarnai dengan hematoxylin-eosin, dan diperiksa di bawah mikroskop cahaya untuk lesi keradangan.

Analisis statistik

Keputusan dibentangkan sebagai min ± SE. Perbandingan kumpulan eksperimen dibuat dengan analisis varians sehala diikuti dengan pembetulan ujian Tukey. nilai AP<0.05 was considered statistically significant.

Keputusan

In vitro, kultur sel RAW 264.7, rawatan IFN-, dan LPS telah meningkatkan pengeluaran NO (Rajah 1). Prarawatan dengan fucoidan (1–320 µg/mL) tidak menjejaskan pelepasan NO daripada garisan sel makrofaj (Rajah 1A). Sebagai perbandingan, ekstrak CT (32–320 µg/mL) menekan pengeluaran NO dengan ketara, menunjukkan aktiviti anti-radang (Rajah 1B).

Suntikan karagenan ke dalam kantung udara tikus dengan ketara meningkatkan jumlah eksudat dalam kantung (Rajah 2). Eksudasi yang meningkat sedemikian telah dilemahkan dengan rawatan dengan fucoidan (18 mg/kg) dan ekstrak CT (54 dan 162 mg/kg). Terutama, rawatan gabungan fucoidan dan ekstrak CT mengurangkan lagi jumlah eksudat, berbanding dengan kesan individu, walaupun kombinasi dos yang lebih tinggi (54+162 mg/kg dan 90+270 mg/kg) tidak menunjukkan keberkesanan tambahan. kepada kombinasi dos terendah (18+54 mg/kg) (Rajah 2A). Ontent darjah N dalam kantung juga meningkat secara drastik berikutan suntikan karagenan (Rajah 2B). Berbanding dengan kesan ringan fucoidan, ekstrak CT dengan ketara menurunkan kepekatan darjah N. Rawatan gabungan ekstrak fucoidan dan CT mengurangkan lagi tahap NO dalam cara yang bergantung kepada dos. Begitu juga, kandungan PGE2 yang meningkat telah ditindas secara sinergi oleh terapi kombinasi fucoidan dan ekstrak CT (Rajah 2C).

Selari dengan mediator radang dalam kantung, bilangan sel radang meningkat secara drastik dengan suntikan karagenan: 37.8, 4.8, dan 24.1 lipatan tahap kawalan untuk neutrofil, monosit dan limfosit, masing-masing (Jadual 1). Walau bagaimanapun, ekstrak fucoidan dan CT telah mengurangkan penyusupan sel radang dengan ketara, di mana fucoidan agak unggul daripada ekstrak CT. Tanpa diduga, tiada kesan sinergistik dalam penyusupan sel radang dicapai dengan pentadbiran bersama ekstrak fucoidan dan CT.

Seperti yang disimpulkan daripada penyusupan sel radang dalam eksudat, tisu subkutaneus di sekeliling kantung udara menunjukkan lesi keradangan yang teruk (Rajah 3). Banyak sel dalam tisu subkutaneus yang menebal yang terdedah kepada Carrageenan telah diperhatikan (Rajah 3B), berbanding dengan ciri-ciri hampir normal dalam haiwan kawalan (Rajah 3A). Lesi keradangan sedemikian telah dilemahkan dengan ketara oleh rawatan dengan fucoidan (Rajah 3C dan 3D) atau ekstrak CT (Rajah 3E dan 3F).

Terutamanya, kesan anti-radang yang lebih tinggi diperoleh melalui terapi kombinasi dengan ekstrak fucoidan dan CT (Rajah 3G-3I).

Perbincangan

Menggunakan model keradangan kantung udara yang disebabkan oleh in viv degree arrageenan, suntikan udara ke belakang tikus mendorong percambahan sel yang berstrata pada permukaan rongga untuk membentuk struktur yang serupa dengan sinovium. Dalam model ini, suntikan penyusupan sel radang yang disebabkan oleh karagenan meningkatkan eksudat, yang menunjukkan kebocoran vaskular. Kantung udara berfungsi sebagai takungan sel radang dan mediator yang boleh diukur dengan mudah dalam cecair yang terkumpul secara tempatan.

Antara mediator keradangan yang pelbagai yang boleh mendorong kebolehtelapan vaskular, diketahui bahawa NO dan PGE2 adalah faktor utama yang terlibat dalam patogenesis banyak penyakit keradangan. Mereka juga dikenali sebagai mediator induksi dan persepsi kesakitan. iNOS, yang dinyatakan dan diaktifkan dalam pelbagai jenis sel melalui rangsangan dengan TNF- dan/atau LPS semasa keradangan, menghasilkan kepekatan NO yang tinggi dan berterusan. NO ialah molekul pengawalseliaan yang penting dalam pelbagai fungsi fisiologi, seperti vasodilatasi yang membawa kepada kebocoran vaskular. PGE2, yang dijana daripada asid arakidonik melalui COX, menyumbang kepada perkembangan banyak penyakit radang, dan pengeluaran berlebihan PGE2 sebagai tindak balas kepada pelbagai rangsangan keradangan dikaitkan dengan pengawalan tahap COX-II dan perkembangan keradangan. Oleh itu, laluan TNF- - NO dan COX-II-PGE2 telah dianggap sebagai dua aliran utama proses keradangan, yang masing-masing disekat oleh perencat iNOS (kortikosteroid) dan COX (NSAIDs).

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA UNTUK MELARANG PENYAKIT RADANG PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Dalam kajian ini, pentadbiran bersama ekstrak fucoidan dan CT mengurangkan jumlah eksudat dalam kantung, menunjukkan bahawa mereka mempunyai aktiviti menindas terhadap kebocoran vaskular (Rajah 2A). Berbanding dengan kesan individu setiap ekstrak fucoidan dan CT, rawatan gabungan terus meningkat, membayangkan bahawa tahap dua menggabungkan tindakan secara sinergistik. Kesan sinergistik sedemikian antara ekstrak fucoidan dan CT disokong oleh aktiviti mereka pada tahap NO dan PGE2 dalam eksudat (Rajah 3B dan 2C).

Menariknya, bagaimanapun, telah disahkan bahawa fucoidan tidak secara langsung menghalang pengaktifan makrofaj in vitro assay (Rajah 1A). Begitu juga, potensi perencatan fucoidan pada pengumpulan NO dan PGE2 dalam ujian vivo secara relatifnya lebih rendah daripada ekstrak CT (Rajah 2B dan 2C). Mekanisme tindakan fucoidan sedemikian adalah berbeza daripada penyahaktifan langsung sel oleh ekstrak CT (Rajah 1B). Sebagai perbandingan, fucoidan memberikan keberkesanan yang tinggi terhadap perencatan penyusupan sel radang dalam kantung (Jadual 1). Fucoidan lebih unggul daripada ekstrak CT dalam menyekat penghijrahan neutrofil, monosit, dan limfosit ke tapak kecederaan tisu yang disebabkan oleh karagenan. Menariknya, tiada kesan anti-migrasi sinergistik, menunjukkan mekanisme tindakan yang berbeza antara ekstrak fucoidan dan CT: iaitu, fucoidan menghalang penyusupan sel radang, manakala ekstrak CT menghalang pengaktifan sel.

Sel polimorfonuklear, terutamanya neutrofil, adalah komponen selular utama yang direkrut ke tapak keradangan akut yang disebabkan oleh karagenan. Di samping itu, sel-sel radang seterusnya seperti makrofaj dan limfosit juga memainkan peranan utama dalam proses keradangan dengan merembeskan sitokin. Apabila prarawatan dengan ekstrak fucoidan atau CT, bilangan sel darah putih yang berhijrah ke dalam kantung udara yang disuntik karagenan telah ditekan dengan ketara. Keputusan ini konsisten dengan kesan yang akan diperolehi oleh kortikosteroid seperti dexamethasone, tetapi bukan oleh NSAID termasuk indomethacin. Oleh itu, diandaikan bahawa ekstrak fucoidan dan CT mempunyai sebahagian daripada sifat steroid.

Sebagai tambahan kepada tindakan menyekat pada chemotaxis sel radang, ekstrak CT kelihatan menyekat pengaktifan makrofaj. Ini disahkan oleh tindakan perencatannya pada NO in vitro dan in vivo, yang merupakan pengantara keradangan utama yang dihasilkan oleh makrofaj. Oleh itu, kesan ekstrak CT pada makrofaj mungkin disebabkan oleh penindasan ekspresi mRNA dan/atau perencatan langsung aktiviti iNOS dalam sel-sel ini.

PGE2 juga merupakan salah satu mediator keradangan utama. Ia meningkat selari dengan edema tisu, yang ditindas oleh NSAID, perencat COX. Karagenan boleh meningkatkan pengeluaran PGE2 dengan mendorong mRNA COX-II dan protein COX-II dalam eksudat kantung. Dalam model ini, karagenan meningkatkan jumlah PGE2 dengan ketara dan ia telah ditindas dengan ketara oleh ekstrak CT. Adalah menarik untuk diperhatikan bahawa keputusan ini konsisten dengan kesan yang akan diperolehi oleh indometasin NSAID. Oleh itu, disimpulkan daripada keputusan bahawa ekstrak CT mempunyai sifat tambahan NSAID. Diambil bersama, adalah dipercayai bahawa ekstrak CT memberikan kesan seperti kortikosteroid dan NSAID dalam model keradangan yang disebabkan oleh karagenan dan fucoidan meningkatkankesan anti-radang ekstrak CTdengan menyekat penyusupan sel radang.

Walaupun mentakrifkan mekanisme tindakan yang tepat memerlukan kajian lanjut, campuran fucoidan dan ekstrak CT melemahkan tanda-tanda keradangan dengan menyekat laluan TNF- –NO dan COX-II–PGE2 dalam keradangan kantung udara yang disebabkan oleh karagenan. Penemuan ini memberikan bukti bahawa rawatan gabungan fucoidan dan ekstrak CT mungkin merupakan calon yang menjanjikan untuk melegakan pelbagai jenis keradangan yang responsif kepada kortikosteroid atau NSAID.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA UNTUK MELARANG PENYAKIT RADANG PHGS75% ECH 30% ACT 12%