Pengklonan Gen, Pengenalpastian Fungsian, Analisis Struktur Dan Ekspresi Sukrosa Sintase Daripada Cistanche Tubulosa Ⅱ

Keputusan dan analisis

1 Perlombongan gen sukrosa sintase dalam Cistanche tubulosa dan pengklonan gen CtSus

Using the amino acid sequence of the identified Arabidopsis thaliana sucrose synthase AtSus1 as a template[16], the sequence was aligned in the Cistanche tubulosa transcriptome database by local Blastp. At the same time, two sucrose synthase gene sequences with FPKM values greater than 10 were screened out in combination with transcriptome gene annotation and gene expression abundance data. They were named CtSus and CtSus1, respectively. The comparative transcriptome data of different parts of Cistanche (haustoria, underground parts and aerial parts) were further analyzed. The distribution of chemical components in different parts of Cistanche plants has been studied in depth. The results showed that glycoside compounds represented by phenylethanoid glycosides in Cistanche are mainly present in its underground parts, with the highest content in the haustoria[22]. In the early stage of this study, the content of phenylethanoid glycosides in plant materials used for comparative transcriptome sequencing of different parts was also determined, confirming that the content of phenylethanoid glycosides in different parts of Cistanche tubulosa was different in the following manner: haustorium>underground part>>bahagian udara.

Cistanche Tubulosa Berkualiti Tinggi untuk Kesihatan Lelaki

Oleh itu, nilai FPKM tahap ekspresi bagi dua gen sintase sukrosa calon yang diperolehi dalam saringan awal dalam data transkrip bagi bahagian berlainan Cistanche tubulosa telah dinormalisasi oleh Z-Score dan analisis pembezaan telah dilakukan (Rajah 1A). Keputusan menunjukkan bahawa gen CtSus mempunyai tahap ekspresi tertinggi di haustorium, dan tahap ekspresi di bahagian bawah tanah adalah lebih tinggi daripada di bahagian udara, yang konsisten dengan corak pengumpulan sebatian glikosida di bahagian berlainan Cistanche tubulosa, manakala tahap ekspresi gen CtSus1 dalam haustorium adalah rendah. Oleh itu, berdasarkan keputusan di atas, gen CtSus telah dipilih untuk penguatan jujukan seterusnya, ekspresi eksogen dan pengenalpastian berfungsi. Menggunakan cDNA Cistanche tubulosa sebagai templat, produk jalur tunggal diperolehi pada ~ 2500 bp selepas penguatan PCR (Rajah 1B). Produk PCR telah dipulihkan daripada gel dan diikat ke vektor pengklonan, dan kawasan pengekodan panjang penuh gen sasaran diperoleh dengan penjujukan. Panjang jujukan CtSus ialah 2418 bp.

Rajah 1 Penerokaan gen dan pengklonan CtSus daripada C. tubulosa dan analisis bioinformatik protein yang dikodkan. A: Tahap ekspresi gen CtSus dan CtSus1 di bahagian berlainan C. tubulosanormalisasi sebagai Z-Scores berdasarkan nilai FPKM mereka; B: Penguatan gen CtSus; M: Penanda DNA; C: Domain konservatif protein CtSus yang diramalkan oleh SMART; D: Penjajaran berbilang jujukan CtSus dan sintase sukrosa yang dikenal pasti daripada tumbuhan lain termasuk Arabidopsis thaliana, Solanumtuberosum dan Albuca bracteata. Domain sintesis sukrosa dan domain pemindahan gula masing-masing diwakili oleh kotak merah dan biru; E: Analisis filogenetik CtSus dan sukrosesynthases daripada tumbuhan lain; F: Analisis SDS-PAGE bagi ekspresi heterolog CtSus menggunakan vektorpCold™ I dalam E. coli. Lorong 1: Penanda protein; Lorong 2: Pecahan supernatan; Lorong 3: Pecahan Mendakan. Anak panah merah menunjukkan protein CtSus. G: Koloni PCR bagi klon tunggal yang mengandungi kedua-dua plasmid dua rekombinan. M: penanda DNA; 1: pET-28a-UGT71BD1; 2: pCold™ I-CtSus

Jadual 2 Persamaan jujukan asid amino antara CtSus dan sintase sukrosa yang dikenal pasti daripada tumbuhan lain

2.3 Analisis filogenetik

Pokok filogenetik yang dibina oleh perisian MEGA digunakan untuk menganalisis hubungan filogenetik antara sintase sukrosa CtSus daripada Cistanche tubulosa dan sintase sukrosa terbitan tumbuhan lain. Keputusan ditunjukkan dalam Rajah 1E. Sintesis sukrosa terbitan tumbuhan menunjukkan cabang evolusi yang berbeza dalam dikot (wilayah I dan II) dan monokot (wilayah III). CtSus berada dalam dahan dicot, dan jujukan yang paling rapat dengan CtSus semuanya daripada tumbuhan Lamiaceae (Cistanche tubulosa ialah tumbuhan Lamiaceae Orobanchaceae), manakala cawangan lain terutamanya terdiri daripada tumbuhan Solanales, yang seterusnya menunjukkan pemuliharaan yang tinggi dan homologi gen sukrosa sintase terbitan tumbuhan dalam evolusi tumbuhan dalam susunan yang sama. Antaranya, sukrosa sintase PrSus (AEN79500.1) daripada Pelipanche ramosa tumbuhan Orobanchaceae paling rapat dengan CtSus.

3 Ekspresi eksogen dan analisis aktiviti CtSus

3.1 Ekspresi eksogen gen CtSus PET-28a-CtSus, pET-24b-CtSus dan pCold™ I-CtSus plasmid yang disahkan melalui penjujukan telah dipindahkan ke dalam ekspresi kompeten E. coli Transetta (DE3), dan klon positif telah disaring oleh PCR koloni untuk pengesahan penjujukan. Strain ekspresi rekombinan yang diperoleh telah diinduksi oleh suhu rendah IPTG untuk ekspresi protein, bakteria dikumpulkan dengan sentrifugasi, dan penimbal lisis ditambah untuk memecahkan bakteria untuk mendapatkan supernatan dan mendakan, dan SDS-PAGE dilakukan untuk pengesanan. Keputusan menunjukkan bahawa apabila pET-28a dan pET-24b digunakan sebagai vektor ungkapan, CtSus tidak dinyatakan dalam E. coli, manakala apabila pCold™ I digunakan sebagai vektor ungkapan, CtSus yang jelas jalur protein rekombinan dikesan di rantau ~ 100 kDa, yang konsisten dengan jisim molekul relatif yang diramalkan secara teori sebanyak 92.2 kDa (Rajah 1F).

3.2 Transformasi sel keseluruhan

Untuk mengesahkan fungsi pemangkin CtSus secara awal, ketegangan ekspresi bersama CtSus dan gen glycosyltransferase UGT71BD1 telah dibina. UGT71BD1 telah diklon dan dikenal pasti daripada Cistanche tubulosa dan merupakan UDP-glucosyltransferase yang boleh menerima secara meluas sebatian aromatik seperti phenylethanoid glycosides, pelbagai jenis flavonoid, stilbene dan coumarin sebagai reseptor dan memangkinkan tindak balas glukosasilasi kumpulan hidroksil fenolik substrat menggunakan UDP-glucose. sebagai penderma gula [18]. Pengenalan CtSus secara teorinya boleh memberikan penderma glikosil UDP-glukosa yang lebih mencukupi untuk tindak balas glikosilasi yang dimangkin oleh UGT71BD1, dengan itu menggalakkan keseimbangan tindak balas untuk bergerak ke arah pembentukan produk glikosilasi, dengan itu meningkatkan hasil produk glikosilasi. Plasmid pCold™ I-CtSus dan plasmid pET-28a-UGT71BD1 secara serentak diubah menjadi ekspresi E. coli Transetta (DE3) yang kompeten. Klon tunggal yang mengandungi kedua-dua plasmid rekombinan telah disaring oleh PCR koloni, dan strain ekspresi rekombinan positif diperoleh dengan pengesahan penjujukan (Rajah 1G). Ungkapan bersama gen dwi telah diinduksi secara in vitro, dan strain ekspresi gen tunggal pET-28aUGT71BD1 digunakan sebagai kumpulan kawalan. Aktiviti CtSus dalam memangkinkan penjanaan penderma UDP-glukosa telah disahkan terlebih dahulu oleh transformasi sel keseluruhan. Keputusan HPLC dan spektrometri jisim resolusi tinggi menunjukkan bahawa apabila tindak balas transformasi sel keseluruhan dijalankan dengan aconitine 1 dan resveratrol 2 sebagai substrat, penjanaan produk glikosilasi yang jelas dikesan selepas 24 jam transformasi, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2.

Rajah 2 Biotransformasi sel keseluruhan substrat 1 atau 2 oleh terikan rekombinan yang melindungi UGT71BD1 atau terikan rekombinan yang menampung gandingan UGT71BD1 dengan CtSus, masing-masing. A: HPLCchromatograms bagi biotransformasi seluruh sel substrat 1. Panjang gelombang pengesanan ialah 360nm; B: HRESI-MS dan MS2spectra produk 1a; C: Kromatogram HPLC bagi keseluruhan-selbiotransformasi substrat 2; Panjang gelombang pengesanan ialah 330 nm. D: Spektrum HRESI-MS produk 2a dan 2b

Apabila 1 (m/z 179.034 4 [M+H]+, formula molekul C9H6O4) digunakan sebagai substrat, puncak kromatografi produk 1a (m/z 341.087 2 [M+H]+, formula molekul ramalan C15H16O9) telah dikesan pada 5.39 min, yang konsisten dengan UV penyerapan substrat dan produk kawalan. Pada masa yang sama, puncak serpihan m/z 179.033 4 [M+H]+ dikesan dalam spektrum MS2 1a, yang dihasilkan oleh 1a kehilangan molekul glukosa (162 Da), menunjukkan bahawa 1a ialah hasil daripada substrat 1 yang disambungkan kepada molekul glukosa. Kadar penukaran dikira dengan menyepadukan kawasan puncak. Didapati bahawa kadar penukaran keseluruhan sel UGT71BD1 yang memangkinkan substrat 1 untuk menghasilkan produk terglikosilasi 1a ialah 71.87%, manakala penambahan CtSus meningkatkan kadar penukaran tindak balas kepada 95.84%, 1.3 kali ganda daripada kumpulan kawalan. Apabila substrat adalah sebatian 2 (m/z 227.072 5 [MH]-, formula molekul C14H12O3), kromatografi produk mencapai puncak 2a (m/z 389.123 4 [MH]-, molekul ramalan formula C20H22O8) dan 2b (m/z 575.175 9 [M+Na]+, formula molekul ramalan C26H32O13) selaras dengan ciri penyerapan UV substrat dan produk kawalan dikesan pada 10.32 dan 6.52 min, masing-masing . Puncak serpihan telah dikesan pada 3 [MH]-, yang dihasilkan oleh kehilangan satu molekul glukosa (162 Da), menunjukkan bahawa 2a ialah hasil daripada substrat 2 yang disambungkan kepada satu molekul glukosa. Dengan membandingkan dengan data dalam kesusasteraan [18] dan maklumat ramalan spektrometri jisim, telah ditentukan bahawa produk 2b ialah hasil daripada substrat 2 yang disambungkan kepada dua molekul glukosa. Kadar penukaran dikira menggunakan kawasan puncak bersepadu. Didapati penambahan CtSus boleh meningkatkan kadar penukaran tindak balas glikosilasi substrat 2 daripada 64.01% kepada 78.51%, antaranya hasil produk monosakarida 2a meningkat daripada 45.09% kepada 63.58%, dan hasil produk disakarida 2b berubah daripada 18.92% kepada 14.93%.

3.3 Pembersihan protein rekombinan CtSus dan pengenalpastian aktiviti enzimatik in vitro

Keputusan eksperimen transformasi sel keseluruhan menunjukkan bahawa CtSus mempunyai aktiviti memangkin pengeluaran glukosa aktif penderma UDP-glukosa. Untuk mengesahkan secara langsung aktiviti pemangkin ini melalui tindak balas pemangkin enzim in vitro, protein gabungan gen CtSus dalam sistem ekspresi pCold™ telah diasingkan dan disucikan oleh kromatografi pertalian. Keputusan menunjukkan bahawa apabila pCold™ I digunakan sebagai vektor ekspresi, protein rekombinan dinyatakan dalam kuantiti yang banyak, tetapi kebanyakannya dalam mendakan. Apabila pCold™ TF digunakan sebagai vektor ekspresi, gen CtSus dinyatakan dalam kuantiti yang banyak dalam E. coli (Rajah 3A). Protein gabungan telah disucikan oleh kromatografi afiniti HisTrap FF dan tertakluk kepada tindak balas pemangkin enzimatik in vitro. Keputusan ditunjukkan dalam Rajah 3B. Apabila sukrosa dan UDP digunakan sebagai substrat, berbanding dengan kumpulan kawalan negatif, puncak produk baru dikesan pada 10.32 min. Masa pengekalan dan penyerapan UV adalah konsisten dengan UDP-glukosa. Produk itu terbukti UDP-glukosa dengan perbandingan dengan standard. Walau bagaimanapun, oleh kerana protein gabungan yang dinyatakan oleh vektor ekspresi pCold™ TF mengandungi tag larut faktor pencetus yang besar (saiz protein tag ialah 48 kDa), ia akan memberi kesan yang besar terhadap aktiviti pemangkin protein. Oleh itu, tag protein gabungan telah dipotong lagi oleh enzim Faktor Xa, dan protein CtSus tanpa tag eksogen telah disucikan (Rajah 3A). Protein telah tertakluk kepada pemangkinan enzimatik in vitro, dan keputusan menunjukkan bahawa hasil UDP-glukosa meningkat daripada 3.53% kepada 10.66%

(Rajah 3B). Keputusan di atas mengesahkan aktiviti CtSus dalam memangkinkan pengeluaran UDP-glukosa melalui pemangkinan enzimatik in vitro, dan juga menunjukkan bahawa kehadiran tag pertalian yang besar adalah kondusif untuk ekspresi larut CtSus, tetapi ia juga akan menjejaskan dengan ketara dalam aktiviti pemangkin vitro enzim.

Rajah 3 Ekspresi heterolog dan pengenalan fungsi CtSus. A: Analisis SDS-PAGE bagi protein CtSus. Lorong 1: Penanda protein; Lorong 2: CtSus Rekombinan dengan faktor pencetus; Lorong 3: Pembelahan tag faktor pencetus menggunakan protease Faktor Xa untuk memberikan protein CtSus yang dilabelkan oleh anak panah merah. B: Ujian enzimatik invitro menggunakan protein gabungan dan protein CtSus bebas faktor pencetus untuk memangkinkan sintesis UDP-glukosa dengan kehadiran sukrosa dan UDP, masing-masing, dengan rujukan standardUDP-glukosa. Protein rebus digunakan sebagai kumpulan kawalan di bawah keadaan yang sama. Panjang gelombang pengesanan ialah 260 nm