Pengklonan Gen, Pengenalpastian Fungsian, Analisis Struktur Dan Ekspresi Sukrosa Sintase Daripada Cistanche Tubulosa Ⅲ

4 Analisis ekspresi CtSus di bahagian berlainan Cistanche tubulosa dan sistem kultur sel di bawah tekanan kemarau

4.1 Analisis ungkapan CtSus di bahagian berlainan Cistanche tubulosa

In vitro, eksperimen transformasi sel keseluruhan dan eksperimen tindak balas pemangkin enzimatik mengesahkan bahawa protein yang dikodkan oleh gen CtSus boleh memangkinkan sintesis UDP-glukosa. Untuk meneroka lebih lanjut korelasi antara gen ini dan biosintesis sebatian glikosida dalam Cistanche tubulosa, tahap ekspresi gen ini di bahagian berlainan Cistanche tubulosa telah dianalisis.

HERBA CISTANCHE BERKUALITI TINGGI DENGAN 10-98% ECHINACOSIDE

Echinacoside is the most representative glycoside compound in Cistanche tubulosa, and its content can reach more than 30% of the dry weight of Cistanche tubulosa plants [23]. The research group previously measured the content of echinacoside in different parts of Cistanche tubulosa plants. Specifically, the content of echinacoside in different tissues is as follows: haustoria>underground part>>bahagian udara; antaranya, kandungan echinacoside dalam haustoria adalah yang paling tinggi.

PCR kuantitatif pendarfluor masa nyata dilakukan menggunakan cDNA dari bahagian berbeza Cistanche tubulosa sebagai templat, dan hasilnya dianalisis dengan kaedah 2-ΔΔCT dan analisis pembezaan dilakukan. Keputusan ditunjukkan dalam Rajah 4A. Tahap ekspresi gen CtSus dalam haustoria adalah yang tertinggi, 1.5 kali ganda daripada bahagian udara, dan tahap ekspresi di bahagian bawah tanah adalah jauh lebih tinggi daripada bahagian udara, yang konsisten dengan corak pengumpulan glikosida fenilethanoid. diwakili oleh echinacoside di bahagian berlainan Cistanche tubulosa.

Rajah 4 Tahap ekspresi relatif CtSus dalam bahagian berlainan C. tubulosa dan sel penggantungan dirawat oleh PEG6000. A: Tahap ekspresi relatif CtSus di bahagian berlainan C. tubulosa; B: Tahap ekspresi relatif CtSus dalam sel penggantungan C. tubulosa dirawat oleh PEG6000 pada titik masa yang berbeza. n=3, 𝑥̅± s.*P ＜ 0.05,***P ＜ 0.001

4.2 Analisis ekspresi CtSus dalam sel suspensi Cistanche deserticola di bawah keadaan tekanan kemarau

Penyelidikan awal mengenai projek itu menunjukkan bahawa tekanan kemarau yang disebabkan oleh PEG6000 boleh meningkatkan pengumpulan phenylethanol glycosides dengan ketara dalam sel suspensi Cistanche deserticola. Dari 3 hingga 9 hari selepas induksi, kandungan echinaceaside meningkat dengan ketara. Dari hari ke-12 hingga ke-15, kadar pertumbuhan kandungan echinacoside menjadi perlahan dan mencapai nilai maksimum pada hari ke-15. Kemudian, apabila masa kultur meningkat, kandungan echinacoside meningkat dengan ketara. Kandungan fruktosida secara beransur-ansur menurun [24]. Berdasarkan penyelidikan ini, makalah ini menggunakan cDNA sel suspensi Cistanche deserticola yang tidak dirawat dan sel suspensi Cistanche deserticola PEG6000-induced sebagai templat untuk menjalankan pengesanan PCR kuantitatif pendarfluor masa nyata untuk memeriksa gen CtSus dalam sel suspensi Cistanche deserticola di bawah keadaan tekanan kemarau. Perubahan dalam tahap ekspresi. Keputusan ditunjukkan dalam Rajah 4B. Dalam sel penggantungan Cistanche deserticola yang disebabkan oleh PEG6000, ekspresi CtSus meningkat dengan ketara pada hari ke-6 selepas induksi, mencapai nilai tertinggi pada hari ke-9, dan kemudian jatuh semula ke tahap yang sama seperti kawalan. Kumpulan yang sama tahap. Keputusan di atas menunjukkan bahawa tekanan kemarau boleh meningkatkan dengan ketara ekspresi gen CtSus dalam barisan sel penggantungan Cistanche deserticola, yang konsisten dengan corak pengumpulan echinaceaside di bawah tekanan kemarau. Walau bagaimanapun, ekspresi puncak gen CtSus muncul lebih awal daripada puncak kandungan echinaceaside, kerana penderma glikosil aktif yang disintesis oleh pemangkinan CtSus adalah prekursor penting yang diperlukan untuk tindak balas glikosilasi berbilang langkah dalam laluan biosintetik echinaceaside berikutnya. , adalah spekulasi bahawa selepas mengalami tekanan kemarau, organisma akan lebih suka menggerakkan gen yang berkaitan dengan metabolisme primer untuk mencapai pengumpulan penderma aktif, dan kemudian mencapai pengumpulan metabolisme sekunder yang penting bagi produk metabolik.

5 Kajian tentang struktur tiga dimensi protein CtSus dan analisis tapak aktif utama

Berdasarkan fungsi CtSus dalam memangkinkan penghasilan glikosil penderma UDP-glukosa, asas struktur aktiviti pemangkin CtSus telah dikaji lebih lanjut. Alat dalam talian SOPMA digunakan untuk meramalkan struktur sekunder protein. Keputusan menunjukkan bahawa struktur sekunder CtSus mengandungi 55.28% -heliks, 25.47% gegelung rawak, 12.80% helai lanjutan, dan 6.46% -putaran (Rajah 5A), menunjukkan bahawa -heliks adalah unit struktur sekunder yang paling penting dalam protein CtSus, diikuti oleh gegelung rawak, yang juga menyumbang sebahagian besar protein. Helai dan belitan yang dilanjutkan diedarkan ke seluruh protein. Menurut kajian sedia ada, sintase sukrosa biasanya wujud dalam bentuk tetramer, yang dianggap sebagai bentuk aktifnya. Oleh itu, kertas ini selanjutnya menggunakan AlphaFold2 untuk meramalkan struktur protein CtSus dan memperoleh struktur tiga dimensi protein tetramer. Perbandingan pangkalan data PDB (Protein Data Bank) mendapati persamaan jujukan antara Arabidopsis thaliana sucrose synthase AtSus1 (PDBID 3S28) dan CtSus boleh mencapai 77.93%. Struktur CtSus yang diramalkan dibandingkan dengan struktur tiga dimensi AtSus1, dan nilai sisihan purata kuasa dua akar (RMSD) selepas superposisi protein ialah 1.11 Å, menunjukkan bahawa struktur spatial kedua-duanya sangat konsisten (Rajah 5B).

Rajah 5 Penyiasatan struktur CtSus. A: Ramalan struktur sekunder CtSus menggunakan SOPMA. Biru: heliks; Ungu: Gegelung rawak; Merah: Helai lanjutan; Hijau: helaian. B: Penjajaran struktur tiga dimensi AtSus1 (dalam warna biru) dan CtSus (dalam warna hijau). Kedua-duanya ditunjukkan sebagai tetramer.C: Sisa utama dalam poket pengikat substrat AtSus1 (dalam warna biru) dan CtSus (dalam warna hijaudengan sisa berlabel); D: Penjajaran konformasi mengikat UDP dan fruktosa dalam AtSus1 (dalam warna biru) dan CtSus (dalam warna hijau); E: Interaksi antara UDP dan CtSus ditunjukkan dalam rajah 2D yang dianalisis oleh Pelanggan Discovery Studio

Struktur kompleks kristal protein-ligan Arabidopsis AtSus1 yang dilaporkan dengan UDP dan fruktosa (PDBID3S29) digunakan sebagai templat [16] untuk menganalisis mod pengikatan CtSus dengan UDP dan fruktosa. Keputusan dok molekul ditunjukkan dalam Rajah 5C. Dapat diperhatikan bahawa poket pengikat substrat AtSus1 dan CtSus sangat serupa dari segi jenis asid amino, taburan ruang, dan konfigurasi, dan pertindihan adalah tinggi, membuktikan bahawa jujukan sintase sukrosa sangat terpelihara dalam tumbuhan. Konformasi dua ligan, UDP dan fruktosa, dalam poket pengikat substrat protein, ditunjukkan dalam Rajah 5D. Konformasi dok molekul UDP dan CtSus yang paling berfaedah bertindih dengan baik dengan konformasi UDP dalam kompleks kristal AtSus1-UDP, membuktikan ketepatan keputusan dok molekul. Interaksi antara UDP dan sisa asid amino utama dalam poket pengikat substrat protein ditunjukkan dalam Rajah 5E. UDP dan CtSus terutamanya terikat bersama oleh ikatan hidrogen dan interaksi hidrofobik. Sisa asid amino utama dalam poket pengikat substrat termasuk Leu294, Gly301, Met576, Arg578, Lys583, Gln646, Asn652, Leu677, Thr678, dan Glu681.

Perbincangan

Pengubahsuaian glikosilasi adalah salah satu cara penting untuk meningkatkan sifat fizikal dan aktiviti biologi produk semula jadi atau prekursor ubat. Berbanding dengan kaedah kimia tradisional, pengubahsuaian glikosilasi enzimatik mempunyai kelebihan keadaan tindak balas yang ringan, selektiviti yang kuat, dan keramahan alam sekitar. Walau bagaimanapun, tindak balas glikosilasi glikosiltransferase memerlukan sejumlah besar penderma UDP-gula, yang mahal dan sukar diperoleh, menyebabkan hakikat bahawa glikosiltransferase tidak boleh digunakan secara meluas dalam pengeluaran perindustrian. Sukrosa sintase boleh memangkinkan tindak balas boleh balik: sukrosa + UDP ⇌ UDP-glukosa + fruktosa dan boleh membentuk kitaran UDP-glukosa yang boleh diperbaharui melalui tindak balas gandingan dengan glikosiltransferase. Cistanche tubulosa kaya dengan pelbagai sebatian glikosida dari jenis struktur yang berbeza, diwakili oleh sebatian phenylethanol glikosida, menunjukkan bahawa laluan sintesis penderma glikosil aktif dalam badannya yang melibatkan sintase sukrosa mempunyai metabolisme yang kuat, tetapi sintase sukrosa yang berkaitan daripada tumbuhan Cistanche tidak telah dilaporkan. Dalam kajian ini, gen sintase sukrosa CtSus telah diklon dari Cistanche tubulosa buat kali pertama. Protein yang dikodkan oleh gen ini mengandungi domain terpelihara sukrosa sintase tumbuhan. Dengan membandingkan jujukan sintase sukrosa daripada tumbuhan lain, didapati bahawa persamaan jujukan asid amino antaranya dan sintase sukrosa daripada tumbuhan dalam susunan yang sama adalah lebih daripada 90%, menunjukkan tahap pemuliharaan jujukan sintase sukrosa yang tinggi daripada tumbuhan. Analisis evolusi molekul menunjukkan bahawa CtSus tergolong dalam cabang sukrosa sintase tumbuhan dikotiledon dan paling berkait rapat dengan sintase sukrosa PrSus daripada P. ramosa daripada keluarga Orobanchaceae.

Untuk meneroka aktiviti pemangkin CtSus, kajian ini menggabungkan glycosyltransferase UGT71BD1, yang aktivitinya telah disahkan sebelum ini oleh kumpulan penyelidik, untuk membina sistem ekspresi bersama dwi-plasmid. Melalui eksperimen pemangkin seluruh sel, syarat telah dicapai tanpa menambah penderma gula UDP tambahan. Tindak balas glikosilasi kayu manis sebatian kumarin dan sebatian stilbene resveratrol. Berbanding dengan kumpulan kawalan, penambahan CtSus meningkatkan kadar penukaran UGT71BD1-tindak balas glikosilasi bermangkin dengan ketara. Atas dasar ini, kajian ini seterusnya membina plasmid ekspresi rekombinan CtSus dan mencapai ekspresi larut protein rekombinan dalam E. coli. In vitro, tindak balas pemangkin enzimatik menunjukkan bahawa dengan kehadiran sukrosa dan UDP, CtSus boleh memangkinkan penjanaan UDP-glukosa, dan selepas tag pertalian faktor pencetus yang terkandung dalam protein rekombinan dikeluarkan, produk CtSus memangkinkan penjanaan UDP. -glukosa diperolehi. Kadar telah meningkat dengan ketara. Transformasi sel keseluruhan dan keputusan tindak balas pemangkin enzim in vitro mengesahkan aktiviti CtSus sebagai sukrosa sintase pemangkin penderma gula aktif UDP-glukosa. Untuk meneroka lebih lanjut korelasi antara gen CtSus dan biosintesis glikosida dalam Cistanche tuberosum, ungkapan CtSus di bahagian berlainan Cistanche tuberosum telah dianalisis oleh eksperimen PCR kuantitatif pendarfluor masa nyata. Keputusan menunjukkan bahawa gen itu dinyatakan dalam haustoria Cistanche tuberosum. Tahap ekspresi tertinggi. Cistanche deserticola adalah tumbuhan parasit dan tidak dapat memperoleh nutrien yang diperlukan untuk pertumbuhan dan perkembangan melalui fotosintesis. Oleh itu, ia perlu bersifat parasit pada akar tumbuhan perumah dan bergantung kepada tumbuhan perumah untuk mendapatkan nutrien bagi mengekalkan pertumbuhan. Dalam tumbuhan, sukrosa kebanyakannya menyediakan tenaga dan penderma sumber karbon [12]. Walau bagaimanapun, sukrosa tidak boleh digunakan secara langsung oleh sel dan perlu diuraikan lagi. Haustoria ialah jambatan yang menghubungkan Cistanche deserticola dan tumbuhan perumah, dan memainkan peranan penting dalam proses pertumbuhannya. penting

[25], oleh itu ungkapan tinggi sukrosa sintase dalam haustoria Cistanche deserticola adalah munasabah. Ekspresi tinggi CtSus dalam haustoria juga konsisten dengan corak pengumpulan besar glikosida phenylethanoid dalam haustoria. Di samping itu, melalui analisis PCR kuantitatif pendarfluor perubahan dalam tahap ekspresi gen CtSus dalam sel penggantungan Cistanche deserticola pada titik masa yang berbeza di bawah tekanan kemarau, didapati bahawa tekanan kemarau boleh meningkatkan dengan ketara ekspresi gen CtSus dalam garisan sel penggantungan, iaitu konsisten dengan echinaceaside. Corak pengumpulan dalam garisan sel ampaian di bawah tekanan kemarau adalah konsisten. Keputusan di atas menunjukkan bahawa CtSus terlibat dalam laluan biosintetik glikosida phenylethanoid yang diwakili oleh echinacea dalam Cistanche tulipis in vivo . Ia adalah salah satu daripada banyak laluan biosintetik. Tindak balas glikosilasi langkah pertama menyediakan penderma glikosil aktif UDP-glukosa. Pendek kata, kajian ini

Kajian itu mengenal pasti gen sintase sukrosa baharu dalam Cistanche deserticola, yang membolehkan sintesis enzimatik in vitro penderma glikosil aktif dan menyediakan unsur genetik baharu untuk pembinaan bakteria kejuruteraan untuk biosintesis glikosida Cistanche deserticola.

Sumbangan pengarang: Tian Weisheng bertanggungjawab untuk analisis bioinformatik, analisis ekspresi, analisis aktiviti enzim dan penulisan draf pertama gen CtSus; Yan Yaru bertanggungjawab untuk pemeriksaan gen dan pengklonan; Cui Xiaoxue dan Huang Wenqian mengambil bahagian dalam analisis bioinformatik dan analisis ekspresi; Wang Yingxia dan Zhao Saijing mengambil bahagian dalam pembinaan vektor dan analisis Aktiviti enzim; Li Jun dan Shi Shepo terutamanya membimbing analisis aktiviti enzim dan analisis ekspresi; Tu Pengfei dan Liu Xiao bertanggungjawab untuk reka bentuk idea kertas, membimbing eksperimen, dan menulis serta menyemak kertas itu. Semua pengarang mengambil bahagian dalam menyemak kertas kerja.

Rujukan

[1] Lagu ZH, Lei L, Tu PF. Kemajuan dalam penyelidikan aktiviti farmakologi dalam tumbuhan CistancheHoffing. dan Pautan [J]. Ubat Herba Tradit Dagu (中草药), 2003, 34: 113-115.

[2] Liu WJ, Liu Y, Song QQ, et al. Perbandingan kemom antara Cistanchetubulosa yang ditanam dan liar menggunakan spektroskopi ¹H-NMR [J]. China J Chin Mater Med (中国中药杂志), 2018, 43:3506-3512.

[3] Lagu Y, Zeng K, Jiang Y, et al. Cistanches Herba, daripada spesies terancam kepada jenama besar perubatan Cina [J]. Med Res Rev, 2021, 41: 1539-1577.[4] Liu Y, Wang H, Yang M, et al. Polisakarida deserticola cistanche melindungi sel PC12 daripada kecederaan yang disebabkan oleh OGD/RP [J]. Biomed Pharmacother, 2018, 99: 671-680.

[5] Yin Y, Huang J, Gu X, et al. Evolusi enzim interkonversi nukleotida-gula tumbuhan [J].PLoS One, 2011, 6: e27995.

[6] Bar-Peled M, O'Neill MA. Pembentukan gula nukleotida tumbuhan, pertukaran, dan penyelamatan melalui kitar semula gula [J]. Annu Rev Plant Biol, 2011, 62: 127-155.

[7] Guo H, Li L, Wang PG. Pencirian biokimia UDP-GlcNAc/Glc4-epimerase daripada Escherichia coli O86:B7 [J]. Biokimia, 2006, 45: 13760-13768.

[8] Dong S, Chesnokova ON, Turnbough CL Jr, et al. Pengenalpastian UDP-N-acetylglucosamine4-epimerase yang terlibat dalam glikosilasi protein eksosporium dalam Bacillus anthracis [J]. J Bacteriol,2009, 191: 7094-7101.

[9] Li LN, Kong JQ. Pengenalpastian seluruh transkrip bagi gen sintase sukrosa dalam Ornithogalumcaudatum [J]. RSC Adv, 2016, 6: 18778-18792.

[10]Schmölzer K, Gutmann A, Diricks M, et al. Sukrosa sintase: pembangunan proses glikosilasi glycosyltransferase unik untuk biokatalitik [J]. Biotechnol Adv, 2016, 34: 88-111.[11]Cardini CE, Leloir LF, Chiriboga J. Biosintesis sukrosa [J]. J Biol Chem, 1955,214: 149-155.