Pengklonan Gen, Pengenalpastian Fungsian, Analisis Struktur Dan Ekspresi Sukrosa Sintase Daripada Cistanche Tubulosa Ⅲ

4 Analisis ekspresi CtSus di bahagian berlainan Cistanche tubulosa dan dalam sistem kultur sel di bawah tekanan kemarau

4.1 Analisis ungkapan CtSus di bahagian berlainan Cistanche tubulosa

Eksperimen transformasi sel keseluruhan in vitro dan eksperimen tindak balas pemangkin enzimatik mengesahkan bahawa protein yang dikodkan oleh gen CtSus mempunyai keupayaan untuk memangkinkan sintesis UDP-glukosa. Untuk meneroka lebih lanjut korelasi antara gen ini dan biosintesis sebatian glikosida dalam Cistanche tubulosa, tahap ekspresi gen ini di bahagian yang berlainanCistanche tubulosatelah dianalisis.

BAHAN MENTAH CISTANCHE BERKUALITI TINGGI UNTUK DIJUAL

Perkhidmatan Sokongan Wecistanche-Hubungi kami untuk mendapatkan maklumat diskaun:

E-mel:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Echinacosideadalah sebatian glikosida yang paling mewakili dalam Cistanche tubulosa, dan kandungannya boleh mencapai lebih daripada 30% daripada berat kering tumbuhan Cistanche tubulosa [23]. Kumpulan penyelidik sebelum ini mengukur kandungan echinacoside di bahagian berlainan tumbuhan Cistanche tubulosa, dan prestasi khusus ialah: kandunganechinacoside in different tissues was haustorium>underground part>>bahagian udara; antaranya, kandungan echinacoside dalam haustorium adalah yang paling tinggi. PCR kuantitatif pendarfluor masa nyata dilakukan menggunakan cDNA dari bahagian berlainan Cistanche tubulosa sebagai templat, dan hasilnya dianalisis oleh 2–ΔΔCT kaedah, dan analisis pembezaan telah dilakukan. Keputusan ditunjukkan dalam Rajah 4A. Tahap ekspresi gen CtSus dalam haustorium adalah yang tertinggi, 1.5 kali ganda daripada bahagian atas tanah, dan tahap ekspresi di bahagian bawah tanah adalah jauh lebih tinggi daripada bahagian atas tanah, yang konsisten dengan corak pengumpulan glikosida phenylethanol. diwakili oleh echinacoside di bahagian yang berlainanCistanche tubulosa.

Rajah 4 Tahap ekspresi relatif CtSus di bahagian berlainan C. tubulosa dan dalam sel penggantungan dirawat oleh PEG6000. A: Tahap ekspresi relatif CtSus di bahagian berlainan C. tubulosa; B: Tahap ekspresi relatif CtSus dalam sel penggantungan C. tubulosa dirawat oleh PEG6000 pada titik masa berbeza n=3, 𝑥̅± s.*P ＜ 0.05,***P ＜ 0.001

BAHAN MENTAH CISTANCHE BERKUALITI TINGGI

4.2 Analisis ekspresi CtSus dalam sel suspensi Cistanche deserticola di bawah keadaan tekanan kemarau

Penyelidikan awal mengenai projek itu menunjukkan bahawatekanan kemarau yang disebabkan oleh PEG6000bolehmeningkat dengan ketarayangpengumpulan phenylethanol glycosidesdalam sel suspensi Cistanche. Dari 3 hingga 9 hari selepas induksi, kandungan echinaceaside meningkat dengan ketara. Dari hari ke-12 hingga ke-15,kadar pertumbuhan echinaceasidekandungan menjadi perlahan dan mencapai nilai maksimum pada hari ke-15. Kemudian, apabila masa kultur meningkat, kandungan echinaceaside meningkat dengan ketara. Kandungan fruktosida secara beransur-ansur menurun [24]. Berdasarkan penyelidikan ini, kertas kerja ini menggunakan cDNA sel penggantungan Cistanche deserticola yang tidak dirawat dan sel penggantungan Cistanche deserticola yang tidak dirawat PEG6000-sebagai templat untuk menjalankan pengesanan PCR kuantitatif pendarfluor masa nyata untuk memeriksa gen CtSus dalam penggantungan Cistanche deserticola. sel di bawah keadaan tekanan kemarau. perubahan dalam tahap ekspresi. Keputusan ditunjukkan dalam Rajah 4B. Dalam sel penggantungan Cistanche deserticola yang disebabkan oleh PEG6000, ekspresi CtSus meningkat dengan ketara pada hari ke-6 selepas induksi, dan mencapai nilai tertinggi pada hari ke-9, dan kemudian jatuh semula ke tahap yang sama seperti kawalan. kumpulan yang sama tahap. Keputusan di atas menunjukkan bahawa tekanan kemarau boleh meningkatkan ekspresi gen CtSus dengan ketara dalam barisan sel penggantungan Cistanche deserticola, yang konsisten dengan corak pengumpulan echinaceaside di bawah tekanan kemarau. Walau bagaimanapun, ekspresi puncak gen CtSus muncul lebih awal daripada puncak kandungan echinaceaside, kerana penderma glikosil aktif yang disintesis oleh pemangkinan CtSus adalah prekursor penting yang diperlukan untuk tindak balas glikosilasi berbilang langkah dalam laluan biosintetik echinaceaside berikutnya. , oleh itu spekulasi bahawa selepas mengalami tekanan kemarau, organisma akan lebih suka menggerakkan gen yang berkaitan dengan metabolisme primer untuk mencapai pengumpulan penderma aktif, dan kemudian mencapai pengumpulan metabolit sekunder yang penting.

BAHAN MENTAH CISTANCHE BERKUALITI TINGGI

5 Kajian struktur tiga dimensi protein CtSus dan analisis tapak aktif utama

Berdasarkan fungsi CtSus dalam memangkinkan penghasilan glikosil penderma UDP-glukosa, asas struktur aktiviti pemangkin CtSus telah dikaji lebih lanjut. Alat dalam talian SOPMA digunakan untuk meramalkan struktur sekunder protein. Keputusan menunjukkan bahawa struktur sekunder CtSus mengandungi 55.28% -heliks, 25.47% gegelung rawak, 12.80% helai lanjutan, dan 6.46% -putaran (Rajah 5A), menunjukkan bahawa -heliks adalah unit struktur sekunder yang paling penting dalam protein CtSus, diikuti oleh gegelung rawak, yang juga menyumbang sebahagian besar protein. Helai dan belitan yang dilanjutkan diedarkan ke seluruh protein. Menurut kajian sedia ada, sintase sukrosa biasanya wujud dalam bentuk tetramer, yang dianggap sebagai bentuk aktifnya. Oleh itu, kertas ini selanjutnya menggunakan AlphaFold2 untuk meramalkan struktur protein CtSus dan memperoleh struktur tiga dimensi protein tetramer. Perbandingan pangkalan data PDB (Protein Data Bank) mendapati persamaan jujukan antara Arabidopsis thaliana sucrose synthase AtSus1 (PDBID 3S28) dan CtSus boleh mencapai 77.93%. Struktur CtSus yang diramalkan dibandingkan dengan struktur tiga dimensi AtSus1, dan nilai sisihan purata kuasa dua akar (RMSD) selepas superposisi protein ialah 1.11 Å, menunjukkan bahawa struktur spatial kedua-duanya sangat konsisten (Rajah 5B).

Struktur kompleks kristal protein-ligan Arabidopsis AtSus1 yang dilaporkan dengan UDP dan fruktosa (PDBID3S29) digunakan sebagai templat [16] untuk menganalisis mod pengikatan CtSus dengan UDP dan fruktosa. Keputusan dok molekul ditunjukkan dalam Rajah 5C. Dapat diperhatikan bahawa poket pengikat substrat AtSus1 dan CtSus sangat serupa dari segi jenis asid amino, taburan ruang dan konfigurasi, dan pertindihan adalah tinggi, membuktikan bahawa jujukan sintase sukrosa sangat terpelihara dalam tumbuhan. Konformasi dua ligan, UDP dan fruktosa, dalam poket pengikat substrat protein ditunjukkan dalam Rajah 5D. Konformasi dok molekul yang paling berfaedah bagi UDP dan CtSus mempunyai pertindihan yang baik dengan konformasi UDP dalam kompleks kristal AtSus1-UDP, membuktikan ketepatan keputusan dok molekul. Interaksi antara UDP dan sisa asid amino utama dalam poket pengikat substrat protein ditunjukkan dalam Rajah 5E. UDP dan CtSus terutamanya terikat bersama oleh ikatan hidrogen dan interaksi hidrofobik. Sisa asid amino utama dalam poket pengikat substrat termasuk: eu294, Gly301, Met576, Arg578, Lys583, Gln646, Asn652, Leu677, Thr678, dan Glu681.

Rujukan

[1] Lagu ZH, Lei L, Tu PF. Kemajuan dalam penyelidikan aktiviti farmakologi dalam tumbuhan CistancheHoffing. dan Pautan [J]. Ubat Herba Tradit Dagu (中草药), 2003, 34: 113-115.

[2] Liu WJ, Liu Y, Song QQ, et al. Perbandingan kemom antara Cistanchetubulosa yang ditanam dan liar menggunakan spektroskopi ¹H-NMR [J]. China J Chin Mater Med (中国中药杂志), 2018, 43:3506-3512.

[3] Lagu Y, Zeng K, Jiang Y, et al. Cistanches Herba, daripada spesies terancam kepada jenama besar perubatan Cina [J]. Med Res Rev, 2021, 41: 1539-1577.

[4] Liu Y, Wang H, Yang M, et al. Cistanche deserticola polysaccharides melindungi sel PC12 daripada kecederaan yang disebabkan oleh OGD/RP [J]. Biomed Pharmacother, 2018, 99: 671-680.

[5] Yin Y, Huang J, Gu X, et al. Evolusi enzim interkonversi nukleotida-gula tumbuhan [J].PLoS One, 2011, 6: e27995.

[6] Bar-Peled M, O'Neill MA. Pembentukan gula nukleotida tumbuhan, pertukaran, dan penyelamatan melalui kitar semula gula [J]. Annu Rev Plant Biol, 2011, 62: 127-155.

[7] Guo H, Li L, Wang PG. Pencirian biokimia UDP-GlcNAc/Glc4-epimerase daripada Escherichia coli O86:B7 [J]. Biokimia, 2006, 45: 13760-13768.

[8] Dong S, Chesnokova ON, Turnbough CL Jr, et al. Pengenalpastian UDP-N-acetylglucosamine4-epimerase yang terlibat dalam glikosilasi protein eksosporium dalam Bacillus anthracis [J]. J Bacteriol,2009, 191: 7094-7101.

[9] Li LN, Kong JQ. Pengenalpastian seluruh transkrip bagi gen sintase sukrosa dalam Ornithogalumcaudatum [J]. RSC Adv, 2016, 6: 18778-18792.

[10]Schmölzer K, Gutmann A, Diricks M, et al. Sukrosa sintase: pembangunan proses glikosilasi glycosyltransferase unik untuk biokatalitik [J]. Biotechnol Adv, 2016, 34: 88-111.

[11]Cardini CE, Leloir LF, Chiriboga J. Biosintesis sukrosa [J]. J Biol Chem, 1955,214: 149-155.[12]Stein O, Granot