Stx2 Mendorong Ekspresi Gen Berbeza Dan Mengganggu Gen Irama Sirkadian dalam Tubul Proksimal Ⅱ

3. Perbincangan

3.1. Patologi Tubular Proksimal dalam Pesakit STEC dan Model Haiwan

Oliguria adalah tandanekrosis tubular akut(ATN). Disebabkan ATN, sel epitelium yang terkelupas menghalang lumen tubulus untuk mengurangkan aliran bendalir yang kelihatan sebagai oliguria. Dalam pesakit STEC, oliguria dan anuria selalunya merupakan penemuan yang mencadangkan ATN. Pengurangan dalam fungsi tubul proksimal semasa peringkat awal penyakit berjangkit STEC telah ditunjukkan sebagai peningkatan dalam kencing 2MG dan NAG [3,33]. B2MG ialah protein kecil 12 kDa yang ditapis secara bebas melalui glomeruli dan diserap sepenuhnya oleh tubul proksimal dalam keadaan sihat. Walau bagaimanapun, sebaik sahaja tubul proksimal rosak, jumlah 2MG dalam air kencing meningkat sekali gus berfungsi sebagai biomarker untuk fungsi tubular proksimal. NAG ialah enzim lisosom besar 130 kDa dan glukosidase utama dalam tubul proksimal. Oleh kerana saiznya yang besar, glomerulus tidak dapat menapis NAG manakala tubul proksimal yang rosak merembeskan NAG dalam air kencing. Oleh itu, peningkatan NAG kencing adalah satu lagi biomarker untuk kerosakan tiub proksimal. Histopatologi glomerular seperti kapilari terhalang fibrin adalah penemuan kerap pesakit STEC; walau bagaimanapun, data kencing di atas mencadangkan kerosakan tiub proksimal dalam penyakit terdahulu. Juga, air kencing daripada pesakit STEC mengandungi tuangan yang terdiri daripada epitelium tiub yang merupakan hasil daripada pengelupasan sel-sel tiub proksimal yang rosak [1]. Dalam model haiwan, sloughing sel tubular proksimal sering dijumpai dalam kedua-dua jangkitan STEC dan model suntikan Stx [25-27,34]. Dalam kajian semasa, kami mendapati pengelupasan sel tubular proksimal dalam Stx2-buah pinggang murine yang disuntik mencadangkan Stx2-pengubahan tubular proksimal (Rajah 1). Juga, kami mengesan reseptor Stx2 Gb3 dalam kedua-dua tetikus dantubul proksimal buah pinggang manusiadengan ekspresi sisi luminal yang menunjukkan interaksi langsung Stx2 dengan tubul proksimal (Rajah 2 dan 3). PDK4 memfosforilasi piruvat dehidrogenase untuk menghalang aktivitinya mengakibatkan penurunan dalam penggunaan glukosa dan peningkatan dalam metabolisme lemak sebagai tindak balas kepada puasa yang berpanjangan dan kelaparan. Ia melindungi sel epitelium yang terpisah daripada kematian sel yang disebabkan oleh detasmen (anoikis) [35]. PDK4 pada mulanya mempunyai puncak pada 4 jam, kemudian satu lagi puncak pada 8 jam (Rajah 5A). Ia dikurangkan pada 12 jam, tetapi dari sana ia mengalami peningkatan secara beransur-ansur sehingga 72 jam dengan log2-perubahan kali ganda dan berakhir dengan 3 (12-perubahan kali ganda) (Rajah 5A). Detasmen sel epitelium berlaku dalam Stx{16}}sel tubular proksimal tetikus (sloughing) dengan morfologi yang agak utuh (Rajah 1), ini mungkin mencerminkan regulasi PDK4.

CISTANCHE TUBULOSA EXTRACT POWDER UNTUK BUAH PINGGANG

Oleh kerana NHERF1 (SLC9A3R1) menyumbang kepada pematuhan sel normal kepada matriks ekstraselular [36], organisasi sitoskeleton aktin, dan mengekalkan morfologi sel, ekspresi gen ini yang diturunkan mungkin mempunyai akibat seperti pengelupasan sel (Rajah 5K).

Kesan Stx2 pada tubul proksimal nampaknya merupakan faktor penting untuk penyakit berjangkit STEC; walau bagaimanapun, perubahan dalam ekspresi gen yang memfokuskan pada sel tiub proksimal in vivo tidak tersedia sebelum ini. Keepers et al. [37] menunjukkan gen yang dinyatakan secara berbeza (DEG) dalam buah pinggang Stx2+tikus yang disuntik LPS sehingga kebanyakan gen yang lebih awal dan sebahagian besarnya diubah adalah daripada pengaruh LPS dan gen yang diubah lewat adalah daripada kesan Stx2. . Data mereka menunjukkan pandangan yang berharga tentang ekspresi gen pembezaan buah pinggang tetapi tidak memisahkan jenis sel yang bertanggungjawab untuk perubahan itu. Dalam kajian semasa, kami cuba mencari DEG yang dikaitkan dengan sel tubular proksimal dengan membandingkan data microarray daripada tetikusbuah pinggang dan tiub proksimal utama manusiasel yang dirawat dengan Stx2.

3.2. Faktor Tubular Proksimal yang Terlibat dalam Stx2-Patologi Terinduksi Berkaitan dengan Aktiviti Stx2 yang Diketahui dalam Sel Pengekspresian Gb3

3.2.1. Aktiviti (I), Transduksi Isyarat Dicetuskan oleh Stxs Mengikat kepada Gb3

Subunit B Stxs mendorong bukan reseptor src tyrosine kinase Ya fosforilasi [4]. Fosforilasi Ya mengaktifkan molekul isyarat hiliran dengan aktiviti kinasenya dan membawa kepada pembentukan semula sitoskeleton [5]. Fosforilasi protein berkaitan Ya (YAP) dalam Y357 oleh Ya diketahui mendorong translokasi nuklear YAP di mana ia bertindak sebagai pengaktif bersama transkrip untuk mendorong gen sasaran seperti CTGF [38]. Protein matriselular CYR61 (CCN1) dan CTGF (CCN2) dirembeskan kepada matriks ekstraselular (ECM) dan menyumbang kepada mengekalkan lekatan sel-ECM dengan mengikat integrin reseptor dan heparan sulfat proteoglycans (HSPG) yang melekat pada permukaan sel [39,40]. Molekul utama transkripsi CCN1 dan 2 ialah YAP, dan ia disimpan tidak aktif (terfosforilasi pada residu serin 127) dalam keadaan biasa di bawah laluan isyarat Hippo. Setelah lekatan sel sel rendah dikesan, YAP (S127) tidak lagi terfosforilasi membenarkannya memasuki nukleus, dan transkripsi CCN1 dan 2 meningkat [41-43]. CCN1 dan 2 bertindak sebagai molekul penyembuhan luka untuk membaiki tisu yang hilang sel [38,44]. Dalam dataset kami, CCN1 dan 2 mempunyai puncak kecil pada titik masa yang lebih awal (6 jam). Ini mungkin mencerminkan pengaktifan Ya yang disebabkan oleh pengikatan Stx2. Beberapa jam kemudian, sloughing mungkin telah mencetuskan pengaktifan YAP selanjutnya dengan mematikan laluan isyarat Hippo untuk mendorong ekspresi CCN1 dan 2 yang lebih besar pada 12 jam atau lebih baru (Rajah 5C).

3.2.2. Aktiviti (II), Mendorong ER-Stress/UPR

Stxs mencapai ER, di mana serpihan A1 yang dibelah dan subunit B meniru protein yang tidak dilipat [9,10,45,46]. Protein terkawal glukosa 78 kDa (Grp78, protein immunoglobulin pengikat (Bip)) sedang menambat tiga protein utama UPR yang memerlukan enzim Inositol-1 (Ire-1), kinase protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase (PERK ) dan mengaktifkan faktor transkripsi 6 (ATF6) dalam membran ER semasa keadaan normal. Walau bagaimanapun, disebabkan pertalian Grp78 yang lebih tinggi kepada protein terungkap, ia membebaskan protein berlabuh tersebut. ATF6 diaktifkan selepas keluaran dan meningkatkan CHOP (DDIT3) dan protein pengikat X-box 1 (XBP-1) mR NA, manakala Ire-1 menyambung mRNA XBP-1 untuk menghasilkan XBP{{ 22}} protein, yang menyumbang kepada transkripsi CHOP (DDIT3). Pengaktifan PERK membawa kepada pengaktifan ATF4 yang turut meningkatkan mRNA CHOP (DDIT3). Oleh itu, peningkatan dalam mRNA CHOP (DDIT3) adalah ciri UPR [47,48]. Stxs dilaporkan untuk mendorong UPR dan CHOP (DDIT3) dikawal selia dalam dataset kami (Rajah 5D-G).

GDF15 tergolong dalam keluarga faktor pertumbuhan mengubah beta (TGF). Baru-baru ini, GDF15 ditunjukkan untuk menengahi penurunan berat badan akibat metformin ubat diabetes [49]. Dalam tikus yang diberi metformin secara lisan, mRNA GDF15 usus dan buah pinggang telah meningkat menyebabkan peningkatan dalam serum GDF15. GDF15 yang beredar berfungsi melalui reseptor terhad batang otak untuk menyekat pengambilan makanan dan mengurangkan berat badan [50]. Dalam tikus yang ditadbir metformin, peningkatan GDF15 buah pinggang sekurang-kurangnya sebahagiannya di bawah peraturan CHOP (DDIT3). Dalam set data kami Stx2-buah pinggang tikus yang disuntik, CHOP (DDIT3) meningkat pada mulanya pada 4 jam dengan kemuncak yang sangat kecil dan kemudian mula mengalami aliran meningkat ke arah 48 jam di mana ia mengekalkan tahap log{{16 }}perubahan kali ganda sekitar 1.3 (Rajah 5E). Menurut analisis kelompok STRING, GDF15 menerima input aktif daripada faktor transkripsi CHOP (DDIT3) dan ATF3 (Rajah 5E) [51,52]. Berat murine yang disuntik Stx2-mula menurun atau menyimpang daripada kawalan garam selepas 24 jam (Rajah S3B). Peningkatan dalam mRNA GDF15 dalam buah pinggang pada 12 jam mungkin telah mempengaruhi batang otak untuk mengurangkan pengambilan makanan, yang seterusnya muncul sebagai penurunan berat badan (Rajah 5E dan S3B). Oleh kerana tahap ekspresi GDF15 terus tinggi selepas 24 jam, tikus terus menurunkan berat badan (Rajah 5E dan S3B).

Apabila tekanan ER, PERK dilepaskan daripada Grp78 (Bip) dan oligomer untuk memfosforilasi dan menghalang eIF2 yang membawa kepada penindasan terjemahan global, kecuali beberapa protein yang responsif UPR seperti ATF4, CHOP dan Grp78. GADD34 (subunit pengawalseliaan protein fosfatase 1 15A (PPP1R15A)) ialah salah satu daripada peningkatan protein di bawah perencatan berkaitan eIF2 (eIF2 (P)) terfosforilasi dan dikawal dalam dataset kami (Rajah 5D, G). GADD34 ialah protein fosfatase-1 yang menyahfosforilasi eIF2 (P) untuk mengawal secara negatif perencatan sintesis protein yang disebabkan oleh UPR [53]. Ungkapan GADD34 (PPP1R15A) menjadi log2-perubahan kali ganda lebih besar daripada 1 selepas 12 jam Stx2 dalam set data kami dan terus meningkat sehingga 24 jam apabila ia mendatar (log2-perubahan kali ganda bersamaan dengan 2.1) dan mengekalkannya aras sehingga tamat (Rajah 5D,G). Ini menunjukkan bahawa UPR yang disebabkan oleh Stx{32}}mempunyai maklum balas negatif selepas 12 jam. Peningkatan transkripsi dan terjemahan CHOP (DDIT3, GADD153) merupakan ciri tegasan ER dan corak ungkapan pembezaan menyerupai GADD34 kecuali log2 yang lebih besar daripada 1 berlaku selepas 24 jam dan secara beransur-ansur menjadi dataran tinggi selepas itu (log2 bersamaan 1.3) (Rajah 5D, G). Selain itu, CEBPB, rakan kongsi dimerisasi utama CHOP, dikawal selia dalam dataset kami (Rajah 5D, G). Keputusan ini menunjukkan bahawa walaupun tekanan ER teraruh Stx2-bermula dari awal dalam perjalanan masa, ia meningkatkan kesan sehingga 24 jam dan mengekalkan tahap tekanan ER ini sehingga tamat manakala lengan maklum balas negatif juga mengimbangi dirinya secara serentak

3.2.3. Aktiviti (III), Aktiviti Ribosome Inactivating Protein (RIP).

Dengan membelah adenin daripada rRNA, Stxs menghalang sintesis protein de novo. RRNA yang dinyahpurnasi mempengaruhi pengubahan morfologi ribosom, yang mengaktifkan transduksi isyarat [11] yang dikenali sebagai tindak balas tegasan ribotoksik (RSR), yang membawa kepada pengaktifan gen ciri (lihat perenggan seterusnya).

3.2.4. Aktiviti (IV), Aktiviti Tindak Balas Tekanan Ribotoksik (RSR).

ZAK (MAPKKK) ialah kinase yang diketahui dalam RSR dan mengaktifkan laluan hiliran JUN N terminal kinase (JNK) dan p38 MAPK [12,15]. Stx1 mendorong ekspresi mRNA JUN dan FOS dalam sel epitelium usus manusia dan peristiwa ini memerlukan aktiviti RIP positif Stx1 yang dianggap berada di bawah kawalan RSR [15]. Satu lagi molekul hiliran RSR, p38 MAPK, diketahui mendorong gen tindak balas awal seperti JUN, FOS, EGR1, MAFF, DDIT3 dan ATF3 [54], yang semuanya dinyatakan secara berbeza dalam dataset kami. Laluan JNK dan p38 MAPK juga diketahui diaktifkan peristiwa hiliran Ire-1 di bawah UPR (Rajah 4B,D dan 5B,E,F) [47]. Disebabkan ini, Stxs boleh mengaktifkan kedua-dua laluan ini melalui RSR dan/atau UPR. Laluan kinase terkawal isyarat ekstraselular (ERK) 1/2 juga ditunjukkan sebagai hiliran RSR [55] dan gen DUSP1 (MKP1) diketahui diinduksi oleh laluan ERK1/2 [56]. Stx1 dan anisomycin (perencat sintesis protein lain) mampu mendorong ekspresi DUSP1 dalam sel Caco-2 [57]. Dalam dataset kami, ungkapan DUSP1 telah diinduksi dan ini mungkin menunjukkan pengaktifan ERK1/2 (Rajah 4B, D).

3.2.5. Aktiviti (V), Transkripsi Gen Tertentu Membawa kepada Sitokin

Secretion IL-8 secretion in Stxs-treated cells, human intestinal cells in particular, has been reported extensively as a downstream factor of RSR [12,58]. Cytokines and chemokines in animal models revealed CXCL1 and CXCL10 expression within Stx2-treated mouse kidneys [37,59]. IL-8 (CXCL8) and CXCL1 are both neutrophil chemoattractants that utilize CXCR2 as their receptor. IL-8 is expressed in humans but not in mice. In our dataset, human RPTEC showed an increase in IL-8 expression by log2 equals 4.6-fold maximum (log2 values were 4.6, 3.52 and 4.48 at 6, 13, and 19 h after Stx2, respectively). As we extracted common DEGs from mouse kidney and human proximal tubular cells IL-8 was not included in the final dataset. Instead, the molecule with similar function as IL-8, CXCL1 showed a significant increase as a common DEG (Figure 5L). A downstream pathway of UPR is the NF-κB signaling pathway. NFKBIA (IκBα) is an inhibitory factor of the classical (canonical) NF-κB pathway that binds with NF-κB subunits RelA (p65) and p50. Upon phosphorylation by an upstream kinase, NF-kappa B kinase (IKK), NFKBIA (IκBα) is degraded, thus NF-κB can translocate to the nucleus and induce transcription of inflammatory factors. RelB proto-oncogene nuclear factor-kappa B subunit (RelB) is involved in the alternative (non-canonical) NF-κB pathway and induces inflammatory factor expression. RelB-p50 or -p52 dimers act as a transcription factor (NF-κB) when phosphorylation of p100 of RelB-p50-p100 or RelB-p100 complexes is done by IKKα homodimers and this step does not involve IκBα. In our dataset, both NFKBIA and RelB were differentially expressed reaching to log2-fold change >1 selepas 24 dan 48 jam, masing-masing (Rajah 5F). Ini menunjukkan gen topi di bawah kedua-dua laluan NF-κB, IκB (klasik) dan RelB (alternatif), diinduksi. Oleh kerana ungkapan pembezaan CHOP (DDIT3) melebihi log2 lebih besar daripada 1 selepas 24 jam, buah pinggang tetikus menjalani UPR, dengan itu mengaktifkan PERK memfosforilasi faktor permulaan terjemahan eukariotik 2 subunit alpha (eIF2 ) untuk menghalang terjemahan NFKBIA [60]. Atas sebab ini, peningkatan dalam mRNA NFKBIA mungkin tidak menghalang banyak laluan NF-κB, oleh itu transkripsi faktor keradangan dibenarkan (Rajah 5L).

Sobbe et al. [61] menunjukkan bahawa kedua-dua laluan klasik (RelA-p50) dan alternatif (RelB-p52) NF-κB aktif dalam tikus suntikan Stx yang mengesan regulasi sitokin sasaran RelA CCL20, CXCL1 dan CXCL10 yang juga dinyatakan secara berbeza dalam kami. set data (Rajah 5L).

3.2.6. Aktiviti (VI), Apoptosis Terinduksi Stxs

Caspase 3 yang dipotong telah ditemui dalam kematian sel yang berkaitan dengan Stxs [13,15,62]. Telah ditunjukkan bahawa pengaktifan caspase-3 atau aruhan apoptosis oleh Stxs berlaku dalam konteks RSR dan UPR. Dalam RSR yang disebabkan oleh Stxs, kedua-dua laluan p38 MAPK dan JNK terlibat [15] serta pengaktifan ERK dilaporkan [55]. UPR sebaliknya diketahui mendorong laluan NF-κB, JNK dan p38 MAPK. CHOP (DDIT3) di bawah UPR ditunjukkan terlibat dalam apoptosis [63] dan ia juga telah ditunjukkan dalam apoptosis berkaitan Stxs [13]. Penglibatan JNK dalam apoptosis yang disebabkan oleh UPR telah dilaporkan juga [64]. Dalam set data kami, beberapa DEG seperti CHOP (DDIT3), NFKBIA, FOS, JUN dan JUNB terlibat dalam RSR dan UPR (Rajah 5B, F).

3.3. Disregulasi Circadian oleh Stx2

Peningkatan dalam serum endothelin-1 (ET-1, EDN1) berlaku pada pesakit STEC-HUS [65]. Juga, secara eksperimen, Stx2 mendorong ekspresi EDN1 dengan mengaktifkan lata transduksi isyarat yang melibatkan MAPK [66], manakala UPR diketahui mendorong transkripsi EDN1 [67]. Dalam dataset kami, ekspresi EDN1 yang disebabkan oleh rawatan Stx2 dalam kedua-dua buah pinggang tetikus dan sel tiub proksimal manusia (Rajah 5G). Oleh kerana ekspresi gen EDN1 adalah penyebut biasa buah pinggang tetikus dan sel epitelium tiub proksimal manusia, ia menunjukkan ekspresi EDN1 berlaku, sekurang-kurangnya sebahagiannya, dalam sel epitelium tiub proksimal dalam vivo sebagai tambahan kepada sel endothelial. Selain itu, ET yang dirembeskan-1 mendorong ekspresi EGR1 melalui pengaktifan MAPK [68]. Data kami mengesahkan peningkatan EGR1 dalam masa apabila EDN1 dikawal (Rajah 5H). EGR1 mendorong ungkapan PER1 faktor utama irama sirkadian [69], oleh itu, melaraskan amplitud faktor sirkadian lain (Rajah 5H).

Dalam peraturan sirkadian, heterodimer CLOCK-BAML1 (ARNTL) mengimbangi PER1 dan CRY1. Sebagai balasan, heterodimer PER1-CRY1 mengikat kepada CLOCK-BAML1 (ARNTL) untuk menyekat transkripsi mereka sendiri, seterusnya membuat gelung negatif irama sirkadian. Oleh itu, puncak ekspresi gen pengawal selia positif (JAM dan BAML1 (ARNTL)) dan gen pengawal selia negatif (PER1 dan CRY1) berlaku dalam satu jam bergantian apabila CLOCK dan BAML1 (ARNTL) mempunyai peningkatan dalam ekspresi, PER1 dan CRY1 berkurangan, dan corak bertukar pada jam berikutnya. Apabila kami menambah log2-nilai perubahan kali ganda bagi CLOCK dan BAML1 (ARNTL) pada graf (Rajah 5J), semasa titik masa sebelumnya, PER1 dan BAML1 (ARNTL) menunjukkan corak irama bertentangan dengan puncak tajam/sempit, bagaimanapun, selepas 24 jam puncak mula menjadi kusam dan terus meningkat tanpa irama. Ini menunjukkan bahawa Stx2 mempengaruhi irama sirkadian buah pinggang termasuk dalam tubul proksimal. Walaupun percubaan pengesahan lanjut diperlukan, data kami digabungkan dengan literatur yang diterbitkan yang menerangkan kesan PER1 pada peraturan sirkadian buah pinggang apabila rangsangan [70,71], mencadangkan kemungkinan penglibatan Stx2 dalam gangguan irama sirkadian dan kesan pada fungsi tiub proksimal dengan mengurangkan gen jam buah pinggang- faktor terkawal seperti SGLT1 (SLC5A1) (Rajah 5K). Sesungguhnya, kami memerhatikan glukosuria dalam Stx{30}}tikus suntikan yang membiak dalam kajian lain dengan Stx1-tikus suntikan [21] yang menunjukkan disfungsi SGLT1 (SLC5A1) dalam tubul proksimal (Jadual 3). Untuk pengetahuan terbaik kami, ini adalah laporan pertama yang menunjukkan penglibatan Stx2 dalam gangguan irama sirkadian buah pinggang.

4. Kesimpulan

Kami menentukan gen penting mengenai ungkapan berkaitan tubul proksimal yang telah diubah oleh Stx2. Ekspresi pembezaan gen ini diandaikan sebagai hasil daripada aktiviti Stx2 seperti induksi UPR, RSR berkaitan depurination rRNA, dan transduksi isyarat yang disebabkan oleh pengikatan Gb3 reseptor membran plasma. Gen yang paling dinyatakan, GDF15, boleh mempengaruhi penurunan berat badan yang disebabkan oleh Stx2 melalui reseptor terhad batang otak dengan mengurangkan pengambilan makanan. Matriks ekstraselular dan lekatan sel mungkin dipengaruhi oleh PDK4, NHERF1 (SLC9A3R1), CYR61 dan CTGF yang menyebabkan Stx2-histopatologi khusus dan sloughing. Selain itu, gangguan dalam irama sirkadian buah pinggang oleh Stx2 boleh mengakibatkan kecacatan fungsi tiub proksimal seperti penyerapan semula glukosa.

5. Bahan dan Kaedah

5.1. Haiwan Tikus

(C57BL/6, lelaki, 19–22 g, bebas patogen khusus) telah dibeli daripada Charles River Laboratories Japan, Inc. (Yokohama, Jepun). Makanan dan air diberi secara ad libitum. Tikus dikekalkan dengan kitaran standard 12 jam: 12 jam gelap terang di mana cahaya dihidupkan pada 7 pagi dan padam pada 7 malam Suhu bilik haiwan disimpan sekitar 24 ◦C. Semua prosedur telah diluluskan oleh Jawatankuasa Penjagaan Haiwan Universiti.

5.2. Tisu Buah Pinggang Manusia

Tisu mayat tanpa sebarang pengecam peribadi telah digunakan dalam kajian ini, dan ia dianggap dikecualikan oleh garis panduan penyiasatan manusia Universiti.

5.3. Kultur sel

Kultur primer sel epitelium tiub proksimal renal manusia (RPTEC) telah dibeli daripada Clonetics (Walkersville, MD, Amerika Syarikat) dan dikekalkan pada 37 ◦C, 5% atmosfera CO2. Sel telah dibiakkan dalam medium pertumbuhan sel epitelium buah pinggang yang ditambah dengan faktor pertumbuhan epidermis manusia, hidrokortison, epinefrin, insulin, tri-iodothyronine, transferrin, GA-1000 dan FBS.

5.4. Penyingkiran LPS Stx2 Bebas LPS daripada Stx2 telah dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini [72]. Secara ringkas, lajur konjugat antibodi2 11E10 anti-Stx telah digunakan untuk mendapatkan pecahan Stx2, dan pecahan itu kemudiannya disalurkan melalui Detoxi-gel (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA) untuk mengeluarkan LPS. Pecahan Stx2 telah ditapis dengan 0.2 µm penapis dan tahap LPS telah diuji dengan ujian Limulus amebocyte lysate (Pyrotell, Associates of Cape Cod Incorporated, East Falmouth, MA, USA). Pecahan Stx2 ditentukan sebagai mempunyai kurang daripada 0.03 unit endotoksin (EU)/mL. Jenis varian Stx2 ialah Stx2a.

5.5. Pentadbiran Stx2 kepada Tikus A 2LD50 dos (5 ng Stx2/20 g berat badan), yang membunuh tikus dalam masa empat hari (Rajah S3A), telah disuntik kepada tikus secara intraperitoneal dalam jumlah 0.1 mL dalam salin bebas LPS (Otsuka farmaseutikal, Jepun). Suntikan toksin dilakukan antara jam 7 dan 9 pagi, di mana tikus kursus lebih lama menerima Stx2 pada jam 7 pagi dan diikuti dengan pensampelan 24, 48 dan 72 jam pada jam 7 pagi

5.6. Pengumpulan Urin dan Pengukuran Glukosa Air Kencing Selepas 2, 6, 8, 12, 24, 36, 48, 60, dan 84 jam suntikan Stx2, air kencing diambil dan 10 µL dijatuhkan ke atas slaid kimia kering Fuji GLU- P III (FUJIFILM, Kanagawa, Jepun) dan glukosa air kencing diukur dengan Fuji Dry Chem 7000 V (FUJIFILM) di kemudahan yang diuruskan oleh. Urin daripada suntikan pra-Stx2 digunakan sebagai sampel 0 jam. Pengumpulan air kencing dilakukan dengan dua tikus

5.7. Pemprosesan Tisu Selepas 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, dan 72 jam suntikan Stx2, tiga tikus setiap titik masa telah dieutanasi oleh CO2, dan buah pinggang telah dikumpulkan. Separuh daripada satu buah pinggang telah ditetapkan dengan 4% garam paraformaldehid/fosfat-buffered selama 7 hari pada suhu 4◦C dan diproses untuk bahagian parafin. Separuh lagi buah pinggang digunakan untuk mengekstrak RNA untuk analisis microarray. Tiga tikus tanpa sebarang rawatan telah digunakan sebagai kawalan biasa (naif atau 0 h). Tiga tikus disuntik dengan PBS (kenderaan) dan dikorbankan pada 72 jam dan berfungsi sebagai kawalan kenderaan untuk menunjukkan terdapat perubahan yang boleh diabaikan dalam ekspresi gen berbanding kawalan biasa.

5.8. Bahagian Parafin Stain Acid-Schiff (PAS) Berkala telah dihidratkan dan diwarnakan dengan 0.5% larutan asid berkala, diikuti dengan bilas dengan air suling. Bahagian dipindahkan ke reagen Schiff. Selepas bahagian dibasuh dengan 0.6% larutan natrium bisulfit dengan teliti, ia diwarnakan balas dengan hematoxylin.

5.9. Rawatan Stx2 dalam sel RPTEC Human RPTEC telah dirawat dengan 10 ng/mL Stx2 selama 6, 13 dan 19 jam di bawah 37 ◦C, 5% CO2. RPTEC tanpa rawatan Stx2 digunakan sebagai kawalan. Dua replika biologi telah dilakukan setiap titik masa. Selepas mencuci dengan PBS, sel digunakan untuk pengekstrakan RNA.

5.10. Pewarnaan Imunofluoresensi Terapung Bebas Untuk pemprosesan bahagian terapung bebas, tetikus biasa telah dirapikan-diperfus seperti yang diterangkan dalam Obata et al. [69]. Buah pinggang Murine kemudiannya dibedah dan direndam dalam 4% PFA/PBS selama 3 jam pada suhu 4 ◦C dengan pengadukan lembut. Tisu dibasuh dengan PBS, dan dilindungi dengan 30% sukrosa/PBS pada suhu 4 ◦C semalaman atau sehingga tenggelam ke dasar. Bahagian beku tebal (50 µm) dipotong dengan mikrotom gelongsor dengan tetapan beku. Bahagian telah disekat dengan antibodi IgM anti-tikus 1:50 kambing dalam PBS (F104UN, American Qualex International, Inc., San Clemente, CA, Amerika Syarikat) selama 1 jam dan diinkubasi dengan antibodi anti-Gb3/CD77 1:100 dalam penyekatan larutan atau kawalan isotaip (IgM tikus) dalam kepekatan yang sepadan sebagai antibodi utama untuk semalaman pada suhu 4 ◦C. Selepas mencuci, bahagian diinkubasi dengan antibodi sekunder (anti-tikus IgM Alexa Fluor 488, pencairan 1:2000 dalam PBS) selama 2 jam pada 4 ◦C. Bahagian telah diwarnai untuk probe lain AQP1 (pencairan 1:1000, Sigma-Aldrich Jepun, Tokyo, Jepun) dan CD31 (550274, pencairan 1:50, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, Amerika Syarikat) dengan antibodi sekunder anti-arnab IgG Alexa Fluor 546 (pencairan 1:2000 dalam PBS) dan IgG Alexa Fluor 647 anti-tikus (pencairan 1:2000 dalam PBS), masing-masing. Selepas mencuci dengan pewarnaan PBS, 40 ,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI, D21490, Thermo Fisher) dilakukan selama 15 minit pada suhu 4 ◦C. Bahagian telah direndam dalam cecair dalam perigi 96-plat perigi (berbentuk U) dengan pemerah pipi lukisan kecil setiap kali larutan ditukar. Langkah membasuh dilakukan di telaga yang lebih besar seperti dalam 12- atau 6-plat perigi. Media pelekap berair digunakan untuk lilitan penutup. Untuk penyediaan tisu manusia, buah pinggang postmortem telah ditetapkan dalam 20% formalin selama 2 minggu dan diproses untuk penyediaan terapung bebas seperti yang dilakukan untuk tisu tikus dengan satu pengecualian antibodi CD31 anti-manusia (CBL468, pencairan 1:20, Merck KGaA, Darmstadt , Jerman) telah digunakan.

5.11. Analisis Mikroarray

Separuh daripada buah pinggang direndam dalam 2 mL RNALater (Ambion, Austin, TX, USA) pada 4 ◦C dan jumlah RNA diekstrak dengan kit Rneasy Midi (Qiagen, Santa Clarita, CA, Amerika Syarikat). Tatasusunan Genom Tetikus 430A 2.0 (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) telah digunakan. Fail CEL telah diperoleh dan dinormalisasi dengan purata berbilang cip (RMA), pengiraan nombor salinan RNA dan perubahan lipatan terhadap 0 h dilakukan dalam R (v.3.6.0) dengan pakejnya affy [73] dan RankProd 2.0 [74]. Data ditunjukkan dalam log2-nilai perubahan kali ganda. Dataset didepositkan ke Gene Expression Omnibus (GEO) (Nombor akses GSE172465). Daripada sel RPTEC, jumlah RNA diekstrak dengan Sistem Pengasingan Jumlah RNA RNAgents (Promega, Tokyo, Jepun). Mikroarray oligonukleotida genom manusia keseluruhan (mikroarray DNA oligonukleotida 44K, Agilent Technologies, Tokyo, Jepun) telah digunakan untuk eksperimen mikroarray. Jumlah sampel RNA telah digunakan untuk penyediaan kuar cDNA berlabel Cy5- dan Cy{18}}. Sampel berlabel fluorophore telah dihibridkan pada setiap slaid kaca dan dibasuh, kemudian diimbas dengan pengimbas mikroarray DNA (model G2505A; Agilent Technologies). Perisian Pengekstrakan Ciri dan Analisis Imej (Agilent Technologies) telah digunakan untuk mencari dan menggambarkan setiap tempat dalam tatasusunan dan untuk menyepadukan keamatan, yang kemudiannya ditapis dan dinormalkan dengan menggunakan kaedah pelicinan plot serakan berwajaran tempatan. Kebolehulangan analisis microarray dinilai oleh dua ulangan pertukaran pewarna dalam setiap eksperimen. Perbezaan dalam ekspresi mRNA antara kawalan dan RPTEC yang dirawat Stx2-yang dituai pada 6, 10 atau 19 jam telah dibandingkan. Data format TXT daripada perisian GeneSpring telah digunakan untuk menentukan nama gen daripada ID probe dan menukar perubahan lipatan kepada log2-perubahan lipatan. Set data didepositkan ke GEO (Nombor akses GSE172466).

5.12. Analisis Bioinformatik Data Microarray dan Visualisasi Dalam kedua-dua buah pinggang tetikus dan data microarray RPTEC, gen yang biasa kepada kedua-duanya dan di mana perubahan dalam ungkapan adalah lebih daripada 2-penurunan atau peningkatan (atau log2-perubahan kali ganda adalah sama ada lebih kecil daripada −1 atau lebih besar daripada 1) pada bila-bila masa telah dipilih oleh R. Selain itu, dalam data microarray buah pinggang tetikus. Pengubahan gen yang sesuai dengan lengkung padu telah dipilih menggunakan pakej R maSigPro [https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/ maSigPro.html (terakhir diakses pada 4 Januari 2022)] [75]. Keluk padu sesuai untuk menampung peningkatan atau penurunan gen tersebut semasa tempoh masa. Ijazah polinomial yang lebih tinggi seperti lengkung padu membolehkan untuk memilih gen dengan pelbagai perubahan semasa perjalanan masa lebih baik daripada lengkung kuadratik. Gen yang berkelakuan mengikut trajektori yang serupa telah dikelompokkan dan corak penurunan/peningkatannya divisualisasikan oleh peta haba menggunakan gplots pakej R [https://CRAN.R-project.org/package=gplots (terakhir diakses pada 4 Januari 2022)] [76]. Ontologi gen (GO) telah diberikan dan fungsi GO di kalangan gen biasa diperkaya menggunakan Metascape [http://metascape.org (terakhir diakses pada 4 Januari 2022)] [77]. Sambungan/hubungan gen biasa dianalisis menggunakan STRING [https://string-db.org/ (terakhir diakses pada 4 Januari 2022)] [78]. Perkaitan antara gen biasa telah dicari secara manual serta menggunakan fungsi perlombongan teks STRING.

Rujukan

1. Gianantonio, C.; Vitacco, M.; Mendilharzu, F.; Rutty, A.; Mendilaharzu, J. Sindrom Hemolitik-Uremik.J. Pediatr.1964, 64, 478–491. [CrossRef] 

2. Vitsky, BH; Suzuki, Y.; Strauss, L.; Churg, J. Sindrom hemolitik-uremik: Kajian tentang perubahan patologi buah pinggang.Am. J. Pathol.1969, 57, 627–647. 

3. Takeda, T.; Dohi, S.; Igarashi, T.; Yamanaka, T.; Yoshiya, K.; Kobayashi, N. Kemerosotan oleh verotoksin fungsi tiub menyumbang kepada kerosakan buah pinggang yang dilihat dalam sindrom uraemik hemolitik.J. Jangkitan.1993, 27, 339–341. [CrossRef] 

4. Katagiri, YU; Mori, T.; Nakajima, H.; Katagiri, C.; Taguchi, T.; Takeda, T.; Kiyokawa, N.; Fujimoto, J. Pengaktifan kinase keluarga Src ya disebabkan oleh toksin Shiga yang mengikat globotriaosyl ceramide (Gb3/CD77) dalam ketumpatan rendah, mikrodomain tidak larut detergen.J. Biol. Kimia.1999, 274, 35278–35282. [CrossRef] 

5. Takenouchi, H.; Kiyokawa, N.; Taguchi, T.; Matsui, J.; Katagiri, YU; Okita, H.; Okuda, K.; Fujimoto, J. Shiga toksin yang mengikat kepada globotriaosyl ceramide mendorong isyarat intraselular yang menengahi pembentukan semula sitoskeleton dalam sel yang berasal dari karsinoma buah pinggang manusia.J. Sel Sci.2004, 117, 3911–3922. [CrossRef] [PubMed] 

6. Garred, O.; van Deurs, B.; Sandvig, K. Pembelahan yang disebabkan oleh Furin dan pengaktifan toksin Shiga.J. Biol. Kimia.1995, 270, 10817–10821. [CrossRef] 

7. Majoul, I.; Ferrari, D.; Söling, HD Pengurangan ikatan protein disulfida dalam persekitaran pengoksidaan. Jambatan disulfida toksin kolera A-subunit dikurangkan dalam retikulum endoplasma.FEBS Lett.1997, 401, 104–108. [CrossRef] 

8. Spooner, RA; Watson, PD; Marsden, CJ; Smith, DC; Moore, KAH; Tukang masak, JP; Tuhan, JM; Roberts, LM Protein disulfida isomerase mengurangkan risin kepada rantai A dan B dalam retikulum endoplasma.Biokim. J.2004, 383, 285–293. [CrossRef] 

9. Yu, M.; Haslam, Toksin DB Shiga Diangkut dari Retikulum Endoplasma Berikutan Interaksi dengan Luminal Chaperone HEDJ/ERdj3.Jangkitan. imun.2005, 73, 2524–2532. [CrossRef] 

10. Falguieres, T.; Johannes, L. Shiga toksin B-subunit mengikat kepada BiP pendamping dan protein nukleolar B23.biol. sel2006, 98, 125–134. [CrossRef]