Kajian Mengenai Fungsi Kekebalan Neuroendokrin Cistanche Deserticola Dan Produk Mengukus Wain Berasnya dalam Model Tikus Aruh Glukokortikoid-Ⅰ

1. Pengenalan

Cistanche deserticola, yang dipanggil "ginseng padang pasir," adalah ubat tradisional Cina yang telah digunakan selama berabad-abad sebagai herba yang-tonik untukmencergaskan buah pinggang dan menguatkan yang[1]. Lapan spesies dan satu variasiCistanche Herba telah direkodkan di China dan hanyaCistanche deserticolaYC Ma danCistanche tubulosa(Schenk) Wight direkodkan dalam Pharmacopoeia Cina [2]. Kajian farmakologi menunjukkan bahawaCistanches Herbamempamerkan neuroprotektif [3], imunomodulator [4], kardioprotektif [5], antikeletihan [6], anti-radang [7], hepatoprotektif [8], antioksida [9], antibakteria [10], julap [11], dan antitumor kesan [12]. Yang luasspektrum aktiviti biologi yang dilaporkan genus ini telah dikaitkan dengan komposisi fitokimia yang kompleks dan pelbagai.Cistanche deserticolamengandungi glikosida phenylethanol, iridoid, polisakarida [13], dan lain-lain. Kandungan glikosida phenylethanol adalah yang tertinggi dalam bahan perubatan asli [14].

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA UNTUK MENJAGA BUAH PINGGANG PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Pemprosesan Materia Medica Cina (CMM) ialah teknik farmaseutikal tradisional untuk memenuhi keperluan yang berbeza untuk merawat, mendispens dan membuat persediaan mengikut teori perubatan tradisional Cina. Produk yang diproses itu dinamakan potongan rebusan, yang digunakan di klinik. Pemprosesan bertujuan untuk meningkatkan keberkesanan untuk mengurangkan ketoksikan dadah mentah. 2015 Chinese Pharmacopoeia merekodkan bahawa hirisan tebal (CD) Cistanche dan Cistanche kukus wain beras (WCD) boleh digunakan sebagai rebusan di klinik. Kumpulan penyelidikan kami menunjukkan bahawa kesan julap telah lega, dan kesan antipenuaan dan mencergaskan buah pinggang telah dipertingkatkan selepas Cistanche dikukus dengan wain beras [15].

Fungsi paksi hypothalamus-pituitari-adrenal gland-thymus gland (HPAT) adalah bercelaru dalam sindrom kekurangan buah pinggang-yang [16]. Pesakit dengan kekurangan buah pinggang-yang juga mempunyai disfungsi imun yang meluas. Disfungsi paksi HPA berkait rapat dengan kekurangan imun. Teori rangkaian neuroendokrin-imun (NEI) menunjukkan bahawa sistem imun dan neuroendokrin berkongsi banyak ligan dan reseptor [17], dan hipotalamus dianggap sebagai pangsi untuk menghubungkan neuroendokrin dengan sistem imun.

Dalam kajian ini, kami mereplikasi kekurangan buah pinggang-yang dalam tikus model dengan suntikan kortikosteroid eksogen dan meneroka mekanisme kekurangan buah pinggang-yang sebagai tindak balas kepada produk yang diproses Cistanche deserticola dari perspektif fungsi imun endokrin.

2. Bahan-bahan dan cara-cara

2.1. Bahan dan Reagen

Cistanche deserticola dikumpul daripada Alashan Neimenggu pada 2019.5 dan dikenal pasti sebagai batang daging kering Cistanche deserticola YC Ma oleh Prof. Yanjun Zhai (Sekolah Farmasi, Universiti Perubatan Tradisional Cina Liaoning, China). Spesimen baucar telah disimpan di Pusat Teknologi Kejuruteraan Pemprosesan Liaoning.

Sebatian standard ajugol telah dibeli daripada Chengdu Pure Chem-Standard Co., Ltd. (Chengdu, China); cistanoside F,echinacoside, cistanoside A, dan isoacteosidetelah dibeli daripada Must Company (Sichuan China); acteoside telah dibeli daripada Dalian Meilun Bio. Co., Ltd. (Dalian, China). Acetonitril dan metanol gred MS telah dibeli daripada Merck KGaA (Darmstadt, Jerman). Asid formik gred HPLC dibeli daripada Merck KGaA (Darmstadt, Jerman). Wain beras dibeli daripada Zhejiang Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Zhejiang, China).

Kortikosteron (CAS: 50-22-6, ketulenan > 98%, TCI Shanghai Development Ltd. Co.), pil chinkuei shin chewan (Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd.), tikus ACTH, CRH, T, IL{{ 2}}, IFN-c, TNF- , IL-2 dan IL-10 Kit pengesanan ELISA telah dibeli daripada Nanjing Jiancheng Co., Ltd. Kit kortisol tikus ELISA disediakan oleh BOSK Co., antibodi CD4 tikus, antibodi CD8a (nos. 561833 dan 559976), lisat RBC (Solarbio, R1010), larutan penimbal PBS (Solarbio, P1020-500), TRIzol (MAN0001271), primer CaM dan -actin hulu dan hiliran telah disediakan oleh Kit Transkripsi Terbalik Guangzhou Invitrogen Co. (no. RR037A) dan Kit Sintesis cDNA (no. 10000068167) disediakan oleh Bole Life Medicine Products (Shanghai) Co., Ltd. Kloroform, isopropanol, etanol 75% dan uretana larutan semuanya tulen secara analitikal dan dihasilkan oleh Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. Air ultratulen dihasilkan oleh sistem Milli-Q (18.2 MΩ, Millipore, MA, Amerika Syarikat).

2.2. Instrumen Eksperimen

Penanda enzim (Thermo, model 3530911931), mesin basuh plat automatik (model HBS- 4009), meter daya tolak tarik paparan digital (model VICTOR- 50N), emparan beku berkelajuan tinggi (model Sigma 3k15 ), spektrofotometer ultramikro (model B-50Q), penguat gen (model L96G), PCR kuantitatif pendarfluor masa nyata (model StepOne), sitometer aliran (model AC66051710132), mikrotom parafin (model Laika), mikroskop (Olympus , model BS-53), dan instrumen air tulen (model F7JA36507) telah digunakan.

2.3. Penyediaan Sampel untuk UPLC-Q-TOF-MS dan Eksperimen Farmakologi

WCD telah diproses daripada kumpulan yang samaCistanche deserticoladalam makmal kami. Untuk penyediaan WCD, kepingan CD kering (tebal 5 mm) (100 g) diselitkan dengan wain beras (30 mL), dikukus pada tekanan tinggi (1.25 kPa) selama 4 jam, dan kemudian dikeringkan pada suhu 55 darjah .

Serbuk kasar CD dan WCD direndam dalam 10 kali 95% etanol selama 0.5 jam, diekstrak refluks 3 kali setiap kali selama 1 jam, dan ditapis, dan turasan 3 kali digabungkan. Etanol diperoleh semula di bawah tekanan yang dikurangkan, dan ekstrak diperolehi untuk pentadbiran. Ekstrak (1 mL) telah ditambah kepada 50% metanol, menjadikan jumlah isipadu kepada 20 mL, dan disimpan pada 4 darjah untuk analisis kandungan.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA UNTUK MENINGKATKAN FUNGSI SEKSUAL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.4. Syarat UPLC-QqQ-MS untuk Analisis Ekstrak CD dan WCD

2.4.1. Keadaan Analisis LCThMS

Sistem UPLC-MSThMS dengan perisian MassLynx 4.1 Analyst digunakan untuk melaksanakan pemerolehan dan pemprosesan data. Lajur analisis ialah Acquity UPLC BEH C18 (1{{10}}0 mm × 2.1 mm, 1.7 μm) pada suhu 40 darjah C. Fasa mudah alih ialah 0.1% larutan akueus asid formik (A) dan asetonitril yang mengandungi 0.1% asid formik (B). Kecerunan elusi ialah 0.00–1.00 min dengan 3% B, 1.01–2.00 min dengan 3%–11.5% B, 2.01–3.{{29 }} min dengan 12% B, 3.01–4.00 min dengan 15% B, 4.01–5.00 min dengan 20% B, 5.01–6.00 min dengan 22 % B, 6.01–8.00 min dengan 25% B dan 8.01–9.00 min dengan 10% B. Kadar alir ialah 0.3 mLTh min dan isipadu suntikan ialah 1.0 μL.

Spektrometer jisim triple quadruple Waters (Xevo TQD, Waters Corp., Milford, MA, USA) yang dilengkapi dengan sumber pengionan elektrospray (ESI) telah digunakan dalam mod ion negatif. Gas pelarutan ialah nitrogen dengan kadar alir 500 LThh pada suhu 250 darjah . Semua sebatian yang dikesan diukur dalam mod pemantauan tindak balas berbilang (MRM); Jadual 1 menunjukkan parameter tenaga, dan Jadual 2 menunjukkan lengkung penentukuran untuk komponen yang dianalisis.

2.4.2. Penyediaan Bahan Rujukan

Tubuloside A (3.02 mg), echinacoside (3.00 mg), 2′-acetylacteoside (2.34 mg), acteoside (2.45 mg), isoacteoside (0.61 mg), cistanoside F ( 2.14 mg), salidroside (3.39 mg), asid geniposidik (2.84 mg), ajugol (1.58 mg), dan catalpol (2.39 mg) telah dilarutkan dalam metanol untuk menyediakan larutan stok. Larutan stok telah dicairkan dengan metanol untuk mendapatkan kepekatan yang sesuai untuk penyelesaian standard kerja. Semua penyelesaian yang disediakan disimpan pada 4 darjah sebelum digunakan.

2.5. Penyediaan dan Pengelompokan Model Haiwan

Tikus jantan SD (180–220 g) telah dibeli daripada Liaoning Changsheng Biotechnological Co., Nombor permit haiwan: SCXK (Liao) 2015–0001. Semua tikus dikekalkan dengan akses percuma kepada makanan dan air pada 25 darjah dan kelembapan relatif 30-50%. Haiwan itu ditempatkan selama 7 hari sebelum eksperimen.

Seratus tikus dibahagikan secara rawak kepada 10 kumpulan: kumpulan kawalan kosong (BC), kumpulan kawalan model (MC), kumpulan kawalan positif (PC), kumpulan kawalan wain beras (WC), CD dos tinggi (CD) -HD), kumpulan CD dos pertengahan (CD-MD), kumpulan CD dos rendah (CD-LD), kumpulan WCD dos tinggi (WCD-HD), kumpulan dos pertengahan WCD (WCD-MD) dan Kumpulan WCD dos rendah (WCD-LD). Dos CD-HDThWCD-HD, CD-MDTh WCD-MD dan CD-LDThWCD-LD masing-masing ialah 5.48 gTh(kg ∙ d), 2.74 gTh (kg ∙ d), dan 1.37 gTh(kg ∙ d). Dos untuk kumpulan PC ialah 1.646 gTh (kg ∙ d), dan untuk kumpulan WC, 1 mLTh100 g selama 40 hari. Pada hari ke-6 selepas pentadbiran, tikus disuntik secara subkutan dengan penggantungan air kortikosteron (kortikosteron + 0.1% dimetil sulfoksida + 0.1% Tween-80 + 0.9% natrium klorida) kecuali untuk kumpulan SM [18]. Kepekatan kortikosteron ialah 5 gThL, dan dosnya ialah 0.1 mLTh100 g. Tikus dalam kumpulan BC telah diberi garam biasa + 0.1% dimetil sulfoksida + 0.1% Tween- 80 + 0.9% natrium klorida melalui suntikan pada dos yang sama.

2.6. Penentuan Fungsi Paksi HPA

2.6.1. Ujian Berat, Suhu dan Kuasa Pegangan

Ujian berat dilakukan setiap 3 hari, dan suhu diambil setiap 6 hari. semasa eksperimen. Pada hari ke-39, kekuatan maksimum anggota belakang diukur dengan meter cengkaman. Tikus-tikus itu diletakkan di atas pelantar yang licin, membuatkan anggota belakang mereka mencengkam tiang. Tikus akan secara naluri mencengkam sebarang objek untuk mengelakkan bergerak ke belakang apabila ekor ditarik sehingga daya tarikan melebihi cengkaman. Apabila tikus kehilangan cengkamannya, prapenguat secara automatik boleh merekodkan daya cengkaman maksimum.

2.6.2. Penentuan Tahap T, CRH, ACTH, CORT, dan Kortisol dalam Serum

Satu jam selepas pemberian terakhir, tikus telah dibius dengan suntikan intraperitoneal larutan uretana (20 gTh100 mL). Kemudian, sampel darah dikumpulkan, disentrifugasi pada 3500 r selama 15 minit untuk mendapatkan serum, dan disimpan pada -20 darjah. Kepekatan T, CRH, ACTH, CORT, dan kortisol diukur dengan kit ELISA tikus mengikut arahan pengilang.

2.6.3. Pemerhatian Mikroskop

Struktur morfologi tisu kelenjar adrenal diperhatikan dengan pewarnaan HE. Tisu adrenal telah ditetapkan dalam 10% paraformaldehyde, dehidrasi dalam etanol, dibuat lutsinar dengan larutan xilena, tertanam dengan kaedah konvensional, dipotong kepada kepingan tebal 4 μm, didewax dengan larutan xilena, terhidrat dengan kecerunan etanol, dan kemudian diwarnakan dengan hematoxylin dan eosin larutan pewarna. Selepas dibuat lutsinar dengan xilena, plat itu dimeterai dengan getah neutral dan diperhatikan di bawah mikroskop.

2.6.4. Pewarnaan Imunohistokimia bagi Ungkapan Protein Bax, Bcl-2, Caspase-3, Fas dan FasL dalam Kelenjar Adrenal

Bahagian adrenal tikus tertanam formalin, parafin telah dinyahparafin dan dihidrat semula selepas dipotong pada ketebalan 4 μm. Untuk menyekat aktiviti peroksidase endogen, bahagian tersebut telah dipraeram dalam blok hidrogen peroksida selama 10 min. Bahagian dicelup ke dalam 0.01 M sitrat (pH 6.0) dan dipanaskan hingga mendidih. Proses itu diulang selepas 5-10 minit. Selepas penyejukan, bahagian itu dibasuh dengan PBS (pH 7.2-7.6) 1-2 kali, dibiarkan pada suhu bilik selama kira-kira 5 minit, dan dibasuh dengan PBS (pH 7.2-7.6) 2-3 kali. Larutan penyekat BSA 5% telah ditambah pada suhu bilik, dan cecair yang berlebihan pada bahagian itu digoncang 20 minit kemudian. Antibodi primer yang dicairkan khusus untuk FasTh FasL, Bcl-2ThBax dan caspase-3 (1:100 dicairkan dengan PBS) telah ditambah dan diinkubasi pada 37 darjah selama 1 jam atau 4 darjah semalaman. Bahagian itu dibasuh 2-3 kali dengan PBS (pH 7.2-7.6). Kemudian, IgG anti-tikus kambing terbiotinilasi ditambah, dan bahagiannya dikeringkan pada suhu 20-37 darjah selama 20 minit dan dibasuh dengan PBS (pH 7.2-7.6) 4 kali selama 5 minit. Selepas pencucian menyeluruh dalam PBS, bahagian tersebut diinkubasi dengan campuran reagen A dan B selama 30 minit, diinkubasi dengan PBS selama 45 minit, dan akhirnya dibangunkan dengan substrat DAB (DAKO) selama 30 minit sebelum diwarnakan sedikit dengan hematoxylin, dehidrasi, dan dipasang.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA UNTUK MENINGKATKAN SENSASI SEKSUAL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.7. Penentuan Fungsi Imun

2.7.1. Pengiraan Indeks Organ Kekebalan

Satu jam selepas pemberian terakhir, tikus telah dibius dengan suntikan intraperitoneal larutan uretana (20 gTh100 mL), dan kemudian limpa dan kelenjar timus dikeluarkan dan ditimbang serta-merta dalam tudung steril. Pekali berat limpa atau timus (%) � limpa atau berat timus (mg) Berat badan (g).

2.7.2. Pengesanan Subset Limfosit T dalam Darah Periferi

Splenosit dan hemosit diinkubasi dengan antibodi monoklonal anti-CD4 (PE) dan anti-CD8 (FITC) selama 30 minit dalam gelap. 2 mL erythrocyte lysate telah ditambah, dan larutan dicampurkan dengan vorteks. Larutan dibiarkan dalam kegelapan selama 10 minit dan disentrifugasi selama 5 minit. Supernatan dibuang, dan kemudian larutan dibasuh 3 kali dengan PBS sejuk ais dan digantung semula dalam larutan permeabilizing PBS. Sekurang-kurangnya 10,000 sel telah dianalisis oleh sitometri aliran dalam masa 1 jam dari setiap pewarnaan Mab.

2.7.3. Penentuan Tahap IL-10, IL-6, IL-2, TNF- dan IFN-c dalam Serum

Satu jam selepas pemberian terakhir, tikus telah dibius dengan suntikan intraperitoneal larutan uretana (20 gTh100 mL), dan darah diambil dari aorta abdomen. Darah telah disentrifugasi pada 3500 r selama 15 minit untuk mendapatkan serum dan disimpan pada -20 darjah. Kepekatan IL-10, IL-6, IL-2, TNF- dan IFN-c telah dikesan dengan kit ELISA tikus mengikut arahan pengilang.

2.8. Ekspresi CaM dalam Tisu Hypothalamus dan Hypophysis

Jumlah RNA diekstrak daripada tisu hipotalamus dan hipofisis oleh TRIzol. Transkripsi terbalik telah dijalankan pada 10 μL jumlah RNA mengikut arahan pengeluar. Jumlah cDNA yang sama dianalisis melalui qPCR dengan kehadiran pewarna pengikat dsDNA (Promega, Amerika Syarikat) dan Sistem PCR Masa Nyata CFX 96 (Bio-Rad, Amerika Syarikat) untuk melihat gen yang berbeza di bawah syarat pengaktifan awal di 95 darjah selama 10 minit, 40 kitaran denaturasi pada 95 darjah selama 15 s, dan lanjutan penyepuhlindapan pada 60 darjah selama 1 minit.

Primer untuk CaM dan -actin diberikan dalam Jadual 1, dan -actin digunakan sebagai kawalan dalaman. Setiap sampel telah dinormalisasi dengan menggunakan perbezaan dalam ambang kritikal (Ct) antara gen sasaran dan -aktin. Persamaan berikut digunakan untuk menerangkan keputusan: ΔΔCt � (gen sasaran Ct − gen Ct -aktin) kumpulan eksperimen − (gen sasaran Ct − gen Ct -aktin) kumpulan kawalan. Tahap mRNA setiap sampel kemudiannya dibandingkan, menggunakan ungkapan 2- gen sasaran ΔΔCt. Keputusan setiap kumpulan dipuratakan (Jadual 3).

2.9. Analisis statistik

Semua data dianalisis menggunakan perisian SPSS (versi 19.0, SPSS Institute Inc., Chicago, IL). Perbezaan antara kumpulan dianalisis dengan analisis varians ukuran berulang sehala (ANOVA). Hasilnya dinyatakan sebagai min ± sisihan piawai (SD) menggunakan perisian GraphPad Prism (versi 6.0, San Diego, CA, USA). Perbezaan dengan nilai P kurang daripada 0.05 dianggap signifikan secara statistik.

3. Keputusan Eksperimen

3.1. UPLC-QqQ-MSAnalisis

Untuk mencapai pemisahan terbaik, bentuk puncak dan masa analisis yang singkat, keadaan kromatografi termasuk lajur, fasa mudah alih dan program kecerunan telah dikaji dalam percubaan awal kami. Kromatogram biasa dengan mod MRM dibentangkan dalam Rajah 1.

Daripada Jadual 4, kita dapat melihat bahawa kandungan glikosida phenylethanoid dalam WCD meningkat berbanding dengan CD, terutamanya untuk echinacoside dan acteoside, manakala kandungan iridoid telah menurun dalam WCD.

3.2. Peraturan untuk Fungsi Paksi HPA

3.2.1. Ujian Berat, Suhu dan Kuasa Pegangan

Tikus kumpulan MC dan kumpulan eksperimen menunjukkan gejala kekurangan buah pinggang-yang secara beransur-ansur selepas diberi kortikosteron. Gejala-gejala, seperti penurunan berat badan, hipotermia, kehilangan kilauan rambut, semangat terkulai, kelewatan dalam tindak balas, dan penurunan ketara dalam penggunaan dan aktiviti air, bertambah baik dalam kumpulan CD dan WCD. Rajah 2(a) menunjukkan perubahan berat. Berat setiap kumpulan ubat meningkat, terutamanya dalam kumpulan CDHD dan WCD-HD. Pertambahan berat badan dalam kumpulan MC adalah yang paling rendah. Rajah 2(b) menunjukkan perubahan suhu, yang paling rendah dalam kumpulan MC, dan suhu meningkat dalam kumpulan WCD-HD, WCD-MD dan WCD-LD.

Rajah 2(c) menunjukkan bahawa kuasa pegangan meningkat untuk kumpulan BC dan setiap kumpulan eksperimen, dan kumpulan WCD-MD adalah yang tertinggi, yang menunjukkan bahawa tanda-tanda kelemahan yang disebabkan oleh kekurangan buah pinggang-yang bertambah baik selepas pentadbiran.

3.2.2. Tahap T, CRH, ACTH, CORT, dan Kortisol

Rajah 3 menunjukkan bahawa berbanding kumpulan BC, tahap T, CRH, ACTH, dan CORT dalam serum tikus menurun (P < 0.01) dan tahap kortisol menurun (P < 0.05) dalam kumpulan MC. Berbanding dengan kumpulan MC, tahap T dalam kumpulan WCD-HD dan WCD-MD meningkat (P < 0.01), tahap CRH dalam WCD-LD, Kumpulan WCD-MD dan WC dipertingkatkan (P < 0.01), kandungan ACTH meningkat dalam kumpulan CD-HD, WCD-MD dan WCD-HD (P <0.01), tahap CORT dinaik taraf dalam Kumpulan CD-MD, WCD-MD, dan WCD-HD (P <0.01) dan dipertingkatkan dalam kumpulan CDHD dan WCD-LD (P <0.05), dan tahap kortisol meningkat dalam setiap kumpulan ubat.

3.2.3. Hasil Pemerhatian Mikroskop

Tisu kelenjar adrenal boleh dibahagikan kepada lapisan kortikal dan lapisan medula. Lapisan kortikal termasuk lapisan globular, berkas, dan retikular. Sel-sel mengandungi lebih banyak lipid, dan lapisan medula kebanyakannya terdiri daripada sel pheochromocytoma dan sejumlah kecil tisu berserabut. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 4, kami mendapati bahawa semuanya adalah normal dalam kumpulan BC, manakala dalam kumpulan MC, korteks adrenal mempunyai hiperplasia yang jelas, atrofi selular, dan ketumpatan yang semakin meningkat. Jalur bulbous menebal, dan zon fascicular lut sinar, zona reticularis sempit, dan sel yang lebih kecil menunjukkan pewarnaan yang tidak sekata dan kesesakan kapilari. Dalam kumpulan PC, sempadan kortikal dan medullar kelihatan. Sel-sel jalur globular dan bundle telah disusun secara sama rata, dan struktur morfologi telah dipulihkan. Pemulihan yang lebih baik yang sama diperhatikan dalam kumpulan WCD, dan kesan dalam kumpulan WCD-MD adalah lebih baik daripada kumpulan WCD-HD dan WCD-LD. Morfologi kelenjar adrenal dalam kumpulan CD tidak sebaik dalam kumpulan WCD.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA UNTUK MENINGKATKAN FUNGSI SEKSUAL PHGS75% ECH 30% ACT 12%