Kajian Mekanisme Seperti Estrogenik Glikosida Cistanche Menggunakan Metabolomik

pengenalan

Estrogen memainkan peranan penting dalam banyak proses perkembangan, fisiologi dan berkaitan, termasuk perkembangan rahim.1–3 Walau bagaimanapun, penggunaan jangka panjang estrogen boleh menyebabkan banyak kesan sampingan, seperti meningkatkan risiko kanser payudara, kanser endometrium dan tumor ginekologi yang lain.4,5 Oleh itu, penyelidik telah komited untuk mencari pengganti estrogen yang boleh mengelakkan kesan sampingan ini, yang dikenali sebagai modulator reseptor estrogen terpilih, yang mana fitoestrogen terdiri daripada kategori penting.6 Sebatian fitoestrogen secara semula jadi berlaku dalam tumbuhan dengan potensi estrogenik dan boleh mengikat reseptor estrogen untuk menjalankan aktivitinya. Oleh itu, fitoestrogen boleh merangsang pertumbuhan rahim dengan menggabungkan dengan reseptor estrogen yang banyak dalam rahim, bermakna ujian uterotropik boleh digunakan untuk pemeriksaan awal dan menilai fitoestrogen.

Cistanchedeserticola (CD), dikenali sebagai Rou Cong-Rong di China, didakwa berkesan untuk pembiakan, pembangunan, dan fungsi kesuburan, dan telah digunakan sebagai tonik selama lebih daripada 1800 tahun.8,9 Baru-baru ini, kajian farmakologi telah menunjukkan bahawa ini tonik mempunyai fungsi perubatan yang luas, sepertipengawalseliaan hormon, aperient, imunomodulator, anti-oksidatif, anti-apoptosis, neuroprotektif, antinociceptive, anti-radang, anti-keletihan, dan aktiviti estrogenik.10 Glikosida cistanche (GC) yang diekstrak daripada CD adalah antara komponen aktif utama dan mempamerkan pelbagai aktiviti biologi.11 Walaupun konstituen aktif CD telah dijelaskan sebelum ini,12 mekanisme seperti estrogenik GC tidak pernah disiasat.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA UNTUK MENCEGAH OSTEOPOROSIS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Dalam kajian berterusan ini, kami berhasrat untuk mengesahkan kemungkinan penggunaan GC sebagai fitoestrogen dan menjalankan analisis metabolomik untuk meneroka mekanisme seperti estrogenik GC. Pertama, ujian uterotropik dan analisis histologi digunakan untuk mengesahkan aktiviti estrogenik GC. Paling penting, kami memberi tumpuan kepada perubahan metabolik dalam serum dan air kencing tikus menggunakan analisis metabolomik berasaskan UPLC-MS/MS. Disebabkan oleh kekurangan metabolomik yang tidak disasarkan, seperti kebolehulangan dan pengaruh matriks yang rumit, kaedah pseudo berasaskan mod MRM digunakan untuk memantau metabolit dan indeks secara khusus (termasuk metabolisme tenaga, tekanan oksidatif, metabolisme lipid dan metabolisme amino) berkaitan dengan kesan estrogenik, pertumbuhan, dan perkembangan telah dipilih sebagai biomarker untuk pengesanan. Keputusan kami memberi penerangan tentang mekanisme seperti estrogenik GC, yang akan membantu pembangunan dan penggunaan GC.

Percubaan

Reagen

L-Leucine, L-kynurenine, L-tryptophan, 5-HTP, asid kolik, Nphenylacetylglycine, 5-HT, glutathione (GSH), dan 2,4-dinitrophenylhydrazine ($99.{{ 8}}%, HPLC) telah dibeli daripada Dalian Melone Biology Technology Co. (Dalian, China). N-Ethylmaleimide ($98%, HPLC), L-glutathione teroksida (GSSG, $98%, HPLC) dan 1,1,3,3-tetraethoxypropane (TEP) telah dibeli daripada Sigma (Madrid, Sepanyol). L-Phenylalanine (Ring-D5, 98%, DLM-1258-5) telah dibeli daripada makmal isotop Cambridge (MA, USA). Metanol dan asetonitril gred MS telah dibeli daripada ACS (Houston, Amerika Syarikat). Diethylstilbestrol (ketulenan, $99.0%), asid formik, asid asetik glasier, dan hematoxylin dan eosin (H&E) telah dibeli daripada Sigma-Aldrich (Sigma Chemical Co., St. Louis, Amerika Syarikat). Naringenin (ketulenan, $98% (HPLC)) telah dibeli daripada Shanghai Jingchun Aladdin Reagent Co. (Shanghai, China). GC telah disediakan di makmal kami, dan ketulenannya ditentukan 60% oleh spektrofotometri ultraviolet menggunakan acteoside sebagai penanda untuk penentuan.

Penyediaan GC

Briey,serbuk cistanche(100 g) direndam dalam 75% etanol (1000 mL) selama 1 jam, kemudian reux diekstrak selama 2.5 jam tiga kali. Supernatan itu dipekatkan di bawah vakum untuk mendapatkannyaekstrak cistanche(23.3 g). Ekstrak telah dicairkan dengan air hingga kepekatan 0.5 g mL- 1 (keterlarutan ditentukan dengan ubat mentah). Selepas penjerapan dengan resin makroporous AB-8 selama 8 jam, lajur dielusi secara berurutan dengan air dan 85% etanol. eluan etanol 85% telah ditumpukan untuk mendapatkan ekstrak etanol (8.4 g). Ekstrak etanol (0.02 g) ditimbang dengan tepat dan dilarutkan dalam 50% metanol (10 mL). Sebanyak 1 mL aliquot larutan telah dicairkan kepada 100 mL dengan metanol dalam volumetrik ask. Akhirnya, larutan yang dicairkan diukur pada 330 nm oleh spektrofotometri ultraviolet. Serapan ultraungu ialah 0.341, dan hubungan linear untuk acteoside oleh UV ialah y ¼ 24.905X + 0.0426 (R2 ¼ 0.9982). Apabila mengandungi 5.04 g GC, kadar penulenan adalah 60% (acteoside digunakan sebagai penanda untuk penentuan GC). Penilaian cap jari GC ditunjukkan dalam ESI Rajah S1.

Eksperimen haiwan dan pengumpulan sampel

Tikus SD betina yang tidak matang seksual (45–60 g) dan kematangan seksual (320–380 g) telah disediakan oleh Pusat Haiwan Universiti Perubatan Harbin, lesen haiwan makmal, SCXK- (Tentera): 2013-001. Haiwan itu ditempatkan di bawah keadaan makmal SPF dan dibekalkan dengan air paip yang diubah suai diet makmal secara ad libitum. Semua prosedur haiwan telah diluluskan oleh Garis Panduan Kebajikan dan Penjagaan Haiwan Wilayah Heilongjiang, dan dilakukan mengikut garis panduan Institut Kesihatan Kebangsaan mengenai prinsip penjagaan haiwan (2004). Semua tikus yang digunakan dalam eksperimen ini telah disesuaikan dengan persekitaran di atas selama seminggu.

Tikus SD yang tidak matang secara seksual dibahagikan secara rawak kepada tiga kumpulan 10 tikus: kumpulan kosong, kumpulan diethylstilbestrol dan kumpulan GC. Manakala, 10 ekor tikus SD kematangan seksual telah dipilih sebagai kumpulan kawalan. Kumpulan diethylstilbestrol telah ditadbir dengan diethylstilbestrol (0.35 mg kg- 1, 1 mL/ 100 g), kumpulan GC ditadbir dengan larutan GC (30 g kg- 1, 1 mL/100 g ), dan kumpulan kosong dan kumpulan kawalan menerima air suling dengan isipadu yang sama dua kali sehari (pagi dan petang) selama 3 hari. Pada hari ketiga, tikus ditempatkan di dalam sangkar metabolik selepas pentadbiran, dan sampel air kencing dikumpulkan secara berterusan selama 24 jam. Tikus-tikus telah dibius menggunakan pentobarbital dan sampel darah diperoleh dan dikumpulkan dari aorta abdomen dan disentrifugasi pada 3000 × g (15 min, 4. C) untuk mendapatkan serum. Semua sampel telah disimpan di - 20. C. Selanjutnya, rahim dipisahkan, ditimbang, dan diperiksa menggunakan formalin 10%.

Analisis histologi

Tisu bersiri 5 mm tebal dipotong dari rahim. Bahagian tisu kemudiannya dibenamkan dalam parafin, diwarnai dengan H&E menggunakan kaedah rutin dan diperhatikan dengan mikroskop optik (BZ-9000; Keyence, Osaka, Jepun). Ketinggian sel epitelium rahim diukur dengan mikrometer di bawah mikroskop.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA UNTUK MENGGALAKKAN PERTUMBUHAN PAYUDARA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Metabolomik

Penyediaan serum dilucutkan arang aktif

Serum kosong khas disediakan daripada serum tikus yang telah dilucutkan daripada bahan endogen menggunakan serbuk arang aktif. Serbuk arang aktif (6 g) telah ditambah ke dalam serum tikus (10}0 mL) digoncang selama 2 jam pada suhu bilik dan disentrifugasi pada 4 . C dan 13 500 rpm selama 20 minit. Supernatan telah diubah menggunakan membran PES ekspres Millipore (Merck Millipore, Ltd.) yang dilekatkan pada picagari 20 mL dalam urutan berikut: 5 mm, 1.2 mm, dan 0.45 mm. Serum "dilucutkan" telah disahkan bebas daripada biomarker oleh LC-MS/MS.

Penyediaan penyelesaian standard

L-Tryptophan (Cuba), L-kynurenine (Kyn), GSSG, N-phenylacetylglycine (N-Phe), 5- HTP, L-leucine (Leu), 5-HT, dan asid kolik ( Penyelesaian stok CA) (1 mg mL- 1 ) telah disediakan menggunakan 100% metanol. GSH telah disediakan pada 0.5 mg mL- 1 dalam penimbal PBS NEM 10 mM dan disimpan pada - 40. C dalam botol coklat. Kalibrator dijana menggunakan gabungan L-tryptophan, L-kynurenine, GSSG, N-phenylacetylglycine, 5-HTP, L-leucine, 5-HT, asid kolik dan GSH-NEM yang dicairkan secara bersiri dengan suling air. Penyelesaian stok IS L-phenylalanine-d5 (d5-Phe) telah disediakan dalam 100% metanol, dan penyelesaian kerja d5-Phe (10 ng mL- 1 ) telah disediakan dalam 100% metanol dan disimpan di - 40. C.

Semasa analisis, langkah derivatisasi diperlukan untuk mengelakkan degradasi GSH, yang meningkatkan kestabilan untuk pengesanan dan kuantifikasi GSH. GSH ditentukan selepas tindak balas dengan NEM.15,16 Menurut laporan sebelumnya, 50 mM NEM telah dipilih untuk GSH.

Penyediaan sampel

Untuk sampel serum, 10 mM NEM (200 mL) ditambah kepada sampel (200 mL), diikuti dengan metanol (1000 mL mengandungi IS Phe-d5 pada 10 ng mL- 1 ), dan diinkubasi selama 20 minit pada { {9}}. C. Selepas sentrifugasi pada 4. C dan 12 000 rpm selama 10 minit, supernatan (1000 mL) dipindahkan ke 2 mL empar dan disejat hingga kering. Sisa kering dilarutkan semula dalam air suling (100 mL) selepas sentrifugasi selama 15 minit pada 4 . C dan 13 500 rpm, dan aliquot 10 mL supernatan telah disuntik untuk analisis.

Untuk sampel air kencing, 100 mL sampel dimasukkan ke dalam tiub 2 mL, dan 1 isipadu PBS (m/v) yang mengandungi 50 mM NEM telah ditambah kepada setiap sampel kencing. Kemudian, metanol (1000 mL mengandungi IS pada 10 ng mL- 1 ) ditambah, dan sampel diinkubasi pada - 20. C selama 20 minit, dan kemudian disentrifugasi pada 12 000 rpm selama 10 minit pada 4 . C. Supernatan (1000 mL) telah disejat hingga kering di bawah aliran nitrogen yang lembut pada suhu bilik, dan kemudian sisa itu dilarutkan dalam 60 mL fasa mudah alih dan dipusingkan selama 1 minit sebelum sentrifugasi pada 13 500 rpm dan 4 . C selama 15 minit. Supernatan aliquot 10 mL disuntik untuk analisis.

Pengesahan metodologi

Pengesahan ujian dilakukan mengikut "Panduan untuk Industri: Pengesahan Kaedah Bioanalitik" (Pentadbiran Makanan dan Dadah, September 2013). Penentukuran telah dijana menggunakan matriks pengganti untuk Trp, Kyn, GSH, GSSG, 5-HT, 5-HTP, N-Phe dan CA daripada penyelesaian kerja standard dalam serum "dilucutkan". Setiap penentukuran kepekatan telah diduplikasi. Lengkung piawai dikira dengan regresi linear kuasa dua terkecil berwajaran 1/X bagi kepekatan penentukur lengkung piawai dan nisbah kawasan puncak untuk analit kepada IS.

Ujian ketepatan dan ketepatan

Ketepatan ujian sampel QC terkumpul dan sampel QC serum/urin tikus yang tidak dirawat telah dinilai menggunakan satu larian analitik intra-hari dan tiga antara hari. Sampel QC dengan tiga kepekatan berbeza dijana dengan menambahkan L-tryptophan, L-kynurenine, GSSG, N-phenylacetylglycine, 5-HTP, L-leucine, 5-HT, asid kolik dan GSH-NEM penyelesaian standard kepada serum/PBS "dilucutkan", yang kemudiannya diproses dengan cara yang sama seperti sampel dalam vivo. Cuba, Kyn, GSSG, N-Phe, 5-HTP, 5-HT, Leu dan penyelesaian stok standard CA (1 mg mL- 1 ) telah disediakan dalam 10 0% metanol, kecuali GSH, yang disediakan pada 0.5 mg mL- 1 dalam penimbal PBS NEM 10 mM. Lengkung piawai pada lapan kepekatan berbeza dijana dengan cara yang sama seperti sampel QC, dan dianalisis dengan regresi linear kuasa dua terkecil berwajaran 1/X. Untuk kajian pengesahan kaedah, kaedah QC lain dilakukan serentak menggunakan serum/urin terkumpul (50 mL) daripada setiap sampel kumpulan kawalan atau model untuk mendapatkan spesimen QC dan kemudian diproses seperti sampel in vivo. Satu siri sampel QC dan lengkung standard dijalankan untuk setiap 50 sampel haiwan.

Kesan matriks

Variasi matriks, yang ditakrifkan sebagai variasi dalam ketepatan ujian untuk lot matriks yang berbeza, telah dinilai menggunakan enam plot berbeza serum/urin tikus berduri untuk analisis dan menilai pemulihan berduri.17 Penilaian keseluruhan kesan matriks untuk ujian kompaun endogen adalah mencabar . Satu cara untuk menguji sama ada ujian mempunyai sebarang kesan matriks (keseluruhan) adalah dengan menilai pemulihan yang berduri. Ujian pemulihan berduri melibatkan pemancingan analit ke dalam sampel pra-pengekstrak, yang berbeza daripada ujian faktor matriks (MF), yang melibatkan pemancingan analit ke dalam sampel pasca pengekstrakan.18 MF dikira sebagai kawasan puncak analit dalam kehadiran matriks biologi berbanding dengan ketiadaan matriks biologi. MF yang dinormalisasi IS digunakan: MF ¼ nisbah kawasan puncak/IS dengan kehadiran nisbah matriks vs kawasan puncak/IS tanpa ketiadaan matriks.

Analisis UPLC-MS/MS

Peralatan MS yang dilengkapi dengan lajur analitik Waters X BridgeTM BEH C18 XP (2.5 mm, 3.0 × 100 mm; Waters, Torrance, CA) telah digunakan untuk LC-MS / analisis MS. Fasa mudah alih kecerunan linear Q yang terdiri daripada 0.1% air asid formik (pelarut A) dan metanol (pelarut B) telah digunakan mengikut atur cara kecerunan berikut: 0–3.0 min (0–1% B); 3.0–10.0 min (1–3% B); 10.0–14.0 min (3–50% B); 14.0–18.0 min (50–95% B); 18.0–22.0 min (95–0% B), masa berhenti ialah 25 min. Isipadu suntikan ialah 10 mL dan kadarnya ialah 0.6 mL min- 1. Kaedah terakhir menggunakan parameter berikut: jenis imbasan, MRM; mod ion, pengionan electrospray (ESI) dalam mod ion positif dan negatif; voltan semburan ion, ± 4500 V; gas tirai, 20; suhu, 450. C; gas sumber ion 1, 40; gas sumber ion 2, 40. Semua data UPLC-MS diperoleh menggunakan perisian AB Analyst (versi 1.6.2), dan m/z 171.1–125.2 untuk piawai dalaman d5-Phe (DP, 63 V; CE , 8 V; CXP, 21 V; EP, 24 V) dan keadaan MS terperinci ditunjukkan dalam Jadual S1.

Analisis statistik

Semua nilai dinyatakan sebagai min ± SD. Kepentingan perbezaan antara kumpulan telah dibandingkan melalui ujian ANOVA sehala diikuti dengan ujian Dunnett menggunakan program Statistical Package for Social Sciences (SPSS 20.0, Chicago, IL, USA). Ambang kepentingan ditetapkan pada p <0.05 dalam ujian ini.

Keputusan dan perbincangan

Kesan GC pada rahim

Berat rahim dan analisis histologi digunakan untuk menilai kesan GC pada rahim. Berat rahim meningkat dengan ketara dalam kumpulan diethylstilbestrol, GC, dan kawalan berbanding kumpulan kosong (P < {{0}}.01). Dalam kumpulan kosong, epitelium endometrium adalah kolumnar rendah dengan kelenjar kecil, epitelium kelenjar berbentuk kubik, dan tanpa sel radang interstisial. Dalam kumpulan diethylstilbestrol, epitelium kelenjar dan endometrium adalah kolumnar tinggi dan menunjukkan hiperplasia, dengan banyak sel radang interstisial. Dalam kumpulan GC, epitelium kelenjar dan endometrium sangat bergerigi kolumnar dan menunjukkan hiperplasia dengan banyak sel radang interstisial dan penebalan intimal. Dalam kumpulan kawalan, endometrium adalah kolumnar tinggi dan epitelium kelenjar adalah kolumnar rendah, dengan beberapa sel radang interstisial. Berbanding dengan kumpulan kosong, ketinggian sel epitelium rahim meningkat dengan ketara dalam kumpulan lain (P <0.01) (Rajah 1).

Kaedah pengesahan biomarker yang dikesan oleh UPLC-MS/MS

Julat lineariti dan penentukuran

Bagi setiap ukuran, satu lengkung penentukuran linear dengan faktor pemberat 1/X dalam matriks yang dikaji telah dibina. Keluk penentukuran untuk analisis dalam serum dianalisis pada hari yang berbeza. Julat penentukuran untuk analisis telah diedarkan di sepanjang tujuh titik penentukuran, seperti ditunjukkan dalam Jadual 1.

Ketepatan dan ketepatan. Kaedah ini terbukti sesuai, dari segi ketepatan dan ketepatan, kedua-dua antara hari dan intra-hari, untuk semua sampel yang dikaji. Nilai parameter ini adalah kurang daripada 5% pada kepekatan yang ditetapkan untuk GSH, GSSG, Leu, Trp, Kyn, 5-HTP, asid kolik, 5-HT dan N-phenylacetylglycine, dengan tiga ulangan setiap kepekatan yang dianalisis. Data yang sepadan dengan nilai antara hari dan intra-hari ketepatan dan ketepatan ditunjukkan dalam Jadual ESI S2.

Kesan matriks

Seperti yang ditunjukkan dalam Jadual S3 ESI,† pemulihan yang meningkat adalah 92.5–118.1% apabila menambahkan 1000 ng mL- 1 GSH, 2000 ng mL- 1 GSSG, 1000 ng mL- 1 Leu , 6000 ng mL- 1 Trp, 50 ng mL- 1 Kyn, 2 ng mL- 1 5-HTP, 400 ng mL- 1 asid kolik , 8 ng mL- 1 5-HT, dan 2500 ng mL- 1 N-phenylacetylglycine ke dalam tiga plot berbeza serum tikus, dan apabila menambah 100 ng mL- 1 GSH, 200 ng mL- 1 GSSG, 1000 ng mL- 1 Leu, 6000 ng mL- 1 Trp, 50 ng mL- 1 Kyn, 2 ng mL{ {37}} daripada 5-HTP, 400 ng mL- 1 asid kolik, 8 ng mL- 1 daripada 5-HT, 2500 ng mL- 1 N -phenylacetylglycine ke dalam tiga plot berbeza air kencing tikus dengan pelbagai tahap asas. CV bagi kepekatan Trp dan Kyn yang diukur daripada lot ini ialah #10% (n ¼ 5). Keputusan ini menunjukkan bahawa matriks yang berbeza tidak mempengaruhi ujian dengan ketara.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA UNTUK MENCEGAH KANSER RAHIM PHGS75% ECH 30% BERTINDAK 12%

Analisis profil metabolit dengan kaedah pseudo-targeted

Kaedah pseudotargeted telah dieksploitasi untuk menyiasat serum dan metabolit air kencing MRM proling empat kumpulan (kosong, diethylstilbestrol, kawalan, dan GC).

Pertama, model PCA dibina untuk mempamerkan perbezaan metabolik bagi empat kumpulan. Daripada analisis multivariate, terdapat perbezaan metabolik yang jelas antara kumpulan GC (termasuk diethylstilbestrol dan kumpulan kawalan) dan kumpulan kosong. Sampel QC berkumpul bersama rapat dalam plot skor PCA, yang menunjukkan bahawa kestabilan sistem adalah akomodatif untuk kajian metabolomik ini (Rajah 2).

Kemudian, nilai P kritikal telah ditetapkan kepada 0.05 untuk metabolit berbeza yang ketara dalam penyelidikan ini. Sehubungan itu, seperti yang ditunjukkan dalam Jadual 2, metabolit berbeza berbanding kumpulan kosong secara tentatif dikenal pasti seperti berikut: 17 dalam sampel serum dan

12 dalam sampel air kencing untuk kumpulan GC, 15 dalam sampel serum dan 9 dalam sampel air kencing untuk kumpulan diethylstilbestrol, 12 dalam sampel serum dan 11 dalam sampel air kencing untuk kumpulan kawalan, dan 11 dalam sampel serum dan 7 dalam sampel air kencing yang serentak terdapat dalam GC, diethylstilbestrol, dan kumpulan kawalan. Untuk lebih memahami perbezaan metabolik antara kumpulan yang berbeza, peta haba berkelompok dijana untuk semua metabolit pembezaan, menunjukkan peningkatan relatif (merah) atau penurunan (hijau) (Rajah 3).

Lapan belas metabolit pembezaan hadir secara serentak dalam GC, diethylstilbestrol, dan kumpulan kawalan digambarkan sebagai

berikut: glukosa, asid sitrik, prolin, betaine, ornithine, N-phenylacetylglycine, asid fenil piruvik, inosin, C16:0LPC, kreatinin dan xanthosine dalam serum, dan benzena asetil glisin, asid piroglutamat, asetilkarnitin, dan N6-acetyl lysine dalam air kencing diperhatikan menurun dengan ketara (P < 0.05); manakala taurin, ornitin, asid a-ketoglutarik dan spermidin dalam air kencing meningkat dengan ketara (P < 0.05). Selain itu, taurin (serum) telah meningkat dengan ketara, manakala asid a-ketoglutarik (serum), C18:0LPC (serum) dan betaine (urin) telah menurun dengan ketara dalam kumpulan diethylstilbestrol dan GC (P < {{ 19}}.05); L-kynurenine (serum) dikawal selia dalam kumpulan diethylstilbestrol, tetapi dikawal turun dalam kumpulan GC (P <0.05); asid pyroglutamic (serum) dan proline (urin) dikurangkan, dan asid sitrik (urin) dan nikotinamida (urin) meningkat dengan ketara dalam kumpulan kawalan dan GC (P <0.05); dan fenilalanin dikawal ke bawah dalam kumpulan GC (P <0.05).

Dalam kajian ini, kesan GC pada rahim tikus yang tidak matang telah disiasat. Rahim adalah organ yang paling sensitif untuk menguji kesan bahan kimia yang bergantung kepada ER.Herba Cistanchestelah dilaporkan mendorong pertambahan berat rahim dengan meningkatkan fungsi pelepas lutropin hipotalamus-pituitari-ovari,20 yang juga diperhatikan untuk GC dalam kajian ini. Ini menunjukkan bahawa GC mempunyai aktiviti seperti estrogenik. Baru-baru ini, laporan terutamanya memberi tumpuan kepada mekanisme utama yang mana kesan estrogenik dinyatakan melalui pengikatan kepada ER,21-23 tetapi mekanisme metabolik belum dikaji secara mendalam. Dalam kajian ini, kaedah pseudometabolomik digunakan untuk meneroka mekanisme seperti estrogenik GC.

Perantaraan metabolik siri tindak balas berurutan berubah dalam cara yang lebih ketara daripada kinetik enzimatik atau individu.24 Tujuh belas metabolit dalam serum, termasuk glukosa, asid sitrik, taurin, prolin, betaine, ornitin, asid piroglutamat, asid a-ketoglutarik, N- phenylacetylglycine, asid fenilpiruvat, inosin, C18:0LPC, C16:0LPC,

kreatinin, fenilalanin, L-kynurenine, dan xanthosine, dan 12 metabolit dalam air kencing, termasuk benzena asetil glisin, betaine, taurin, asid sitrik, ornithine, asid piroglutamik, asetilkarnitin, N6-acetyl lysine, nicotinamide, a-ket asid, spermidine, dan proline, didapati terlibat dalam mekanisme seperti estrogenik GC. Beberapa metabolit yang diubah adalah menarik minat khusus kerana ia terdapat dalam kedua-dua serum dan air kencing. Sebagai contoh, asid sitrik, yang dibentuk oleh pemeluwapan asetil koenzim A dan asid oksaloasetik dan memainkan peranan penting dalam kitaran asid sitrik yang berkaitan dengan metabolisme tenaga, 25 dikawal selia ke bawah dalam serum kumpulan GC tetapi dikawal selia dalam air kencing. . Tambahan pula, asid a-ketoglutarik dengan bingkai karbon glutamin, yang boleh mengekalkan keseimbangan nitrogen total dan menggalakkan sintesis protein, dan merupakan bahan pusat kitaran asid sitrik, dikawal ke bawah dalam serum kumpulan GC, tetapi dikawal selia. dalam air kencing.26 Kitaran asid sitrik bukan sahaja laluan metabolik terakhir bagi tiga nutrien utama (karbohidrat, lipid, dan asid amino), tetapi juga penghubung antara metabolisme gula, lipid dan asid amino, dan cara utama untuk mendapatkan tenaga. untuk badan.27,28 Ini menunjukkan bahawa mekanisme seperti estrogenik GCs adalah berkaitan dengan metabolisme tenaga, yang sama seperti diethylstilbestrol. Oleh itu, terdapat hubungan yang jelas antara kitaran asid sitrik dan peningkatan berat rahim pada tikus yang tidak matang yang dirawat dengan GC. Sebagai penderma metil yang penting, betaine memainkan peranan penting dalam pertumbuhan dan perkembangan janin, menunjukkan bahawa betaine terlibat dalam peningkatan berat rahim.29 Menariknya, taurin dikawal selia dalam kedua-dua serum dan air kencing, yang boleh menggalakkan pencernaan dan penyerapan lipid. , dan pengambilan sel dan penggunaan glukosa dengan menggalakkan metabolisme glukosa. Kekurangan taurin juga telah dilaporkan menyebabkan penurunan berat badan pada haiwan muda, menunjukkan bahawa taurin memainkan peranan penting dalam pertumbuhan dan perkembangan.30 Selain itu, kesan pengawalan betaine dan taurine oleh GCs mengikuti trend yang sama menggunakan diethylstilbestrol, tetapi dengan peningkatan kesan berbanding dietilstilbestrol.

Tambahan pula, banyak asid amino telah diubah dengan ketara. Keputusan kami mencadangkan bahawa GC menyebabkan keabnormalan metabolik dalam asid amino. Metabolisme asid amino boleh digunakan untuk sintesis protein tertentu, peptida, dan sebatian nitrogen yang lain, atau penyahkarboksilasi melalui penyahcemaran, transaminasi, digabungkan dengan penguraian ammonia, atau untuk pembebasan tenaga melalui kitaran asid sitrik.31,32 Oleh itu, pengubahan ini sebatian mungkin terlibat dalam peristiwa isyarat penting yang mencetuskan peningkatan berat rahim.

Selain itu, untuk analisis laluan terperinci, metabolit pembezaan dikategorikan kepada beberapa laluan utama termasuk kitaran sitrat (kitaran TCA), metabolisme glutation,

metabolisme arginin dan prolin, metabolisme D-glutamin dan D-glutamat, biosintesis fenilalanin, tirosin dan triptofan, metabolisme fenilalanin, dan laluan lain menggunakan Pathway Analysis of MetaboAnalyst soware (http://www.metaboanalyst.ca), seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 4. Laluan berkaitan metabolisme tenaga, termasuk kitaran TCA dan metabolisme glutation (kedua-duanya dalam serum dan air kencing), merupakan salah satu sasaran utama kesan estrogenik. Peranan kritikal bahan kimia estrogenik dalam metabolisme tenaga telah disahkan oleh ER yang mengawal selia gen yang diperlukan untuk fungsi mitokondria, kitaran TCA, dan banyak lagi, menurut kajian terdahulu.33,34 Dapat disimpulkan bahawa mekanisme seperti estrogenik GC adalah serupa kepada diethylstilbestrol, dengan kedua-duanya berkaitan, sedikit sebanyak, dengan kitaran TCA dan metabolisme glutation, tetapi dengan GC berprestasi lebih baik daripada diethylstilbestrol.

Walaupun mekanisme yang mungkin tidak dapat dijelaskan dalam kajian ini, beberapa metabolit telah dipilih yang boleh digunakan untuk meneroka mekanisme estrogenik lain GC dalam rahim pada masa hadapan. Oleh itu, untuk meneroka mekanisme dengan lebih baik, teknologi lain, seperti proteomik, akan digunakan dalam penyelidikan masa depan.

Kesimpulan

Untuk meringkaskan, kaedah metabolomik pseudotargeted serum dan air kencing berdasarkan UPLC-QTRAP MS telah ditubuhkan untuk meneroka mekanisme seperti estrogenik GC, yang memberikan hasil yang mantap dan boleh dipercayai. Menggunakan pendekatan pseudotargeted yang ditubuhkan, pandangan holistik tentang perubahan dalam serum dan metabolomik air kencing mekanisme seperti estrogenik (GC) telah didedahkan.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA UNTUK MENINGKATKAN FUNGSI SEKSUAL PHGS75% ECH 30% ACT 12%