Reka Bentuk Struktur, Sintesis Dan Antioksidan, Antileishmania, Aktiviti Anti-Radang Dan Antikanser Dari Novel Quercetin Acetylated Derivative

Untuk maklumat lanjut. hubungi:tina.xiang@wecistanche.com

Abstrak: Quercetin(Q) ialah bioflavonoid dengan potensi biologi; walau bagaimanapun, keterlarutan yang lemah dalam air, metabolisme enzimatik yang meluas, dan bioavailabiliti yang berkurangan mengehadkan penggunaan biofarmakologinya. Matlamat kajian ini adalah untuk melakukan pengubahsuaian struktur dalam asetilasi Qby, dengan itu, mendapatkan analog quercetin pentaacetate (Q5), untuk menyiasat potensi biologi (antioksidan, antileishmania, anti-radang, dan aktiviti sitotoksisiti) dalam kultur sel. Q5 dicirikan oleh spektrum FTIR, 'H, dan 13C NMR. Theantioksidanpotensi dinilai terhadap radikal ABTS· tambah . Potensi anti-radang dinilai dengan mengukur faktor nekrosis tumor sitokin pro-radang (TNF) dan pengeluaran nitrik oksida (NO) dalam makrofaj peritoneal daripada tikus BALB/c. Ujian sitotoksisiti dilakukan menggunakan kaedah AlamarBlue dalam sel kanser HepG2(hepatokarsinoma manusia), HL-60 (leukemia promyelocytic) dan MCR-5 (fibroblas paru-paru manusia yang sihat) serta kaedah MTT untuk sel C6 budaya (glioma tikus). Q dan Q5 menunjukkan aktiviti antioksidan masing-masing 29 peratus dan 18 peratus, yang dibenarkan oleh penggantian hidroksil oleh kumpulan asetil. Q dan Q5 menunjukkan pengurangan bergantung kepekatan dalam pengeluaran NO dan TNF (hlm<0.05); q="" and="" q5="" showed="" higher="" activity="" at="" concentrations="">40μM when compared to dexamethasone （20 μM）. For the HL-60 lineage, Q5 demonstrated selectivity, inducing death in cancer cells, when compared to the healthy cell line MRC-5（IC50>80 μM）. Akhirnya, keunggulan sitotoksik Q5 telah disahkan （IC50=11 μM）, yang, pada 50 μM selama 24 jam, menyebabkan perubahan dalam morfologi sel glioma C6 yang dicirikan oleh bentuk badan bulat (belum dilaporkan dalam kesusasteraan ). Q5 analog mempunyai kesan biologi yang berpotensi dan mungkin menjanjikan untuk penyiasatan lanjut terhadap kultur sel lain, terutamanya yang saraf.

Kata kunci: quercetin;sintesis; quercetin pentaacetate; antioksidan; antileishmania; anti-radang; aktiviti sitotoksisiti

Klik untuk mengetahui lebih lanjut tentang produk

1. Pengenalan

Quercetinadalah bioflavonoid dengan kesan terbukti terhadap kesihatan dan aktiviti biokimia yang didokumentasikan dengan baik. Kompaun ini dianggap sebagai salah satu antioksidan paling mujarab di kalangan polifenol [1-3]. Oleh kerana sifatnya, quercetin telah diuji untuk pelbagai aplikasi terapeutik, sepertiantioksidan, antiparasit,anti-radang, dan aktiviti anti-kanser [4,5]. Dalam penyakit parasit, flavonoid adalah kumpulan yang mempunyai minat tinggi. Ini disebabkan oleh ketoksikan yang rendah dalam perumah dan beberapa mekanisme yang mana mereka boleh memodulasi proses yang diubah secara patologi semasa jangkitan [6].Flavonoidmempunyai pelbagai sasaran untuk merawat leishmaniasis dan termasuk sasaran, seperti arginase, ribonucleotide reductase, dan topoisomerase II [7,8].

Quercetinmempunyai pelbagai aktiviti antikanser dalam beberapa jenis tumor pepejal. Tambahan pula, ia telah terbukti mempunyai aktiviti dalam sel HL-60 (berasal daripada leukemia myeloid akut(AML)) untuk mengurangkan pertumbuhan tumor dengan ketara dengan mengurangkan tekanan oksidatif intratumoral, pengaktifan isyarat Kinase Terkawal Ekstraselular (ERK) dan apoptosis seterusnya [9]. Quercetin meningkatkan tindak balas pro-radang dengan mengurangkan ekspresi IL-6 dan TNF dengan aktiviti anti-radang positif dalam populasi makrofaj THP1 manusia [10].

Antara jenis kanser yang berbeza, glioma adalah salah satu yang paling agresif dan dengan prognosis yang buruk. Malangnya, terapi utama (pembuangan pembedahan, terapi sinaran dan kemoterapi) tidak berkesan. Purata kelangsungan hidup keseluruhan untuk pesakit kekal pada kira-kira 14 bulan [11]. Namun begitu, sebatian baru, seperti temozolomide [12], retinoid [13], dan flavonoid [14] telah menunjukkan aktiviti anti-glioma. Kesan antitumoral quercetin telah diterangkan terhadap sel-sel daripada glioblastoma, yang merupakan yang paling agresif daripada glioma [15].

Tindak balas imun yang tidak normal terlibat dalam permulaan dan perkembangan sejumlah besar penyakit, termasuk penyakit autoimun, alahan, kanser, dan penyakit neurodegeneratif.Flavonoidmempunyai aktiviti imunomodulator yang berpotensi dan dikaji sebagai alternatif untuk kegunaan klinikal. Quercetin boleh memberikan kesan imunomodulator yang ketara pada pengeluaran selular sitokin yang diperoleh daripada profil Th-1 dan Th-2 serta percambahan limfositik, mengawal selia imuniti selular[16]. Tambahan pula, quercetin boleh memodulasi secara berbeza ekspresi gen interleukin dalam sel mononuklear darah periferal (PBMC), memihak kepada profil Th-1, yang menggalakkan imuniti selular oleh interferon-gamma (IFN-y), pengurangan Th{ {6}} profil yang terlibat dalam imuniti humoral dan pengaktifan makrofaj oleh IL-4 [17].

Keterlarutan air yang rendah, metabolisme yang meluas, dan degradasi enzimatik mengehadkan bioavailabiliti dan mengurangkan penggunaan biofarmakologi quercetin sebagai agen terapeutik[13]. Pendekatan yang menarik untuk mengatasi bioavailabiliti rendah polifenol, untuk menguji dan meneroka aktiviti in vivo mereka, ialah pengubahsuaian kimia sebatian semula jadi, meningkatkan keterlarutan dan melambatkan metabolisme. Oleh itu, banyak laluan sintetik sedang dikaji, seperti asetilasi, penambahan amina dan brominasi, pengubahsuaian kepada oksim, dan kompleks dengan hidrazin [18-20].

Dalam kajian ini, kami melakukan pengubahsuaian struktur dalam quercetin, bertujuan untuk mendapatkan analog quercetin pentaacetate (Q5) untuk penilaian potensi antioksidan, aktiviti anti-radang, dan perencatan pertumbuhan sel-sel kanser, hepatokarsinoma (HepG2), leukemia promyelocytic. (HL-60) dan sel glioma tikus (C6).

2. Keputusan dan Perbincangan

2.1.Sintesis dan Pencirian

Untuk sintesis kuersetin analog (3,3', A',5,7-pentaacetate), pendekatan jumlah asetilasi telah digunakan, yang disesuaikan dengan keadaan eksperimen yang terdapat dalam literatur [21]. Dengan cara ini, anhidrida asetik dipelihara sebagai agen pengasilat dan piridin sebagai pemangkin.

Produk yang diperolehi (Q5), pepejal kuning, dicirikan dengan menampilkan takat lebur dalam julat 178-186 darjah , serasi dengan data literatur[18]. Selain itu, analisis perbandingan FTIR antara kuersetin dan produk menunjukkan ketiadaan jalur penyerapan dalam ciri 3400 cm-1 hidroksil kuersetin dan dengan penampilan jalur sekitar 1600-1650 cm-'indikasi ester karbonil , menunjukkan penggantian kumpulan hidroksil oleh kumpulan asetil: IR (KBr)v(cm-1):1761,1652,1615, 1505, 1442,1377,1208,1176,1121,1085,1012,892,83 (Rajah 1). Spektrum dibandingkan dengan yang diterangkan dalam kesusasteraan [21].

Analisis resonans magnetik nuklear (NMR) kuersetin (Q) dan produk yang diperolehi (Q5) menunjukkan jumlah asetilasi, dengan kehilangan ciri singlet hidroksil melebihi 9 ppm dalam spektrum H NMR (Rajah Tambahan S1, S2, dan S{ {4}}S6) dan kemunculan isyarat besar dan ciri metil dalam kawasan alifatik spektrum, antara 2 dan 3ppm. Untuk spektrum 13C NMR (Rajah Tambahan S3 dan S7-S9), produk yang diperoleh menunjukkan peningkatan dalam isyarat wakil karbonil ester hampir kepada 170ppm dan kemunculan isyarat antara 20 dan 21 ppm sepadan dengan bahan kimia anjakan lima karbon alifatik metil, disahkan melalui penyepaduan isyarat. Spektrum dibandingkan dengan yang diterangkan dalam kesusasteraan [22].

Biasutto et al. [23] adalah perintis dalam penyiasatan prekursor berdasarkan ester, untuk meningkatkan bioavailabiliti kuersetin. Berdasarkan kajian mereka, Mattarei et al. [21] menggalakkan jumlah asetilasi kuersetin dan memperoleh derivatif Q5 dalam hasil yang tinggi (79-97 peratus ). Baru-baru ini, Mohajeri et al. [24] memperoleh hasil sebanyak 85 peratus dalam mendapatkan analog Q5, di bawah pemanasan (180 darjah selama 6j). Dalam kajian ini, sintesis Q5 adalah cekap, dan kami memperoleh satu kompaun yang dicirikan dengan sewajarnya mengikut data yang diterangkan dalam literatur.

2.2. Antioksidan ABTS· ditambah Aktiviti Radikal

Analisis perbandingan aktiviti antioksidan Qand Q5 menunjukkan bahawa kuersetin (Q) lebih aktif dalam memusnahkan ABTS* ditambah radikal daripada O5 (masing-masing 29 peratus dan 18 peratus), dengan nilai IC50 （dalam μM） sebanyak 188.850±0.003 dan 379.560± 0.004 untuk Q dan Q5, masing-masing.

Aktiviti antioksidan flavonoid secara langsung berkaitan dengan struktur molekulnya. Terdapat dua mekanisme di mana sebatian fenolik boleh menggunakan fungsi antioksidannya: pemindahan atom hidrogen dan pendermaan elektron [25]. Aktiviti antioksidan unggul Quercetin boleh dikaitkan dengan sumbangan besar hidroksil dan hidrogennya, yang digantikan oleh asetil dalam analog Q5, dengan itu, mengurangkan kapasiti untuk pendermaan hidrogen atau penghapusan radikal bebas oleh molekul sintetik.

Tiada data ditemui dalam literatur saintifik yang melaporkan aktiviti antioksidan sebatian Q5. Oh, et al. [26] menilai persediaan ester kuersetin dan aktiviti antioksidannya, menunjukkan bahawa kuersetin mempunyai aktiviti penghapusan radikal yang paling tinggi di kalangan sampel yang diuji. Oleh itu, sumbangan kumpulan hidroksil yang tinggi dalam aktiviti antioksidan kuersetin adalah penting [27].

2.3.Antiishmania Actioity

In order to evaluate the activity of the compound(O and O5)against the promastigote forms of the two Leishmania species, the 50% inhibitory concentration(IC50)was calculated from the cell viability assay in axenic culture. For Leishmania braziliensis, Q and Q5 had ICs0 values>100 μM jika dibandingkan dengan amphotericin B （IC501.1 μM±0.1）. Di samping itu, kesan Q5 pada bentuk promastigot L.amazonenses telah dinilai, dan sebatian ini menunjukkan nilai IC50 yang lebih rendah （75.1 ± 4.7 μM）untuk spesies ini berbanding L. braziliensis.

Tasdemir et al. [8] membandingkan aktiviti antitrypanosomal dan antileishmanial flavonoid dan analognya (berasal daripada quercetin) dan mendapati ia adalah agen antiprotozoal yang mujarab dan berkesan terhadap bentuk amastigote L donovani (IC50=1.0ug mL -l). Untuk bentuk promastigot L.amazonensis, Fonseca dan Silva et al.[27] menemui IC50=31.4 uM dalam kultur yang dirawat dengan kuersetin dalam masa 48 jam. Tambahan pula, mereka melaporkan penangkapan pertumbuhan sel lengkap dengan 96 μM quercetin dalam 96 jam, menunjukkan aktiviti antileishmanial-dal yang memuaskan. Cataneo et al. [28] menilai kesan anti promastigot quercetin (sehingga 192 μM） terhadap L.brasiliensis, dalam sel peritoneal makrofaj. Dalam kultur promastigot L. major, quercetin dan quercetin-pentaacetate analognya menunjukkan kesan bergantung kepada kepekatan （IC 50 =2.5±0.92 dan 2.85±0.99 μM, masing-masing 【24】.

Sesetengah penulis telah menunjukkan bahawa quercetin mendorong kematian dalam L amazonensis promastigot melalui disfungsi membran mitokondria akibat daripada pengeluaran spesies oksigen reaktif [27,28] dan sasaran lain, seperti arginase [7], ribonucleotide reductase [8,29], dan topoisomerase II[30]. Keputusan yang diperoleh dalam kajian ini menunjukkan bahawa ujian lain harus dipertimbangkan dalam perspektif untuk sebatian yang diuji (Q dan Q5), mempertimbangkan ujian siliko untuk penyiasatan sasaran yang mungkin terlibat dalam mekanisme kematian yang diperhatikan.

2.4. Aktiviti Anti-Radang dan Sitotoksisiti

Kemudian, kami memberi tumpuan kepada menilai aktiviti biologi terbitan novel. Pertama, kepekatan bukan toksik Q dan Q5 ditentukan dalam makrofaj peritoneal yang diperoleh daripada tikus BALB / c. Nilai CC0 tidak menunjukkan sitotoksisiti pada kepekatan yang sama atau kurang daripada 80 μM （Rajah 2A, D）. Dexamethasone tidak sitotoksik pada kepekatan yang diuji （20 μM）. Berdasarkan ini, ujian seterusnya dijalankan pada kepekatan tidak melebihi 80 μM.

Aktiviti imunomodulator Q dan Q5 telah disiasat untuk menentukan kesan sebatian pada rembesan mediator proinflamasi. Kesan imunomodulator sebatian (Qand Q5) pada mulanya dinilai dalam kultur makrofaj peritoneal melalui penghasilan nitrik oksida. Seperti yang dijangkakan, pengaktifan makrofaj dengan LPS PLUS IFNy meningkatkan jumlah pengeluaran nitrit (Rajah 2B, E). Rawatan dengan kuersetin menghalang, dalam cara yang bergantung kepada kepekatan, penghasilan nitrit (hlm<>

Kompaun pentadactyl （Q5） tidak menunjukkan aktiviti yang serupa pada 20 μM. Menariknya, aktiviti itu ketara pada kepekatan tertinggi yang diuji (40 dan 80 μM), untuk kedua-dua sebatian. Pada kepekatan tertinggi yang diuji (80 uM), kesan sebatian adalah serupa dengan yang diperhatikan dalam kultur makrofaj diaktifkan dan dirawat dengan 20 μM dexamethasone. Sebatian tersebut bukan sitotoksik untuk makrofaj peritoneal pada kepekatan yang diuji （20, 40, dan 80 μM）.

Untuk pencirian yang lebih baikanti-radangkesan sebatian (O dan O5), sitokin radang TNF dikira dengan kaedah Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA). Rangsangan makrofaj menggunakan LPS ditambah INF-y mendorong peningkatan ketara dalam pengeluaran TNF. Rawatan dengan Q dan Q5 mengurangkan pengeluaran TNF dengan ketara (hlm<0.05) in="" a="" concentration-dependent="" manner="" (figure="" 2c,="">

Pengurangan faktor keradangan oleh quercetin diterangkan secara pelbagai, termasuk modulasi untuk profil keradangan Th-2, berkaitan dengan perlindungan dalam penyakit saraf [31,32]. Tindakan anti-radang quercetin diterangkan dengan baik dalam kesusasteraan [33,34]. Walau bagaimanapun, terdapat beberapa kajian yang menunjukkan potensi anti-radang analog O5. Kajian ini menyokong penemuan Chen et al. [35], yang membuktikan peranan Q dan O5 dalam perencatan pengeluaran NO yang disebabkan oleh LPS, dalam cara yang bergantung kepada kepekatan tanpa kesan sitotoksik yang merosakkan untuk keturunan makrofaj RAW 264.7. Tambahan pula, kajian ini menunjukkan kesan Q5 yang tidak pernah berlaku sebelum ini dalam menghalang TNF sitokin pro-radang.

Data yang diperoleh menunjukkan pemuliharaan kesan pada molekul separa sintetik(O5); bagaimanapun, dos faktor lain, seperti sitokin IL-10, boleh menjadi perspektif dalam penilaian profil ini. Oleh itu, Q5 boleh dianggap sebagai molekul berpotensi untuk ujian in vitro dan in vivo masa depan yang bertujuan untuk alternatif terapeutik tambahan dengan aktiviti anti-radang.

Sitotoksisiti sebatian yang diuji (Q dan Q5) telah dinilai pada 20, 40, dan 80 uM menggunakan kaedah kolorimetrik AlamarBlue dalam garisan sel yang sihat (MRC-5, fibroblas paru-paru manusia) dan dalam dua garisan sel kanser yang berbeza , HepG2(karsinoma hepatoselular manusia) dan HL-60 (leukemia promyelocytic manusia), seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3. Doxorubicin ialah ubat standard yang digunakan sebagai kawalan positif.

Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3, untuk sel HepG2, quercetin (Q) tidak menunjukkan aktiviti sitotoksik yang ketara pada kepekatan tertinggi yang disiasat（80 μM）, dan analog pentaacetatenya （Q5）menunjukkan aktiviti berkurangan （IC{{4 }}.9μM）. Untuk barisan sel kanser HL-60, quercetin ditunjukkan sebagai tidak begitu aktif (IC50=51.3 uM); walau bagaimanapun, menariknya, Q5 adalah jauh lebih aktif daripada quercetin dengan IC50 sebanyak 33.6 uM. Doxorubicin ubat standard mempunyai nilai IC50 antara 0.1 hingga 0.2 uM untuk garisan sel kanser yang menunjukkan kesan sitotoksik yang ketara terhadap garisan sel sihat MRC-5(Jadual 1), yang tidak dilihat untuk sebatian (Q dan Q5) .

For the HL-60 cell line, the Land O5presented values of 51.3 and 33.6 μM, respectively, in agreement with Massi et al.[17]. Regarding cytotoxicity in non-tumor cells, O and Q5 presented IC50 values >80 μM, menunjukkan profil terpilih terhadap garis sel kanser. Beberapa kajian telah menunjukkan aktiviti analog quercetin O5 dalam sel kanser. Walau bagaimanapun, aktiviti Q5 dalam keturunan sel tumor HeLa telah didokumenkan oleh Danihelovået al. [22], yang menunjukkan bahawa ester asetilasi kuersetin adalah derivatif sitotoksik yang paling berkesan. Tiada data ditemui mengenai peranan sitotoksik Q5 dalam sel keturunan HepG2. Hanya satu kajian ditemui dalam literatur yang mendedahkan bahawa analog tetra-asetilasi kuersetin mempunyai kesan ketara ke atas perencatan sel keturunan HL-60 melalui pengaktifan caspase-3, menggalakkan apoptosis [36].

Kaedah kolorimetrik ujian MTT digunakan untuk mengakses sitotoksisiti dalam kultur sel C6. Quercetin dan Q5 menyebabkan penurunan dalam penyerapan MTT 57{{1{0}}} nm yang mewakili aktiviti dehidrogenase mitokondria dan mencadangkan penurunan daya maju sel dalam sel C6. Seperti yang didedahkan dalam Rajah 4, sitotoksisiti yang disebabkan oleh kuersetin dalam sel C6 dalam kepekatan lebih tinggi daripada 25 uM selama 72 jam (Rajah 4A), manakala 0.78 μM Q5 selama 72 jam dapat mengurangkan daya maju sel (Rajah 4B). ). Telah diperhatikan bahawa 50 uM quercetin(O) dan O5 menurunkan daya maju sel masing-masing kepada 41.3 peratus ± 2.9 peratus dan 47.5 peratus ±1.2 peratus, jika dibandingkan dengan kumpulan kawalan(100.0 peratus ±6.4 peratus )(Rajah 4A, B) . Tiada perubahan ketara dalam daya maju sel telah divisualisasikan dalam kultur C6 yang dirawat dengan DMSO (0.05 peratus ), jika dibandingkan dengan sel yang tidak dirawat.

Berdasarkan keputusan yang diperoleh, kami kemudiannya menyiasat kesan morfologi sebatian Q dan Q5 （50 μM） pada sel C6, pada 24,48, dan 72 jam rawatan, menggunakan mikroskop optik. Quercetin pentaacetate（Q5） pada 50 μM menyebabkan perubahan dalam morfologi sel glioma C6 dalam 24 jam pertama, dengan pengurangan ketara dalam pemanjangan sitoplasma jika dibandingkan dengan kumpulan kawalan (Rajah 5). Selepas 48 jam rawatan dengan Q5, sel-sel menganggap morfologi bulat yang dicirikan oleh penarikan balik badan sel dan membran tidak berbentuk (yang tidak dilaporkan dalam kesusasteraan saintifik), tidak seperti kuersetin, yang, pada masa rawatan ini, membentangkan aspek morfologi. serupa dengan fibroblas [37]. Sebarang perubahan morfologi lain telah divisualisasikan dalam sel di bawah keadaan rawatan lain.

Penggantian hidroksil oleh kumpulan asetil boleh menggalakkan penyerapan selular yang lebih baik daripada analog kuersetin yang memihak kepada pelbagai ujian biologi, terutamanya dalam sel-sel kanser [38,39]. Bispo da Silva et al. [40] menunjukkan, dengan merawat sel C6 dengan rutin flavonoid dan kuersetin, pengurangan ketara dalam bahagian sel C6 yang melekat, dengan fenotip morfologi yang lebih nipis dan bipolar, berbanding dengan kultur kawalan. Rawatan sel C6 dengan flavonoid menghalang sifat migrasi sel C6 yang berdaya maju selepas 24 jam rawatan. Dalam keadaan kawalan, mikroglia membentangkan fenotip yang lebih bulat; selepas rawatan rutin, lebih daripada 50 peratus sel memperoleh fenotip multipolar bercabang, dan yang lain memperoleh fenotip amoeboid, kedua-duanya menunjukkan pengaktifan.

Kajian menunjukkan bahawa quercetin mengganggu peraturan laluan transduksi isyarat sel yang dikaitkan dengan kematian sel oleh apoptosis dan dalam peringkat perkembangan kitaran sel [41,42]. Santos et al. [14] menunjukkan potensi pengurangan dalam pertumbuhan GL-15 sel glioblastoma manusia. Bi et al. [43] menggambarkan induksi autophagy sel glioblastoma manusia U87 dan U251 dalam cara yang bergantung kepada dos.

Keputusan yang diperolehi menyokong dengan Danihelova et al. [22], di mana kumpulan asetil yang dimasukkan ke dalam molekul kuersetin menggalakkan peningkatan dalam aktiviti antikanser. Tambahan pula, mereka menunjukkan tropisme yang lebih besar untuk sel-sel kanser, terutamanya untuk sel-sel keturunan saraf. Kajian ini tidak pernah berlaku sebelum ini berkaitan dengan analog O5 dalam rawatan sel glioma C6. Dell'Albani et al. [44]menunjukkan tindakan derivatif asil kuersetin yang lebih baik dalam kultur strain glioma manusia U373-MG dan murine glioma 9L, yang menunjukkan laluan kematian melalui apoptosis. Pengubahsuaian morfologi sel kepada profil bulat boleh merujuk kepada mekanisme kematian, seperti apoptosis, dikaitkan secara meluas kepada kuersetin [45-47]. Dalam perspektif masa depan, ujian dengan sel saraf yang sihat boleh membantu untuk menjelaskan hipotesis ini.

3. Bahan dan Kaedah

3.1.Reagen dan Bahan

Semua reagen (kuersetin, piridin, anhidrida asetik, asid tricoloroisocyanuric, diklorometana, 2,4-dinitro-fenilhidrazin, hidroksilamin hidroklorida, natrium asetat, eter petroleum, asid sulfurik, kalium persulfat dan nitrat) adalah gred analisis dan nitrat. (Ouimex, Merck, Brazil dan Sigma Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Syarikat). Untuk penyediaan semua larutan dan sampel piawai, air ultratulen (dengan kerintangan 18 MOcm-I) yang diperoleh daripada sistem penulenan air Milli-Q Plus (Millipore, Molsheim, Perancis） telah digunakan. Semua barangan kaca makmal telah dicuci dalam 10 peratus （ o/ø） larutan HNO3 selama 24 jam, dibilas dengan air ketulenan tinggi, dan dikeringkan pada suhu ambien.

3.2. Sintesis dan Pencirian

Analog struktur diperolehi selepasquercetinpengubahsuaian molekul daripada laluan sintetik yang lebih mudah diakses dan boleh dihasilkan semula (Penta asetilasi). Kami menggunakan prinsip kimia hijau dengan meminimumkan penggunaan bahan. Analog pentadactyl (Q5) diperolehi selepas pengubahsuaian molekul kuersetin, daripada laluan sintetik, yang menggunakan anhidrida asetik sebagai agen pengasilat dan piridin sebagai pemangkin.

Campuran yang mengandungi kuersetin (300 mg, 1 cth.), anhidrida asetik (0.80 mL, 20 cth.), dan piridin (7.5 mL) disimpan di bawah kacau magnet pada suhu bilik. Selepas 24 jam kacau, 250 mL diklorometana telah ditambah ke dalam medium tindak balas. Kemudian, tindak balas telah dibasuh dengan 10 peratus HCl(3×100 mL), NaOH (3× 50 mL) yang dicairkan dan air (3× 100 mL); dikeringkan di atas natrium sulfat kontang; ditapis; dan disejat, dalam penyejat berputar (Fisatom, Minas Gerais, Brazil)[21]. Jumlah O5 dan hasil yang diperolehi ialah 280 mg dan 54 peratus, masing-masing.

Tindak balas pengubahsuaian struktur molekul kuersetin dipantau oleh kromatografi lapisan nipis (TLC) menggunakan campuran heksana dan etil asetat (1:1) sebagai pelarut. Untuk pencirian fizikokimia, takat lebur digunakan. Ujian Fourier Transform Infrared (FTIR) oleh kaedah Attenuated Total Reflection (ATR) telah dilakukan oleh model FTIR Spectrum 100S (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA), dengan pemerolehan spektrum pengimbasan dalam inframerah pertengahan (4000 hingga 600 sm-1).

Sampel (jisim~5.0 mg) telah diletakkan pada kristal ATR dan tertakluk kepada tekanan kira-kira 20 N dengan bantuan mesin penekan manual. Spektrum FTIR telah dikesan oleh perisian OriginPro8, OriginLAB4(www.originlab.com, diakses pada 10 September 2021). Spektrum Resonans Magnetik Nuklear(NMR) telah direkodkan dalam spektrometer Bruker Avance IⅢI500 MHz (Uster, Switzerland)-500 MHz untuk 1H NMR dan 125 MHz untuk 13C NMR, menggunakan DMSO sebagai pelarut. Anjakan kimia dinyatakan dalam skala ppm (ug/mL), dan kloroform (CHCla) digunakan sebagai rujukan dalaman.

Spektrum NMR telah diproses oleh perisian TopSpin⑤4.0 (Bruker Biospin, Coventry, UK) dan dibandingkan dengan data literatur [38]. Data NMR ialah: 'H NMR(500 MHz, CDCl3)2.34(6H,s,-OCOCH3);2.35(3H,s,-OCOCH3);2.35(3H,s, -OCOCH3);2.44(3 H, s,-OCOCH3);6.88(1H,d, J=2.5 Hz);7.34(1H,d,J=2.0 Hz);7.36(1H,d,J=8.5);7.70 （1Hd, J=2.0Hz）;7.73（1H,dd,J1=8.5 Hz,J 2=2.0Hz）;13CNMR（125 MHz, CDCl3）δ 170.04;169.24;167.86;167.79;156.87;154.28;150.43;144.20;312.12;142.18; ;113.89;108.96;21.16;21.02;20.65; dan 20.49.

3.3. Antioksidan ABTS* serta Aktiviti Radikal

Aktiviti penyerapan ABTS* ditambah telah diadaptasi daripada kaedah yang diterangkan oleh Dorman dan Hiltunen[48]. Potassium persulfate dan ABTS (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) telah dilarutkan dalam air suling untuk membentuk kepekatan akhir masing-masing 2.45 mM dan 7 mM. Penyelesaian ABTS dihasilkan dengan menambahkan kedua-dua larutan pada kadar 1:1, dan kemudian larutan itu diinkubasi pada suhu bilik selama 16 jam dalam gelap.

Larutan yang terhasil, berwarna pekat, dilaraskan dengan etanol, dalam spektrofotometer, kepada penyerapan {{0}}.7±0.05 nm pada 734 nm sebelum digunakan. Kami menggunakan 30 μL sampel, atau Trolox (Sigma Aldrich⑧, St.Louis, MO), sebagai piawai rujukan pada kepekatan berbeza （5,10,25,50,75 dan 100 μM）, telah ditambah kepada 3 mL daripada larutan ABTS* tambah dan menunggu untuk bertindak balas selama 6 minit. Penyerapan diukur pada 734 nm terhadap kosong (etanol). Kapasiti pengosongan ABTS· ditambah dikira sebagai:

ABTS* tambah kesan scavenging ( peratus ){{0}} (1- A0/A1)×100;

dengan A0 ialah penyerapan kawalan, dan A1 ialah penyerapan sampel atau piawai. Semua penentuan dilakukan dalam tiga kali ganda. Nilai IC5so dikira dan dinyatakan sebagai min ± SD dalam μM.

3.4.Antiishmania Actioity

Lamazonensis (MHOM/BR88/BA-125Terikan Leila) dan Lbraziliensis (MHOM/BR88/BA-3456)promastigotes(1 × 10 darjah setiap telaga) telah dikultur dalam 96-plat perigi dalam Medium Schneider (Sigma-Aldrich⑧, St. Louis, MO, USA) ditambah dengan 10 peratus serum lembu janin (FBS; GIBCO) dan 50ug mL-' gentamicin (Life, Carlsbad, CA, Amerika Syarikat) dan tertakluk kepada rawatan dengan kepekatan yang berbeza（ 100 μM; enam pencairan 1∶2） daripada Q5. Parasit telah diinkubasi selama 72 jam pada 26 darjah. Kemudian, 20 μL/telaga AlamarBlue （Invitrogen, Carlsbad, CA, Amerika Syarikat）ditambah selama 2 jam. Bacaan dilakukan dalam spektrofotometer menggunakan panjang gelombang 570 dan 600 nm. Pengiraan perencatan budaya axenic ditentukan berdasarkan kawalan yang tidak dirawat [49].

3.5. Aktiviti Anti-Radang dan Sitotoksisiti

3.5.1.Dadah

Dexamethasone (Sigma-Aldrich⑧, St. Louis, MO, Amerika Syarikat), glucocorticoid sintetik, digunakan sebagai kawalan positif dalam ujian imunomodulator. Doxorubicin (doxorubicin hydrochloride, Laboratory IMA SAIC, Buenos Aires, Argentina) telah digunakan sebagai ubat antikanser rujukan. Semua sebatian telah dibubarkan dalam dimetil sulfoksida (DMSO; PanReac, Barcelona, ​​Sepanyol) dan dicairkan dalam medium kultur sel untuk digunakan dalam ujian. Kepekatan akhir DMSO adalah kurang daripada 1 peratus dalam semua eksperimen.

3.5.2.Haiwan

Tikus BALB/c, berumur 4-10 minggu, telah disediakan oleh vivarium Goncalo Moniz Institute/FIOCRUZ-BA (IGM, Salvador, Bahia, Brazil) di mana ia disimpan dalam sangkar yang mengandungi maksimum lima tikus. Semua sangkar disimpan di dalam bilik yang disesuaikan pada 21 darjah ±1 darjah , pada 12-kitaran terang/gelap, dengan air dan makanan secara ad libitum sepanjang tempoh percubaan. Percubaan dengan haiwan telah diluluskan oleh Jawatankuasa Etika dan Penggunaan Haiwan Institut Goncalo Moniz/FIOCRUZ-BA (IGM-018/15).

3.5.3. sel

HL-60(leukemia promyelocytic akut manusia) dan HepG2 (karsinoma hepatoselular manusia) diperoleh daripada American Type Culture Collection—ATCC(Rockville, ML.USA), telah digunakan. Untuk menilai selektiviti quercetin(O) dan derivatif O5 pada percambahan sel bukan kanser, garis keturunan MRC-5 (fibroblas paru-paru manusia), juga diperoleh daripada ATCC, telah digunakan. Talian sel telah ditanam dalam sel botol kultur (isipadu 75 cm3,250 mL) menggunakan medium kultur RPMI 1640 (GibcoTM) ditambah dengan 10 peratus serum lembu janin (GibcoM) dan 50 ug/mL gentamicin (GibcoTM). Sel-sel tersebut disimpan dalam inkubator dengan atmosfera 5 peratus CO, pada 37 darjah dan dipantau setiap hari. Semua garisan sel telah diuji untuk mycoplasma menggunakan kit pengesanan mycoplasma pewarnaan Hoechst (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, Amerika Syarikat). Garis sel C6 diperoleh daripada tumor glial tikus yang disebabkan oleh n-nitrosomethylurea [50]. Sel-sel glioma ini telah dibiakkan seperti yang diterangkan oleh de Oliveira et al. [51]. Sel-sel telah diinkubasi pada 37 darjah dalam inkubator yang dilembapkan pada 5 peratus CO2. Sel C6 telah ditanam pada hidangan kultur sel （100-mm Ø, TPP） dalam medium DMEM ditambah dengan 100 UI/mL penicillin G,100ug/mL streptomycin,7 mM glukosa,2 mM L-glutamin, 1 mM piruvat, dan 10 peratus serum anak lembu janin. Medium kultur ditukar setiap 2 hari. Dua puluh empat jam sebelum rawatan, sel C6 telah disemai dalam piring Petri berdiameter 35 mm atau 96-plat perigi pada ketumpatan 3.5 × 10* sel/telaga.

Semua garisan sel telah diuji untuk mycoplasma menggunakan Mycoplasma Stain Kit (Sigma-Aldrich) untuk mengesahkan penggunaan sel bebas daripada pencemaran. Maklumat talian sel terkandung dalam pangkalan data"Cell Bank of Rio de Janeiro (BCRJ)": sel HepG2(Kod: 0291), sel HL-60 (Kod: 0104) dan sel C6 (Kod: 0057) .

3.5.4. Ujian Aktiviti Sitotoksik

Untuk menilai sitotoksisiti sebatian yang diuji (Q dan Q5) pada HL-60 (leukemia promyelocytic akut manusia) dan sel HepG2, kaedah kolorimetrik Alamar Blue (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) telah digunakan. Alamar Blue (resazurin) ialah penunjuk yang menghasilkan perubahan kolorimetrik dan isyarat pendarfluor sebagai tindak balas kepada aktiviti metabolik. Resazurin dikurangkan kepada resorufin oleh sel yang aktif secara metabolik. Bentuk teroksida ialah biru (sel tidak pendarfluor/tidak berdaya maju), dan bentuk terkurang ialah merah jambu (sel pendarfluor/berdaya maju). Pengurangan resazurin kepada resorufin mencerminkan daya maju sel [52].

Dalam ujian, sel telah diedarkan dalam {{0}}plat perigi pada ketumpatan pratakrif 0.3×1{{10}} sel darjah/mL untuk sel keturunan HL-60 dan 0.7× 10 sel/mL untuk sel keturunan HepG2. Sebatian telah ditambah dalam satu siri lapan kepekatan (80 hingga 0.62 uM), dengan pengecualian doxorubicin, yang digunakan dalam kepekatan antara 0.003 hingga 5 μM. Kawalan negatif menerima jumlah DMSO yang sama（0.025 peratus）. Plat diinkubasi selama 72 jam dalam ketuhar pada 37 darjah dan 5 peratus CO2. Selepas tempoh ini, 20 μL/telaga Alamar Blue telah ditambah, dan plat diinkubasi selama 4 jam lagi. Plat dibaca menggunakan spektrofotometer (Spectramax 190, Peranti Molekul, Sunnyvale, CA, Amerika Syarikat), pada panjang gelombang 570 dan 600 nm.

Daya maju sel C6 ditentukan menggunakan kaedah kolorimetrik yang diterangkan oleh Hansen et al. [53]. MTT(3-4,5-dimethylthiazol-2-yl,25-diphenyltetrazolium bromide) telah dibubarkan pada kepekatan 5mg/mL dalam salin penimbal fosfat steril (PBS) di bilik suhu, dan larutan itu disterilkan lagi dengan melalui 0.2-mm penapis dan disimpan pada 4 darjah dalam gelap. Dalam ujian, sel telah diedarkan dalam 96-plat perigi pada ketumpatan pratakrif 3.5× 10* sel/mL untuk keturunan sel C6. Sebatian telah ditambah dalam satu siri lapan kepekatan (80 hingga 0.39 uM).

MTT telah ditambah kepada setiap telaga pada kepekatan akhir 2 mg/ml, dan sel-sel tersebut diinkubasi selama 2 jam. Selepas itu, sel-sel telah dilisiskan dengan 20 peratus （w/ø）sodium dodecyl sulfate （SDS）dan 50 peratus （o/ø） larutan dimetilformamida （DMF） （pH 4.7）, dalam inkubasi semalaman pada suhu bilik] [54,55]. . Penyerapan diukur dengan pembaca plat mikro spektrofotometer (570 nm), Thermo ScientificFlash Varioskan (Versi 3001, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finland). Lapan replika digunakan untuk setiap kepekatan. Daya maju sel dinyatakan sebagai peratusan penyerapan pada 570 nm, dan kawalan telah diterima pakai sebagai 100 peratus . Selepas rawatan, morfologi sel dinilai dengan mikroskop cahaya menggunakan mikroskop optik (mikroskop terbalik Eclipse TS100, Instrumen Nikon, Tokyo, Jepun) dan diambil gambar menggunakan kamera digital (Coolpix S4300, Instrumen Nikon, Tokyo, Jepun).

3.5.5. Budaya Makrofaj

Makrofaj eksudat peritoneal(2×105 sel/telaga) diinkubasi dalam 96-plat perigi dalam medium DMEM ditambah dengan 10 peratus PBS dan 50 ug/ml gentamicin, dalam tiga kali ganda, dirangsang atau tidak dengan LPS （500ng/mL） dan IFN-y （5 ng/mL） dan dirawat atau tidak dengan kepekatan sebatian yang berbeza (20,40 dan 80 uM). Sel-sel tersebut disimpan dalam inkubator pada 37 darjah dan 5 peratus CO2 selama4 24 h. Selepas tempoh ini, supernatan kultur dikumpulkan untuk sitokin dan dos nitrik oksida. Dalam beberapa ujian, untuk menilai sitotoksisiti, supernatan digantikan dengan medium-plus 10 peratus Alamar Blue (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), dan plat diinkubasi selama 4 jam tambahan. Bacaan spektrofotometer dilakukan pada 570 dan 600 nm.

3.5.6. Dos TNF

Pengukuran TNF dilakukan daripada supernatan kultur sel, menggunakan teknik sandwic ELISA, menggunakan kit Sistem PembangunanDuoset ELISA(R&D Systems, Minneapolis, MI, USA), mengikut cadangan pengeluar. Plat ELISA （NUNC—IMMUNO PLATE Maxisorp Surface） telah dipeka dengan 50 μL/telaga antibodi tangkap, pada kepekatan 2 ug/mL, dicairkan dalam PBS 1x dan diinkubasi selama 16 jam pada 4 darjah . Plat dibasuh tiga kali dengan 1 × PBS/0.05 peratus antara 20 dan disekat dengan 100 μL/telaga 1× PBS dan 0.05 peratus antara 20 dan 0.1 peratus albumin lembu selama 2 jam .

Kemudian, 50 μL/telaga sampel, lengkung kosong dan standard rekombinan yang dicairkan dalam penimbal Tris-saline(20 mM Trix dalam pangkalan dan 150 mM NaCl) yang mengandungi 0.1 peratus albumin lembu dan 0.05 ditambah peratus antara 20 selama 2 jam pada suhu bilik. Piawaian telah dicairkan secara bersiri (1:2), daripada kepekatan awal 2000 pg/mL, dengan 11 pencairan pendua. Plat itu dibasuh tiga kali dengan PBS/0.05 peratus tween dan diinkubasi dengan 50 μL antibodi pengesanan （biotinylated） pada kepekatan 400ng/mL untuk tempoh 2 jam.

Plat dibasuh tiga kali dengan PBS/{{0}}.05 peratus tween dan diinkubasi selama 20 minit dengan avidin-peroksidase dicairkan 1:200. Pembangunan dilakukan dengan menambah substrat TMB (Thermo Fisher) dan diganggu dengan asid fosforik 0.05 M. Bacaan tindak balas ditentukan menggunakan spektrofotometer (Spectramax) (Peranti Molekul, San Jose, CA, Amerika Syarikat), dengan penapis 450 nm. Analisis dilakukan menggunakan Perisian Softmax 4.3.1 (Peranti Molekul, San Jose, CA, Amerika Syarikat).

3.5.7.Dos Nitrik Oksida

Pengeluaran nitrit dalam supernatan makrofaj dianggarkan melalui kuantifikasi produk oksidatifnya, nitrit, dengan kaedah Griess [50]. Penyerapan ditentukan dalam spektrofotometer (Spectramax) (Peranti Molekul, San Jose, CA, Amerika Syarikat), dengan penapis 570 nm. Analisis dilakukan menggunakan Softmax Software 4.3.1 (Molecular Devices, San Jose, CA, USA), dan hasilnya dinyatakan dalam μM nitrit, berdasarkan lengkung standard natrium nitrit dengan kepekatan awal 400 uM.

3.6. Analisis statistik

Ujian ANOVA sehala diikuti dengan ujian pasca perbandingan berganda Bonferroni digunakan untuk menentukan kepentingan statistik perbandingan antara kumpulan dalam kajian. Keputusan dianggap signifikan secara statistik apabila p<0.05. all="" analyses="" were="" performed="" using="" the="" graphpad="" prism="" version="" 5.01="" program="" (graphpad="" software,="" san="" diego,="" ca,="">

4. Kesimpulan

Keadaan dan tindak balas media sintesis analog kuersetin menunjukkan kecekapan dalam mendapatkan satu sebatian yang dicirikan dengan sewajarnya, mengikut data yang diterangkan dalam literatur. Analisis perbandingan aktiviti antioksidan Q dan Q5 menunjukkan bahawa kuersetin (O) lebih aktif dalam memusnahkan ABTS* ditambah radikal daripada O5 (masing-masing 29 peratus dan 18 peratus). Potensi antioksidan yang dikurangkan tidak menunjukkan gangguan dalam aktiviti imunomodulator dan antitumoral. Pengubahsuaian kimia yang dicadangkan dalam kajian ini meningkatkan kesan antiproliferatif dan mengekalkan aktiviti anti-radang tetapi bukan aktiviti sitotoksisiti dalam sel yang diuji yang sihat.

Derivatif asetilasi (Q5) yang hadir meningkatkan sitotoksisiti dalam sel hepatoselular kanser (HepG2), sel leukemia promyelocytic (LH-60) dan, khususnya, dalam sel glioma (C6). Sel glioma tikus C6 yang diperdagangkan menunjukkan corak kematian sel yang belum pernah berlaku sebelum ini. Q5 pada 50 μM selama 24 jam menyebabkan perubahan dalam morfologi sel C6glioma yang dicirikan oleh bentuk badan bulat (yang tidak dilaporkan dalam kesusasteraan saintifik), tidak seperti quercetin, yang membentangkan morfologi seperti fibroblast.

Penyiasatan lanjut perlu dilakukan untuk lebih memahami kesan derivatif asetilasi kuersetin, terutamanya dalam sel neuron. Kajian ini membenarkan, buat kali pertama, penggunaan kuersetin yang diubah suai secara struktur dalam sel saraf untuk kesan neuroprotektif yang berpotensi.

Rujukan

1. Formica, JV; Regelson, W. Kajian semula biologi quercetin dan bioflavonoid yang berkaitan. Kimia Makanan. Toksik. 1995, 33, 1061–1080. [CrossRef]

2. Materska, M. Quercetin dan derivatifnya: Struktur kimia dan bioaktiviti—Semakan. Pol. J. Nutr Makanan. Sci. 2008, 58, 407–413.

3. Wang, TY; Li, Q.; Bi, KS Bioaktif flavonoid dalam tumbuhan ubatan: Struktur, aktiviti, dan nasib biologi. Asia J. Pharm. Sci. 2018, 13, 12–23. [CrossRef] [PubMed]

4. D'Andrea, G. Quercetin: Fflavonol dengan aplikasi terapeutik pelbagai rupa? Fitoterapia 2015, 106, 256–271. [CrossRef]

5. Araújo, MV; Queiroz, AC; Silva, JFM; Silva, AE; Silva, JKS; Silva, GR; Silva, ECO; Souza, ST; Fonseca, EJS; Camara, CA; et al. Flavonoid mendorong kematian sel dalam Leishmania amazonensis: Pencirian in vitro oleh sitometri aliran dan spektroskopi Raman. Penganalisis 2019, 144, 5232–5244. [CrossRef] [PubMed]

6. Faixová, D.; Hrˇckova, G.; Kubašková, TM; Mudro ˇnová, D. Kesan antiparasit isoflflavon terpilih pada cacing kutu. Helmintologi 2021, 58, 1–16. [CrossRef]

7. Manjolin, LC; Reis, MBG; Maquiaveli, CC; Santos-Filho, OA; Silva, ER Flavonoid diet fisetin, luteolin, dan sebatian terbitannya menghalang arginase, enzim pusat dalam jangkitan amazonensis Leishmania (Leishmania). Kimia Makanan. 2013, 141, 2253–2262. [CrossRef]

8. Tasdemir, D.; Kaiser, M.; Brun, R.; Yardley, V.; Schmidt, TJ; Tosun, F.; Rüedi1, P. Aktiviti antitrypanosomal dan antileishmanial flflavonoid dan analognya: In vitro, in vivo, hubungan struktur-aktiviti, dan kajian hubungan struktur-aktiviti kuantitatif. Antimikrob. Ejen Chemother. 2006, 50, 1352–1364. [CrossRef] 9. Lee, WJ; Hsiao, M.; Chang, JL; Yang, SF; Tseng, TH; Chang, CW; Chow, JM; Lin, KH; Lin, YW; Liu, CC; et al. Quercetin mendorong apoptosis terbitan mitokondria melalui pengaktifan ERK pengantara spesies oksigen reaktif dalam sel leukemia HL{11}} dan xenograf. Gerbang. Toksik. 2015, 89, 1103–1117. [CrossRef]

10. Drummond, EM; Harbourne, N.; Marete, E.; Martyn, D.; Jacquier, J.; O'Riordan, D.; Gibney, ER Perencatan biomarker pro-radang dalam makrofaj THP1 oleh polifenol yang diperoleh daripada chamomile, meadowsweet, dan kulit willow. Phytother Res. 2013, 27, 588–594. [CrossRef]