Pencirian struktur polysaccharide cistanche cistanche dan kesan pelindungnya terhadap kecederaan sel Hk -2 yang tinggi

Abstrak:

 

Objektif: Untuk mengkaji struktur polysaccharides cistanche cistanche (CDPs) dan kesan perlindungan dan mekanisme sel epitelium tubular proksimal manusia (HK {{0}) kecederaan. Kaedah: Komposisi kimia, berat molekul, komposisi monosakarida dan struktur CDP yang mungkin dikesan oleh kaedah fenol asid sulfurik, kaedah hidroksil biphenyl, kaedah biru coomassie, kaedah kromatografi ion, kromatografi gel prestasi tinggi dan kromatografi. Kesan perlindungan CDP pada kecederaan HK -2 dan mekanismenya telah dinilai dengan mewujudkan model kerosakan sel HK -2 yang disebabkan oleh glukosa tinggi. Rhamnose, mannose dan arabinose, dan mungkin ada ikatan -glikosid. Ia dapat mengurangkan kerosakan oksidatif sel HK -2 yang disebabkan oleh glukosa tinggi dan kerosakan potensi membran mitokondria HK -2 sel yang disebabkan oleh glukosa tinggi. Ekspresi relatif reseptor seperti tol 4 (TLR4) protein dan nisbah faktor p -nuklear (NF) -κB p65 / -actin dan p -iκB / -actin dalam sel HK -2 telah berkurangan dengan ketara selepas intervensi dengan kepekatan CDP yang berbeza (P <0.05, Kesimpulan: CDP boleh mengurangkan tinggiSel epitelium tiub ginjal yang disebabkan oleh glukosaKecederaan dengan menghalang TLR4 / NF-κB untuk menggalakkan percambahan sel dan menghalang tekanan oksidatif dan apoptosis.

 

Kata kunci: Cistanche Desertacola Polysaccharide; Sel epitelium tubular buah pinggang manusia; Tekanan oksidatif; Laluan TLR4/NF-κB

 

 

 

Cistanche untuk Nefropati Diabetes (DN)

 

Nefropati Diabetes (DN)adalah penyebab utama penyakit buah pinggang peringkat akhir dan serius mengancam nyawa dan kesihatan pesakit [1]. Kecederaan tiub renal memainkan peranan penting dalam kejadian dan perkembangan DN. Keabnormalan hemodinamik, tekanan oksidatif, tindak balas keradangan, dan keabnormalan metabolik yang disebabkan oleh persekitaran gula tinggi boleh menyebabkan apoptosis dan nekrosis sel epitelium tiub buah pinggang, yang membawa kepada kerosakan tiub buah pinggang [2,3]. TLR4 dalam buah pinggang adalah ahli keluarga TLRS, dan transduksi isyarat yang berkaitan memainkan peranan penting dalam kejadian dan perkembangan DN [4]. Di bawah keadaan glukosa yang tinggi, ekspresi tinggi TLR4 dalam buah pinggang boleh mengaktifkan laluan NF-κB, memburukkan kerosakan oksidatif selular dan menyebabkan apoptosis sel HK -2 [5, 6].
Cistanches Herba adalah batang berisi kering dengan daun fosforus Cistanche desertacola ycma dan (atau) Cistanche tubulosa (Schenk) Wight, tumbuhan perubatan dan boleh dimakan tradisional. Rasanya manis, asin,

Ia memanaskan dan memasukibuah pinggang dan meridian usus besar. Ia mempunyai kesan tonifikasi buah pinggang, meningkatkan intipati dan darah, dan melembapkan usus dan melegakan sembelit. [7] Polysaccharides adalah salah satu bahan aktif utama Cistanche Desertacola. Kandungan polysaccharides dalam ekstrak air Cistanche deserticola agak tinggi, dengan literatur melaporkan bahawa kandungannya adalah 29.598 hingga 39.609 mg/g [8]. Ia terdiri daripada glukosa, galaktosa, rhamnose, arabinosa, fruktosa, dan lain-lain. Dalam tahun -tahun kebelakangan ini, sejumlah besar kajian telah menunjukkan bahawa polisakarida dalam perubatan tradisional Cina dapat meningkatkan nefropati diabetes. Ciri-ciri multi-sasaran, pelbagai jalan dan kesan penting polysaccharides herba Cina menunjukkan potensi yang besar dalam campur tangan dalam nefropati diabetes [10]. Dalam kajian oleh Wang et al. [11], Polysaccharides Banyan menunjukkan kesan yang signifikan dalam meningkatkan metabolisme glukosa dan lipid, mengurangkan tindak balas keradangan, dan mengawal mikrobiota usus tikus diabetik jenis 2 melalui paksi usus. Kajian terdahulu oleh pasukan penyelidikan telah menunjukkan bahawa ekstrak air dari cistanche deserticola dapat meningkatkan kadar survival sel HK -2 dalam persekitaran gula tinggi dan tinggi lemak, mengawal apoptosis sel, tekanan oksidatif dan tahap keradangan, dan mempunyai kesan terapeutik yang berpotensi terhadap nephropati diabetes [12]. Hasil eksperimen haiwan menunjukkan bahawa CDP secara berkesan dapat meningkatkan nefropati diabetes pada tikus, dan hasil patologi menunjukkan bahawa fibrosis tiub buah pinggang meningkat dengan ketara [13]. Walau bagaimanapun, terdapat beberapa kajian mengenai peranan polysaccharides cistanche desidenes dalam melindungi model sel HK -2 yang disebabkan oleh glukosa tinggi. Memandangkan potensi aktiviti farmakologi dan mekanisme polysaccharides, kajian ini bertujuan untuk mengesan komposisi kimia, struktur molekul dan struktur molekul CDP dengan menggunakan kaedah fenol asid sulfurik, kaedah hydroxybiphenyl, coomassie brilliant, kromatografi. Komposisi jisim, monosakarida dan struktur yang mungkin dianalisis, dan model kerosakan sel HK -2 yang disebabkan oleh glukosa tinggi ditubuhkan untuk menilai kesan perlindungan CDP pada kerosakan HK -2 dan mekanisme tindakannya. Menyediakan asas teoritis dan bukti eksperimen untuk penggunaan CDP yang berpotensi dalam rawatan DN.

1 Bahan dan Kaedah
1.1 Bahan dan Instrumen

CDPS (kandungan polysaccharide> 8 0%, nombor batch: 2306019, Shaanxi Xintianyu Company); Dapagliflozin (Dapa, nombor batch: BMS -512148, AstraZeneca Pharmaceuticals Co., Ltd.); Sel epitelium tubular renal manusia Hk -2 (nombor batch: 20231014, Actt Company, USA); MEM Culture Medium, Serum Bovine Fetal (Nombor Lot: 20231014, 20231014, Gibco Company, Amerika Syarikat); PBS Buffer (Lot Number: 20230906, Hyclone Company, USA); 0.25% EDTA yang mengandungi penyelesaian pencernaan trypsin (nombor lot: 20240411, syarikat anhui biosharp); CCK -8 Kit Pengesanan Keterlaksanaan Sel (nombor batch: 20240415, Wuhan Elarite Biotechnology Co., Ltd.); Superoxide Dismutase (SOD), Malondialdehyde (MDA), Glutathione Peroxidase
Kit Pengesanan Peroxidase, GSH-PX) (Batch No.: 20240505, 20240423, 20240423, Shanghai Yoxuan Biotechnology Co., Ltd.); Hoechst33258 Mengotorkan Kit Apoptosis (Batch No.: 20240223, Shanghai Biotechnology Co., Ltd.); JC -1 pewarnaan
Kit Pengesanan Potensi Membran Mitokondria (Batch No.: 20240319, Wuhan Elarite Biotechnology Co., Ltd.); dichlorofluorescein diacetate (DCF-da) sel-spesies oksigen reaktif sel (ROS) reagen pengesanan
Kit (Lot No.: 20231225, Beijing Solebow Technology Co., Ltd.); TLR4 antibodi monoklonal, faktor nuklear fosforilasi-κB p65 (phospho-NF-κB p65, p-NF-κB p65) antibodi monoklonal (Lot No.: 10032512, 00128965, Wuhan Sanying.

Kromatografi ion IC5000, pembaca mikroplat Mul-Tigo (Thermo Fisher, Amerika Syarikat); PowerPac HC+Mini Protein Electrophoresis Instrument (Biorad, USA); Mikroskop terbalik TS2 (Nikon, Jepun); LC -10 kromatografi cecair prestasi tinggi, RI -20 pengesan pembezaan (Shimadzu Technology Co., Ltd., Jepun); 105-103-101 (8 mm × 300 mm) Tandem Gel Column (BRT Company, UK); CPA225D Baki Elektronik, Eppendorf5424 Centrifuge (Sartorius, Jerman).

 

1.2 Kaedah Eksperimen
1.2.1 Penentuan Jumlah Gula, Asid Uronik dan Kandungan Protein CDP

Kaedah ini diikuti mengikut rujukan [14]. Kandungan gula jumlah CDP ditentukan oleh kaedah asid fenol-sulfurik; Kandungan asid uronik CDP ditentukan oleh kaedah mydroxybiphenyl colorimetric; dan kandungan protein CDP ditentukan oleh kaedah biru coomassie yang cemerlang.

 

1.2.2 Penentuan Massa Molekul

Pengagihan berat molekul polysaccharides dikesan oleh lajur tandem kromatografi gel prestasi tinggi. Satu siri standard dextran (dextran p {{0}}, p -10, p -20, p -50, p -100, p -200 0. 0 5 mol/l Sebelum digunakan. Kepekatan akhir adalah 5 mg/ml, vortexed untuk dibubarkan, dan disentrifuged pada 12 0 00 r/min selama 10 minit. Supernatan itu disedut dan ditapis dengan membran microporous 0.22 μm. Selepas sentrifugasi berkelajuan tinggi, 0.05 mol/L NaCl digunakan sebagai fasa mudah alih. Lajur kromatografi adalah Brt 105-103-101 (8 mm × 300 mm); Kadar aliran adalah 0.7 ml /min; Suhu lajur: 40 darjah; Jumlah suntikan: 25 μl; pengesan: pengesan pembezaan rid -20 a; Masa Analisis: 62 min. Pilih kaedah kromatografi di atas untuk analisis, dapatkan masa pengekalan, dan plot logaritma berat molekul puncak (MP) pada ordinat (LGMP) dan masa pengekalan (RT) pada abscissa (LGMP-RT). Kurva Standard: Menurut kaedah di atas, kelengkungan berat molekul purata berat (MW) keluk standard LGMW-RT dan kelengkungan standard molekul purata (MN) LGMN-RT dibuat untuk mendapatkan berat molekul. Formula pengiraan. Menggantikan masa pengekalan sampel ke dalam formula, berat molekul (MP, MW, MN) boleh diperolehi.

1.2.3 Komposisi Monosakarida

Komposisi monosakarida ditentukan menggunakan kromatografi ion. Take appropriate amounts of 16 monosaccharide standards (fucose, rhamnose, arabinose, galactose, glucose, xylose, mannose, fructose, ribose, galacturonic acid, glucuronic acid, aminogalactose hydrochloride) , glucosamine hydrochloride, N-acetyl-D-glucosamine, guluronic acid, asid mannuronik) ditambah dengan 2 mL 3 mol/L trifluoroacetic acid (TFA), dihidrolisiskan pada 120 darjah selama 3 jam, dikeringkan dengan nitrogen, dan ditambah untuk menghilangkan vorteks air berair untuk mencampur dengan baik dan menyediakan penyelesaian standard standard. Ambil setiap penyelesaian standard monosakarida dan menyediakan standard tumpuan dengan tepat sebagai standard campuran. Menurut kaedah kuantifikasi mutlak, massa monosakarida yang berbeza telah ditentukan, dan nisbah molar dikira berdasarkan jisim molar monosakarida.
Tambah 2 ml 3 mol/L TFA ke polysaccharide dan bertindak balas pada 12 0 darjah selama 3 jam. Semasa tindak balas, N2 digunakan untuk perlindungan. Larutkan selepas penyejatan di bawah tekanan yang dikurangkan. Tambah 5 ml air dan vorteks untuk dicampur. Ambil 5 0 μl dan tambah 950 μl air deionized. Centrifuge pada rpm selama 5 minit. Supernatan itu ditapis melalui membran mikrofiltrasi 0.22 μm dan dianalisis oleh kromatografi ion. Lajur itu ialah Dionex Carbopactm PA20 (3 mm × 150 mm); Fasa mudah alih adalah: H2O; B: 15 mol/lnaOH; C: 15 mol/ l NaOH & 100 mol/ l NAAC; Kadar aliran: 0.3 ml/min; Jumlah suntikan: 25 μl; Suhu lajur: 30 darjah ;. Pengesan: pengesan elektrokimia; Kecerunan Elusi Lihat Jadual 1.

 

Jadual 1 jadual elusi kecerunan fasa mudah alih

 

 

1.2.4 Pengesanan Spektrum Inframerah

Timbang 1 mg polysaccharide kering dan serbuk KBr, gulungkan dan campurkannya dalam mortar, dan tekannya ke dalam lembaran nipis menggunakan tekan tablet. Analisis ini dijalankan menggunakan Spektrometer Inframerah Transformasi Fourier dalam julat nombor gelombang 4500 ~ 400cm -1.

 

1.2.5 Kesan perlindungan CDP pada sel Hk -2 yang disebabkan oleh glukosa tinggi dalam nefropati diabetes

1.2.5.1 hk -2 Budaya sel

Selepas HK {{0}} sel telah dihidupkan semula, mereka dibiakkan dalam medium lengkap MEM yang mengandungi 10% serum lembu janin dan antibodi ganda 1%, dan sel -sel diletakkan dalam inkubator kultur sel pada 37 darjah, 5% CO2 dan kelembapan tepu untuk mematuhi dinding. . Apabila sel -sel tumbuh hingga 80% hingga 90%, mereka dicerna dengan trypsin 0.25% dan subkultur. HK -2 sel dalam fasa pertumbuhan logaritma digunakan untuk eksperimen berikutnya.

 

1.2.5.2 Penyediaan penyelesaian saham CDP dan kepekatan dos.

Tepat berat 3 0 mg CDP, tambah 6 ml MEM medium lengkap glukosa untuk menyediakan penyelesaian stok CDP 5 mg/ml, dan simpan dalam peti sejuk 4 darjah. Apabila menggunakan, ukur jumlah penyelesaian ibu CDPS tertentu, tambahkan medium kultur, campurkan dengan baik, sterilkan dengan penapis steril 0.22 μm, dan sediakan penyelesaian sampel kepekatan yang sesuai.

 

1.2.5.3 Kesan CDP pada sel Hk -2 biasa

HK -2 sel -sel dalam fasa pertumbuhan logaritma telah dibiakkan dalam plat 96- pada kepadatan 3000 sel/sumur. Menurut keputusan percubaan awal, sel -sel dibahagikan kepada kumpulan kawalan biasa (kumpulan kawalan, CON), kepekatan massa yang berlainan (25, 50, 100, 200, 400, 800, 1000, 1600 ug/ml)
Kumpulan kosong yang mengandungi hanya medium budaya telah ditubuhkan; Selepas berbudaya dengan medium budaya atau ubat selama 24 jam dan 48 jam, 100 μl medium kultur yang mengandungi 10% CCK -8 telah ditambahkan ke setiap sumur dan sel -sel diinkubasi pada 37 darjah untuk mengelakkan cuti dalam cahaya selama 1.5 jam. Ketumpatan optik (OD) bagi setiap telaga diukur pada panjang gelombang 450 nm menggunakan pembaca mikroplat, dan daya tahan sel (%) dikira mengikut formula "daya tahan sel (%)=[(OD OD OD OD kosong) Dadah ke sel biasa.

1.2.5.4 HK -2 Masa pemodelan glukosa tinggi dan pemeriksaan kepekatan
Sediakan larutan stok glukosa (glukosa, GLC) (10 mg/ml) dan cairkannya dengan medium kultur lengkap untuk memodelkan kepekatan 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, dan 80 mmol/l masing -masing untuk digunakan. Sel -sel HK -2 dalam fasa pertumbuhan logaritma telah disenaraikan dalam plat baik 96- pada 3000/sumur, dan con, kumpulan model (model, mod), dan kumpulan pelarasan kosong ditubuhkan dan diberi budaya medium medium medium medium dan tinggi kebudayaan yang berbeza. , jumlah medium budaya lengkap, budaya selama 24 jam dan 48 jam, dan mengesan daya maju sel mengikut kaedah di bawah "1.2.5.3".

 

1.2.5.5 Kesan CDP pada kadar survival sel -sel model

Menurut hasil eksperimen "1.2.5.4", sel -sel HK -2 dalam fasa pertumbuhan logaritma telah dibiakkan dalam plat 96- pada kepadatan 3000 sel setiap telaga. Sel -sel dibahagikan kepada CON, MOD, dan kepekatan massa yang berlainan sebanyak 50, 100, dan 200 sel -sel telah dibiakkan pada 400 ug/mL, 400 ug/ml, dan 800 ug/ml CDP. Kumpulan pelarasan kosong tanpa sel telah ditubuhkan. Kumpulan pelarasan dan kosong telah ditambah dengan jumlah medium lengkap yang sama. MOD dan setiap kumpulan yang dirawat dadah ditambah dengan 60 mmol/L GLC dan berbudaya selama 24 jam. , buang medium budaya, tambahkan medium dan budaya dan budaya yang sepadan dengan budaya selama 24 jam dan 48 jam, dan mengesan kadar survival sel mengikut kaedah di bawah "1.2.5.3".

 

1.2.5.6 Kesan CDP pada Petunjuk Tekanan Oksidatif dalam Sel Model

Menurut keputusan eksperimen dalam "1.2.5.5", sel-sel dibahagikan kepada CON, MOD, kumpulan CDPs dos yang tinggi (CDPS-H, 400 mg/kg), kumpulan CDPs dos pertengahan (CDPS-m, 200 mg/kg), kumpulan CDPS rendah (CDPS, Kumpulan kosong tanpa sel ditubuhkan dalam kumpulan penyesuaian sifar, selepas pemodelan, medium budaya atau ubat-ubatan yang sepadan telah ditambah dan dibiakkan selama 24 jam. Protein dikumpulkan dan lysates dinormalisasikan ke tahap yang sama dengan pembetulan kepekatan protein. Mengikut arahan setiap kit penunjuk, kandungan MDA, kandungan GSH-PX dan aktiviti SOD dalam setiap kumpulan sel telah dikesan.

 

1.2.5.7 Pengesanan ROS dalam sel HK -2

Tambah penggantungan sel ke plat 6- dan letakkannya dalam inkubator budaya sel sehingga sel -sel tumbuh menjadi monolayer dan menerima rangsangan yang sepadan. Basuh sel 3 kali dengan PBS pra-disejukkan dan cair dengan medium MEM bebas serum. Pewarna pendarfluor DCF-DA dicairkan kepada kepekatan akhir 10 μmol/L. Pewarna ini ditambah kepada plat 6-, sel-sel telah dibasuh 3 kali dengan PBS pra-disejukkan, dan pewarna pendarfluor DCFH-DA dicairkan kepada kepekatan akhir 10 μmol/L dengan medium MEM serum. μmol/l, pewarna itu ditambah kepada plat 6-, pewarna dibuang, sel-sel dibasuh tiga kali dengan medium MEM bebas serum, dan kemudian imej dikumpulkan di bawah mikroskop pendarfluor.