Spike Dan Nsp6 Adalah Penentu Utama SARS-CoV-2 Omicron BA.1 Pengecilan

Varian SARS-CoV-2 Omicron lebih mengelak kebal dan kurang virulen berbanding varian virus utama lain yang telah dikenal pasti setakat ini1–12. Protein Omicron spike (S), yang mempunyai bilangan mutasi yang luar biasa besar, dianggap sebagai pemacu utama fenotip ini. Di sini kami menjana rekombinan chimeric SARS-CoV-2 pengekodan gen S Omicron (keturunan BA.1) dalam tulang belakang pengasingan SARS-CoV-2 nenek moyang, dan membandingkan virus ini dengan Omicron yang beredar secara semula jadi pelbagai. Virus Omicron S-bearing teguh melarikan diri dari imuniti humoral yang disebabkan oleh vaksin, terutamanya disebabkan oleh mutasi dalam motif pengikat reseptor; walau bagaimanapun, tidak seperti Omicron yang wujud secara semula jadi, ia mereplikasi dengan cekap dalam garisan sel dan sel paru-paru distal seperti primer. Begitu juga, dalam K18-hACE2 tikus, walaupun pembawa virus Omicron S menyebabkan penyakit yang kurang teruk berbanding virus nenek moyang, virulensinya tidak dilemahkan kepada tahap Omicron. Siasatan lanjut menunjukkan bahawa mutasi protein bukan struktur 6 (nsp6) sebagai tambahan kepada protein S adalah mencukupi untuk menyusun semula fenotip Omicron yang dilemahkan. Ini menunjukkan bahawa walaupun pelarian vaksin Omicron didorong oleh mutasi dalam S, patogenikiti Omicron ditentukan oleh mutasi di dalam dan di luar protein S.

cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun

Sehingga Disember 2022, gelombang pandemik COVID-19 berturut-turut telah didorong oleh lima varian SARS-CoV-2 utama, dikenali sebagai varian kebimbangan (VOC): Alpha (B.1.1.7) , Beta (B.1.351), Gamma (P.1), Delta (B.1.617.2 dan keturunan AY) dan Omicron (keturunan BA)13. Omicron ialah VOC yang paling baru diiktiraf, dan pertama kali didokumenkan di Afrika Selatan, Botswana dan oleh pengembara dari Afrika Selatan di Hong Kong pada November 2021 (ID GISAID: EPI_ISL_7605742)14, 15. Ia dengan pantas melanda dunia, menggantikan varian Delta yang dominan sebelum ini dalam beberapa minggu dan menyumbang kebanyakan jangkitan SARS-CoV-2 baharu menjelang Januari 2022 (rujuk 16–18). Sekurang-kurangnya lima keturunan Omicron telah dikenal pasti setakat ini: BA.1, BA.2, BA.3, BA.4, dan BA.5. BA.1 (selepas ini dirujuk sebagai Omicron) mempamerkan pelarian yang luar biasa daripada imuniti humoral yang disebabkan oleh jangkitan dan vaksin3,19. Tambahan pula, ia kurang virulen daripada VOC lain pada manusia dan model jangkitan in vivo4,5,7,11,12,20. Omicron berbeza daripada prototaip pengasingan SARS-CoV-2, Wuhan-Hu-1, dengan 59 asid amino; 37 daripada perubahan ini adalah dalam protein S, meningkatkan kemungkinan bahawa S berada di tengah-tengah tingkah laku patogenik dan antigenik Omicron.

cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun

Mutasi S menjejaskan replikasi Omicron dalam kultur sel

Protein Omicron S mengandungi 30 penggantian asid amino, 6 pemadaman dan satu sisipan 3 asid amino panjangnya, berbanding dengan Wuhan-Hu-1 (Data Lanjutan Rajah 1). Dua puluh lima daripada perubahan ini adalah unik kepada Omicron berbanding VOC lain, walaupun sebahagian daripadanya telah dilaporkan dalam air sisa dan varian SARS-CoV-2 kecil21,22. Untuk menguji peranan protein S dalam fenotip Omicron, kami menghasilkan virus rekombinan chimeric yang mengandungi gen S Omicron (USA-lh01/2021) dan semua gen lain SARS-CoV leluhur-2 (GISAID EPI{ {16}}ISL_2732373)23 (Data Lanjutan Rajah 2a). Virus chimeric ini, bernama Omi-S, dibuat dengan menggunakan bentuk tindak balas lanjutan polimerase bulat (CPER)24 (Data Lanjutan Rajah 2b) yang diubah suai yang menghasilkan stok virus yang sangat pekat, yang mengandungi 0.5 × 106 –5 × 106 pembentukan plak unit (PFU) per ml, daripada sel yang ditransfeksi dalam masa dua hari selepas pemindahan (Data Lanjutan Rajah 2c,d), mengelakkan keperluan untuk penguatan virus selanjutnya.

Rajah 1|Kesan S pada kinetik pertumbuhan in vitro Omicron. Skema virus. S, pancang; N, nukleokapsid. b–e, sel ACE2/TMPRSS2/Caco-2 (b,d) dan sel Vero E6 (c,e) telah dijangkiti di MOI 0.01, dan peratusan sel N-positif (n=6 replikasi) (b,c) dan pembebasan zarah berjangkit (n=3 replikasi) (d,e) ditentukan oleh sitometri aliran dan ujian plak, masing-masing. f, sel ACE2/TMPRSS2/Caco-2 telah dijangkiti dengan campuran virus pada nisbah 1:1 untuk mendapatkan MOI akhir sebanyak 0.005 untuk setiap virus . Sel-sel telah ditetapkan pada masa yang dinyatakan dan tertakluk kepada sitometri aliran. Kiri, plot titik perwakilan; kanan, peratusan yang tidak dijangkiti, Omi-S/mCherry-dijangkiti, Omicron/mNeoGreen (Omicron/mNG)-dijangkiti dan sel yang dijangkiti dua kali ganda. Sel yang dijangkiti tunggal digunakan untuk pampasan. Bar ralat, min ± sd (n {{20}} replika). g, Saiz plak. Kiri, imej mewakili plak pada sel ACE2/TMPRSS2/ Caco-2. Betul, diameter plak diplotkan sebagai min ± sd bagi 20 plak bagi setiap virus. h, sel epitelium iAT2 manusia telah dijangkiti pada MOI sebanyak 2.5 selama 48 jam atau 96 jam. Bahagian apikal sel telah dibasuh dengan 1 × phosphate-buffered saline (PBS) dan tahap zarah virus berjangkit diukur dengan ujian plak. Bar ralat, min ± sd (n=4 replika). Eksperimen telah diulang dua kali, dengan setiap ulangan eksperimen mengandungi 3 (b–g) atau 4 (h) ulangan. Nilai P dikira dengan ujian t dua ekor, tidak berpasangan dengan pembetulan Welch. *P <0.05, **P <0.01, ***P <0.001 dan ****P <0.0001; NS, tidak penting. Strategi gating untuk sitometri aliran ditunjukkan dalam Rajah Tambahan 1.

Kami mula-mula membandingkan kecekapan jangkitan Omi-S dengan virus yang mengandungi D614G nenek moyang (GISAID EPI_ISL_2732373; dijana oleh CPER; selepas ini dirujuk sebagai jenis liar (WT)) dan pengasingan Omicron (USA-lh01/2021) dalam kultur sel (Rajah 1a). Untuk ini, kami menjangkiti ACE2- dan TMPRSS2-expressing Caco-2 (selepas ini, ACE2/TMPRSS2/Caco-2) dan sel Vero E6 dengan Omi-S, WT dan Omicron pada kepelbagaian jangkitan (MOI) 0.01, dan memantau penyebaran virus melalui sitometri aliran dan ujian pembentukan plak. Virus WT dan Omi-S merebak dengan pantas dalam sel ACE2/TMPRSS2/Caco-2, masing-masing menghasilkan 89% dan 80% sel yang dijangkiti, pada 24 jam selepas jangkitan (HPI) (Rajah 1b). Sebaliknya, Omicron mereplikasi lebih perlahan, membawa kepada 48% sel yang dijangkiti pada 24 hpi. Corak yang sama dilihat dalam sel Vero E6, di mana 60% dan 41% sel adalah positif untuk WT dan Omi-S, masing-masing, pada 48 hpi, berbanding 10% untuk Omicron (Rajah 1c). Ujian plak menunjukkan bahawa walaupun kedua-dua Omi-S dan Omicron menghasilkan tahap zarah virus berjangkit yang lebih rendah berbanding dengan WT, titer virus Omi-S adalah jauh lebih tinggi daripada Omicron. Dalam sel ACE2/TMPRSS2/Caco-2, Omi-S menghasilkan 5.1-lipatan (P=0.0006) dan 5.5-lipatan (P {{49} }.0312) lebih banyak zarah berjangkit daripada Omicron pada 12 hpi dan 24 hpi, masing-masing (Rajah 1d). Begitu juga, dalam sel Vero E6, titer virus berjangkit Omi-S adalah 17-kali ganda (P=0.0080) dan 11-kali ganda (P=0.0078) lebih tinggi berbanding Omicron pada 24 hpi dan 48 hpi, masing-masing (Rajah 1e). Perbezaan antara virus menjadi kurang jelas pada titik masa kemudian kerana sitotoksisiti yang lebih tinggi disebabkan oleh Omi-S berbanding dengan Omicron (Data Lanjutan Rajah 3a). Peningkatan kecekapan replikasi Omi-S berbanding Omicron telah dikekalkan apabila diuji pada MOI yang berbeza-beza (Data Lanjutan Rajah 3b). Kami mengesahkan lagi kelebihan kecergasan Omi-S berbanding Omicron melalui ujian persaingan langsung. Untuk ini, kami mula-mula menghasilkan Omicron (mikron) rekombinan, yang, dalam ujian kultur sel kami, meniru kinetik replikasi Omicron semula jadi (Data Lanjutan Rajah 4). Seterusnya, kami mencipta Omi-S yang mengandungi mCherry dan Omicron yang mengandungi mNeonGreen, dan menginokulasi sel ACE2/TMPRSS2/Caco-2 dengan virus ini bercampur pada nisbah 1:1. Analisis sitometrik aliran sel yang dijangkiti pada pelbagai masa jangkitan menunjukkan bahawa Omi-S/mCherry jelas lebih unggul daripada Omicron/mNeonGreen dari segi replikasi (Rajah 1f). Akhirnya, kecekapan jangkitan Omi-S yang lebih tinggi juga ditunjukkan dalam saiz plak; walaupun virus WT menghasilkan plak terbesar (sekitar 4.1 mm), saiz plak Omi-S (sekitar 2.2 mm) adalah dua kali ganda (P <0.0001) lebih besar daripada plak Omicron (sekitar 1.1 mm) (Rajah 1g). Keputusan ini menunjukkan bahawa walaupun mutasi dalam protein S mempengaruhi kecekapan jangkitan Omicron, mereka tidak menjelaskan sepenuhnya fenotip Omicron.

Beberapa baris bukti menunjukkan bahawa protein S yang digabungkan ke dalam Omi-S berkelakuan dengan cara yang sama seperti dalam Omicron semula jadi. Sebagai contoh, seperti yang diterangkan sebelum ini20,25, Omicron S telah dibelah dengan buruk berbanding dengan WT S; manakala 71% daripada S dalam virion WT adalah dalam bentuk terbelah, hanya 45% dan 47% telah dibelah dalam Omi-S dan Omicron, masing-masing (Data Lanjutan Rajah 5a). Corak pembelahan S yang sama terbukti dalam sel yang dijangkiti virus (WT, 63% dibelah; Omi-S, 33% dibelah; Omicron, 42% dibelah) (Data Lanjutan Rajah 5b). Eksperimen ini juga mendedahkan bahawa Omicron S telah dimasukkan secara tidak cekap ke dalam zarah virus berbanding dengan nisbah WT S (S kepada nukleokapsid (N): 3.40 untuk virus WT, 1.91 untuk Omi-S dan 2.04 untuk Omicron) (Data Lanjutan Rajah 5a). Begitu juga, kedua-dua Omi-S dan Omicron menghasilkan syncytia yang lebih kecil berbanding dengan virus WT, pemerhatian yang sebelum ini telah dilaporkan untuk Omicron20,26 (Data Lanjutan Rajah 5c). Akhir sekali, selaras dengan literatur25 yang diterbitkan, Omi-S dan Omicron menunjukkan keutamaan untuk kemasukan pengantaraan cathepsin, seperti yang dicerminkan oleh kepekaan mereka yang lebih tinggi kepada perencat cathepsin E64d (Data Lanjutan Rajah 6). Kami seterusnya membandingkan kinetik replikasi WT, Omi-S dan Omicron dalam sel epitelium paru-paru, yang membentuk tapak replikasi virus utama dalam pesakit COVID-19 (rujuk 27,28). Sehubungan itu, kami menggunakan sel-sel epitelium (iAT2) alveolar jenis 2 (iAT2) sel-sel yang berasal dari stem pluripotent akibat manusia. Sel AT2 mewakili populasi sel penting dalam paru-paru distal dan merupakan salah satu sasaran utama jangkitan SARS-CoV-228,29. Kami menjangkiti sel iAT2, ditanam sebagai budaya antara muka cecair udara (ALI), pada MOI 2.5 dan memantau rembesan keturunan virus pada bahagian apikal sel pada 48 hpi dan 96 hp. Selaras dengan keputusan yang diperoleh daripada garisan sel, virus WT menghasilkan zarah virus berjangkit tahap tertinggi (Rajah 1h). Antara Omi-S dan Omicron, yang pertama menghasilkan kira-kira lima kali ganda (P=0.0008) titer virus berjangkit lebih tinggi pada 48 hp. Titer virus untuk WT dan Omi-S menurun pada 96 dpi berbanding 48 hp disebabkan oleh kesan sitopatik (CPE) jangkitan. Walau bagaimanapun, tiada CPE dilihat untuk Omicron, yang membawa kepada pengeluaran virion berjangkit yang berterusan. Secara keseluruhannya, keputusan ini menyokong kesimpulan bahawa mutasi dalam S tidak mengambil kira sepenuhnya kapasiti replikasi Omicron yang dilemahkan dalam kultur sel.

manfaat cistanche untuk lelaki-menguatkan sistem imun

Klik di sini untuk melihat produk Cistanche Enhance Immunity

【Minta lebih lanjut】 E-mel:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Peranan minimum S dalam patogenik Omicron pada tikus

Untuk memeriksa sama ada Omi-S menunjukkan kecergasan in vivo yang lebih tinggi berbanding dengan Omicron, kami menyiasat hasil jangkitan Omi-S berbanding WT SARS-CoV-2 dan Omicron dalam tikus K18-hACE2. Dalam persetujuan dengan literatur yang diterbitkan4, 5 , inokulasi intranasal tikus (berumur 12-20 minggu) dengan Omicron (104 PFU setiap tetikus) tidak menyebabkan penurunan berat badan yang ketara, manakala inokulasi dengan virus WT mencetuskan penurunan berat badan yang cepat, dengan semua tikus kehilangan lebih 20% berat badan awal mereka selama 8 hari selepas jangkitan (dpi) (Rajah 2a). Terutama, 80% tikus yang dijangkiti Omi-S juga kehilangan lebih 20% berat badan mereka sebanyak 9 dpi (Rajah 2a dan Data Lanjutan Rajah 7a). Penilaian markah klinikal (ukuran kumulatif penurunan berat badan, pernafasan yang tidak normal, penampilan yang menyimpang, tindak balas yang berkurangan dan tingkah laku yang diubah) juga mendedahkan corak yang sama; manakala tikus yang dijangkiti Omicron menunjukkan sedikit atau tiada tanda-tanda penyakit klinikal, kesihatan mereka yang dijangkiti WT dan Omi-S dengan cepat merosot, dengan virus WT menyebabkan penyakit yang lebih teruk (P=0.0102) (Gamb. 2b dan Data Lanjutan Rajah 7b). Oleh kerana SARS-CoV-2 menyebabkan jangkitan maut pada K18-hACE2 tikus4 , kami membandingkan kemandirian tikus selepas jangkitan virus. Bersetuju dengan keputusan penurunan berat badan dan skor klinikal, WT, dan Omi-S menyebabkan kadar kematian masing-masing 100% (6/6) dan 80% (8/10). Sebaliknya, semua tikus yang dijangkiti Omicron terselamat (Rajah 2c). Penemuan ini, yang konsisten dengan penerbitan baru-baru ini30, menunjukkan bahawa protein S bukanlah penentu eksklusif patogenik Omicron dalam tikus K18-hACE2.

Seterusnya, kami membandingkan pembiakan Omi-S dengan Omicron dan WT SARS-CoV-2 dalam paru-paru dan turbinat hidung tikus K18-hACE2. Tikus (12-20 minggu) dicabar secara intranasal dengan 104 PFU (tujuh tikus setiap virus), dan titer virus dalam paru-paru tikus diukur pada 2 dan 4 dpi. Selaras dengan penemuan in vitro, titer virus berjangkit dalam paru-paru tikus yang dijangkiti WT adalah lebih tinggi daripada yang dikesan pada tikus yang dijangkiti dengan dua virus lain (Rajah 2d). Walau bagaimanapun, secara ketara, tikus yang dijangkiti Omi-S menghasilkan 30-kali ganda (P=0.0286) lebih banyak zarah virus berjangkit berbanding dengan tikus yang dijangkiti Omicron pada 2 dpi. Titer menurun pada 4 dpi untuk tikus yang dijangkiti WT dan Omi-S, tetapi ia menunjukkan trend yang meningkat untuk tikus yang dijangkiti Omicron, menunjukkan kemungkinan jangkitan ringan tetapi berterusan oleh Omicron dalam tikus K18-hACE2. Ketiga-tiga varian yang dipulihkan daripada paru-paru tikus mengekalkan fenotip saiz plak yang sama seperti inokulum asal, menunjukkan bahawa replikasi pada tikus tidak mempunyai kesan yang dapat dikesan pada genotip virus ini (data tidak ditunjukkan).

Untuk menilai patogenik virus dalam paru-paru dan turbinat hidung tikus K18-hACE2, kami melakukan analisis histopatologi tisu-tisu ini pada 2 dpi. Seperti yang dilaporkan sebelum ini4,31, imunoreaktiviti hampir meresap meluas protein SARS-CoV-2 N telah dikesan dalam alveoli paru-paru tikus yang dijangkiti virus WT (Rajah 2e). Sebaliknya, jangkitan Omi-S dan Omicron menghasilkan fokus setempat pewarnaan alveolar dengan fokus yang lebih sedikit untuk Omicron berbanding dengan Omi-S. Fenotip yang paling ketara dilihat dalam epitelium bronkiolar, di mana Omi-S menyebabkan jangkitan lilitan yang ketara, dengan sekitar 10-15% bronkiol positif untuk protein N virus pada 2 dpi, manakala hanya 3-5% daripada bronkiol adalah N. -positif untuk Omicron (Rajah 2f). Virus WT menjangkiti sekitar 1% daripada bronkiol dan dalam semua kes hanya termasuk satu sel epitelium terpencil bagi setiap bronkiol. Tambahan pula, jangkitan bronkiolar dikaitkan dengan nekrosis epitelium dalam tikus yang dijangkiti Omi-S, seperti yang ditentukan melalui analisis bahagian hematoxylin dan eosin (H&E) bersiri, manakala tiada bukti histologi kecederaan saluran pernafasan diperhatikan pada tikus yang dijangkiti Omicron atau WT (Data Lanjutan Rajah 8a,b). Turbinat hidung tikus yang disuntik dengan virus WT dan Omi-S kedua-duanya mengandungi sel-sel positif-2-SARS-CoV yang banyak, yang dikaitkan dengan kesan sitopatik yang terang-terangan, manakala Omicron menghasilkan sel-sel positif yang jarang berlaku, sporadis, tanpa tanda-tanda epitelium yang jelas. kecederaan (Data Lanjutan Rajah 8c). Secara keseluruhan, penemuan ini menunjukkan bahawa replikasi Omicron dalam saluran pernafasan tikus dilemahkan dengan ketara berbanding dengan Omi-S, menyokong kesimpulan kami bahawa mutasi dalam S hanya sebahagiannya bertanggungjawab untuk patogenik Omicron yang dilemahkan.

Mutasi dalam S dan nsp6 mentakrifkan pengecilan Omicron

Sebagai tambahan kepada protein S, Omicron mempunyai perubahan asid amino dalam protein bukan struktur 3 (nsp3), nsp4, nsp5, nsp6, nsp14, sampul (E), membran (M), dan protein N, jika dibandingkan dengan virus WT. (Data Lanjutan Rajah 9a). Untuk mengenal pasti protein bukan spike yang terlibat dalam pengecilan Omicron, kami menghasilkan panel besar virus chimeric berlabel pendarfluor, masing-masing mengandungi Omicron S dalam kombinasi dengan satu protein bukan spike Omicron, dengan protein selebihnya datang daripada virus WT (Data Lanjutan Rajah 9b). Apabila kami menggabungkan Omicron S dengan Omicron nsp6 (Omi-S/nsp6), kami melihat penurunan yang kuat dalam replikasi virus, dengan kinetik jangkitan meniru Omicron dalam kultur sel (Rajah 3a-d); tiada penurunan sedemikian dilihat untuk virus chimeric lain. Kecekapan replikasi Omi-S / nsp6 yang lemah juga disokong oleh penemuan kami bahawa kedua-dua Omi-S / nsp6 dan Omicron mengambil masa hampir lima hingga enam hari untuk pulih oleh CPER, manakala semua varian lain telah dipulihkan dalam dua hari (data tidak ditunjukkan). Akhirnya, seperti Omicron, Omi-S/nsp6 jelas dikalahkan oleh Omi-S dalam ujian persaingan langsung (Rajah 3e).

Rajah 2|Peranan S dalam patogenik Omicron. a–c, Tikus K18-hACE2 jantan dan betina (berumur 12–20} minggu) telah disuntik secara intranasal dengan 1 × 104 PFU WT (n=6 tikus), virus Omi-S (n=10 tikus) atau Omicron (n {{1{{40}}}} tikus). Dua stok virus yang dijana secara bebas telah digunakan dalam eksperimen ini. Berat badan (a), skor klinikal (b), dan survival (c) dipantau setiap hari selama 14 hari. Tikus yang kehilangan 20% berat badan awalnya telah dibunuh. d,e, K18-hACE2 tikus telah diinokulasi secara intranasal dengan 1 × 104 PFU WT (n=14 tikus), Omi-S (n=14 tikus) dan Omicron (n {{ 20}} tikus). Sampel paru-paru tikus yang dijangkiti dikumpulkan pada 2 atau 4 dpi untuk menentukan titer virus (n=4 tikus) (d) atau untuk pengesanan imunohistokimia (IHC) protein N (n=3 tikus) (e). Dalam e, imej wakil IHC yang menunjukkan SARS-CoV-2 N (warna coklat) dalam alveoli (anak panah) dan bronkiol (anak panah) dalam paru-paru tikus pada 2 dpi dipersembahkan. Bar skala, 100 µm. f, Peratusan bronkiol N-positif dalam paru-paru tikus yang dijangkiti (n=3 tikus) pada 2 dpi. Setiap titik mewakili tetikus yang dijangkiti. Kepentingan statistik ditentukan menggunakan ujian t dua ekor, tidak berpasangan dengan pembetulan Welch (a, b, d, f) dan ujian peringkat log (Mantel-Cox) (c). *P <0.05, **P <0.01, ***P <0.001 dan ****P <0.0001; NS, tidak penting.

Dalam paru-paru tikus K18-hACE2, manakala Omi-S menyebabkan jangkitan dan kecederaan bronkiolar yang meluas, kedua-dua Omicron dan Omi-S/nsp6 menunjukkan penurunan jangkitan tanpa bukti kerosakan epitelium (Rajah 3f). Selaras dengan penemuan ini, paru-paru tikus yang dijangkiti Omi-S/nsp6-menghasilkan titer virus yang setara dengan yang dilihat untuk pencilan rOmicron dan Omicron (Rajah 3g). Akhirnya, 71% tikus yang dijangkiti Omi-S/nsp6 terselamat (Rajah 3h) -berbeza dengan kadar survival hanya 20% yang diperhatikan pada tikus yang dijangkiti Omi-S (Rajah 2c). Secara keseluruhan, keputusan ini menunjukkan bahawa mutasi dalam S dan nsp6 adalah mencukupi untuk menentukan virulensi yang dilemahkan Omicron. Pemerhatian ini menyokong dan memanjangkan lagi penemuan kajian terdahulu yang menunjukkan bahawa mutasi di rantau 5'-UTR–nsp12, di mana nsp6 berada, menyumbang kepada pengecilan Omicron dalam K18-hACE2 tikus30.

Rajah 3|Mutasi dalam S dan nsp6 memacu Omicron pathogenicity.a–d, Kinetik replikasi virus wartawan mNeonGreen yang ditunjukkan dalam sel ACE2/TMPRSS2/Caco-2 (MOI=0.01) ditentukan oleh aliran sitometri (n=3 ulangan) (a,c) dan ujian plak (n=3 ulangan) (b,d). Eksperimen diulang dua kali. e, sel ACE2/ TMPRSS2/Caco-2 telah dijangkiti dengan campuran virus pada nisbah 1:1 untuk mendapatkan MOI akhir sebanyak 0.005 untuk setiap virus . Sel-sel telah ditetapkan pada masa yang ditunjukkan dan dianalisis oleh sitometri aliran. Peratusan sel yang tidak dijangkiti, dijangkiti tunggal dan dijangkiti berganda ditunjukkan. Sel yang dijangkiti tunggal digunakan untuk pampasan. Titik data individu diplot bersama-sama dengan min ± sd (n=3 replika). Eksperimen diulang dua kali. f–h, K18-hACE2 tikus telah diinokulasi secara intranasal dengan 1 × 104 PFU virus. Sampel paru-paru tikus yang dijangkiti dikumpulkan pada 2 dpi untuk pengesanan IHC bagi protein N (n=3 tikus) (f) atau untuk penentuan titer virus (n=4 tikus) (g). Dalam f, imej perwakilan pewarnaan H&E bronkiol N-positif ditunjukkan dalam inset. Nekrosis epitelium bronkiolar ditunjukkan dengan anak panah. Tiada bukti nekrosis dilihat dalam bronkiol tikus yang dijangkiti Omicron atau Omi-S/nsp6. Bar skala, 100 µm. Graf kanan dalam f menunjukkan peratusan bronkiol N-positif dalam paru-paru tikus yang dijangkiti. Setiap titik mewakili tetikus yang dijangkiti. h, Kemandirian tikus yang dijangkiti dipantau setiap hari selama 14 hari. Tikus yang kehilangan 20% berat badan awalnya telah dibunuh. Kepentingan statistik ditentukan menggunakan ujian t dua ekor, tidak berpasangan dengan pembetulan Welch (a–g) dan ujian peringkat log (Mantel-Cox) (h). *P <0.05, **P <0.01, ***P <0.001 dan ****P <0.0001; NS, tidak penting.

RBM protein S memacu pelarian vaksin Omicron

Sebilangan besar literatur telah memberikan bukti tentang pelarian Omicron secara meluas daripada imuniti humoral yang disebabkan oleh vaksin14,19. Untuk menentukan kawasan S yang dikaitkan dengan fenotip pelarian imun Omicron, kami mula-mula membandingkan aktiviti peneutralan in vitro sera daripada individu yang divaksin terhadap WT SARS-CoV-2 (USA-WA1/20 20), Omi-S dan Omicron. Sera yang dikumpul dalam masa dua bulan selepas dos kedua mRNA-1273 (Vaksin mRNA moden; n=12) atau BNT162b2 (vaksin mRNA Pfizer-BioNTech; n=12) dimasukkan (Data Lanjutan Jadual 1). Kami melakukan ujian peneutralan berbilang kitaran menggunakan tetapan di mana virus dan sera meneutralkan hadir pada setiap masa, meniru situasi dalam individu seropositif. Semua sera kurang meneutralkan Omicron, dengan 11.1-lipatan (julat: 4.4-lipat kepada 81.2-lipat; P < 0.0001) rendah separuh pencairan peneutralan maksimum (ND50) untuk Omicron berbanding dengan WA1 (Rajah 4a, b). Malah, kira-kira 80% sampel tidak meneutralkan sepenuhnya Omicron pada kepekatan tertinggi yang diuji (Data Lanjutan Rajah 10). Terutama, Omi-S mempamerkan nilai ND50 yang sama kepada Omicron (11.5-lipat lebih rendah daripada WA1; P <0.0001) (Rajah 4a,b), menunjukkan bahawa protein Omicron S, apabila digabungkan ke dalam WT virus, berkelakuan sama seperti dalam Omicron.

Rajah 4|Peranan S dalam rintangan imun Omicron. Nilai ND50 untuk WA1, Omi-S dan Omicron dalam sera daripada individu yang menerima dua suntikan vaksin Moderna (penderma 1–12) atau Pfizer (penderma 13–24) (butiran lanjut sera disediakan dalam Extended Jadual Data 1; lengkung individu ditunjukkan dalam Data Lanjutan Rajah 10). b, Trajektori nilai ND50 terhadap WA1, Omi-S dan Omicron (data daripada a diplot). Perubahan lipatan dalam nilai ND50 ditunjukkan (n=24 sampel serum). c–f, Skema virus chimeric (kiri; c, d) dan mutan (kiri; e, f). Penomboran asid amino untuk mutan WA1 dalam e adalah berdasarkan jujukan WA1 S, manakala penomboran untuk mutan Omicron dalam f adalah berdasarkan jujukan Omicron S. Enam daripada 24 sera (3 dari Moderna dan 3 dari Pfizer) telah diuji. Setiap sampel serum diwakili oleh titik warna tertentu. Data diplot sebagai perubahan lipatan virus ibu bapa. Kepentingan statistik ditentukan menggunakan ujian-t dua ekor, tidak berpasangan dengan pembetulan Welch. *P <0.05, **P <0.01, ***P <0.001 dan ****P <0.0001; NS, tidak penting.

Protein SARS-CoV-2 S terdiri daripada dua domain: domain S1, yang berinteraksi dengan reseptor ACE2 dan domain S2, yang bertanggungjawab untuk pelakuran membran32. Dalam domain S1 terdapat domain terminal N (NTD) dan domain pengikat reseptor (RBD), yang mengandungi motif pengikat reseptor (RBM) yang membuat hubungan langsung dengan reseptor ACE233. NTD Omicron S mempunyai 11 perubahan asid amino, termasuk 6 pemadaman dan satu 3-sisipan panjang asid amino, manakala RBD mengandungi 15 mutasi, 10 daripadanya tertumpu dalam RBM (Extended Data Rajah 1). Kedua-dua NTD dan hos RBD meneutralkan epitopes34–37, tetapi RBD adalah imunodominan dan mewakili sasaran utama aktiviti peneutralan yang terdapat dalam sera imun SARS-CoV-237,38. Untuk menentukan sama ada fenotip rintangan peneutralan Omicron disebabkan oleh mutasi dalam domain tertentu protein S, kami menghasilkan dua kumpulan virus chimeric. Kumpulan pertama terdiri daripada virus WA1 yang membawa NTD, RBD atau RBM Omicron (Rajah 4c), dan kumpulan kedua terdiri daripada virus Omi-S yang mengandungi NTD, RBD atau RBM WA1 (Rajah 4d). Ujian peneutralan menunjukkan bahawa mutasi dalam RBM adalah punca utama rintangan Omicron terhadap imuniti humoral yang disebabkan oleh vaksin: menggantikan RBM WA1 dengan Omicron mengurangkan ND50 sebanyak 5.4-kali ganda (P < 0.0001), dan, sebaliknya, menggantikan RBM Omi-S dengan WA1 meningkatkan ND50 sebanyak 5.6-kali ganda (P=0.0003) (Rajah 4c,d). Hakikat bahawa tiada virus RBM-swap mencapai perbezaan sekitar 11-lipat ganda yang dilihat antara WA1 dan Omi-S menunjukkan bahawa mutasi di bahagian lain S juga menyumbang kepada rintangan vaksin.

Untuk menyiasat sama ada mutasi tertentu dalam pelarian vaksin pemacu Omicron RBM, kami menghasilkan dua panel tambahan virus rekombinan, satu dengan WA1 S yang membawa mutasi Omicron RBM, sama ada secara tunggal atau gabungan (Rajah 4e), dan satu lagi dengan Omicron S tidak mempunyai ciri yang sama. set mutasi (Rajah 4f). Dua mutan WA1-mutant 3 (dengan penggantian E484A) dan mutan 4 (mengandungi kelompok lima penggantian Q493R, G496S, Q498R, N501Y dan Y505H)-menunjukkan penurunan sederhana tetapi ketara secara statistik sebanyak 1.4-kali ganda ( P=0.0002) dan 1.8-lipatan (P=0.0003) dalam nilai ND50, masing-masing, berbanding dengan WA1 (Rajah 4e). Sebaliknya diperhatikan apabila mutasi ini dikeluarkan daripada Omicron S; mutan Omicron 3 (tanpa penggantian E484A) dan mutan 4 (tanpa Q493R, G496S, Q498R, N501Y dan Y505H) mempunyai 1.9-lipatan (P=0.0082) dan 3.{{38} }}lipatan (P=0.0025) nilai ND50 lebih tinggi berbanding dengan Omicron (Rajah 4f). Oleh kerana tiada mutan yang menangkap keseluruhan fenotip Omicron, kami menganggap bahawa pelarian vaksin adalah kesan kumulatif mutasi yang diedarkan sepanjang panjang protein S. Ada kemungkinan mutasi mengubah konformasi Omicron S sedemikian rupa sehingga kebanyakan epitop peneutralan imunodominan terganggu dan menjadi tidak tersedia untuk peneutralan.

cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun

Perbincangan

Kajian ini memberikan cerapan utama tentang protein virus yang menyumbang kepada kepatogenisitas-2 SARS-CoV. Kami menunjukkan bahawa S, protein yang paling bermutasi dalam Omicron, mempunyai peranan yang tidak lengkap dalam pengecilan Omicron. Dalam ujian jangkitan berasaskan sel, virus Omi-S mempamerkan kecekapan replikasi perantaraan antara virus leluhur dan Omicron. Begitu juga, dalam tikus K18-hACE2, Omi-S berbeza dengan Omicron yang tidak membawa maut dan membawa kepada 80% kematian; virus nenek moyang menyebabkan 100% kematian pada tikus ini. Terutama, apabila kita menggabungkan mutasi S dengan mutasi dalam nsp6, virus itu menunjukkan fenotip yang dilemahkan yang sebahagian besarnya menyerupai Omicron, menunjukkan bahawa kedua-dua protein ini adalah penentu utama patogenik Omicron. Kajian masa depan akan menguraikan mekanisme yang mana mutasi nsp6 mempengaruhi replikasi virus.

Satu potensi had kajian kami ialah penggunaan K18-hACE2 tikus untuk kajian patogenesis dan bukannya model primat yang mempunyai lebih banyak persamaan dengan manusia39. Walau bagaimanapun, perlu diambil perhatian bahawa tikus K18-hACE2 ialah model yang mantap untuk menyiasat fenotip maut SARS-CoV-24,31. Walaupun tikus ini mengalami patologi paru-paru selepas jangkitan SARS-CoV{10}}, kematian telah dikaitkan dengan penglibatan sistem saraf pusat akibat neuroinvasion dan penyebaran virus31,40. Hakikat bahawa jangkitan K{13}}hACE2 tikus dengan Omi-S, tetapi tidak dengan Omicron, menimbulkan tanda neurologi (contohnya, postur bongkok dan kurang responsif) menunjukkan bahawa sifat neuroinvasion dipelihara dalam Omi-S, mungkin hasil daripada kecekapan replikasi yang lebih tinggi, dan bahawa penentu sifat ini terletak di luar protein S. Penemuan ini konsisten dengan kajian terdahulu yang menunjukkan bahawa hamster yang dijangkiti Omi-S menumpahkan lebih banyak virus dan kehilangan lebih banyak berat daripada mereka yang dijangkiti Omicron, menunjukkan bahawa mutasi di luar S menyumbang kepada patogenikiti Omicron41 yang dilemahkan.

Kami mendapati bahawa walaupun virus nenek moyang kebanyakannya mereplikasi dalam alveoli paru-paru dan menyebabkan hanya jangkitan bronkiol yang jarang berlaku pada tikus K18-hACE2, kedua-dua Omi-S dan Omicron mempamerkan peningkatan kecenderungan untuk mereplikasi dalam epitelium bronkiolar, menunjukkan bahawa S protein bertanggungjawab untuk tropisme yang berubah. Mekanisme di sebalik suis ini tidak diketahui, tetapi ada kemungkinan bahawa Omicron S lebih cekap daripada WT S dalam menggunakan cathepsin B atau cathepsin L (rujuk 25,42,43), yang membentuk laluan kemasukan virus aktif dalam bronkiol dan saluran udara lain sel41. Sebaliknya, kemasukan SARS-CoV-2 ke dalam sel epitelium alveolar terutamanya didorong oleh TMPRSS2 (rujuk 28,44), yang mana Omicron S kekurangan penggunaan25,45, yang membawa kepada jangkitan yang lemah pada sel-sel ini4,5 ,25,43. Penemuan ini mungkin menjelaskan patologi paru-paru yang dilemahkan yang disebabkan oleh Omicron.

manfaat cistanche-menguatkan sistem imun

Omicron nsp6 mempunyai dua tapak yang diubah berbanding prototaip SARS CoV-2 Wuhan-Hu-1 pencilan: penghapusan tiga asid amino (LSG, kedudukan 105–107) dan penggantian I189V (Data Lanjutan Rajah 9). Beberapa fungsi nsp6 dalam replikasi coronavirus telah diterangkan; ketua di antara mereka ialah biogenesis vesikel membran dua kali (DMV), yang mewakili tapak sintesis RNA virus46-50. Kajian terdahulu menunjukkan bahawa SARS-CoV-2 DMV dijana terutamanya oleh tindakan bersepadu tiga protein virus: nsp3, nsp4 dan nsp6; walaupun nsp3 dan nsp4 mencukupi untuk pembentukan DMV, nsp6 menghubungkan DMV ini dengan retikulum endoplasma dan menyalurkan komunikasi penting antara struktur ini46. Sama ada buruj mutasi dalam Omicron nsp6 mempengaruhi pembentukan atau fungsi DMV memerlukan siasatan lanjut. Nsp6 juga mengaktifkan pengeluaran sitokin bergantung kepada NLR3-dan pyroptosis dalam paru-paru pesakit COVID-19, berfungsi sebagai faktor virulensi utama47. Daripada makluman, varian nsp6 yang dikaitkan dengan COVID tanpa gejala-19 mempamerkan keupayaan yang berkurangan untuk mendorong pyroptosis47, menyebabkan spekulasi bahawa mutasi dalam Omicron nsp6 juga mungkin mempengaruhi pyroptosis. Kajian mekanistik terperinci akan diperlukan untuk membedah kesan mutasi Omicron pada fungsi nsp6.

Pada masa ini tidak diketahui sama ada mutasi dalam S dan nsp6 berfungsi secara bersama antara satu sama lain untuk memacu pengecilan Omicron. Memandangkan Omicron S menunjukkan kecenderungan yang lebih tinggi untuk bronkiol, ada kemungkinan S bertanggungjawab terhadap tropisme virus yang diubah, manakala mutasi bukan pancang-termasuk dalam nsp6-adalah penyesuaian kepada persekitaran tisu yang berubah. Perlu dinyatakan bahawa walaupun nsp6 nampaknya merupakan protein bukan spike utama di sebalik pelemahan Omicron, sumbangan protein virus lain tidak boleh diketepikan sepenuhnya. Percubaan in vitro yang mengkaji peranan mutasi bukan spike semuanya dijalankan dalam sel ACE2/TMPRSS2/Caco-2. Menggunakan jenis sel lain yang lebih cekap imun boleh mendedahkan kesan mutasi bukan spike lain juga. Di samping itu, virus chimeric kami mengandungi Omicron S yang dipasangkan dengan hanya satu protein bukan spike pada satu masa, yang mengehadkan interaksi epistatik jarak jauh antara mutasi dalam berbilang protein virus.

manfaat cistanche untuk lelaki-menguatkan sistem imun

Kajian kami menunjukkan bahawa mutasi dalam RBM Omicron S adalah penentu utama pelarian Omicron daripada meneutralkan antibodi, walaupun mutasi di kawasan lain S juga menyumbang. Dalam RBM, kami mengenal pasti dua titik panas mutasi, yang memberikan Omicron S keupayaan untuk menentang peneutralan: satu mengandungi penggantian E484A dan satu lagi mengandungi sekumpulan lima penggantian-Q493R, G496S, Q498R, N501Y dan Y505H. Penggantian E484A telah ditunjukkan untuk melarikan diri dari peneutralan oleh sera pemulihan51. Selain itu, pemodelan struktur mencadangkan bahawa beberapa antibodi monoklonal terapeutik mewujudkan jambatan garam yang sangat stabil dengan sisa E484, kehilangan pengikatannya sepenuhnya apabila residu ini ditukar kepada A atau selepas perubahan Q493K dan Y505H52. Begitu juga, pemetaan sisa RBM yang berinteraksi secara langsung dengan 49 antibodi peneutral yang diketahui mendedahkan N440, G446, S477, dan T478 sebagai interaksi frekuensi rendah, N501, Y505, dan Q498 sebagai interaksi frekuensi sederhana, dan E484 dan Q493 sebagai interaksi frekuensi tinggi. , selaras dengan keputusan ujian peneutralan kami. Terutama, walaupun potensi pengikat antibodi Omicron S terjejas54, kapasiti pengikatan reseptornya adalah utuh. Malah, Omicron RBD mempunyai pertalian yang lebih tinggi untuk ACE2 berbanding dengan Wuhan-Hu-1 dan Delta RBD25. Ini menunjukkan bahawa mutasi dalam Omicron S telah berkembang sedemikian rupa sehingga menghalang pengikatan antibodi tetapi mengekalkan penglibatan reseptor. Ini membuka kemungkinan untuk menyasarkan kawasan terpelihara dan terkandas dari segi struktur S yang terlibat dalam pengiktirafan ACE2 untuk reka bentuk vaksin spektrum luas untuk mengawal pandemik-19 COVID.

rujukan

1. Liu, L. et al. Pengelakan antibodi yang ketara ditunjukkan oleh varian Omicron bagi SARS-CoV-2. Alam 602, 676–681 (2022).

2. Planas, D. et al. Banyak pelarian SARS-CoV-2 Omicron kepada peneutralan antibodi. Alam 602, 671–675 (2022).

3. Schmidt, F. et al. Peneutralan plasma bagi varian Omicron-2 SARS-CoV. N. Inggeris. J. Med. 386, 599–601 (2022).

4. Shuai, H. et al. Replikasi dan patogenik SARS-CoV-2 B.1.1.529 Omicron yang dilemahkan. Alam 603, 693–699 (2022).

5. Halfmann, PJ et al. Virus SARS-CoV-2 Omicron menyebabkan penyakit yang dilemahkan pada tikus dan hamster. Alam 603, 687–692 (2022).

6. Lewnard, JA et al. Hasil klinikal yang dikaitkan dengan varian SARS-CoV-2 Omicron (B.1.1.529) dan jangkitan subvarian BA.1/BA.1.1 atau BA.2 di California Selatan. Nat. Med. 28, 1933–1943 (2022).

7. Wolter, N. et al. Penilaian awal keterukan klinikal varian omicron-2 SARS-CoV di Afrika Selatan: kajian pautan data. Lancet 399, 437–446 (2022).

8. Ulloa, AC, Buchan, SA, Daneman, N. & Brown, KA Anggaran keterukan varian SARS-CoV-2 Omicron di Ontario, Kanada. J. Am. Med. Prof. 327, 1286–1288 (2022).

9. Uraki, R. et al. Pencirian pengasingan SARS-CoV-2 Omicron BA.4 dan BA.5 dalam tikus. Alam 612, 540–545 (2022).

10. Uraki, R. et al. Pencirian dan kerentanan antivirus bagi SARS-CoV-2 Omicron BA.2. Alam 607, 119–127 (2022).

11. Dyer, O. Covid-19: Omicron menyebabkan lebih banyak jangkitan tetapi lebih sedikit kemasukan ke hospital berbanding Delta, rancangan data Afrika Selatan. Br. Med. J. 375, n3104 (2021).

12. Sigal, A. Penyakit yang lebih ringan dengan Omicron: adakah ia virus atau imuniti yang sedia ada? Nat. Rev. Immunol. 22, 69–71 (2022).

13. SIAPA. Menjejaki varian SARS-CoV-2 https://www.who.int/en/activities/tracking-SARS CoV-2-variants/ (2022).

14. Cele, S. et al. Omicron secara meluas tetapi tidak sepenuhnya terlepas daripada peneutralan Pfizer BNT162b2. Alam 602, 654–656 (2022).

15. Gu, H. et al. Kemungkinan penularan varian omicron-2 SARS-CoV di hotel kuarantin, Hong Kong, China, November 2021. Emerg. Jangkitan. Dis. 28, 460–462 (2022).

16. Iuliano, AD et al. Trend dalam keterukan penyakit dan penggunaan penjagaan kesihatan semasa tempoh varian Omicron awal berbanding dengan tempoh penularan tinggi SARS-CoV-2 sebelumnya- Amerika Syarikat, Disember 2020–Januari 2022. Morb. fana. Wkly Rep. 71, 146–152 (2022).

17. CDC. Penjejak Data COVID https://covid.cdc.gov/covid-data-tracker/#variant-proportions (2022).

18. Taylor, L. Covid-19: Omicron memacu rekod mingguan tinggi dalam jangkitan global. Br. Med. J. 376, o66 (2022).

19. Dejnirattisai, W. et al. SARS-CoV-2 Omicron-B.1.1.529 membawa kepada pelarian meluas daripada meneutralkan tindak balas antibodi. Sel 185, 467–484 (2022).

20. Suzuki, R. et al. Fusogenik dan patogenikiti SARS-CoV-2 varian Omicron yang dilemahkan. Alam 603, 700–705 (2022).

21. Smyth, DS et al. Menjejaki salasilah SARS-CoV-2 samar yang dikesan dalam air sisa NYC. Nat. Commun. 13, 635 (2022).

22. Kirby, AE et al. Nota dari lapangan: bukti awal varian SARS-CoV-2 B.1.1.529 (Omicron) dalam air sisa komuniti-Amerika Syarikat, November–Disember 2021. Morb. fana. Wkly Rep. 71, 103–105 (2022).

23. Herrmann, A. et al. Pengklonan genom SARS-CoV-2 bebas laluan dan mutagenesis menggunakan penggabungan semula merah. Int. J. Mol. Sci. 22, 10188 (2021).

24. Liu, G. & Gack, MU Kaedah berasaskan tindak balas sambungan polimerase bulat yang dioptimumkan untuk analisis fungsi SARS-CoV-2. Pracetak di https://doi.org/10.1101/2022.11.26.518005 (2022).

25. Meng, B. et al. Penggunaan TMPRSS2 yang diubah oleh SARS-CoV-2 Omicron memberi kesan tropisme dan fusogenisitas. Alam 603, 706–714 (2022).

26. Willett, BJ et al. SARS-CoV-2 Omicron ialah varian pelarian imun dengan laluan kemasukan sel yang diubah. Nat. mikrobiol. 7, 1161–1179 (2022).

27. Martines, RB et al. Patologi dan patogenesis SARS-CoV-2 yang dikaitkan dengan penyakit coronavirus maut, Amerika Syarikat. Muncul. Jangkitan. Dis. 26, 2005–2015 (2020).

28. Huang, J. et al. Jangkitan SARS-CoV-2 sel induk pluripotent yang berasal dari sel alveolar paru-paru manusia jenis 2 menimbulkan tindak balas keradangan epitelium-intrinsik yang cepat. Sel Stem Sel 27, 962–973 (2020).

29. Mulay, A. et al. Jangkitan SARS-CoV-2 epitelium paru-paru manusia primer untuk pemodelan-19 COVID dan penemuan dadah. Sel Rep. 35, 109055 (2021).

30. Liu, S., Selvaraj, P., Sangare, K., Luan, B. & Wang, TT Spike pengecilan bebas protein SARS-CoV-2 varian Omicron dalam tikus makmal. Sel Rep. 40, 111359 (2022).

31. Carossino, M. et al. Penyebaran saraf maut dan tropisme SARS-CoV-2 dalam tikus K18-hACE2 hanya sebahagiannya bergantung pada ekspresi hACE2. Virus 14, 535 (2022).

32. Huang, Y., Yang, C., Xu, XF, Xu, W. & Liu, SW Sifat struktur dan fungsi SARS CoV-2 spike protein: potensi pembangunan ubat antivirus untuk COVID-19 . Acta Pharmacol. Dosa. 41, 1141–1149 (2020).

33. Lan, J. et al. Struktur domain pengikat reseptor lonjakan SARS-CoV-2 terikat pada reseptor ACE2. Alam 581, 215–220 (2020).

34. Chi, X. et al. Antibodi manusia yang meneutralkan terikat pada domain terminal N bagi protein Spike SARS-CoV-2. Sains 369, 650–655 (2020).

35. Voss, WN et al. Pengecaman IgG lazim, pelindung dan konvergen bagi epitop lonjakan SARS-CoV-2 bukan RBD. Sains 372, 1108–1112 (2021).

36. Premkumar, L. et al. Domain pengikat reseptor protein spike virus ialah sasaran antibodi imunodominan dan sangat spesifik dalam pesakit SARS-CoV-2. Sci. Immunol. 5, eabc8413 (2020).

37. Ju, B. et al. Antibodi peneutral manusia yang ditimbulkan oleh jangkitan SARS-CoV-2. Alam 584, 115–119 (2020).

38. Piccoli, L. et al. Memetakan tapak peneutralan dan imunodominan pada domain pengikat reseptor lonjakan SARS-CoV-2 oleh serologi resolusi tinggi berpandukan struktur. Sel 183, 1024–1042 (2020).

39. Chang, MC, Hild, S. & Grieder, F. Model primat bukan manusia untuk penyelidikan SARS-CoV-2: pertimbangkan alternatif kepada kera. Makmal Anim. 50, 113–114 (2021).

40. Kumari, P. et al. Neuroinvasion dan ensefalitis berikutan inokulasi intranasal SARS CoV-2 dalam K18-hACE2 tikus. Virus 13, 132 (2021).

41. Peacock, TP et al. Laluan masuk yang diubah dan jarak antigen bagi peta varian SARS-CoV-2 Omicron untuk memisahkan domain protein spike. Pracetak di https://doi.org/ 10.1101/2021.12.31.474653 (2022).

42. Padmanabhan, P. & Dixit, NM Memodelkan cara penggunaan laluan kemasukan sel yang diubah oleh varian SARS-CoV-2 Omicron boleh menjejaskan keberkesanan dan sinergi perencat TMPRSS2 dan cathepsin B/L. Pracetak di https://doi.org/10.1101/2022.01.13.476267 (2022).

43. Hui, KPY et al. SARS-CoV-2 Replikasi varian Omicron dalam bronkus manusia dan paru-paru ex vivo. Alam 603, 715–720 (2022).

44. Grau-Exposito, J. et al. Penilaian kemasukan SARS-CoV-2, keradangan dan terapeutik baharu dalam sel tisu paru-paru manusia. Pathog PLoS. 18, e1010171 (2022).

45. Zhao, H. et al. Varian SARS-CoV-2 Omicron menunjukkan aktiviti replikasi dan gabungan yang kurang cekap jika dibandingkan dengan varian Delta dalam sel yang diekspresikan2-TMPRSS. Muncul. Jangkitan Mikrob. 11, 277–283 (2022).

46. ​​Ricciardi, S. et al. Peranan NSP6 dalam biogenesis organel replikasi-2 SARS-CoV. Alam 606, 761–768 (2022).

47. Sun, X. et al. SARS-CoV-2 protein bukan struktur 6 mencetuskan pyroptosis bergantung3-NLRP dengan menyasarkan ATP6AP1. Kematian Sel Berbeza. 29, 1240–1254 (2022).

48. Cottam, EM, Whelband, MC & Wileman, T. Coronavirus NSP6 menyekat pengembangan autofagosom. Autophagy 10, 1426–1441 (2014).

49. Benvenuto, D. et al. Analisis evolusi SARS-CoV-2: bagaimana mutasi protein bukan struktur 6 (NSP6) boleh menjejaskan autophagy virus. J. Jangkitan. 81, e24–e27 (2020).

50. Gosert, R., Kanjanahaluethai, A., Egger, D., Bienz, K. & Baker, SC RNA replikasi virus hepatitis tikus berlaku pada vesikel dua membran. J. Virol 76, 3697–3708 (2002).

51. Liu, Z. et al. Pengenalpastian mutasi lonjakan SARS-CoV-2 yang melemahkan peneutralan antibodi monoklonal dan serum. Mikrob Hos Sel 29, 477–488 (2021).

52. Shah, M. & Woo, HG Omicron: varian SARS-CoV-2 yang banyak bermutasi mempamerkan ikatan yang lebih kuat kepada ACE2 dan berpotensi melarikan diri daripada antibodi terapeutik COVID-19 yang diluluskan. Depan. Immunol. 12, 830527 (2021).

53. Ye, G., Liu, B. & Li, F. Cryo-EM struktur ektodomain protein lonjakan omicron-2 SARS-CoV. Nat. Commun. 13, 1214 (2022).

54. Carreno, JM et al. Aktiviti serum pemulihan dan vaksin terhadap SARS-CoV-2 Omicron. Alam 602, 682–688 (2022).