Tapak Kerentanan Pada SARS-CoV-2 Spike Mendorong Antibodi Perlindungan Secara Luas Terhadap Subvarian Omikron Antigen yang Berbeza
Nov 30, 2023
Evolusi pesat varian Omicron sindrom pernafasan akut teruk coronavirus 2 (SARS-CoV-2) telah menekankan keperluan untuk mengenal pasti antibodi dengan keupayaan peneutralan luas untuk memaklumkan terapi monoklonal dan strategi vaksinasi masa hadapan. Di sini, kami mengenal pasti S728-1157, antibodi peneutral secara meluas (bnAb) yang menyasarkan tapak pengikat reseptor (RBS) yang diperoleh daripada individu yang sebelum ini dijangkiti WT SARS-CoV-2 sebelum penyebaran varian kebimbangan (VOC). S728-1157 menunjukkan peneutralan silang yang luas bagi semua varian dominan, termasuk D614G, Beta, Delta, Kappa, Mu dan Omicron (BA.1/BA.2/BA.2.75/BA.4/BA.5/ BL.1/XBB). Tambahan pula, S728-1157 melindungi hamster daripada cabaran in vivo dengan virus WT, Delta dan BA.1. Analisis struktur menunjukkan bahawa antibodi ini menyasarkan epitope kelas 1/RBS-A dalam domain pengikatan reseptor melalui pelbagai interaksi hidrofobik dan kutub dengan rantaian berat yang saling melengkapi menentukan rantau 3 (CDR-H3), sebagai tambahan kepada motif biasa dalam CDR-H1/ CDR-H2 antibodi kelas 1/RBS-A. Yang penting, epitope ini lebih mudah diakses dalam keadaan terbuka dan prefusi, atau dalam binaan pancang stabil heksaprolin (6P), berbanding dengan binaan diprolin (2P). Secara keseluruhannya, S728-1157 menunjukkan potensi terapeutik yang luas dan mungkin memaklumkan reka bentuk vaksin dipacu sasaran terhadap varian SARS-CoV-2 masa hadapan.
cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun
pengenalan
Sejak permulaan wabak pada Disember 2019, virus coronavirus 2 (SARS-CoV-2) teruk sindrom pernafasan akut yang teruk telah menyebabkan lebih 660 juta kes penyakit coronavirus 2019 (COVID-19) dan lebih 6.5 juta kematian di seluruh dunia. Walaupun perkembangan pesat dan pengedaran vaksin dan terapeutik telah mengekang kesan COVID-19 pada tahap yang besar, kemunculan varian kebimbangan (VOC) yang beredar terus mewakili ancaman besar disebabkan potensi pengelakan imun selanjutnya. dan peningkatan patogenik. Varian D614G adalah varian terawal yang muncul dan menjadi lazim secara universal selepas itu. Berbanding dengan WT, varian D614G mempamerkan peningkatan kebolehtransmisian daripada peningkatan patogenik dan oleh itu tidak mungkin mengurangkan keberkesanan vaksin dalam ujian klinikal (1). Antara kemunculan D614G hingga Oktober 2021, 4 VOC penting tambahan telah berkembang di seluruh dunia, termasuk Alpha, Beta, Gamma dan Delta. Antara varian ini, Delta menjadi ancaman global yang serius kerana kebolehtransmisiannya, peningkatan keterukan penyakit, dan pengelakan imun separa, seperti yang ditunjukkan oleh pengurangan keupayaan serum poliklonal dan mAbs untuk meneutralkan ketegangan ini (2-6). Tidak lama selepas itu, pada November 2021, varian Omicron telah dikenal pasti dan diumumkan sebagai novel VOC. Varian ini mempunyai bilangan mutasi terbesar setakat ini dan kelihatan merebak lebih cepat daripada strain sebelumnya (7, 8). Pada masa ini, terdapat pelbagai subgarisan Omicron yang membawa kepada kes COVID-19 baharu, dengan BQ.1, BQ.1.1 dan XBB.1.5 menjadi dominan berbanding BA.5 dan menyumbang kebanyakan kes baharu di seluruh dunia pada masa itu daripada penulisan. Varian Omicron boleh terlepas daripada pengiktirafan oleh imuniti berkaitan vaksin COVID{28}} pada tahap yang berbeza-beza, dengan itu mengurangkan dengan ketara potensi peneutralan antibodi serum daripada individu yang pulih, divaksin mRNA sepenuhnya dan individu yang dirangsang dengan bivalen WT/BA.5 baharu vaksin mRNA (9, 10). Begitu juga, varian Omicron dapat melepaskan diri daripada pengikatan beberapa mAb terapeutik kebenaran penggunaan kecemasan (EUA), walaupun ini sebelum ini telah terbukti berkesan terhadap VOC terdahulu (10-12). Disebabkan penurunan peneutralan terhadap Omicron dan ancaman berterusan VOC masa hadapan, terdapat keperluan mendesak untuk mengenal pasti antibodi peneutralan yang luas dan kuat yang boleh melindungi daripada pelbagai keturunan SARS-CoV-2 yang berubah-ubah. Dalam kajian ini, kami mengenal pasti mAb domain mengikat reseptor yang kuat-reaktif (RBD-reaktif) daripada darah periferi individu SARS-CoV-2-pemulihan yang meneutralkan Alpha, Beta, Kappa, Delta, Mu dengan berkesan, dan varian Omicron (BA.1, BA.2, BA.2.75, BA.4, BA.5, BL.1 dan XBB). MAb, S728-1157 ini, telah mengurangkan beban virus BA.1 Omicron, Delta dan WT dengan ketara dalam paru-paru dan mukosa hidung berikutan cabaran in vivo dalam hamster. S728-1157 mengikat tapak pengikat reseptor (RBS) yang terdedah sepenuhnya apabila RBD pada pancang berada dalam konformasi atas. mAb menggunakan motif yang terdapat dalam CDR-H1 dan CDR-H2 yang biasa kepada antibodi IGHV3-53/3-66 kelas 1/RBS-A (13, 14), tetapi juga melalui hubungan unik yang meluas dengan CDR -H3 untuk mengelakkan mutasi dalam pancang VOC. Ini menunjukkan bahawa reka bentuk rasional bagi rangsangan vaksin masa hadapan yang meliputi varian Omicron harus diubah suai untuk menampilkan lonjakan yang stabil dalam konfigurasi yang kebanyakannya meningkat untuk mendorong secara optimum kelas 1/RBS-A mAbs yang mempunyai ciri CDR-H3 yang serupa.
manfaat cistanche-menguatkan sistem imun
Keputusan
Pengasingan mAbs RBD-reaktif yang mempamerkan pelbagai corak peneutralan dan potensi. Sebelum penyebaran garis keturunan Omicron, kami sebelum ini mencirikan 43 mAbs yang menyasarkan epitop yang berbeza pada protein spike, termasuk domain N-terminal (NTD), RBD, dan subunit 2 (S2). Tiada satu pun daripada antibodi ini dapat meneutralkan varian SARS-CoV-2 yang beredar pada masa itu (15). Dalam kajian ini, panel tambahan mAbs RBD-reaktif telah dinyatakan daripada 3 individu yang bertindak balas tinggi yang memasang tindak balas IgG anti-spike yang teguh, seperti yang ditakrifkan sebelum ini (16) (Jadual Tambahan 1 dan 3; bahan tambahan tersedia dalam talian dengan artikel ini; https://doi.org/10.1172/JCI166844DS1). Walaupun perkadaran sel B pengikat RBD spike adalah serupa dalam responden tinggi berbanding dengan responden pertengahan dan rendah (Rajah 1, A-C), kadar hipermutasi somatik rantaian berat adalah jauh lebih besar dalam kumpulan responden tinggi (Rajah 1). , D, dan E), menunjukkan bahawa individu ini mungkin mempunyai potensi tertinggi untuk menjana mAbs reaktif silang yang kuat (16). Antibodi ini disiasat selanjutnya terhadap mutan RBD untuk mengenal pasti klasifikasi epitope mereka (17). Di antara 14 mAbs RBD-reaktif, kami mengenal pasti 4 kelas 2 mAbs, 2 kelas 3 mAbs, dan 8 mAbs tidak dikelaskan yang menunjukkan sedikit atau tiada pengurangan dalam mengikat terhadap mana-mana mutan RBD utama yang diuji (Rajah 1F). Untuk diperhatikan, antibodi kelas 2, kelas 3, dan kelas 4 kira-kira sepadan dengan epitop RBS BD, S309, dan CR3022 yang ditakrifkan dalam kajian terdahulu (13, 18). Kelas 2 dan 3 RBD mAbs tidak mengenali mutan RBD multivarian yang mengandungi penggantian K417N/E484K/L452R/ N501Y, RBD yang direka secara buatan untuk memasukkan mutasi utama untuk melarikan diri virus (17, 18), dan juga tidak menunjukkan sebarang kereaktifan silang kepada RBD SARS-CoV-1 dan sindrom pernafasan Timur Tengah (MERS)-CoV (Rajah 1F). Secara fungsional, kelas 2 dan 3 RBD mAbs meneutralkan varian D614G dan Delta dengan kuat, tetapi aktiviti meneutralkan lebih terhad terhadap Beta, Kappa dan Mu (Rajah 1G). Tiada antibodi kelas 2 atau 3 yang diuji meneutralkan sebarang varian Omicron yang diuji.
Sebaliknya, majoriti mAb yang tidak dikelaskan terikat pada multivarian RBD dan bertindak balas silang kepada SARS-CoV-1 RBD (Rajah 1F). Antaranya, kami mengenal pasti 3 mAb, S451-1140, S626-161 dan S728-1157, yang menunjukkan potensi peneutralan yang tinggi terhadap D614G dan Beta, Delta, Kappa, Mu dan silang yang dineutralkan silang. Omicron BA.1 dengan kepekatan perencatan 99% (IC99) dalam julat 20–2,500 ng/mL (Rajah 1G). Memandangkan potensi peneutralan luas 3 mAb ini, sebagai tambahan kepada platform ujian plak, kami juga melakukan aktiviti peneutralan terhadap BA.2.75, BL.1 (BA.2.75+R346T), BA.4 tulen, BA.5, dan virus XBB menggunakan ujian peneutralan pengurangan fokus (FRNT) (Rajah 1G). Daripada jumlah ini, S728-1157 memaparkan aktiviti peneutralan tinggi terhadap panel varian Omicron termasuk BA.1, BA.2, BA.4 dan BA.5, dengan IC99 sehingga 100 ng/mL seperti yang diukur dengan ujian plak. Senario serupa diperhatikan menggunakan FRNT, di mana S728-1157 mengekalkan aktiviti peneutralan tingginya terhadap BA.2.75, BL.1, BA.4, BA.5 dan XBB dengan IC50 dalam julat 8–300 ng /mL (Rajah 1G). S451-1140 meneutralkan BA.1, BA.2, BA.2.75 dan BL.1 dengan kuat, tetapi tidak BA.4 dan BA.5, seperti yang diperhatikan dalam kedua-dua platform ujian peneutralan. Sebaliknya, S626-161 tidak menunjukkan aktiviti meneutralkan terhadap varian Omicron di luar varian BA.1 (Rajah 1G). Walaupun S626-161 mempunyai potensi peneutralan yang lebih rendah terhadap VOC yang diuji berbanding 2 antibodi lain, ia adalah satu-satunya mAb yang menunjukkan kereaktifan silang bukan sahaja kepada SARS CoV-1 RBD tetapi juga mampu meneutralkan kelawar coronaviruses WIV-1 dan RsSHC014 (Rajah 1, F dan G). Data ini mencadangkan bahawa S626-161 mengiktiraf epitope terpelihara yang dikongsi antara keturunan arbovirus ini tetapi tiada dalam strain BA.2 dan kemudiannya. Selain itu, berbanding dengan S728-1157 dan S451-1140, S626-161 mempunyai CDR-H3 yang lebih panjang yang boleh memberikan keupayaan yang dipertingkatkan untuk mengenali tompok sisa yang sangat terpelihara yang dikongsi merentas arbovirus, seperti yang diterangkan. dalam kajian lepas (19) (Tambahan Rajah 1). Apabila membandingkan gen pembolehubah immunoglobulin heavy (IGHV) dan rantai ringan (IGLV atau IGKV) bagi 3 mAb ini dengan pangkalan data mAbs meneutralkan SARS-CoV{73}} yang tersedia (13, 15, 20–27), kami mendapati bahawa rantai berat gen pembolehubah yang digunakan oleh S728-1157 (IGHV3-66), S451-1140 (IGHV3-23) dan S626-161 (IGHV4-39) mempunyai dilaporkan sebelum ini mengekod beberapa antibodi SARS-CoV{85}} yang berpotensi meneutralkan RBD (21, 22, 28, 29). Walau bagaimanapun, hanya S728-1157 mempunyai gandingan gen pembolehubah rantai berat dan ringan yang unik yang belum dilaporkan dalam pangkalan data (Jadual Tambahan 3), menunjukkan bahawa ia bukan klonotaip awam.
Rajah 1. Pencirian mAbs RBD-reaktif yang diasingkan daripada COVID-19–individu yang sembuh
3 mAb (S451-1140, S626-161 dan S728-1157) ini telah dicirikan lebih lanjut untuk menentukan keluasan pengikatannya terhadap SARSCoV-2 VOC (Rajah 2, A dan B) . Lonjakan penstabilan prefusi yang mengandungi 2-penggantian prolin dalam subunit S2 (2P; diproline) telah ditunjukkan sebagai imunogen unggul berbanding lonjakan WT dan merupakan asas kepada beberapa SARS-CoV semasa-2 vaksin, termasuk vaksin berasaskan mRNA (30, 31). Baru-baru ini, protein spike stabil dengan 6 prolin (6P; hexaproline) dilaporkan meningkatkan ekspresi dan menjadi lebih stabil daripada binaan diprolin asal; akibatnya, ia telah dicadangkan untuk digunakan dalam vaksin COVID{17}} generasi akan datang (32, 33). Untuk menentukan sama ada terdapat perbezaan antigen di antara binaan spike diproline dan hexaproline, kedua-dua imunogen telah dimasukkan ke dalam panel ujian kami. Seperti yang diukur oleh ELISA, kami mendapati bahawa 3 mAbs terikat 6P-WT spike antigen ke tahap yang lebih tinggi berbanding dengan WT-2P spike (Rajah 2, A dan B). Kesemua 3 mAb menunjukkan pengikatan yang setanding dengan pancang virus Alpha, Beta, Gamma dan Delta, berbanding dengan WT-2P (Rajah 2, A dan B). Walau bagaimanapun, kereaktifan mengikat 3 mAb ini telah dikurangkan dengan ketara terhadap panel antigen keluarga Omicron (Rajah 2, B, dan C). Pengikatan S451-1140 adalah sensitif kepada mutasi yang terdapat dalam BA.1 dan BA.2, mengakibatkan pengurangan besar dalam pengikatan dan 31-penurunan peneutralan kali ganda terhadap varian ini berbanding dengan WT-2 Antigen P dan virus D614G, masing-masing (Rajah 2B). MAb peneutralan silang sarbekovirus, S626-161, juga menunjukkan 1.2- hingga 3.5-ikatan berkurangan kali ganda kepada antigen BA.1 pancang, yang mungkin menyumbang kepada {{45} } pengurangan kali ganda dalam aktiviti peneutralan terhadap BA.1 (Rajah 1G dan Rajah 2, B dan C). Untuk antibodi peneutral luas yang paling mujarab (bnAb), S728-1157, pengikatan kepada antigen Omicron dikurangkan ke tahap yang lebih rendah (antara 1.1- hingga 4.4-kali ganda) berbanding dengan WT-2P meningkat dan tidak terjejas dalam aktiviti meneutralkan (Rajah 1G dan Rajah 2, B dan C). Penurunan ketara dalam mAb yang meneutralkan Omicron yang mengikat pancang BA.1 mungkin disebabkan oleh perubahan dalam mobilitinya dan berkaitan dengan pembungkusan ketat struktur Omicron 3-RBD dan keutamaan untuk 1- sehingga RBD yang membantu dalam mengelakkan antibodi, seperti yang dilaporkan oleh kajian terdahulu (34). Mutasi penstabilan 2P dan 6P juga mempunyai kesan pembezaan dalam varian Omicron di mana kesemua 3 mAb menunjukkan lebih 2.8-kali ganda peningkatan pengikatan kepada pancang BA.1-6P berbanding dengan BA.1-2P versi, tetapi hanya meningkatkan sedikit pengikatan untuk melonjakkan versi BA.2 dan BA.4/5 6P berbanding dengan versi 2P mereka sebanyak 1.2 × hingga 1.4 ×, mencadangkan kebolehcapaian yang lebih baik sedikit bagi mAbs yang meneutralkan Omicron kepada versi heksapole, terutamanya untuk konstruk BA.1 pancang. Sebagai tambahan kepada ELISA, interferometri biolayer (BLI) digunakan untuk mengukur kadar pengikatan dan pemalar keseimbangan (kon, koff, dan KD) daripada 3 mAb ini kepada panel antigen spike (Tambahan Rajah 2). Kadar pengecaman bagi pengikatan antigen serpihan (Fab) kepada pancang heksaprolin ialah 1.5- hingga 3.3-lipat lebih cepat jika dibandingkan dengan pancang diprolin (Tambahan Rajah 2, B dan C), menunjukkan bahawa antibodi yang terikat kepada konstruk 6P lebih cepat daripada konstruk 2P. Ini mungkin telah dijangkakan jika epitop lebih mudah diakses pada RBD dalam keadaan terbuka pada spike heksaprolin. Kecuali untuk S626- 161, Fabs dipisahkan daripada spike heksaprolin dengan lebih perlahan (mempunyai koff yang lebih rendah) daripada spike diproline, sehingga keseluruhan KD menunjukkan bahawa S728-1157 dan S451-1140 terikat kepada pancang heksaprolin dengan pertalian yang lebih besar (Tambahan Rajah 2, B dan C). Peningkatan pengikatan pada pancang heksaprolin adalah lebih ketara untuk IgG utuh oleh model interaksi 1:2 seperti yang ditunjukkan oleh S728-1157 dan S451- 1140 mAbs, selaras dengan pendedahan berbilang epitop dengan penstabilan 6P yang membenarkan keghairahan yang lebih baik (Tambahan Rajah 2, A dan C). Secara keseluruhan, keputusan ini menunjukkan bahawa epitop yang disasarkan mungkin lebih mudah diakses pada lonjakan stabil 6P apabila RBD berada dalam keadaan terbuka. Analisis struktur seterusnya dilakukan untuk mengesahkan tekaan ini.
Rajah 2. Keluasan pengikatan mAbs yang meneutralkan Omicron
Analisis struktur meneutralkan secara meluas mAbs. Sebagai anggaran pertama epitop terikat, ujian persaingan ELISA digunakan untuk menentukan sama ada 3 mAb yang meneutralkan secara meluas ini berkongsi sebarang pertindihan dengan panel mAbs semasa kami, koleksi mAb dengan kekhususan epitop yang diketahui daripada kajian terdahulu (15, 25, 35) , dan 2 mAb lain yang sedang digunakan secara klinikal, LY-CoV555 (Eli Lilly) (36) dan REGN10933 (Regeneron) (37). Tapak pengikatan S451-1140 dan S728-1157 sebahagiannya bertindih dengan CC12.3 (23, 25), antibodi peneutral kelas 1 dan kebanyakan antibodi kelas 2, termasuk LY-CoV555 dan REGN10933, tetapi tidak dengan antibodi kelas 3 dan kelas 4 (Rajah 3A). S626-161 berkongsi pertindihan ketara di rantau pengikat dengan kelas 1 CC12.3, beberapa antibodi kelas 4, termasuk CR3022 dan antibodi tidak terkelas lain, sementara mempunyai beberapa pertindihan separa dengan beberapa kelas 2 dan antibodi kelas 3 tunggal (Rajah 3A). Secara analogi, ujian BLI pertandingan mendedahkan bahawa S451-1140 dan S728-1157 bersaing kuat antara satu sama lain untuk mengikat WT-6P, manakala S626-161 tidak (Rajah Tambahan 3). Secara keseluruhan, data ini mencadangkan bahawa S451-1140 dan S728-1157 mengiktiraf epitop serupa yang berbeza daripada S626-161.
Rajah 3. Mekanisme peneutralan luas S728-1157
Antibodi S728-1157 telah dikodkan oleh IGHV3-66 dan mempunyai rantau penentu komplementari yang singkat 3 (CDR-H3). Terutama, mAb yang mengikat RBS dalam mod pengikatan 1 (iaitu tapak RBS-A atau kelas 1), ditandakan oleh CC12.1, CC12.3, B38 dan C105 (13, 18, 23, 29, 38, 39), cenderung menggunakan IGHV3-53 atau 3-66 dan sensitif kepada mutasi VOC (40). Walau bagaimanapun, rantau CDR-H3 S728-1157 sangat berbeza daripada antibodi lain kelas ini, yang berpotensi menyumbang kepada aktivitinya yang lebih luas. Untuk memahami asas struktur peneutralan luas oleh S728-1157 di epitope ini, kami menyelesaikan struktur mikroskopi elektron cryo-elektron (cryo-EM) (Rajah 3B) IgG S728-1157 dalam kompleks dengan spike WT{ {31}}P-Mut7, versi spike WT{34}}P yang mempunyai ikatan disulfida interprotomer pada C705 dan C883, pada resolusi global lebih kurang 3.3 Å (Tambahan Rajah 4E). Menggunakan pengembangan simetri, klasifikasi terfokus, dan kaedah penghalusan, kami mencapai resolusi tempatan pada antara muka RBD-Fv kepada kira-kira 4 Å (Tambahan Rajah 4E dan Jadual Tambahan 8). Struktur kristal S728-1157 Fab ditentukan pada resolusi 3.1 Å dan digunakan untuk membina model atom pada antara muka RBD-Fv. Struktur kami mengesahkan bahawa S728-1157 mengikat epitope RBS-A (atau kelas 1) dalam konformasi RBD-up (Rajah 3B dan Rajah Tambahan 4E), serupa dengan IGHV3-53/{{55} yang lain } antibodi (Rajah 3C). Penyekatan sterik tapak pengikatan enzim penukar angiotensin 2 (ACE2) oleh S728-1157 menerangkan potensi peneutralan yang tinggi terhadap SARS-CoV-2. Motif 32NY33 dan motif 53SGGS56 (23) dalam S728-1157 CDR-H1 dan -H2 berinteraksi dengan RBD dalam cara yang hampir sama seperti CC12.3 (Tambahan Rajah 4, B dan C). Walau bagaimanapun, berbanding dengan VH 98DF99 dalam CC12.3, VH 98DY99 dalam S728-1157 CDR-H3 membentuk interaksi yang lebih meluas, termasuk kedua-dua interaksi hidrofobik dan polar, dengan RBD, yang mungkin menyumbang kepada peneutralan luas terhadap VOC (Rajah Jadual 3D dan Tambahan 6 dan 7). Diglisin VH 100GG101 dalam S728- 1157 CDR-H3 juga boleh memudahkan pengikatan yang lebih meluas berbanding dengan VH Y100 dalam CC12.3, mungkin disebabkan oleh fleksibiliti dalam sisa glisin yang membawa kepada konformasi berbeza pada hujung CDR -Gelung H3 dan anjakan relatif sisa pada 98DY99.
cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun
Klik di sini untuk melihat produk Cistanche Enhance Immunity
【Minta lebih lanjut】 E-mel:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Walaupun VOC Omicron mempunyai mutasi yang meluas dalam RBD, kebanyakan sisa ini tidak berinteraksi dengan S728-1157, kerana pengikatan masih diperhatikan (Tambahan Rajah 4A). Daripada model WT-6P-Mut7 + Fab S728-1157 spike kami, Y505 hingga VL Q31 dan E484 hingga VH Y99 diramalkan menghasilkan ikatan hidrogen (Tambahan Rajah 4D dan Jadual Tambahan 6 ), yang berpotensi untuk diganggu oleh mutasi Omicron Y505H dan E484A. Walau bagaimanapun, mutasi Y505H masih membenarkan ikatan hidrogen dengan VL Q31, dan mutasi E484A akan menambah rantai sisi hidrofobik lain berhampiran residu hidrofobik VL Y99, F456, dan Y489. Kenalan ini mungkin menerangkan, sebahagiannya, mekanisme yang membolehkan S728-1157 mengekalkan aktiviti peneutralan, walaupun dikurangkan, terhadap antigen BA.1 pancang (Rajah 1G dan Rajah 2B). Antigen BA.1 pula berkemungkinan berkaitan dengan mutasi Omicron yang mengubah landskap konformasi protein spike (34). Walau bagaimanapun, beberapa sisa bermutasi secara somatik, iaitu, VH L27, L28, R31, F58 dan VL V28 dan Q31, dalam S728-1157 terlibat dalam interaksi dengan SARS-CoV-2 RBD (Tambahan Rajah 1 dan Jadual Tambahan 7), yang mungkin juga menyumbang kepada kereaktifannya yang luas berbanding dengan CC12.3. Secara keseluruhan, kajian struktur kami mendedahkan asas peneutralan luas S728-1157 yang boleh menampung kebanyakan mutasi dalam SARS-CoV-2 VOC.
Rajah 4. Keberkesanan perlindungan bnAbs terhadap jangkitan SARS-CoV-2 dalam hamster.
S728-1157 mengurangkan replikasi SARS-CoV-2 BA.1 Omicron, Delta dan WT SARS-CoV-2 dalam hamster Syria. Untuk menilai keberkesanan perlindungan mAbs kami yang meneutralkan secara meluas, kami menggunakan model jangkitan hamster Syria keemasan yang telah digunakan secara meluas untuk SARS-CoV-2. Hamster menerima 5 mg/kg mAb ujian kami atau kawalan isotype yang menyasarkan antigen yang tidak berkaitan (ebolavirus glycoprotein) melalui suntikan intraperitoneal 1 hari selepas jangkitan virus SARS CoV-2. Tisu paru-paru dan hidung dikumpulkan 4 hari selepas jangkitan (Rajah 4A). Pentadbiran terapeutik S728-1157 mengakibatkan pengurangan titer varian WT, BA.1 Omicron dan Delta dalam kedua-dua turbinat hidung dan paru-paru hamster yang dijangkiti (Rajah 4, B–D). Menariknya, kesan S728-1157 dalam paru-paru adalah dramatik, mengurangkan beban virus WT dan BA.1 Omicron sebanyak kira-kira 104PFU, dengan titer virus bagi varian BA.1 Omicron telah dimansuhkan sepenuhnya (Rajah 4C). Berbeza dengan peneutralan in vitro (Rajah 1G), S451-1140 tidak mengurangkan replikasi virus BA.1 Omikron dalam paru-paru dan turbinat hidung, menunjukkan pemutusan antara peneutralan in vitro dan perlindungan in vivo untuk klon ini (Rajah 4E) . Sebagai perbandingan, pentadbiran S626-161 menghasilkan pengurangan ketara sedikit dalam titer virus paru-paru berikutan cabaran WT dan BA.1 (Rajah 4, F dan G). Data ini menggariskan bahawa, untuk menentukan dengan tepat mAb pelindung secara meluas, menilai keberkesanan perlindungan selari dengan aktiviti peneutralan diperlukan. Melangkah ke hadapan, adalah menarik untuk mengkaji sejauh mana kapasiti perlindungan S728-1157 bergantung kepada Fc. Secara keseluruhan, S728-1157 mewakili mAb yang menjanjikan dengan keberkesanan peneutralan luas terhadap varian SARS CoV-2 yang mampu mengurangkan replikasi WT, Delta dan BA.1 secara mendadak dalam vivo.
Jangkitan SARS-CoV-2 jarang menimbulkan mAb meneutralkan silang S728-1157 yang kuat. Memandangkan peneutralan silang dan potensi profilaksis S728-1157, kami berusaha untuk menilai sama ada antibodi seperti S728–1157 lazimnya diinduksi dalam kalangan tindak balas poliklonal dalam pesakit SARS-CoV-2. Untuk menilai ini, kami melakukan ELISA persaingan menggunakan serum pemulihan untuk mengesan titer antibodi anti-RBD yang boleh bersaing untuk mengikat dengan S728-1157 (Rajah 5A). Subjek dibahagikan kepada 3 kumpulan berdasarkan magnitud tindak balas antibodi, seperti yang ditakrifkan sebelum ini (15, 16). Walaupun responden yang tinggi dan sederhana mempunyai titer S{16}}–antibodi serum kompetitif yang lebih tinggi berbanding dengan responden yang rendah (Rajah 5B), titer tersebut agak rendah merentas semua kumpulan, menunjukkan bahawa adalah jarang untuk memperoleh tahap S yang tinggi{{ 18}}–antibodi seperti dalam serum poliklonal berikutan jangkitan WT SARS-CoV-2. Selain S728-1157, kami menguji persaingan serum pemulihan dengan mAb lain, termasuk S451- 1140, S626-161, LY-CoV555, REGN10933, CR3022 dan CC12.3. Sama seperti S728-1157, kami memerhatikan titer antibodi yang agak rendah bersaing dengan S451-1140, S626-161, LY-CoV555, REGN10933 dan CC12.3 dalam serum poliklonal daripada kebanyakan pemulihan individu (Rajah 5, C–F dan H). Walau bagaimanapun, responden yang tinggi cenderung mempunyai titer yang jauh lebih tinggi terhadap mAb yang meneutralkan berbanding responden yang rendah (Rajah 5, B-F dan H). Sebaliknya, antibodi yang menyasarkan tapak epitope CR3022 lebih ketara pada individu yang sembuh, mencadangkan pengayaan antibodi kelas 4 RBD dalam serum poliklonal (Rajah 5G). Terutama sekali, tiada perbezaan ketara dalam titer CR3022 merentas 3 kumpulan responden, menunjukkan bahawa antibodi tapak CR{45}}didorong secara konsisten semasa jangkitan WT SARS-CoV-2 dalam kebanyakan individu. Menariknya, berbanding dengan CC12.3, S728-1157 dikesan pada 4-kali ganda tahap lebih rendah dalam serum responden tinggi. Oleh itu, walaupun antibodi kelas 1 sering disebabkan oleh jangkitan semula jadi dan vaksinasi (14, 20, 28, 29, 41-43), data kami menunjukkan bahawa antibodi seperti S728-1157 yang mewakili subset kelas ini agak jarang berlaku.
Di samping itu, kami mengkaji perbezaan kereaktifan kepada 2P berbanding lonjakan stabil 6P dalam sera kohort pemulihan kami (Rajah 5, I-K). Kami mendapati bahawa kesemua 3 kumpulan responden memasang antibodi reaktif anti-spike terhadap spike WT yang distabilkan 6P pada tahap yang lebih besar daripada spike WT yang distabilkan 2P, dengan faktor 6-hingga-11--kali ganda (Rajah 5J), menunjukkan bahawa epitop antigenik utama lebih baik dipamerkan atau distabilkan pada antigen yang distabilkan 6P. Menggunakan sampel yang sama, responden tinggi dan sederhana juga mempunyai titer antibodi anti-pancang yang lebih rendah terhadap BA.1-2P daripada BA.1-6P, sebanyak 4–hingga–5–kali ganda (Rajah 5K). Daripada makluman, responden rendah mempunyai perubahan lipatan yang lebih kecil dalam kereaktifan mengikat terhadap lonjakan BA.1 Omicron-2P dan 6P (2-pengurangan kali ganda) berbanding dengan lonjakan WT-2P dan 6P ({ {28}}pengurangan kali ganda) (Rajah 5, J dan K), menunjukkan bahawa antibodi serum terhadap BA.1 epitop reaktif Omikron mungkin lebih terhad dalam subjek yang bertindak balas rendah. Secara keseluruhan, data ini mencadangkan bahawa terdapat peningkatan pengikatan poliklonal yang disebabkan oleh jangkitan semula jadi kepada lonjakan stabil 6P, kedua-duanya untuk virus WT dan Omicron.
Antibodi seperti S728-1157 diinduksi secara optimum dalam konteks imuniti hibrid. Jangkitan utama SARS-CoV-2 tanpa vaksinasi telah menjadi jarang berlaku dalam persekitaran global semasa dan beberapa kajian telah melaporkan bahawa imuniti SARS-CoV-2 berbeza antara individu yang mempunyai sejarah vaksinasi/jangkitan tertentu. Akibatnya, kami seterusnya berusaha untuk menyiasat pendedahan biasa yang mana, selain daripada jangkitan WT dengan leluhur SARS-CoV-2 sahaja, akan berkesan mendorong antibodi seperti S728–1157 dalam plasma daripada vaksin berasaskan mRNA monovalen dengan dan tanpa terlebih dahulu. jangkitan. Kami memperoleh biospesimen yang diperlukan daripada kohort kajian Protection Associated with Rapid Immunity to SARS-CoV-2 (PARIS), yang telah mengikuti pekerja penjagaan kesihatan secara membujur sejak permulaan wabak (44). Kami memilih sampel plasma daripada peserta kajian yang diimunisasi sepenuhnya (2 × divaksinasi) dengan dan tanpa jangkitan serta daripada peserta yang dirangsang (3 × divaksinasi) dengan dan tanpa jangkitan. Di samping itu, kami juga memasukkan sampel daripada peserta kajian yang telah menerima vaksin mRNA bivalen (WA1/2020 nenek moyang ditambah Omicron BA.5) (Rajah 6A dan Jadual Tambahan 2). Jangkitan terobosan dalam peserta yang telah menerima vaksin penggalak berlaku pada masa keturunan Omicron telah menggantikan semua keturunan SARS-CoV-2 lain di kawasan metropolitan New York. Kami mendapati bahawa individu yang divaksin dua kali mempunyai titer antibodi serum kompetitif S{24}} yang paling rendah antara 5 kumpulan sampel yang diuji (Rajah 6B). Terutama, tahap ini adalah serupa dengan yang diperhatikan untuk kohort kami yang tidak divaksinasi (semua responden; Rajah 5B). Sebagai perbandingan, individu yang mempunyai sejarah jangkitan semula jadi, termasuk individu sembuh dengan 2 daripada 3 dos vaksin dan individu yang telah mengalami jangkitan terobosan dan menerima penggalak bivalen, menunjukkan tahap elisitasi S728-1157 yang jauh lebih tinggi berbanding dengan yang tidak dijangkiti. tetapi individu yang diberi vaksin (Rajah 6B). Walaupun 3-kumpulan dos yang tidak dijangkiti hanya menunjukkan peningkatan yang tidak ketara berbanding dengan 2-kumpulan dos, pecahan berpasangan mengikut jenis vaksin menunjukkan bahawa dos ketiga homolog BNT162b2 dan mRNA-1273 meningkat dengan ketara S{{ 38}} seperti meneutralkan titer antibodi masing-masing sebanyak 2.72 × dan 2.85 × (Rajah 6, C dan D). Untuk ambil perhatian, dalam kalangan peserta yang mempunyai 3 jumlah kontak dengan spike dalam apa jua cara, titer antibodi seperti S728-1157-adalah 3 × lebih tinggi dalam vaksin berganda sembuh berbanding dengan vaksin tiga kali ganda naif jangkitan, menunjukkan bahawa SARS-CoV{{ 51}} jangkitan lebih optimum mendorong clonotype ini. Di antara kumpulan imuniti hibrid, kami mendapati bahawa majoriti individu yang dirangsang dengan kejayaan yang menerima dos vaksin penggalak bivalen hanya mempunyai titer antibodi S728-1157 yang lebih tinggi sedikit berbanding dengan kumpulan yang divaksin pra omicron convalescent, menunjukkan bahawa S{{53 }} titer berkemungkinan menghampiri dataran tinggi selepas 3 pendedahan. Kami juga menyiasat titer antibodi poliklonal yang bersaing dengan CC12.3 dan CR3022 sebagai tambahan kepada S728-1157. Semua individu mempamerkan titer CC12 yang agak tinggi.3- dan CR3022-seperti antibodi, bebas daripada bilangan dan jenis pendedahan (Tambahan Rajah 5), bertentangan dengan apa yang kami perhatikan untuk S728-1157- seperti antibodi. Secara keseluruhan, data ini menunjukkan bahawa jangkitan SARS-CoV-2 dan vaksinasi mRNA kedua-duanya menyumbang kepada induksi antibodi seperti S728-1157-, dengan jangkitan memainkan peranan yang lebih dominan dalam individu yang divaksin.
cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun
Akhirnya, dalam membandingkan tindak balas terhadap lonjakan stabil 2P berbanding 6P dalam kohort vaksinasi mRNA, kami mendapati bahawa kebanyakan kumpulan menimbulkan tahap antibodi yang sama terhadap kedua-dua konstruk. Pengecualian untuk ini ialah kumpulan tiga vaksin yang tidak dijangkiti, yang menunjukkan secara statistik lebih tinggi, walaupun hanya sedikit meningkat, kereaktifan kepada 2P berbanding dengan lonjakan stabil 6P (Rajah 6E). Data ini mencadangkan bahawa berbeza dengan jangkitan semula jadi (Rajah 5, J, dan K), vaksinasi sahaja menghasilkan tindak balas poliklonal yang lebih terhad kepada epitop dalam binaan-2P Spike, sejajar dengan Spike{{12 }}P formulasi vaksin semasa. Akhirnya, penemuan ini menyokong idea bahawa penstabilan 6P bagi vaksin SARS-CoV{16}} masa hadapan boleh memberi manfaat besar dalam mendorong klonotip antibodi yang melindungi secara meluas seperti S728-1157.
Rajah 5. Persaingan antibodi serum pemulihan dengan meneutralkan secara meluas mAbs RBD-reaktif dan perbandingan tindak balas antibodi serum terhadap pancang stabil 6P- berbanding 2P
Rajah 6. persaingan antibodi serum yang divaksinasi mRNA dengan S728-1157 meneutralkan mAbs reaktif RBD dan perbandingan tindak balas antibodi serum terhadap pancang stabil 6P- lawan 2P.
Perbincangan
Dalam kajian ini, kami mengenal pasti bnAb kuat yang diasingkan daripada sel memori B individu yang telah pulih daripada jangkitan SARS-CoV-2 semasa gelombang awal pandemik-19 COVID. bnAb, S728- 1157 ini, mengekalkan kereaktifan mengikat yang besar dan mempunyai aktiviti peneutralan yang konsisten terhadap semua VOC SARS-CoV-2 yang diuji, termasuk Omicron BA.1, BA.2, BA.2.75, BL.1 ( BA.2.75+R346T), BA.4, BA.5 dan XBB serta dapat mengurangkan titer virus berjangkit dengan ketara berikutan jangkitan Delta dan BA.1 pada hamster.
Kami mendapati bahawa serum pemulihan daripada kohort kami mengandungi kepekatan rendah antibodi yang bersaing dengan S728-1157 (antibodi kelas 1/ RBS-A) dan mAbs epitope kelas 2. Ini menunjukkan bahawa S728-1157 agak unik daripada antibodi lain yang menyasarkan epitop kelas 1 dan jarang diinduksi dalam kumpulan sel B memori khusus RBD. Sebaliknya, kohort jangkitan semula jadi kami kelihatan mendorong antibodi yang menyasarkan epitope CR3022 (kelas 4); antibodi kekhususan ini selalunya reaktif silang tetapi kurang kuat meneutralkan daripada antibodi penargetan RBS (14, 17). Data ini adalah pelengkap kepada penemuan kami sebelum ini yang menunjukkan bahawa banyak antibodi kelas 3/S309 dalam sera pemulihan boleh menyumbang kepada aktiviti meneutralkan terhadap varian Alpha dan Gamma, manakala kekurangan antibodi kelas 2 mungkin menyumbang keupayaan peneutralan yang berkurangan terhadap Delta (15) . Walau bagaimanapun, keluasan aktiviti kebanyakan antibodi penyasaran RBS ini (RBS-A/kelas 1, RBS-B, C/kelas 2 dan RBS-D, S309/kelas 3) terhadap varian Omicron dilaporkan sangat terhad (11, 40, 45).
Cabaran utama untuk bergerak ke hadapan adalah untuk menentukan cara untuk meningkatkan elisitasi antibodi reaktif silang secara meluas kepada epitop RBS yang dipelihara. Dalam hal ini, kami memerhatikan di sini bahawa individu yang mempunyai imuniti hibrid mempunyai titer antibodi seperti S728-1157-yang jauh lebih tinggi berbanding individu yang diberi vaksin tanpa jangkitan sebelumnya. Yang penting, fenomena ini diperhatikan walaupun apabila bilangan pendedahan dikawal untuk (iaitu, dalam vaksin berganda sembuh berbanding vaksin tiga kali ganda yang tidak dijangkiti), menunjukkan bahawa beberapa unsur imuniti berkaitan jangkitan (atau formulasi vaksin yang boleh meniru jenis imuniti ini) adalah penting untuk elisitasi klonotip ini. Ini konsisten dengan bukti eksperimen yang mendokumenkan bahawa individu yang mempunyai imuniti hibrid mempunyai profil kereaktifan antibodi yang lebih luas berbanding dengan mereka yang hanya mempunyai tindak balas imun yang disebabkan oleh vaksinasi atau jangkitan primer (9).
Struktur di sini menggambarkan bahawa S728-1157 mengikat epitop RBS-A/kelas 1 dalam RBD penyesuaian atas. Epitope ini nampaknya lebih mudah diakses pada pancang yang distabilkan 6P, yang telah dilaporkan membentangkan 2 RBD di bahagian atas, berbanding dengan pancang 2P, yang hanya menunjukkan 1 (30, 33, 46, 47), dan yang mana antibodi kita khusus untuk spike up-conformation menunjukkan pengikatan yang lebih baik. S728-1157 telah diasingkan selepas jangkitan semula jadi; dalam konteks sedemikian, kemungkinan mendorong klon seperti S728-1157 berkemungkinan lebih tinggi memandangkan RBD mesti boleh menerima pakai konformasi naik, malah secara sementara, untuk mengikat ACE2, sekali gus mendedahkan epitope ini. Tidak seperti kebanyakan antibodi IGHV3-53/3-66 RBS-A/kelas 1, S728-1157 boleh menampung mutasi utama dalam pancang VOC menggunakan interaksi meluas antara CDR-H3 dan RBD (29, 48–50). S728-1157 juga menggunakan rantai ringan yang berbeza (IGLV3-9) berbanding antibodi lain yang kurang luas seperti CC12.3 (IGKV3-20), yang mungkin menjejaskan interaksi pengikatan keseluruhan; walau bagaimanapun, analisis kami menunjukkan bahawa terdapat kurang ikatan hidrogen antara rantai cahaya S728-1157 dan RBD berbanding dengan CC12.3 (Jadual Tambahan 7). Walaupun kebanyakan sisa sentuhan CDR-H3 kritikal untuk kereaktifan silang VOC dalam interaksi ini adalah dikodkan germline dan tidak diperkenalkan oleh mutasi somatik, beberapa residu bermutasi secara somatik dalam kawasan rangka kerja atau CDR-H1, CDR-H2, dan CDR-L1 adalah terlibat dalam interaksi dengan SARS-CoV-2 RBD. Di satu pihak, ini menunjukkan bahawa sel memori B yang mengekod antibodi kelas IGHV3-53/66 boleh memperoleh tahap kereaktifan silang yang serupa melalui pematangan pertalian lanjut. Sebaliknya, ini juga menunjukkan kemungkinan mereka bentuk imunogen sasaran germanium yang menyasarkan S728-1157-seperti sel B naif. Walaupun mungkin mencabar untuk mereka bentuk vaksin yang secara khusus dapat menimbulkan antibodi seperti S728-1157 dengan CDR-H3 terpilih yang mampu mengatasi mutasi VOC, adalah menggalakkan bahawa sekatan gen IGHV diperhatikan dalam SARS-CoV yang lain yang kuat{ {58}} meneutralkan kajian mAbs (13, 15, 20–27). Sebagai alternatif, ini juga boleh dilaksanakan melalui imunisasi berulang dengan imunogen RBD yang dioptimumkan, seperti yang telah dilaporkan sebelum ini untuk patogen lain (51-55).
Walaupun banyak mutasi telah diperhatikan dalam tapak antigenik RBS-A/ kelas 1 (18), berkenaan dengan epitop S728-1157, 13 daripada 15 jumlah sisa sentuhan RBD dan 2 daripada 3 CDR-H{{9} } Sisa sentuhan RBD yang terikat dipelihara dalam Omicron dan semua VOC lain. Ini menunjukkan bahawa rantau RBD di mana epitope S728-1157 ditemui mungkin termasuk sisa yang kritikal untuk fungsi dinamik dan kecergasan virusnya dan oleh itu akan kurang bertolak ansur dengan mutasi dan hanyutan antigen berbanding sisa tapak kelas 1 RBS-A/ di sekeliling. Jika ini berlaku, kecenderungan untuk epitop tertentu ini hilang apabila varian virus berkembang harus dikurangkan, menjadikan pencirian S728-1157 dan antibodi serta epitop yang serupa penting untuk vaksin tahan varian atau pembangunan terapeutik mAb. Ringkasnya, kajian kami mengenal pasti bnAbs yang mungkin memaklumkan reka bentuk imunogen untuk vaksin coronavirus kalis varian generasi akan datang atau berfungsi sebagai terapeutik mAb yang tahan terhadap evolusi SARS CoV-2. Khususnya, dari segi potensi dan keluasan gabungan, S{18}} nampaknya adalah antibodi terbaik dalam kelas yang diasingkan setakat ini. Memandangkan antibodi ini lebih mudah mengikat dengan penstabilan 6P, ia diramalkan lebih disukai disebabkan oleh protein spike rekombinan yang distabilkan 6P atau keseluruhan virus, yang menunjukkan bahawa pengubahsuaian heksaprolin boleh memberi manfaat kepada pembinaan vaksin masa depan untuk melindungi secara optimum daripada SARS-CoV masa depan. -2 varian dan arbovirus lain.
cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun
Kaedah
Pengasingan antibodi monoklonal. PBMC telah diasingkan daripada penapis leukoreduction dan dibekukan seperti yang diterangkan sebelum ini (24). Sel B diperkaya daripada PBMC melalui FACS. Sel-sel telah diwarnai dengan probe CD19, CD3, dan antigen yang terkonjugasi kepada oligo-fluorofor; sel yang diminati dikenal pasti sebagai CD3– CD19+ Antigen+. Semua mAbs dihasilkan daripada sel-sel yang diisih umpan antigen yang diberi tag oligo yang dikenal pasti melalui RNA-Seq sel tunggal, seperti yang diterangkan sebelum ini (15, 24). Data sel B tunggal yang dijana dalam kajian ini telah didepositkan ke Omnibus Ekspresi Gen: GSE171703 dan GSM5231088–GSM5231123.
Sel B khusus antigen telah dipilih untuk menjana mAb berdasarkan keamatan antigen-prob yang dianalisis oleh JMP Pro 15. Gen rantai berat dan ringan antibodi telah disintesis oleh Teknologi DNA Bersepadu (IDT) dan diklonkan ke dalam rantaian cahaya IgG1 manusia dan κ atau λ manusia. vektor ekspresi oleh perhimpunan Gibson, seperti yang diterangkan sebelum ini (56). Rantaian berat dan ringan mAb yang sepadan telah ditransfeksi secara sementara ke dalam sel HEK293T (ATCC). Selepas pemindahan selama 18 jam, sel yang ditransfeksi telah ditambah dengan supernatan sederhana hibridoma tanpa protein (PFHM-II, Gibco). Supernatan yang mengandungi mAb yang dirembes dituai pada hari ke-4 dan disucikan menggunakan manik A-agarose protein (Thermo Fisher Scientific) seperti yang diperincikan sebelum ini (56). Urutan rantai berat dan ringan bagi antibodi yang dicirikan dengan baik telah diperoleh daripada Bank Data Protein (PDB), LY-CoV555 (ID PDB: 7KMG), CR3022 (ID PDB: 6W7Y) dan REGN1{{ 125}}933 (PDB ID: 6XDG) dan telah disintesis seperti yang diterangkan di atas. CC12.3 mAb (PDB ID: 6XC4) telah disediakan oleh Meng Yuan di Institut Penyelidikan Scripps (San Diego, California, Amerika Syarikat). Ekspresi protein spike rekombinan. Lonjakan D614G SARS-CoV-2 rekombinan penuh (FL), BA.2-6P, BA.4/5-6P, BQ.1-6P, BQ. 1.1-6P, XBB-6P, WT RBD, mutan RBD tunggal (R346S, K417N, K417T, G446V, L452R, S477N, F486A, F486Y, N487Q, Y489F, Q493YA, N493N, Y505A dan Y505F), gabungan mutan RBD (K417N/E484K/L452R/NN501Y), SARS-CoV-1 RBD dan MERS-CoV RBD telah dijana secara dalaman. Secara ringkas, antigen rekombinan telah dinyatakan menggunakan sel Expi293F (Thermo Fisher Scientific). Gen yang diminati telah diklonkan ke dalam vektor ekspresi mamalia (AbVec diubah suai dalaman) dan ditransfeksi menggunakan kit ExpiFectamine 293 (Thermo Fisher Scientific) mengikut protokol pengeluar. Supernatan dituai pada hari ke-4 selepas pemindahan dan diinkubasi dengan asid Ni-nitrilotriacetic (Ni-NTA) agarose (Qiagen). Pemurnian telah dijalankan menggunakan lajur aliran graviti dan diencerkan dengan penimbal yang mengandungi imidazole seperti yang diterangkan sebelum ini (57, 58). eluat telah ditimbal dan ditukar dengan PBS menggunakan unit emparan Amicon (Millipore). Pancang FL rekombinan distabilkan oleh mutasi 2P bagi varian B.1.1.7 Alpha, B.1.351 Beta, P.1 Gamma, B.1.617.2 Delta, BA.1, BA.2 dan BA.4 Omicron dan adalah dihasilkan di Makmal Sather di Institut Penyelidikan Kanak-Kanak Seattle. RBD K417V, N439K dan E484K serta rekombinan FL spike WT-2P dan 6P telah dihasilkan di makmal Krammer di Sekolah Perubatan Icahn di Gunung Sinai. SARS-CoV-2-6P-Mut7 dan spike BA.1-6P telah direka bentuk dan dihasilkan seperti yang diterangkan dalam kajian terdahulu (59). Urutan dan sumber protein untuk setiap antigen disenaraikan dalam Jadual Tambahan 4. ELISA. Protein spike/RBD SARS-CoV{95}} rekombinan disalut pada plat mikrotiter pengikat protein tinggi (Costar) pada 2 ug/mL dalam PBS pada 50 μL/perigi dan disimpan semalaman pada suhu 4 darjah . Plat dibasuh dengan PBS yang mengandungi 0.05% Tween 20 (PBS-T) dan disekat dengan 150 μL PBS yang mengandungi 20% FBS selama 1 jam pada 37 darjah . Antibodi monoklonal telah dicairkan secara bersiri 3-kali ganda bermula daripada 10 ug/mL dalam PBS dan diinkubasi dalam telaga selama 1 jam pada 37 darjah . Plat kemudiannya dibasuh dan diinkubasi dengan antibodi IgG anti-manusia kambing konjugasi HRP (Jackson ImmunoResearch; 109- 035-098), 1:1,000) selama 1 jam pada 37 darjah . Selepas mencuci, 100 μL substrat Super AquaBlue ELISA (eBioscience) telah ditambah setiap telaga. Penyerapan diukur pada 405nm pada spektrofotometer mikroplate (Bio-Rad). Ujian telah diseragamkan menggunakan antibodi kawalan S144-509 (15), dengan ciri pengikatan yang diketahui dalam setiap plat, dan plat telah dibangunkan sehingga penyerapan kawalan mencapai OD 3.0. Semua mAb telah diuji dalam pendua, dan setiap eksperimen dilakukan dua kali.
Serum ELISA. Plat mikrotiter pengikat protein tinggi disalut dengan antigen pancang SARS-CoV-2 rekombinan pada 2 ug/mL dalam PBS semalaman pada 4 darjah . Pinggan telah dibasuh dengan PBS 0.05% Tween dan disekat dengan 200 μL PBS 0.1% Tween + 3% susu tepung skim selama 1 jam pada suhu bilik (RT). Sampel plasma telah dinyahaktifkan haba selama 1 jam pada 56 darjah sebelum melakukan eksperimen serologi. Plasma telah dicairkan secara bersiri 2-kali ganda dalam PBS 0.1% Tween + 1% susu tepung skim. Plat diinkubasi dengan pencairan serum selama 2 jam di RT. Antibodi sekunder Ig anti-manusia kambing konjugasi HRP yang dicairkan pada 1:3,000 dengan susu tepung skim PBS 0.1% Tween + 1% telah digunakan untuk mengesan pengikatan antibodi. Selepas 1 jam pengeraman, plat telah dibangunkan dengan larutan 100 μL SigmaFast OPD (Sigma-Aldrich) selama 10 minit. Kemudian, 50 μL 3M HCl digunakan untuk menghentikan tindak balas pembangunan. Penyerapan diukur pada 490 nm pada spektrofotometer mikroplate (Bio-Rad). Titer titik akhir diekstrapolasi daripada lengkung piawai sigmoidal 4PL (di mana x ialah kepekatan log) untuk setiap sampel. Had pengesanan (LOD) ditakrifkan sebagai min + 3 SD bagi isyarat OD yang direkodkan menggunakan plasma daripada individu pra-SARS-CoV-2 . Semua pengiraan dilakukan dalam perisian GraphPad Prism (versi 9.0).
Pertandingan ELISA. Untuk menentukan klasifikasi epitope sasaran mAbs reaktif RBD, ELISA persaingan dilakukan menggunakan mAbs lain dengan ciri pengikatan epitope yang diketahui sebagai mAbs pesaing. mAbs pesaing telah dibiotinilasi menggunakan EZ-Link sulfo-NHS-biotin (Thermo Fisher Scientific) selama 2 jam di RT. Biotin berlebihan mAbs terbiotinilasi telah dikeluarkan dengan lajur penyahgaraman putaran 7k molekul (MWCO) Zeba (Thermo Fisher Scientific). Plat disalut dengan 2 ug/mL antigen RBD semalaman pada 4 darjah. Plat telah disekat dengan PBS–20% FBS selama 2 jam di RT dan 2-pencairan kali ganda mAb bagi kelas atau serum yang tidak ditentukan, telah ditambah, bermula pada 20 ug/mL mAbs dan pencairan serum 1:10. Selepas pengeraman antibodi selama 2 jam di RT, mAb pesaing terbiotinilasi ditambah pada kepekatan dua kali ganda daripada pemalar disosiasi (KD) dan diinkubasi selama 2 jam lagi di RT bersama-sama dengan mAb atau serum yang telah ditambah sebelum ini. Plat dibasuh dan diinkubasi dengan 100 μL HRP-conjugated streptavidin (Southern Biotech) pada pencairan 1:1,000 selama 1 jam pada 37 darjah . Plat telah dibangunkan dengan substrat Super AquaBlue ELISA (eBioscience). Untuk menormalkan ujian, mAb terbiotinilasi pesaing telah ditambah ke dalam perigi tanpa sebarang mAb atau serum yang bersaing sebagai kawalan. Data direkodkan apabila penyerapan telaga kawalan mencapai OD 1.0–1.5. Persaingan peratus antara mAbs kemudiannya dikira dengan membahagikan OD yang diperhatikan sampel dengan OD yang dicapai oleh kawalan positif, menolak nilai ini daripada 1, dan mendarab dengan 100. Untuk serum, OD telah log10 diubah dan dianalisis dengan regresi tak linear untuk menentukan 50 % nilai kepekatan perencatan (IC50) menggunakan perisian GraphPad Prism (versi 9.0). Data telah ditukar kepada Log1P dan diplotkan menjadi wakil graf bagi pencairan serum timbal balik IC50 pencairan serum yang boleh mencapai 50% persaingan dengan mAb pesaing yang diminati. Semua mAb diuji dalam pendua, setiap eksperimen dilakukan 2 kali secara bebas, dan nilai daripada 2 eksperimen bebas dipuratakan.
Ujian plak. Ujian plak dilakukan dengan virus varian SARS-CoV-2 pada sel Vero E6/TMPRSS2 (Japanese Collection of Research Bioresources (JCRB)) (Jadual Tambahan 5). Sel telah dikultur untuk mencapai 90% pertemuan sebelum ditrypsin dan dibenih pada ketumpatan 3 × 104 sel/telaga dalam 96-plat perigi. Pada hari berikutnya, 102 PFU varian SARS-CoV-2 diinkubasi dengan 2-mAb dicairkan kali ganda selama 1 jam. Campuran antibodi-virus diinkubasi dengan sel Vero E6/TMPRSS2 selama 3 hari pada 37 darjah . Plat telah ditetapkan dengan 20% metanol dan kemudian diwarnakan dengan larutan kristal ungu. Kepekatan perencatan lengkap (IC99) dikira menggunakan log (perencat) berbanding tindak balas normal (cerun pembolehubah), dilakukan dalam GraphPad Prism (versi 9.0). Semua mAb telah diuji dalam pendua, dan setiap eksperimen dilakukan dua kali. Ujian peneutralan pengurangan fokus. Ujian peneutralan pengurangan fokus (FRNTs) digunakan untuk menentukan aktiviti peneutralan sebagai platform tambahan selain daripada ujian plak. Pencairan bersiri serum bermula pada kepekatan akhir 1:20 dicampur dengan 103 unit pembentuk fokus virus setiap telaga dan diinkubasi selama 1 jam pada 37 darjah . Sampel serum prepandemik terkumpul berfungsi sebagai kawalan. Campuran antibodi-virus telah diinokulasi pada sel Vero E6/TMPRSS2 (JCRB) dalam 96-plat perigi dan diinkubasi selama 1 jam pada 37 darjah . Satu isipadu larutan metilselulosa yang sama ditambah kepada setiap telaga. Sel-sel tersebut diinkubasi selama 16 jam pada suhu 37 darjah dan kemudian diperbaiki dengan formalin. Selepas formalin dikeluarkan, sel-sel telah diimunisasikan dengan mAb tetikus terhadap nukleoprotein SARS-CoV-1/2 [klon 1C7C7 (Sigma-Aldrich)], diikuti dengan imunoglobulin anti-tikus kambing berlabel HRP (Sigma- Aldrich; A8924). Sel yang dijangkiti telah diwarnai dengan Substrat TrueBlue (Sains Hayat SeraCare) dan kemudian dibasuh dengan air suling. Selepas pengeringan, nombor fokus dikira dengan menggunakan Penganalisis ImmunoSpot S6, perisian ImmunoCapture dan perisian BioSpot (Teknologi Selular). IC50 dikira daripada nilai interpolasi daripada log(perencat) berbanding tindak balas normal, menggunakan regresi tak linear cerun berubah (4 parameter) yang dilakukan dalam GraphPad Prism (versi 9.0).
Rujukan
1. Hou YJ, et al. Varian SARS-CoV-2 D614G mempamerkan replikasi ex vivo dan penghantaran yang cekap secara in vivo. Sains. 2020;370(6523):1464–1468.
2. Garcia-Beltran WF, et al. Pelbagai varian SARS CoV-2 terlepas daripada peneutralan oleh imuniti humoral yang disebabkan oleh vaksin. sel. 2021;184(9):2523.
3. Dinding EC, et al. Meneutralkan aktiviti antibodi terhadap SARS-CoV-2 VOC B.1.617.2 dan B.1.351 melalui vaksinasi BNT162b2. Lancet. 2021;397(10292):2331–2333.
4. Edara VV, et al. Jangkitan dan tindak balas peneutralan antibodi yang disebabkan oleh vaksin kepada varian SARS-CoV-2 B.1.617. N Engl J Med. 2021;385(7):664–666.
5. Zhou D, et al. Bukti pelarian SARS-CoV-2 varian B.1.351 daripada sera semulajadi dan disebabkan oleh vaksin. sel. 2021;184(9):2348–2361.
6. Weisblum Y, et al. Melarikan diri daripada meneutralkan antibodi oleh varian protein lonjakan SARS-CoV-2. Elife. 2020;9:e61312.
7. Graham F. Taklimat harian: Varian coronavirus Omicron meletakkan saintis berjaga-jaga. alam semula jadi. 2021;.
8. Karim SSA, Karim QA. Varian Omicron SARS-CoV-2: babak baharu dalam wabak-19 COVID. Lancet. 2021;398(10317):2126–2128.
9. Carreño JM, et al. Aktiviti serum pemulihan dan vaksin terhadap SARS-CoV-2 Omicron. alam semula jadi. 2021;602(7898):682–688.
10. Wang Q, et al. Sifat pengelakan antibodi yang membimbangkan bagi subvarian SARS-CoV-2 BQ dan XBB yang semakin meningkat. sel. 2022;186(2):279–286.
11. VanBlargan LA, et al. Virus Omicron SARS-CoV-2 B.1.1.529 yang berjangkit terlepas daripada peneutralan oleh antibodi monoklonal terapeutik. Nat Med. 2022;28(3):490–495.
12. Takashita E, et al. Keberkesanan antibodi dan ubat antivirus terhadap Covid-19 Varian Omicron. N Engl J Med. 2022;386(10):995–998.
13. Yuan M, et al. Pengiktirafan domain pengikat reseptor-2 SARS-CoV dengan meneutralkan antibodi. Biochem Biophys Res Commun. 2021;538:192–203.
14. Barnes CO, et al. SARS-CoV-2 meneutralkan struktur antibodi memaklumkan strategi terapeutik. alam semula jadi. 2020;588(7839):682–687.
15. Changrob S, et al. Peneutralan silang varian baru muncul SARS-CoV-2 yang membimbangkan oleh antibodi yang menyasarkan epitop yang berbeza pada spike. Mbio. 2021;12(6):e0297521.
16. Guthmiller JJ, et al. Keterukan jangkitan SARS-CoV-2 dikaitkan dengan imuniti humoral yang unggul terhadap lonjakan. Mbio. 2021;12(1):e02940–20.
17. Greaney AJ, et al. Memetakan mutasi kepada SARS-CoV-2 RBD yang terlepas daripada pengikatan oleh kelas antibodi yang berbeza. Nat Commun. 2021;12(1):4196.
18. Liu H, Wilson IA. Epitop peneutralan pelindung dalam SARS-CoV-2. Immunol Rev. 2022;310(1):76–92.
19. Jette CA, et al. Kereaktifan silang yang luas merentas arbovirus yang ditunjukkan oleh subset antibodi peneutralan COVID-19 penderma. Rep Sel. 2021;36(13):109760.
20. Brouwer PJM, et al. Antibodi peneutral yang kuat daripada pesakit COVID-19 mentakrifkan berbilang sasaran kelemahan. Sains. 2020;369(6504):643–650.
21. Pinto D, et al. Peneutralan silang SARS CoV-2 oleh antibodi SARS-CoV monoklonal manusia. alam semula jadi. 2020;583(7815):290–295.
22. Robbiani DF, et al. Tindak balas antibodi tertumpu kepada SARS-CoV-2 dalam individu yang sembuh. alam semula jadi. 2020;584(7821):437–442.
23. Yuan M, et al. Asas struktur tindak balas antibodi yang dikongsi kepada SARS-CoV-2. Sains. 2020;369(6507):1119–1123.
24. Dugan HL, et al. Memprofilkan imunodominan sel B selepas jangkitan SARS-CoV-2 mendedahkan evolusi antibodi kepada sasaran virus yang tidak meneutralkan. Kekebalan. 2021;54(6):1290–1303.
25. Rogers TF, et al. Pengasingan kuat SARS CoV-2 antibodi meneutralkan dan perlindungan daripada penyakit dalam model haiwan kecil. Sains. 2020;369(6506):956–963.
26. Schmitz AJ, et al. Antibodi awam yang disebabkan oleh vaksin melindungi daripada SARS-CoV-2 dan varian yang muncul. Kekebalan. 2021;54(9):2159–2166.e6.
27. Shi R, et al. Antibodi peneutral manusia menyasarkan tapak pengikat reseptor SARS-CoV-2. alam semula jadi. 2020;584(7819):120–124.
28. Cao Y, et al. Antibodi peneutral yang kuat terhadap SARS-CoV-2 dikenal pasti melalui penjujukan sel tunggal berkeupayaan tinggi bagi sel B pesakit yang sembuh. sel. 2020;182(1):73–84.
29. Barnes CO, et al. Struktur antibodi manusia yang terikat pada lonjakan SARS-CoV-2 mendedahkan epitop biasa dan ciri berulang antibodi. sel. 2020;182(4):828–842.
30. Corbett KS, et al. Reka bentuk vaksin mRNA SARS-CoV-2 didayakan oleh prototaip kesediaan patogen. alam semula jadi. 2020;586(7830):567–571.
31. Amanat F, et al. Pengenalan dua prolin dan penyingkiran tapak belahan polybasic membawa kepada keberkesanan yang lebih tinggi bagi vaksin SARS-CoV-2 berasaskan spike rekombinan dalam model tetikus. mBio. 2021;12(2):e02648–20.
32. Sun W, et al. Virus penyakit Newcastle yang menyatakan protein lonjakan yang stabil bagi SARS-CoV-2 mendorong tindak balas imun yang melindungi. Nat Commun. 2021;12(1):6197.
33. Hsieh CL, et al. Reka bentuk berasaskan struktur pancang SARS-CoV-2 penstabilan prefusi. Sains. 2020;369(6510):1501–1505.
34. Gobeil SM, et al. Kepelbagaian struktur lonjakan Omicron-2 SARS-CoV. Sel Mol. 2022;82(11):2050–2068.
35. Yuan M, et al. Epitope samar yang sangat terpelihara dalam domain pengikat reseptor SARS-CoV-2 dan SARS-CoV. Sains. 2020;368(6491):630–633.
36. Starr TN, et al. Peta lengkap mutasi RBD SARS-CoV-2 yang terlepas daripada antibodi monoklonal LY-CoV555 dan koktelnya dengan LY-CoV016. Sel Rep Med. 2021;2(4):100255.
37. Baum A, et al. Antibodi REGN-COV2 menghalang dan merawat jangkitan SARS-CoV-2 dalam kera rhesus dan hamster. Sains. 2020;370(6520):1110–1115.
38. Wu NC, et al. Mod pengikatan alternatif antibodi IGHV3-53 kepada domain pengikatan reseptor-2 SARS-CoV. Rep. Sel. 2020;33(3):108274.
39. Wu Y, et al. Sepasang antibodi peneutral manusia yang tidak bersaing menghalang virus-19 COVID yang mengikat pada reseptor ACE2nya. Sains. 2020;368(6496):1274–1278.
40. Yuan M, et al. Dampak struktur dan fungsi hanyut antigen dalam varian SARS-CoV-2 terkini. Sains. 2021;373(6556):818–823.
41. Yan Q, et al. Germline IGHV3-53-antibody peneutral penyasaran RBD yang dikodkan biasanya terdapat dalam repertoir antibodi pesakit COVID-19. Jangkitan Mikrob Muncul. 2021;10(1):1097–1111.
42. Zhang Q, et al. Antibodi awam IGHV3- 53/3-66 yang kuat dan pelindung serta mutan melarikan diri bersama mereka pada lonjakan SARS-CoV-2. Nat Commun. 2021;12(1):4210.
43. Wang Z, et al. Antibodi yang ditimbulkan vaksin mRNA kepada SARS-CoV-2 dan varian yang beredar. alam semula jadi. 2021;592(7855):616–622.
44. Simon V, et al. PARIS dan SPARTA: mencari tumit Achilles SARS-CoV-2. mSphere. 2022;7(3):e0017922.
45. Starr TN, et al. Antibodi SARS-CoV-2 RBD yang memaksimumkan keluasan dan rintangan untuk melarikan diri. alam semula jadi. 2021;597(7874):97–102.
46. Dinding AC, et al. Struktur, fungsi dan antigenik bagi glikoprotein pancang SARS-CoV-2. sel. 2020;181(2):281–292.
47. Henderson R, et al. Mengawal konformasi glikoprotein lonjakan SARS-CoV-2. Nat Struct Mol Biol. 2020;27(10):925–933.
48. Shrestha LB, et al. Meneutralkan antibodi secara meluas terhadap Varian SARS-CoV-2 yang muncul. Imunol hadapan. 2021;12:752003.
49. Greaney AJ, et al. Antibodi yang ditimbulkan oleh vaksinasi mRNA-1273 mengikat lebih luas pada domain pengikat reseptor berbanding dengan jangkitan SARS-CoV-2. Sci Transl Med. 2021;13(600):eabi9915.
50. Reincke SM, et al. SARS-CoV-2 Jangkitan varian Beta menimbulkan antibodi khusus keturunan dan reaktif silang yang kuat. Sains. 2022;375(6582):782–787.
51. Wrammert J, et al. Antibodi reaktif silang secara meluas menguasai tindak balas sel B manusia terhadap jangkitan virus influenza H1N1 pandemik 2009. J Exp Med. 2011;208(1):181–193.
52. Guthmiller JJ, et al. Pendedahan pertama kepada pandemik H1N1 yang disebabkan oleh antibodi meneutralkan secara meluas yang menyasarkan epitop kepala hemagglutinin. Sci Transl Med. 2021;13(596):eabg4535.
53. Bajic G, et al. Kejuruteraan antigen influenza memfokuskan pada tindak balas imun terhadap epitop virus yang subdominan tetapi melindungi secara meluas. Mikrob Hos Sel. 2019;25(6):827–835.
54. Nachbagauer R, et al. Pendekatan vaksin virus influenza universal berasaskan hemagglutinin chimeric mendorong imuniti yang luas dan tahan lama dalam percubaan fasa I terkawal secara rawak dan plasebo. Nat Med. 2021;27(1):106–114.
55. Angeletti D, et al. Melebihi imunodominan untuk menyasarkan epitop meneutralkan subdominan secara meluas. Proc Natl Acad Sci US A. 2019;116(27):13474–13479.
56. Guthmiller JJ, et al. Kaedah yang cekap untuk menjana antibodi monoklonal daripada Sel B manusia. Kaedah Mol Biol. 2019;1904:109–145.
57. Amanat F, et al. Ujian serologi untuk mengesan penukaran sero-2 SARS-CoV pada manusia. Nat Med. 2020;26(7):1033–1036.
58. Stadlbauer D, et al. Penukaran sero SARS-CoV-2 pada manusia: protokol terperinci untuk ujian serologi, pengeluaran antigen dan persediaan ujian. Curr Protoc Microbiol. 2020;57(1):e100.
59. Torres JL, et al. Cerapan struktur antibodi monoklonal manusia SARS-CoV{3}} yang sangat kuat meneutralkan pan. Proc Natl Acad Sci USA. 2022;119(20):e2120976119.
60. Suloway C, et al. Mikroskopi molekul automatik: sistem Leginon baharu. J Struct Biol. 2005;151(1):41–60.
61. Lander GC, et al. Appion: saluran paip bersepadu yang dipacu pangkalan data untuk memudahkan pemprosesan imej EM. J Struct Biol. 2009;166(1):95–102.
62. Voss NR, et al. DoG Picker dan TiltPicker: alat perisian untuk memudahkan pemilihan zarah dalam mikroskop elektron zarah tunggal. J Struct Biol. 2009;166(2):205–213.
63. Pettersen EF, et al. UCSF Chimera--sistem visualisasi untuk penyelidikan dan analisis penerokaan. J Comput Chem. 2004;25(13):1605–1612.
64. Punjani A, et al. Penapisan tidak seragam: penyesuaian penyesuaian memperbaik pembinaan semula cryo-EM zarah tunggal. Kaedah Nat. 2020;17(12):1214–1221.
65. Zhang K. Gctf: Penentuan dan pembetulan CTF masa nyata. J Struct Biol. 2016;193(1):1–12.
66. Zivanov J, et al. Alat baharu untuk penentuan struktur cryo-EM resolusi tinggi automatik dalam RELION-3. Elife. 2018;7:e42166.
67. Casanal A, et al. Perkembangan semasa dalam coot untuk pembinaan model makromolekul bagi elektron cryo-mikroscopy dan data kristalografi. Sains Protein. 2020;29(4):1069–1078.
68. Frenz B, et al. Membetulkan ralat secara automatik dalam struktur glikoprotein dengan rosetta. Struktur. 2019;27(1):134–139.
69. Klaholz BP. Menghasilkan dan memperhalusi model atom dalam kristalografi dan cryo-EM: alat Phenix terkini untuk memudahkan analisis struktur. Acta Crystallogr D Struct Biol. 2019;75(pt 10):878–881.
70. Pettersen EF, et al. UCSF ChimeraX: Visualisasi struktur untuk penyelidik, pendidik dan pembangun. Sains Protein. 2021;30(1):70–82.
71. Otwinowski Z, Minor W. Memproses data pembelauan sinar-X yang dikumpul dalam mod ayunan. Kaedah Enzim. 1997;276:307–326.
72. McCoy AJ, et al. Perisian kristalografi fasa. J Appl Crystallogr. 2007;40(pt 4):658–674.
73. Qiang M, et al. Meneutralkan antibodi kepada SARS CoV-2 telah dipilih daripada perpustakaan antibodi manusia yang dibina beberapa dekad yang lalu. Adv Sci (Weinh). 2022;9(1):e2102181.
74. Emsley P, Cowtan K. Coot: alat pembinaan model untuk grafik molekul. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2004;60(pt 12 pt 1):2126–2132.
75. Adams PD, et al. PHENIX: sistem berasaskan Python yang komprehensif untuk penyelesaian struktur makromolekul. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2010;66(pt 2):213–221.
76. Montiel-Garcia D, et al. Epitope-Analyzer: Alat web berasaskan struktur untuk menganalisis epitop meneutralkan secara meluas. J Struct Biol. 2022;214(1):107839.