EDS1-berinteraksi J Protein 1 Merupakan Pengatur Negatif Penting Kekebalan Semula Jadi Tumbuhan dalam Arabidopsis

Abstrak

Tumbuhan telah mengembangkan mekanisme yang tepat untuk mengoptimumkan tindak balas imun terhadap patogen. KERENDAHAN PENYAKIT YANG DIPERTINGKAT 1 (EDS1) memainkan peranan penting dalam imuniti semula jadi tumbuhan dengan mengawal rintangan basal dan imuniti yang dicetuskan oleh effector. Pemerdagangan nukleositoplasma EDS1 diperlukan untuk pengukuhan rintangan, tetapi mekanisme molekul masih sukar difahami. Di sini, kami menunjukkan bahawa EDS1-BERINTERAKSI J PROTEIN1 (EIJ1), yang bertindak sebagai pendamping seperti protein DnaJ sebagai tindak balas kepada jangkitan patogen, berfungsi sebagai pengawal selia negatif penting imuniti tumbuhan dengan berinteraksi dengan EDS1. Mutasi kehilangan fungsi EIJ1 tidak menjejaskan pertumbuhan tumbuhan tetapi meningkatkan rintangan patogen dengan ketara. Selepas jangkitan patogen, EIJ1 berpindah dari kloroplas ke sitoplasma, di mana ia berinteraksi dengan EDS1, dengan itu menyekat pemerdagangan EDS1 yang dicetuskan oleh patogen ke nukleus dan menjejaskan rintangan pada peringkat jangkitan awal. Semasa perkembangan penyakit, EIJ1 secara beransur-ansur terdegradasi, membenarkan pengumpulan nuklear EDS1 untuk pengukuhan rintangan transkrip. Strain avirulen Pst DC3000 (AvrRps4) memansuhkan tindakan penindasan EIJ1 dengan cepat mendorong kemerosotannya dalam tindak balas imuniti yang dicetuskan oleh effector. Oleh itu, penemuan kami menunjukkan bahawa EIJ1 ialah pengawal selia negatif bergantung{23}}EDS penting bagi imuniti tumbuhan semula jadi dan memberikan pemahaman mekanistik tentang cara taburan nuklear berbanding sitoplasma EDS1 dikawal semasa tindak balas imun.

manfaat cistanche-menguatkan sistem imun

pengenalan

Tumbuhan telah mengembangkan rangkaian yang rumit untuk memodulasi tindak balas imun mereka. Untuk mempertahankan diri mereka daripada patogen, tumbuhan menggunakan dua strategi pengawalseliaan utama: imuniti tercetus corak (PTI) dan imuniti tercetus kesan (ETI). PTI dikawal oleh reseptor pengecaman corak (PRR) yang mengenali corak molekul yang berkaitan dengan patogen atau mikrob (Zipfel, 2008). Untuk memudahkan jangkitan, patogen virulen menekan PTI dengan merembeskan pengesan patogen, dan mereka memanipulasi sel perumah untuk memudahkan pemerolehan nutrien dan akhirnya pembiakan (Tsuda dan Katagiri, 2010). Rintangan tahap rendah yang ditunjukkan oleh tumbuhan terhadap patogen virulen ini dipanggil rintangan basal (Jones dan Dangl, 2006; Klessig et al., 2018). Sebaliknya, ETI dimediasi oleh protein rintangan penyakit (R) yang dikodkan tumbuhan, yang boleh secara langsung atau tidak langsung mengenali kehadiran efektor yang dirembes oleh patogen (Tsuda dan Katagiri, 2010). Kebanyakan protein R mengandungi tapak pengikat nukleotida dan domain ulangan yang kaya dengan leucine (NB-LRR). Protein NB-LRR yang mengandungi domain interaksi protein-protein reseptor N-terminal/Interleukin{16}} (TIR) ​​dikenali sebagai protein TIR-NB-LRR (TNL), dan ia terdiri daripada kumpulan terbesar NB- Protein LRR (Caplan et al., 2008). Berbanding dengan rintangan basal, ETI mendorong tindak balas pertahanan yang lebih kuat dan lebih pantas terhadap patogen dan selalunya disertai dengan kematian sel tempatan, ciri ciri tindak balas hipersensitif (HR; Dodds dan Rathjen, 2010). PENINGKATAN KERENCANAN PENYAKIT 1 (EDS1), pengawal selia pusat imuniti tumbuhan, membantu mengawal rintangan basal dengan menyekat pencerobohan patogen biotropik dan hemibiotropik (Wiermer et al., 2005). EDS1 juga memainkan peranan penting dalam ETI, yang terutamanya dimediasi oleh kelas TNL protein R (Heidrich et al., 2012). EDS1 bekerja rapat dengan pengatur terasnya PHYTOALEXIN DEFICIENT 4 dan SENESCENCE-ASSOCIATED GENE 101 dalam sitoplasma dan/atau nukleus untuk mengawal selia pengeluaran spesies oksigen reaktif (ROS) intraselular, pengumpulan asid salisilik (SA) dan proses lain, sekali gus mengukuhkan rintangan patogen (Ruste ´rucci et al., 2001; Rietz et al., 2011; Wagner et al., 2013). Oleh itu, mutan Arabidopsis eds1 sangat terdedah kepada Pseudomonas syringae pv. ketegangan tomato (Pst) DC3000 dan menunjukkan ETI pengantara TNL yang terjejas, di mana ekspresi ISOCHORISMATE SYNTHASE1 (ICS1; gen biosintesis SA) dan biosintesis SA dihalang (Parker et al., 1996; Feys et al., 2001; Bartsch et. al., 2006). Di samping itu, EDS1 mempamerkan pemerdagangan protein antara sitoplasma dan nukleus yang dimediasi oleh reseptor pengangkutan nuklear (Garcı'a et al., 2010). Walaupun fungsi nuklear EDS1 melibatkan rintangan basal dan pengeluaran ROS, kematian sel yang diprogramkan dan pengukuhan rintangan memerlukan penyelarasan penyetempatan nuklear berbanding sitoplasma EDS1 (Heidrich et al., 2011). Keseimbangan antara jumlah EDS1 dalam sitosol dan jumlah dalam nukleus adalah penting untuk rintangan basal yang cekap dan imuniti yang dicetuskan TNL (Garcı´a et al., 2010). Walau bagaimanapun, bagaimana EDS1 mengekalkan corak pengedaran nukleositoplasma semasa tindak balas imun semula jadi tumbuhan masih tidak jelas. Protein DnaJ (atau protein J) ialah protein pendamping (Pulido dan Leister, 2018) yang tergolong dalam superfamili domain kaya sistein (Cys) dan mengambil bahagian dalam lipatan dan pemasangan protein yang baru lahir, pengangkutan protein merentasi membran dengan lipatan semula seterusnya, dan pelupusan protein yang tidak dilipat atau rosak (Bukau et al., 2006). Proses ini diperlukan untuk fungsi normal kebanyakan protein selular pada peringkat perkembangan yang berbeza (Pulido dan Leister, 2018). Penyelidikan dalam pelbagai organisma menunjukkan bahawa protein DnaJ juga memainkan peranan yang pelbagai dalam tindak balas tekanan biotik dan abiotik, terutamanya dalam tindak balas imun. Dalam Nicotiana benthamiana, protein DnaJ Nb-MIP1 berfungsi sebagai cochaperone dalam tindak balas kepada patogen virus (Du et al., 2013). Kacang soya (Glycine max L.) Protein kejutan haba Gm 40 (HSP40.1), protein DnaJ yang disetempatkan nukleus, ialah pengawal selia positif rintangan terhadap virus mozek kacang soya (Liu dan Whitham, 2013). Dalam tomato (Solanum lycopersicum), protein DnaJ setempat kloroplas, Le-CDJ2, dilaporkan meningkatkan daya tahan terhadap patogen bakteria, Pseudomonas solanacearum (Wang et al., 2014). Selain itu, protein berinteraksi Tsi1-1 (Tsip1), sejenis protein DnaJ tembakau (Nicotiana tabacum) dilaporkan mengawal pengaktifan transkrip pengantara Tsi{71}}sebagai tindak balas kepada tekanan (Ham et al., 2006). Keputusan ini menunjukkan dengan jelas bahawa protein DnaJ memainkan peranan penting dalam imuniti tumbuhan, walaupun mekanisme asas memerlukan siasatan lanjut. Dalam kajian ini, kami mengasingkan Arabidopsis thaliana EDS1 INTERACTING J PROTEIN 1 (EIJ1), HSP40-seperti protein DnaJ, dan menunjukkan bahawa EIJ1 berinteraksi dengan EDS1 dalam planta. Tumbuhan mutan eij1 yang kehilangan fungsi menunjukkan pertumbuhan normal, rintangan patogen yang lebih kuat, dan ekspresi gen berkaitan rintangan yang lebih tinggi apabila dijangkiti oleh patogen berbanding dengan tumbuhan jenis liar. Walau bagaimanapun, mutasi kehilangan fungsi EIJ1 tidak menyelamatkan fenotip terdedah mutan eds1 apabila dicabar dengan Pst DC3000. Tambahan pula, protein EIJ1, yang biasanya menyetempat kepada kloroplas, dilepaskan daripada kloroplas ke sitoplasma apabila inokulasi patogen, di mana ia berinteraksi dengan EDS1, dengan itu menghalang pemerdagangan yang dicetuskan oleh patogen ke nukleus dan akibatnya menjejaskan tindak balas rintangan pada peringkat awal. peringkat jangkitan. Penemuan ini menjelaskan butiran penting mekanisme pengawalseliaan yang mendasari corak pengedaran nukleositoplasma EDS1 dan menyediakan sasaran yang berpotensi berkesan untuk pembiakan rintangan penyakit dalam tanaman.

manfaat cistanche-menguatkan sistem imun

Keputusan

EIJ1 berinteraksi dengan EDS1 in vitro dan in vivo

Sebagai komponen penting dalam tindak balas pertahanan tumbuhan, EDS1 terletak di nod utama rangkaian isyarat imuniti semula jadi tumbuhan. Untuk mengenal pasti rakan kongsi protein berinteraksi berpotensi EDS1, kami melakukan pemeriksaan dua hibrid ragi. EDS1 menunjukkan interaksi yang kuat dengan Arabidopsis HSP40- seperti protein pendamping (AT2G24860) dengan fungsi yang tidak diketahui (Rajah 1, A dan B), kepunyaan superfamili DnaJ (Tambahan Rajah 1A); protein ini selepas ini dirujuk sebagai EIJ1. Analisis jujukan menunjukkan bahawa EIJ1 mengandungi 144 sisa asid amino, termasuk empat motif jari Zn yang kaya dengan Cys (CXXCXGXG; Rajah Tambahan 1A). Walaupun spesies angiosperma lain mempunyai homolog EIJ1, homolog terdekat kelihatan terhad kepada Brassicaceae (Tambahan Rajah 1B dan Fail S1). Terutama, EIJ1 menunjukkan persamaan jujukan dengan protein N. tabacum Tsip1, yang terlibat dalam rintangan patogen (Tambahan Rajah 1B; Ham et al., 2006). Untuk mengenal pasti domain berfungsi yang bertanggungjawab untuk interaksi antara EDS1 dan EIJ1, dua versi terpotong protein ini digunakan dalam ujian dua hibrid ragi (Rajah 1A; Rajah Tambahan 1A). Terminal N EIJ1 menunjukkan interaksi yang kuat dengan EDS1 panjang penuh serta terminal EDS1 N tetapi interaksi yang lemah dengan terminal EDS1 C (Rajah 1B). Ini menunjukkan bahawa terminal N EDS1, yang mengandungi domain seperti lipase, dan terminal N EIJ1 adalah perlu dan mencukupi untuk interaksi mereka. Walaupun terminal C EIJ1 mengandungi domain jari Zn yang kaya dengan Cys yang boleh memudahkan pengikatannya kepada DNA atau protein lain, ia tidak menyumbang kepada interaksi dengan EDS1. Ujian tarik ke bawah mengesahkan lagi interaksi antara EDS1 dan EIJ1 secara in vitro (Rajah 1C), manakala ujian co-imunoprecipitation (Co-IP) menggunakan 35Spro: EIJ1- 6HA 35Spro: EDS1-3tumbuhan transgenik FLAG mengesahkan interaksi mereka dalam planta (Rajah 1D). Diambil bersama, keputusan ini menunjukkan bahawa EDS1 berinteraksi dengan EIJ1 secara in vitro dan in vivo. Pencirian EIJ1 Untuk menentukan penyetempatan subselular EIJ1, kami menggabungkan bingkai bacaan terbuka EIJ1 dengan gen wartawan mCherry di bawah kawalan promoter virus mozek kembang kol 35S untuk menjana binaan 35Spro: EIJ1-mCherry. Konstruk ini telah diubah secara sementara menjadi daun N. benthamiana secara agroinfiltrasi. Mikroskopi pendarfluor menunjukkan bahawa EIJ1-mCherry telah disetempatkan pada kedua-dua kloroplas dan nukleus (Rajah 2A). Corak penyetempatan ini telah disahkan oleh analisis imunoblot bagi tumbuhan 35Spro: EIJ1-6HA (Tambahan Rajah 2). Untuk menyiasat corak ekspresi EIJ1, jujukan genomik EIJ1 telah digabungkan dengan gen wartawan ß-glucuronidase (GUS) untuk menjana EIJ1pro: EIJ1-garisan Arabidopsis transgenik GUS. Aktiviti GUS yang kuat dikesan dalam daun dan akar roset; walau bagaimanapun, aktiviti GUS adalah lemah dalam silik dan tidak dapat dikesan pada batang dan bunga (Rajah 2B). Keputusan ini konsisten dengan keputusan ekspresi untuk EIJ1, yang telah diperiksa oleh transkripsi terbalik kuantitatif-PCR (RT-PCR) dalam pelbagai tisu (Rajah 2C). Memandangkan EDS1 ialah pengawal selia pusat imuniti tumbuhan (Saikat et al., 2011), kami menyiasat sama ada EIJ1, kofaktor yang diduga EDS1, juga terlibat dalam tindak balas terhadap jangkitan patogen. Tahap transkrip EIJ1 telah diinduksi oleh rawatan sama ada bakteria hemibiotropik Pst DC3000 atau SA (Rajah 2D). Pewarnaan GUS mendedahkan bahawa EIJ1 telah diinduksi dan tertumpu dengan ketara di sekitar trikoma dalam daun berinokulasi Pst DC3000-(Rajah 2E–G), membayangkan kemungkinan perkaitan biologi EIJ1 dalam tindak balas pertahanan (Xin dan He, 2013). Seterusnya, kami meneliti tahap EIJ1 dalam 35Spro: EIJ1-HA loji yang dirawat dengan Pst DC3000 atau SA. Menariknya, selepas rawatan Pst DC3000 atau SA, EIJ1 secara beransur-ansur terdegradasi selepas induksi cepat (Rajah 2, H dan I). Keputusan ini tidak konsisten dengan corak ekspresi stabil EIJ1-HA yang diperhatikan dalam tumbuhan 35Spro: EIJ1-HA semasa jangkitan patogen (Tambahan Rajah 3), yang menunjukkan peraturan pascatranskrip EIJ1. Bersama-sama, keputusan ini menunjukkan bahawa EIJ1 terlibat dalam tindak balas imun tumbuhan.

manfaat cistanche untuk lelaki-menguatkan sistem imun

Mutasi kehilangan fungsi EIJ1 meningkatkan rintangan kepada Pst DC3000 melalui laluan SA

Untuk menyiasat peranan EIJ1 dalam imuniti tumbuhan, kami mengenal pasti mutan Arabidopsis (SALK_142975) yang mengandungi sisipan T-DNA dalam ekson ketiga EIJ1 (Rajah 3, A dan B). Analisis RT-PCR kuantitatif menunjukkan bahawa EIJ1 kurang dinyatakan dalam mutan sisipan T-DNA eij1 ini; oleh itu, kami menamakan alel EIJ1 ini eij{{10}} (Rajah 3C). Selepas itu, kami menilai fenotip rintangan penyakit tumbuhan mutan 3-eij{14}} berumur seminggu dan Arabidopsis (A. thaliana) ekotaip Columbia (Col-0; jenis liar) dengan inokulasi dengan Pst DC3000. Penilaian daun yang dijangkiti pada 5 hari selepas inokulasi (dpi) mendedahkan lebih sedikit lesi nekrotik pada daun eij1-1 berbanding daun Col-0 (Rajah 3D). Secara konsisten, daun eij1-1 menunjukkan titer bakteria yang jauh lebih rendah daripada daun Col-0 pada 5 dpi, walaupun titer bakteria tidak menunjukkan perbezaan antara daun Col{-0 dan eij1-1 pada 0 dpi (Rajah 3E). Seterusnya, kami menjana eij1-1 EIJ1pro: EIJ1-6garisan pelengkap HA dengan mengubah serpihan genomik EIJ1 yang digabungkan dengan jujukan teg 6xHA ke latar belakang eij1-1. Garis pelengkap menyelamatkan sepenuhnya fenotip rintangan patogen eij1-1 (Rajah 3E), menyokong bahawa eij1-1 ialah mutan kehilangan fungsi. Untuk menentukan kesan EIJ1 pada imuniti apoplastik, fenotip rintangan penyakit garis pelengkap ini juga dinilai oleh penyusupan tekanan Pst DC3000, dan keputusan yang sama diperolehi (Tambahan Rajah 4A). Untuk mengesahkan fungsi EIJ1, kami kemudiannya mengenal pasti satu lagi Arabidopsis mutant eij1-2 (WiscDsLox343G09), yang mengandungi sisipan T-DNA di kawasan promoter EIJ1 (Tambahan Rajah 5, A dan B). Transkrip EIJ1 hampir tidak dapat dikesan dalam mutan eij1-2, menunjukkan bahawa eij1-2 ialah alel nol EIJ1. Sama seperti eij1-1, ujian pertumbuhan bakteria mendedahkan bahawa eij1-2 hadir pada titer bakteria yang jauh lebih rendah daripada Col-0 (Tambahan Rajah 5, D dan E). Ringkasnya, keputusan ini menunjukkan bahawa EIJ1 memainkan peranan penindasan yang penting dalam tindak balas imun tumbuhan.

Rajah 1 EIJ1 berinteraksi dengan EDS1 in vitro dan in planta. (A) Gambar rajah skema yang menunjukkan domain yang terdapat dalam EIJ1, EDS1, dan versi terpotongnya. (B) Ujian dua hibrid ragi menunjukkan interaksi antara EIJ1, EDS1, dan versi terpotongnya. Sel yis yang telah diubah telah ditanam pada medium SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade dan SD/-Trp/-Leu. Kawalan kosong, vektor sahaja; AD, domain pengaktifan; BD, domain pengikat DNA. ( C ) Ujian tarik ke bawah menunjukkan interaksi langsung antara protein gabungan His-EIJ1 dan GST-EDS1 secara in vitro. Protein-EIJ1nya diinkubasi dengan protein GST atau GST-EDS1 yang tidak bergerak. Fraksi imunopresipitasi dikesan oleh antibodi anti-His dan anti-GST, masing-masing. ( D ) Co-IP menunjukkan interaksi EIJ1 dan EDS1 dalam daun Arabidopsis. Jumlah protein yang diekstrak daripada 3-minggu 35Spro: EIJ1-6HA (sebagai kawalan genotip) dan 35Spro: EIJ1-6HA 35Spro: EDS1-3daun FLAG telah imunopresipitasi oleh sama ada antibodi anti-BENDERA atau serum praimun (IgG). Protein coimmunoprecipitated dikesan menggunakan antibodi anti-FLAG dan anti-HA, masing-masing. Keputusan perwakilan yang dibentangkan dalam (B-D) diulang secara bebas tiga kali.

Pengeluaran hidrogen peroksida (H2O2), sejenis spesies oksigen reaktif, adalah ciri kejayaan pengiktirafan patogen dan pengaktifan tindak balas pertahanan tumbuhan seterusnya, termasuk kematian sel terprogram berkaitan HR (Lam et al., 2001; Torres et al., 2006; Nanda et al., 2010). Oleh itu, kami memantau tahap H2O2 dalam 3-Kol yang diinokulasi patogen berusia seminggu-0, eij1-1 dan eij1-1 EIJ1pro: EIJ1-6HA tumbuhan menggunakan kaedah pewarnaan 3,3-diaminobenzidine (DAB). Keputusan menunjukkan bahawa H2O2 terkumpul ke paras yang tinggi dalam tumbuhan yang dijangkiti tetapi tidak dikesan dalam tumbuhan yang tidak diinokulasi (olok-olok) (Rajah 3F). Tahap H2O2 yang lebih tinggi telah dikesan dalam daun eij1-1 berbanding daun Col- 0 dan garisan pelengkap yang diinokulasi dengan Pst DC3000 (Rajah 3F). Tambahan pula, manakala pewarnaan trypan-biru mendedahkan bahawa kematian sel (microHR, Alvarez et al., 1998) berlaku pada daun eij1-1 pada 24-h selepas inokulasi (HPI) dengan Pst DC3000, tetapi tidak microHR telah diperhatikan dalam loji Col-0 dan eij1-1 EIJpro1:EIJ1-6HA (Rajah 3G). Inokulasi dengan avirulen Pst DC3000 (AvrRps4) menghasilkan pengumpulan H2O2 yang lebih tinggi dan lebih banyak mikroHR, walaupun tiada perbezaan yang dapat dilihat di antara ketiga-tiga genotip ini (Rajah 3, F, dan G). Keputusan ini membayangkan peranan penting EIJ1 dalam rintangan basal kepada patogen.

Rajah 2 Corak ekspresi mRNA dan protein EIJ1. (A) Penyetempatan kloroplas dan nukleus EIJ1. Protein gabungan EIJ1-mCherry diekspresikan secara sementara dalam daun N. benthamiana dan dianalisis dengan mikroskop confocal. Pendarfluor DAPI menunjukkan nukleus. Pendarfluor klorofil ditunjukkan sebagai warna hijau. Bar=10 lm. (B) Pewarnaan GUS yang menunjukkan ekspresi EIJ1 dalam akar, batang, daun roset, bunga, silik dan 10-anak benih berumur sehari (dari kiri ke kanan). Bar=1 mm. (C) Corak ekspresi EIJ1 dalam pelbagai tisu tumbuhan Col termasuk akar, batang, daun roset, bunga, dan silik, seperti yang dikesan oleh qRT-PCR. Ungkapan relatif dikira dengan menormalkan tahap transkripsi gen yang diperiksa terhadap ACTIN2 (sama seperti di bawah). Data adalah min ± SD bagi tiga replika biologi. Huruf kecil menunjukkan perbezaan yang ketara (ANOVA sehala, P 5 0.01; Set Data Tambahan 1). (D) Analisis ekspresi EIJ1 menggunakan 3-tumbuhan Col berusia seminggu yang diinokulasi dengan Pst DC3000 (OD600=0.1) atau disembur dengan 0.05 mM SA. Data tersebut ialah min ± SD bagi tiga replika biologi (Set Data Tambahan 1). (E-G) Pewarnaan GUS menunjukkan induksi ekspresi EIJ1 oleh patogen. Tumbuhan pEIJ1:EIJ1-GUS yang berumur tiga minggu telah disuntik (10 mM MgCl2; E) atau disuntik dengan Pst DC3000 (OD600=0.1; F). Bar=1 mm. Gambar yang diperbesarkan menunjukkan bahawa EIJ1-GUS tertumpu di kawasan trikoma dalam (G). Bar=100 lm. Daun pada 4 hpi dituai dan diinkubasi dengan larutan pewarnaan GUS. (H) dan (I) Corak ekspresi EIJ1 berikutan rawatan Pst DC3000 atau SA. Jumlah protein telah diekstrak daripada 3-minggu 35Spro: EIJ1-6tumbuhan HA yang dicelup dengan Pst DC3000 (OD600=0.1; H) atau disembur dengan 0.05 mM SA (I), dan dikesan menggunakan antibodi anti-HA. Panel bawah menunjukkan pewarnaan dengan Coomassie Brilliant Blue (CBB) sebagai kawalan pemuatan. Analisis imunoblot yang dibentangkan dalam (H) dan (I) diulang secara bebas tiga kali.

Rajah 3 Pengenalpastian alel eij bermutasi Arabidopsis EIJ11-1. (A) Gambarajah skematik menunjukkan tapak sisipan T-DNA dalam eij1-1 (SALK_142975). Ekson diwakili oleh kotak dan intron dengan garisan antara kotak. Kotak hitam menunjukkan kawasan pengekodan EIJ1, dan kotak putih mewakili wilayah yang tidak diterjemahkan. Segitiga menunjukkan tapak sisipan T-DNA. (B) Penguatan PCR DNA genomik mengesahkan bahawa eij1-1 ialah mutan sisipan homozigot. Primer yang digunakan (P1, P2) ditunjukkan dalam (A). LB menunjukkan primer sempadan kiri T-DNA dan M menunjukkan penanda molekul DNA. (C) analisis qRT-PCR bagi ekspresi EIJ1. Jumlah RNA telah diekstrak daripada 3-daun eij1 dan Col yang berumur seminggu. Ungkapan relatif EIJ1 dalam eij1-1 telah ditetapkan kepada 1. Data ialah min ± SD bagi tiga replika biologi (Set Data Tambahan 1). (D) Fenotip rintangan penyakit Col, eij1-1 dan dua wakil garis transgenik pelengkap EIJ1 eij1 EIJ1pro: EIJ1-6HA. Tumbuhan berusia tiga minggu telah diinokulasi dengan Pst DC3000 (OD600=0.05). Daun yang ditunjukkan telah difoto pada 5 dpi. Bar=5 mm. (E) Pertumbuhan bakteria Pst DC3000 pada tumbuhan yang diterangkan dalam (D) pada 0 dan 5 dpi. cfu/g, unit pembentuk koloni per g berat segar. Data adalah min ± SD bagi tiga replika biologi. Huruf kecil menunjukkan perbezaan yang ketara (ANOVA sehala, P 5 0.01, Set Data Tambahan 1). (F) Pemeriksaan tahap H2O2 dalam daun Col,

EIJ1 mengantara imuniti tumbuhan dengan menindas aktiviti EDS1

Untuk memahami hubungan genetik antara EDS1 dan EIJ1, kami menghasilkan eij1-1 eds1-22 garis mutan berganda dengan menyilangkan eij1-1 mutan dengan eds1-22, kehilangan- alel mutan berfungsi EDS1-90 (AT3G48090; latar belakang Col-0), yang mempamerkan rintangan patogen yang terjejas (Yang dan Hua, 2004). Tiada perbezaan morfologi diperhatikan di kalangan tumbuhan mutan eij1-1, eds1-22 dan eij1-1 eds1-22 di bawah keadaan pertumbuhan normal (Rajah 4, A dan B). Selepas inokulasi dengan Pst DC3000, loji mutan eij{19}} menunjukkan rintangan yang lebih kuat daripada loji Col-0 pada 5 dpi (Rajah 4, A dan B). Walau bagaimanapun, mutan berganda eij1-1 1-22 menunjukkan lesi nekrotik yang luar biasa dan titer bakteria yang tinggi, setanding dengan mutan tunggal1-22 eds, menunjukkan bahawa alel eij1-1 tidak dapat untuk menyelamatkan fenotip eds yang mudah terdedah kepada penyakit1-22 (Rajah 4, A dan B). Rintangan penyakit juga dinilai berikutan penyusupan tekanan Pst DC3000, dan keputusan yang sama diperolehi (Tambahan Rajah 4B). Tambahan pula, kami menggunakan alel nol EDS1, eds1-2; Kol{34}} latar belakang; Bartsch et al., 2006), untuk menjana eij1-1 eds1-2 loji mutan berganda untuk analisis genetik. Sama seperti eij1-1 eds1-22, eij1-1 eds1-2 double mutant loji juga menunjukkan lesi nekrotik yang luar biasa dan titer bakteria yang lebih tinggi daripada eij1-1, iaitu setanding dengan eds1-2 mutan tunggal (Tambahan Rajah 6). Bukti genetik ini menunjukkan bahawa EDS1 adalah epistatik kepada EIJ1. Selaras dengan pemerhatian di atas, H2O2 terkumpul ke tahap tinggi dalam daun eij1-1 tetapi ke tahap rendah dalam daun1- 22 dan eij1-1 daun1-22, berbanding dengan Col{{ 53}} daun, selepas inokulasi Pst DC3000 (Rajah 4C). Tambahan pula, mikroHR dalam eij1-1 jelas ditindas oleh kehilangan fungsi EDS1 pada 24 hpi dengan Pst DC3000 atau avirulen Pst DC3000 (AvrRps4; Rajah 4D). Selaras dengan keputusan ini, tahap ungkapan ICS1 dan PR1 dalam tumbuhan eij1-1 eds1-22 and eds1-22 adalah setanding tetapi jauh lebih rendah daripada dalam eij1-1 dan Col{ {71}} tumbuhan (Rajah 4E). Keputusan ini menyokong bahawa tindak balas imun semula jadi pengantara EIJ{73}}bergantung pada EDS1. Untuk menyiasat peranan interaksi EIJ1–EDS1 dalam tindak balas imun tumbuhan, kami melakukan analisis RNA-seq daun eij1-1, eds1-22 dan Col-0 pada 24 hpi dengan Pst DC3000 ; dengan daun Col{83}} yang tidak diinokulasi telah digunakan sebagai rawatan olok-olok. Sebanyak 2762, 923 dan 622 gen yang diungkap secara berbeza (DEG) telah dikenal pasti dalam Col_Pst DC3000 versus Col_mock, eij1-1_Pst DC3000 versus Col_ Pst DC3000 dan eds1-22_Pst DC3000 versus Col_Perbandingan Pst DC3000. Gen-gen ini kemudiannya dirujuk sebagai gen yang bertindak balas patogen, EIJ1-terkawal dan{100}}gen terkawal, masing-masing (Tambahan Rajah 7A dan Set Data 2). Antara gen ini, 471 dikawal oleh EIJ1; 396 dikawal oleh EDS1 (Rajah 4F; Set Data Tambahan 2); dan 124 dikawal bersama oleh EIJ1 dan EDS1 (Rajah 4F). Analisis kelompok menunjukkan bahawa 93.5% (116) daripada gen yang dikawal bersama (124) telah dikawal selia oleh EDS1 dan dikawal ke bawah oleh EIJ1 (Rajah 4F; Rajah Tambahan 7B dan Set Data 2), menyokong peranan penindasan EIJ1 pada Fungsi EDS1. Analisis ontologi gen (GO) seterusnya mendedahkan bahawa kebanyakan gen yang dikawal secara antagonis oleh EIJ1 dan EDS1 terutamanya terlibat dalam tindak balas tekanan dan tindak balas imun semula jadi (Rajah 4G; Jadual Tambahan S1). Analisis ini mencadangkan bahawa EIJ1 dan EDS1 mengawal gen berkaitan rintangan dengan cara yang berbeza semasa jangkitan patogen. Sebahagian besar gen terkawal{135}EDS (272/396) tidak dikawal oleh EIJ1, mungkin disebabkan oleh perubahan lipatan bawah (52) atau fungsi bebas EIJ1-EDS1.

cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun

Klik di sini untuk melihat produk Cistanche Enhance Immunity

【Minta lebih lanjut】 E-mel:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

EIJ1 berinteraksi dengan EDS1 dalam sitoplasma dan menghalang pemerdagangan nuklear EDS1

EIJ1 disetempatkan kepada kloroplas dan nukleus sel daun (Rajah 2A), manakala protein EDS1 mempamerkan corak pengedaran nukleositoplasma, yang berlaku di kedua-dua tempat (Garcı´a et al., 2010). Untuk menyiasat di mana dan bagaimana EIJ1 berinteraksi dengan EDS1 dalam planta, kami melakukan ujian ekspresi sementara menggunakan protoplas Arabidopsis. Menariknya, walaupun EIJ1 mengekalkan corak penyetempatan subselular asalnya dalam kloroplas dan nukleus dengan kehadiran protein pendarfluor hijau (GFP; kawalan), EIJ yang disetempatkan kloroplas1-mCherry telah meresap dalam sitoplasma apabila diekspresikan bersama EDS{ {9}}GFP dalam protoplas (Rajah 5A, lihat replika dalam Fail Tambahan 2). Fenomena ini telah disahkan dalam sel epidermis N. benthamiana, di mana EIJ1-mCherry diekspresikan secara sementara dengan sama ada EDS1-GFP atau kawalan GFP (Tambahan Rajah 8, lihat replika dalam Fail Tambahan 2) . Pemerhatian ini menunjukkan bahawa overexpression EDS1 boleh membawa kepada penyetempatan semula subselular EIJ1. Seterusnya, untuk menentukan lokasi subselular di mana EDS1 dan EIJ1 berinteraksi, kami melakukan ujian tarik ke bawah menggunakan protein gabungan Glutathione S-Transferase (GST) -EDS1 rekombinan (umpan) dan jumlah ekstrak protein, pecahan yang habis nukleus, dan nukleus. pecahan diperkaya 35Spro: EIJ1-garisan transgenik HA (protein mangsa). Keputusan kami menunjukkan bahawa EDS1 mengalami immunoprecipitated dengan EIJ1-HA apabila menggunakan jumlah ekstrak protein dan pecahan tersusun nukleus daun 35Spro: EIJ1-HA, tetapi tidak berlaku apabila menggunakan pecahan diperkaya nukleus (Rajah 5B), menunjukkan bahawa interaksi antara EIJ1 dan EDS1 berlaku dalam sitoplasma.

Rajah 4 EIJ1 dan EDS1 mengawal rintangan tumbuhan terhadap patogen secara bertentangan. (A) Fenotip rintangan penyakit Col, eij1-1, eds1-22 dan eij1-1 eds1-22. Tumbuhan berusia tiga minggu telah diinokulasi dengan Pst DC3000 (OD600=0.05). Daun yang ditunjukkan telah difoto pada 5 dpi. Bar=5 mm. (B) Pertumbuhan bakteria Pst DC3000 pada tumbuhan yang diterangkan dalam (A) pada 0 dan 5 dpi. Data adalah min ± SD bagi tiga replika biologi. Huruf kecil menunjukkan perbezaan yang ketara (ANOVA sehala, P 5 0.01, Set Data Tambahan 1). (C) Pemeriksaan tahap H2O2 dalam tumbuhan Col, eij1-1, eds1-22, dan eij1-1 eds1-22. Tumbuhan berusia tiga minggu telah diinokulasi dengan Pst DC3000 atau Pst DC3000 (AvrRps4; OD600=0.1), dan kemudian diwarnakan dengan DAB pada 24 hpi. Bar=500 lm. (D) Analisis kematian sel tumbuhan Col, eij1-1, eds1-22 dan eij1-1 eds1-22. Tumbuhan berusia tiga minggu telah dipinokulasi dengan Pst DC3000 atau Pst DC3000 (AvrRps4; OD600=0.1), dan kemudian diwarnai dengan biru trypan pada 24 hpi. Bar=500 lm.

Memandangkan EIJ1 mengawal selia tindak balas imun tumbuhan secara negatif1-bergantung kepada EDS (Rajah 4), kami seterusnya mengkaji kesan patogen pada interaksi antara EIJ1 dan EDS1. Yang menghairankan, jangkitan Pst DC3000 meningkatkan interaksi EDS1-EIJ1 dalam sitoplasma dan bukannya dalam kedua-dua kloroplas dan nukleus (Rajah 5C, lihat replika dalam Fail Tambahan 2). Penemuan ini, bersama-sama dengan corak pengedaran nukleo-sitoplasma EDS1 dan peranan penyetempatan nuklear EDS1 dalam pengukuhan rintangan patogen pada tahap transkrip (Garcı'a et al., 2010), memaksa kami untuk menyiasat peranan EIJ1 dalam pemerdagangan subselular EDS1 semasa jangkitan patogen. Apabila kami secara sementara menyatakan EDS1-3FLAG dalam protoplas Arabidopsis yang diasingkan daripada eij1-1, EIJ1 dan loji Col-0, EIJ1 secara ketara menekan pemerdagangan EDS1 ke dalam nukleus (Tambahan Rajah 9) . Tambahan pula, analisis imunoblot mendedahkan sedikit perbezaan dalam banyaknya jumlah protein EDS1 antara eds1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG and eij1-1 eds1-22 EDS1pro: EDS{{30} }Tumbuhan transgenik BENDERA (Rajah 5D, lihat replika dalam Fail Tambahan 2). Walau bagaimanapun, berbanding dengan eds1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG transgenik loji, Pst DC{36}} inokulasi eij1-1 eds1-22 EDS1pro: EDS13FLAG loji menunjukkan peningkatan yang ketara dalam tahap protein EDS1 yang diperkaya nukleus dan pengurangan tahap EDS1 setempat sitoplasma (Rajah 5D, lihat replika dalam Fail Tambahan 2), mengesahkan peranan penindasan EIJ1 dalam pemerdagangan sitoplasma kepada nukleus EDS1. Seterusnya, kami menguji sama ada proses pengagihan semula ini yang dimediasi oleh interaksi EIJ1-EDS1 menjejaskan peraturan transkrip gen berkaitan rintangan dalam tumbuhan. Binaan 35Spro: EIJ1-mCherry dan 35Spro: EDS1-3FLAG telah diubah secara individu atau bersama-sama dengan binaan wartawan menjadi sel epidermis daun N. benthamiana (Rajah 5E). Pada 24 hpi dengan Pst DC3000, EDS1 mengaktifkan ekspresi PR1 dan ICS1 (Rajah 5F), manakala EIJ1 menghalang ekspresi gen{65}}EDS dengan ketara (Rajah 5F). Tidak seperti EIJ1 penuh, hujung terminal N protein EIJ1, yang tidak terjejas dalam eij1-1, tidak dapat menghalang ekspresi PR1 teraruh EDS{72}} (Tambahan Rajah 10, A dan B ), menunjukkan bahawa struktur protein utuh EIJ1 diperlukan untuk fungsi penindasannya. Bersama-sama, keputusan ini menyokong bahawa EIJ1 berfungsi sebagai penindas penting dalam tindak balas rintangan pengantara EDS{77}}dengan mengawal selia pemerdagangan nukleositoplasma EDS1. Oleh kerana protein EIJ1 secara beransur-ansur terdegradasi dalam Pst DC3000-tanah yang disuntik atau dirawat SA selepas induksi awal yang cepat (Rajah 2, H dan I), kami menyiasat sama ada EDS1, seterusnya, mencetuskan degradasi EIJ1 melalui interaksi protein-protein. Ujian degradasi bebas sel dan ujian pengesanan protein in vivo menggunakan eds1-22 35Spro: EIJ1-tumbuhan transgenik HA menunjukkan bahawa ketiadaan mahupun kehadiran EDS1 tidak menjejaskan degradasi EIJ1 (Tambahan Rajah 11), mencadangkan bahawa EDS1 tidak terlibat dalam degradasi EIJ1 yang dicetuskan oleh patogen.

Kebaikan cistanche tubulosa-menguatkan sistem imun

Jangkitan patogen mengubah penyetempatan subselular EIJ1

Interaksi yang dipertingkatkan antara EIJ1 dan EDS1 dalam sitoplasma apabila inokulasi patogen (Rajah 5, B, dan C) membayangkan kemungkinan penempatan semula EIJ1 yang dicetuskan oleh patogen dalam sel tumbuhan. Untuk menguji kemungkinan ini, kami telah memeriksa penyetempatan subselular EIJ1 dalam daun N. benthamiana yang diinokulasi dengan Pst DC3000. Di bawah keadaan yang tidak dijangkiti, EIJ1-mCherry telah disetempatkan pada kloroplas dan nukleus. Walau bagaimanapun, pada 24 dpi, isyarat pendarfluor telah sangat berkurangan dalam kloroplas dan dipertingkatkan dalam sitoplasma (Rajah 6A). Untuk menentukan lebih lanjut sama ada patogen mencetuskan pemisahan EIJ1 daripada kloroplas ke sitoplasma dalam daun, analisis imunoblot protein EIJ1 dilakukan menggunakan tumbuhan transgenik 35Spro: EIJ1-6HA. Jumlah protein, protein kloroplas dan protein sitoplasma telah diasingkan daripada tumbuhan transgenik 35Spro: EIJ1-6HA pada 0 dan 4 hpi dengan Pst DC3000. Kelimpahan EIJ1 telah meningkat dengan ketara dalam pecahan sitoplasma tetapi menurun dalam pecahan kloroplas pada 24 dpi (Rajah 6B, lihat replika dalam Fail Tambahan 2), menunjukkan korelasi negatif antara paras protein EIJ1 dalam kloroplas dan sitoplasma.

Rajah 5 EIJ1 Berinteraksi dengan EDS1 dalam sitoplasma untuk mengantara pemerdagangan nuklear EDS1. ( A ) Analisis ekspresi sementara menunjukkan penyetempatan EDS1 dan EIJ1 dalam protoplas Arabidopsis. Bar=10 lm. (B) Ujian tarik ke bawah interaksi antara EIJ1 dan EDS1. Jumlah protein, pecahan habis nukleus dan pecahan diperkaya nukleus yang diekstrak daripada 3-eij berusia seminggu1-1 35Spro: EIJ1-6tumbuhan transgenik HA diinkubasi dengan protein GST-EDS1 atau GST yang tidak bergerak , masing-masing. IP dikesan menggunakan antibodi anti-HA atau anti-GST. PEPC dan histon H3 digunakan sebagai penanda sitoplasma dan nuklear, masing-masing. Asterisk menunjukkan jalur protein GST-EDS1. (C) Jangkitan Pst DC3000 meningkatkan interaksi protein EDS1 dan EIJ1 dalam sitoplasma. Jumlah protein, pecahan habis nukleus, pecahan diperkaya nukleus dan protein kloroplas telah diekstrak daripada 3-EIJ1pro: EIJ1-6HA 35Spro: EDS1-3tumbuhan FLAG yang dicelup dengan Pst DC3000 (OD600=0.1) atau disuntik olok-olok pada 4 hpi dan diimunopresipitasi menggunakan sama ada antibodi anti-FLAG atau serum praimun (IgG). Protein co-immunoprecipitated dikesan menggunakan antibodi anti-HA dan anti-FLAG. N-habis, pecahan habis nukleus; Pecahan diperkaya N, diperkaya nukleus. PEPC dan histon H3 digunakan sebagai penanda sitoplasma dan nuklear, masing-masing. (D) Analisis imunoblot menunjukkan bahawa EIJ1 mengantara pengedaran sitoplasma berbanding nuklear EDS1. Jumlah protein, pecahan habis nukleus dan pecahan diperkaya nukleus telah diekstrak daripada 3-eds berumur seminggu1-22 EDS1pro: EDS1- 3FLAG dan eij1-1 eds{{59 }} EDS1pro: EDS1-3Tumbuhan transgenik FLAG yang diinokulasi dengan Pst DC3000 (OD600=0.1) atau disuntik olok-olok pada 4 hpi dan dikesan menggunakan antibodi anti-FLAG. Keamatan relatif protein daripada eds1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG dengan rawatan inokulasi palsu ditetapkan kepada 1. M, mock; P, Pst DC3000. PEPC dan histon H3 digunakan sebagai penanda sitoplasma dan nuklear, masing-masing. Keputusan yang dibentangkan dalam (A), (C), dan (D) diulang secara bebas tiga kali (Fail Tambahan 2). (E) dan (F) Analisis sementara aktiviti penganjur PR1 dan ICS1 dikawal oleh EIJ1 dan EDS1. Pelbagai konstruk yang digunakan dalam ujian ekspresi sementara ditunjukkan dalam (E). Sama ada PR1pro: GUS atau ICS1pro: GUS telah ditukarkan bersama dengan efektor atau vektor kosong (Kawalan) kepada daun N. benthamiana yang dimandikan dengan Pst DC3000 (OD600=0.1) selama 24 jam. Aktiviti GUS relatif (GUS/Luciferase) yang menunjukkan tahap ekspresi PR1 dan ICS1 yang dikawal oleh pelbagai pengesan ditunjukkan dalam (F). Data tersebut ialah min ± SD bagi tiga replika biologi (Set Data Tambahan 1). Huruf kecil menunjukkan perbezaan yang ketara (ANOVA sehala, P 5 0.01).

Pemisahan EIJ1 yang dicetuskan oleh patogen dari kloroplas menunjukkan potensi fungsi EIJ1 dalam sitoplasma. Untuk menguji kemungkinan ini, kami mengalihkan protein EIJ1 pada kloroplas dengan melampirkan jujukan penargetan kloroplas (CTS; Lee et al., 2008) ke hujung terminal-N gen wartawan EIJ1-mCherry. Gabungan CTS-EIJ1-mCherry kemudiannya dinyatakan dalam daun N. benthamiana di bawah kawalan promoter asli. Pendarfluor dikesan hanya dalam kloroplas, tetapi tidak dalam sitosol dan nukleus Pst DC3000-daun N. benthamiana yang diinokulasi (Tambahan Rajah 12A). Pemerhatian ini mengesahkan bahawa CTStagged EIJ1 telah dikekalkan dalam kloroplas dan tidak dipaksa masuk ke dalam sitoplasma oleh jangkitan patogen. Kami kemudiannya menghasilkan garisan Arabidopsis transgenik EIJ1pro: CTS-EIJ1-6HA untuk menilai fungsi biologi CTS-EIJ1 dalam tindak balas imun tumbuhan. Seperti yang dijangkakan, tidak seperti eij1-1 EIJ1pro: EIJ1-6HA, garisan eij1-1 EIJ1pro: CTS-EIJ1-6HA tidak menunjukkan perbezaan ketara dalam rintangan terhadap patogen berbanding dengan eij1-1, menunjukkan bahawa EIJ1 yang tidak bergerak dalam kloroplas tidak dapat menyelamatkan fenotip rintangan penyakit eij1-1 (Rajah 6C). Selaras dengan pemerhatian ini, ungkapan PR1 dikekalkan pada tahap tinggi dalam eij1-1 EIJ1pro: CTSEIJ1-6tumbuhan transgenik HA, serupa dengan eij1-1 (Tambahan Rajah 12B). Di samping itu, CTS-EIJ1 mempamerkan kurang keupayaan untuk menindas aktiviti transkripsi EDS1 daripada EIJ1 (Rajah 6, D, dan E). Keputusan ini membawa kami untuk membuat kesimpulan bahawa tindak balas perumah awal terhadap jangkitan patogen mencetuskan penempatan semula subselular EIJ1, yang seterusnya memodulasi tindak balas imun dengan menindas pemerdagangan EDS1 ke dalam nukleus.

EIJ1 mengawal tindak balas yang dicetuskan oleh kesan virulensi

Protein efektor AvrRps4 P. syringae yang dirembeskan oleh sistem rembesan jenis III diiktiraf oleh reseptor TIR-NB-LRR RPS4 untuk memulakan ETI, yang bergantung kepada EDS1 (Gassmann et al., 1999; Wirthmueller et al., 2007; Heidrich et al., 2012). Kami menyuntik daun eij1-1 dengan Pst DC3000 (AvrRps4) atau Pst DC3000 avirulen untuk menilai sama ada EIJ1 terlibat dalam ETI. Daun eij{13}} menunjukkan ketahanan yang lebih besar terhadap Pst DC3000 yang ganas berbanding daun Col{15}} (Rajah 7A). Walau bagaimanapun, tiada perbezaan ketara diperhatikan antara daun Col{17}} dan eij{18}} dalam penentangan terhadap Pst DC3000 (AvrRps4), walaupun kedua-dua genotip menunjukkan rintangan yang lebih besar kepada Pst DC3000 (AvrRps4) avirulen berbanding Pst DC3000 ( Rajah 3, F dan G; Rajah7, A), menunjukkan bahawa EIJ1 mungkin tidak diperlukan untuk RPS4-ETI teraruh. Kami juga menentukan rintangan tumbuhan terhadap Pst DC3000 hrcC, yang mempunyai sistem rembesan jenis III yang rosak dan gagal menyuntik effector ke dalam sel perumah untuk menindas PTI (Gassmann et al., 1999; Gloggnitzer et al., 2014). Kedua-dua daun eij1-1 mutan dan Col-0 menunjukkan rintangan yang sama terhadap Pst DC3000 hrcC (Tambahan Rajah 13), menunjukkan bahawa EIJ1 tidak terlibat dalam PTI.

Memandangkan pengumpulan nuklear EDS1 sangat diperlukan untuk pengaturcaraan semula ekspresi gen pertahanan dan rintangan yang disebabkan oleh TIR-NB-LRR (Garcı´a et al., 2010), kami memeriksa sama ada EIJ1 mengawal selia pengedaran subselular. daripada EDS1 sebagai tindak balas kepada ETI. Daun 3-eds berumur seminggu1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG and eij1-1 eds1-22 EDS1pro: EDS1-3Tumbuhan FLAG telah disemai dengan sama ada Pst DC3000 atau Pst DC3000 (AvrRps4), dan pecahan yang habis nukleus dan diperkaya nukleus telah diekstrak pada 0 dan 4 hp. Selaras dengan kajian terdahulu (Garcı´a et al., 2010), peningkatan dalam penyetempatan nuklear EDS1 telah diperhatikan dalam eds1-22 EDS1pro: EDS1-3Loji FLAG yang diinokulasi dengan Pst DC3000 (AvrRps4), tetapi tidak pada yang disuntik dengan Pst DC3000. Walau bagaimanapun, kehilangan fungsi EIJ1 tidak menjejaskan pengumpulan nuklear ETI yang disebabkan oleh EDS1 (Rajah 7B; lihat replika dalam Fail Tambahan 2). Ini menunjukkan bahawa Pst DC3000 (AvrRps4) avirulen sama ada mencetuskan pemerdagangan EDS1 ke dalam nukleus dengan memintas EIJ1 atau memansuhkan fungsi EIJ1 dalam cara yang tidak diketahui. Untuk menguji kemungkinan ini, kami mengkaji kesan avirulen Pst DC3000 (AvrRps4) pada tahap EIJ1. Sama seperti keputusan yang diperoleh menggunakan garisan overexpression EIJ1 (Rajah 2H), tumbuhan eij1-1 EIJ1pro: EIJ1-6HA yang diinokulasi dengan Pst DC3000 menunjukkan peningkatan pengumpulan EIJ1 pada peringkat awal jangkitan, walaupun EIJ1 secara beransur-ansur terdegradasi selepas 8 hpi (Rajah 7C; lihat replika dalam Fail Tambahan 2). Pengumpulan EIJ1 adalah mencukupi untuk menghalang Pst DC3000-mencetuskan pemerdagangan EDS1 ke dalam nukleus pada peringkat jangkitan awal (Rajah 5, D dan 7, B). Selaras dengan keputusan ini, kehilangan fungsi EIJ1 mempercepatkan pemindahan nuklear EDS1 dalam loji yang dijangkiti (Tambahan Rajah 14). Sebaliknya, Pst DC3000 (AvrRps4) memansuhkan fungsi EIJ1 dengan cepat mendorong degradasi protein EIJ1, tetapi bukan dengan menindas transkripsi gen EIJ1 (Rajah 7C; Rajah Tambahan 15), sekali gus menggalakkan lebih banyak translokasi nuklear EDS1 pada peringkat awal jangkitan (Rajah 7B (Rajah 7B). ). Pemerhatian bahawa tumbuhan eij1-1 yang diinokulasi dengan Pst DC3000 menunjukkan rintangan yang setanding dengan tumbuhan Col-0 dan eij1-1 yang disuntik dengan avirulen Pst DC3000 (AvrRps4) menyokong hipotesis ini. Ini mungkin menjelaskan, sekurang-kurangnya pada tahap tertentu, mengapa strain avirulen, tetapi bukan strain virulen, boleh melekapkan rintangan yang diperkukuh untuk mencetuskan tindak balas ETI. Oleh itu, pemerhatian ini mencadangkan bahawa EIJ1 terlibat dalam tindak balas yang dicetuskan oleh kesan virulensi dalam sel hos.

Rajah 6 Penyetempatan semula EIJ1 kepada sitoplasma adalah perlu untuk rintangan bergantung1-EDS. (A) Jangkitan Pst DC3000 mengubah penyetempatan subselular EIJ1. EIJ1-mCherry diekspresikan sementara dalam daun N. benthamiana yang dimandulkan dengan Pst DC3000 (OD600=0.1) atau disuntik olok-olok selama 24 jam. Bar=10 lm. (B) Jangkitan Pst DC3000 mencetuskan pemisahan EIJ1 daripada kloroplas. Jumlah protein, protein sitoplasma dan protein kloroplastik telah diekstrak daripada 3-minggu EIJ1pro: EIJ1-6tumbuhan HA yang diinokulasi dengan Pst DC3000 (OD600=0.1) atau disuntik olok-olok pada 4 hpi dan dikesan oleh antibodi anti-HA. PEPC, histon H3, dan RbcL digunakan sebagai penanda sitoplasma, nuklear, dan kloroplastik, masing-masing. Keamatan relatif protein dengan rawatan olok-olok ditetapkan kepada 1. Keputusan yang dibentangkan dalam (A) dan (B) diulang secara bebas tiga kali (Fail Tambahan 2). (C) EIJ1 yang tidak bergerak dalam kloroplas tidak dapat memulihkan rintangan eij1-1. Tumbuhan berusia tiga minggu telah diinokulasi dengan Pst DC3000 (OD600=0.05). Titer bakteria Pst DC3000 pada 0 dan 5 dpi telah ditentukan. CTS, isyarat penyetempatan kloroplas. Data tersebut ialah min ± SD bagi tiga replika biologi (Set Data Tambahan 1). (D) dan (E) Analisis sementara aktiviti penganjur PR yang dikawal oleh EIJ1, CTS-EIJ1 dan EDS1. Pelbagai konstruk yang digunakan dalam ujian ekspresi sementara ditunjukkan dalam (D). PR1pro: GUS telah ditukarkan bersama dengan efektor atau vektor kosong (Kawalan) kepada daun N. benthamiana yang dimandikan dengan Pst DC3000 (OD600=0.1) selama 24 jam. Aktiviti GUS relatif (GUS/Luciferase) yang menunjukkan tahap ekspresi PR1 yang dikawal oleh pelbagai efektor ditunjukkan dalam (E). Bar ralat mewakili sisihan piawai bagi sampel bebas tiga kali ganda. Data adalah min ± SD bagi tiga replika biologi. Huruf kecil menunjukkan perbezaan yang ketara (ANOVA sehala, P 5 0.01, Set Data Tambahan 1).

Rajah 7 EIJ1 dan EDS1 memodulasi rintangan asas tumbuhan. (A) Pertumbuhan bakteria mutan Col dan eij1-1. Tumbuhan berusia tiga minggu telah diinokulasi dengan Pst DC3000 atau Pst DC3000 (AvrRps4; OD600=0.05). Titer bakteria Pst DC3000 pada 0 dan 5 dpi telah ditentukan. Data adalah min ± SD bagi tiga replika biologi. Huruf kecil menunjukkan perbezaan yang ketara (ANOVA sehala, P 5 0.01, Set Data Tambahan 1). (B) EIJ1 hampir tidak menjejaskan pengumpulan EDS1 yang dicetuskan oleh Pst DC3000 (AvrRps4) dalam nukleus. Pecahan habis nukleus dan pecahan diperkaya nukleus telah diekstrak daripada 3-eds berusia seminggu1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG and eij1-1 eds1-22 EDS1pro: EDS1-3Tumbuhan transgenik FLAG yang dicelupkan dengan Pst DC3000 (OD600=0.1), Pst DC3000 (AvrRps4; OD600=0.1) atau mock inokulasi pada 4 hpi dan dikesan menggunakan antibodi anti-BENDERA. PEPC dan histon H3 digunakan sebagai penanda sitoplasma dan nuklear, masing-masing. Keamatan relatif protein daripada tumbuhan dengan rawatan olok-olok ditetapkan kepada 1. M, olok-olok; P, Pst DC3000; R, Pst DC3000 (AvrRps4). (C) Jangkitan Pst DC3000 (AvrRps4) menggalakkan kemerosotan protein EIJ1. Jumlah protein telah diekstrak daripada 3-eij berumur seminggu1-1 EIJ1pro: EIJ1-6tumbuhan HA yang diinokulasi dengan Pst DC3000 atau Pst DC3000 (AvrRps4; OD600=0.1) , dan dikesan menggunakan antibodi anti-HA. Panel bawah menunjukkan pewarnaan dengan Coomassie Brilliant Blue (CBB) sebagai kawalan pemuatan. Keputusan perwakilan yang dibentangkan dalam (B) dan (C) diulang secara bebas dua kali lagi dan disiasat dengan antibodi anti-ACTIN sebagai kawalan pemuatan (Fail Tambahan 2). (D) Model hipotesis EIJ1 yang mengawal selia{67}}rintangan asas tumbuhan bergantung kepada EDS. Apabila tumbuhan diserang oleh patogen, EIJ1 dibebaskan dengan cepat daripada kloroplas ke dalam sitoplasma di mana ia berinteraksi dengan EDS1. Interaksi EIJ1–EDS1 menghalang pengaliran EDS1 daripada sitoplasma ke dalam nukleus dan dengan itu mengehadkan rintangan nuklear EDS1, membenarkan pemodulatan EDS{74}}tindak balas imun pengantara. Garis anak panah dan garis tumpul masing-masing menunjukkan pengaktifan dan penindasan.

Perbincangan

Untuk memaksimumkan kemandirian, tumbuhan telah mengembangkan mekanisme yang tepat untuk mengoptimumkan pertumbuhan dan untuk pertahanan terhadap patogen yang menyerang, walaupun banyak butiran mekanisme ini masih tidak jelas. EDS1 menduduki kedudukan penting dalam rangkaian isyarat imuniti semula jadi tumbuhan, kerana ia mengawal rintangan kepada patogen biotropik dan hemibiotropik (Wiermer et al., 2005). Dalam kajian ini, kami mengenal pasti gen, EIJ1, yang menyandikan protein DnaJ pendamping, dan menunjukkan bahawa EIJ1 responsif terhadap jangkitan patogen awal dan memainkan peranan dalam imuniti semula jadi tumbuhan dengan berinteraksi secara langsung dengan EDS1. Berdasarkan penemuan ini, kami mencadangkan model pengawalseliaan untuk EIJ1 (Rajah 7D). Apabila tumbuhan diserang oleh patogen, EIJ1 dibebaskan dengan cepat dari kloroplas ke sitoplasma, di mana ia berinteraksi dengan EDS1. Interaksi EIJ1–EDS1 ini menghalang pengaliran EDS1 daripada sitoplasma ke dalam nukleus, dan ini menyekat rintangan nuklear EDS1, membenarkan pemodulatan EDS{13}}tindak balas imun pengantara seperti induksi biosintesis SA dan ekspresi rintangan -gen berkaitan. Apabila tumbuhan mengalami rangsangan berterusan daripada patogen yang menyerang, EIJ1 secara beransur-ansur terdegradasi, membawa kepada peningkatan pengumpulan nuklear EDS1 untuk pengukuhan rintangan. Penemuan ini menggambarkan peranan penindasan penting EIJ1 semasa tindak balas tuan rumah awal terhadap pencerobohan patogen, mengisi jurang dalam pemahaman kita tentang bagaimana penyetempatan subselular EDS1 dikawal untuk memberikan rintangan.

Analisis jujukan mendedahkan bahawa EIJ1 adalah protein DnaJ. Genom Arabidopsis mengodkan tujuh jenis protein DnaJ klasik yang berbeza (Pulido dan Leister, 2018). Kajian terdahulu menunjukkan bahawa protein DnaJ memainkan peranan penting dan berbeza dalam imuniti tumbuhan. Sebagai contoh, kacang soya (Glycine max) GmHSP40 secara positif mengawal kematian sel dan rintangan penyakit (Liu dan Whitham, 2013). Sebaliknya, protein Os-DjA6 beras (Oryza sativa L.) Os-DjA6 secara negatif mengawal imuniti semula jadi tumbuhan melalui laluan degradasi proteasome yang dimediasi ubiquitination (Zhong et al., 2018). Pengesan virulens Hopl1 khusus P. syringae, yang mengandungi domain J, disasarkan kepada kloroplas, di mana ia berinteraksi dengan jentera tindak balas tegasan tumbuhan (Jelenska et al., 2007). Kajian ini menunjukkan bahawa protein DnaJ memainkan peranan yang pelbagai dalam tindak balas pertahanan tumbuhan. Tsip1, protein N. tabacum DnaJ yang homolog dengan EIJ1, mengawal pengaktifan transkripsi gen yang dimediasi Tsi{13}} sebagai tindak balas kepada tekanan (Ham et al., 2006). Tsi1 mengekod faktor transkripsi jenis APETALA2 (AP2) yang berfungsi sebagai pengawal selia penting dalam kedua-dua tindak balas tekanan biotik dan abiotik dalam N. tabacum (Park et al., 2001). SA mencetuskan penempatan semula Tsip1 dari kloroplas ke sitoplasma, yang memudahkan interaksi antara Tsip1 dan Tsi1 dan kemasukan seterusnya kompleks Tsip1-Tsi1 ke dalam nukleus untuk pengaktifan transkrip gen berkaitan tekanan (Ham et al., 2006) . Tidak seperti Tsip1, EIJ1 disetempatkan kepada kloroplas dan nukleus di bawah keadaan normal dalam kajian ini. Kami menunjukkan bahawa jangkitan patogen mencetuskan penempatan semula EIJ1 daripada kloroplas ke sitoplasma dan bahawa interaksi antara EIJ1 dan EDS1 dalam sitoplasma menghalang EDS1-rintangan nuklear pengantara. Selaras dengan penemuan ini, eij1mutant kehilangan fungsi menunjukkan rintangan yang lebih kuat terhadap patogen berbanding jenis liar (Col-0). Ini mengesahkan bahawa EIJ1 memainkan peranan negatif dalam imuniti semula jadi tumbuhan. Menurut kajian terdahulu, aktiviti nuklear dan sitoplasma yang diselaraskan EDS1 adalah penting untuk tumbuhan melengkapkan tindak balas imun semula jadi kepada patogen (Garcı´a et al., 2010; Heidrich et al., 2011). Penyetempatan nuklear EDS1 diperlukan untuk pemrograman semula transkrip rintangan yang disebabkan oleh TNL untuk mendorong tindak balas pertahanan tumbuhan yang berkaitan dengan SA dan lain-lain (Wirthmueller et al., 2007). Kolam EDS1 sitoplasma juga dikekalkan semasa proses jangkitan untuk rintangan lengkap terhadap patogen (Garcı´a et al., 2010). Pemerhatian ini menimbulkan kebimbangan yang ketara mengenai bagaimana tumbuhan mengawal selia peruntukan EDS1 di antara sitoplasma dan nukleus untuk tindak balas pertahanan yang betul apabila dicabar oleh jangkitan patogen. Di sini, kami menunjukkan bahawa peruntukan tepat EDS1 ke petak subselular yang berbeza dikawal sebahagiannya oleh EIJ1 melalui interaksi protein-protein. Mutasi kehilangan fungsi EIJ1 terutamanya menggalakkan pemerdagangan EDS1 kepada nukleus (Rajah 5, D, dan 7, B), yang membawa kepada peningkatan rintangan penyakit.

Oleh kerana EIJ1 telah diinduksi dengan pantas pada peringkat awal jangkitan patogen dan kemudiannya terdegradasi semasa perkembangan penyakit, kami membuat spekulasi bahawa EIJ1 ialah pengawal selia imuniti negatif yang penting yang membolehkan tumbuhan memperhalusi pertahanan optimum mereka. Penindasan pengantara1-EIJ terhadap aktiviti EDS1 boleh menghalang timbulnya tindak balas imun yang tidak perlu kepada rangsangan jangka pendek seperti serangan sekali-sekala oleh bakteria patogen. Sebagai alternatif, bakteria patogen boleh memanipulasi imuniti perumah dengan mencetuskan pemisahan EIJ1 daripada kloroplas, mungkin dengan merembeskan efektor ganas. Kami tidak boleh mengecualikan kemungkinan bahawa EIJ1 melakukan fungsi yang tidak diketahui dalam kloroplas. Seperti yang kita ketahui, SA, hormon tumbuhan dan molekul isyarat yang terlibat dalam penentangan terhadap patogen biotropik, dibiosintesis terutamanya dalam kloroplas dan kemudian dieksport ke dalam sitoplasma oleh EDS5, pengangkut pelbagai ubat dan toksin (Serrano et al., 2013). EIJ1 berkemungkinan pengawal selia negatif pengumpulan SA, kerana ia mengawal selia ekspresi gen biosintetik SA ICS1 apabila inokulasi patogen (Rajah 4E). Sebagai tambahan kepada penindasan transkrip pengantara EIJ1-melalui interaksinya dengan EDS1, ada kemungkinan EIJ1 juga memainkan peranan langsung dalam biosintesis SA atau pengangkutan SA daripada kloroplas dengan cara yang tidak dikenal pasti. Tidak menghairankan jika EIJ1 dan proses biosintesis SA didapati bersambung dalam kajian masa depan. Menariknya, EIJ1 juga disetempatkan ke nukleus. Walaupun EIJ1 tidak berinteraksi dengan EDS1 dalam nukleus, mungkin kerana kekurangan kofaktor atau pengubahsuaian penting, fungsi EIJ1 yang disetempatkan nukleus layak untuk disiasat lanjut.

cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun

Bakteria patogen menghasilkan efektor intraselular untuk menumbangkan PTI perumah dengan menyasarkan protein rintangan patogen seperti PRR, manakala reseptor seperti NOD sitoplasma tumbuhan merasakan efektor ini untuk memulakan ETI (Dou dan Zhou, 2012; Khan et al., 2016). Kajian terdahulu dan keputusan kami menunjukkan bahawa avirulen Pst DC3000 (AvrRps4) menggalakkan pemerdagangan EDS1 sitoplasma ke dalam nukleus (Garcı´a et al., 2010). Tambahan pula, keputusan kami tidak menunjukkan perbezaan yang ketara dalam Pst DC3000 (AvrRps4)-mencetuskan pengumpulan nuklear EDS1 dan rintangan patogen seterusnya antara tumbuhan mutan Col2012 dan eij1-1 (Rajah 7, A dan B) . Selain itu, rintangan yang ditunjukkan oleh mutan eij1-1 adalah setanding dengan yang ditunjukkan oleh tumbuhan Col-0 yang diinokulasi dengan strain Pst DC3000 hrcC yang rosak sistem rembesan jenis III (Tambahan Rajah 12). Selain itu, pengumpulan EIJ1 adalah jauh lebih rendah dalam tumbuhan yang disuntik dengan Pst DC3000 (AvrRps4) avirulen berbanding dengan tumbuhan yang disuntik dengan Pst DC3000 ganas (Rajah 7C), menunjukkan bahawa EIJ1 adalah pengawal selia penting bagi tindak balas imun yang dicetuskan oleh pengaruh virulensi dalam sel perumah. Oleh kerana tumbuhan Pst DC3000-eij1-1 inokulasi meniru fenotip rintangan tumbuhan Col-0 yang diinokulasi Pst DC3000 (AvrRps4) (Rajah 3, F, G, 4, C, D dan 7, A), EIJ1 boleh berfungsi sebagai penghalang untuk menghalang induksi ETI oleh strain virulen. Kesimpulannya, kami telah mengenal pasti EIJ1, protein DnaJ pendamping, dan menunjukkan bahawa ia terlibat dalam tindak balas imun awal terhadap patogen tumbuhan. Interaksi antara EIJ1 dan EDS1 menindas pemerdagangan nuklear EDS1, mungkin sama ada untuk menghalang rangsangan jangka pendek oleh tindak balas imun tumbuhan yang tidak perlu, untuk memudahkan pencerobohan patogen oleh mekanisme manipulasi, atau kedua-duanya. Tanpa mengira mekanisme asas, alel EIJ1 boleh digunakan sebagai sasaran berpotensi berkesan untuk pengubahsuaian imuniti semula jadi tumbuhan dalam pembiakan tahan penyakit. Oleh kerana EIJ1 tidak menjejaskan pertumbuhan normal tumbuhan, pengecilan fungsi EIJ1 melalui penyuntingan genom mungkin meningkatkan tahap ketahanan penyakit tanaman dengan sedikit kesan ke atas pertumbuhan.

Rujukan

Alvarez, ME, Pennell, RI, Meijer, PJ, Ishikawa, A, Dixon, RA, Lamb, C (1998) Perantaraan oksigen reaktif menjadi pengantara rangkaian isyarat sistemik dalam penubuhan imuniti tumbuhan. Sel 92: 773–784

An, C, Mou, Z (2011) Asid salisilik dan fungsinya dalam imuniti tumbuhan. J Integr Plant Biol 53: 412–428

Armbruster, U, Carrillo, LR, Venema, K, Pavlovic, L, Schmidtmann, E, Kornfeld, A, Jahns, P, Berry, JA, Kramer, DM, Jonikas, MC (2014) Antiport ion mempercepatkan penyesuaian fotosintesis dalam cahaya turun naik persekitaran. Nat Commun 5: 5439

Bartsch, M, Gobbato, E, Bednarek, P, Debey, S, Schultze, JL, Bautor, J, Parker, JE (2006) Isyarat PENINGKATAN PENYAKIT YANG DIPERTINGKATKAN tanpa asid salisilik1 dalam imuniti Arabidopsis dan kematian sel dikawal oleh monooxygenase FMO1 dan Nudix hydrolase NUDT7. Sel Tumbuhan 18: 1038–1051

Ben Rejeb, K, Lefebvre-De Vos, D, Le Disquet, I, Leprince, AS, Bordenave, M, Maldiney, R, Jdey, A, Abdelly, C, Savoure´, A (2015) Hidrogen peroksida yang dihasilkan oleh NADPH oxidases meningkatkan pengumpulan prolin semasa tekanan garam atau manitol dalam Arabidopsis thaliana. Phytol Baharu 208: 1138–1148

Bukau, B, Weissman, J, Horwich, A (2006) Pengawal molekul dan kawalan kualiti protein. Sel 125: 443–451

Caplan, J, Padmanabhan, M, Dinesh-Kumar, SP (2008) Tumbuhan reseptor imun NB-LRR: daripada pengiktirafan kepada pengaturcaraan semula transkrip. Mikrob Hos Sel 3: 126–135 10.1016/j.chom.2008.02.010

Dodds, PN, Rathjen, JP (2010) Kekebalan tumbuhan: ke arah pandangan bersepadu interaksi tumbuhan-patogen. Nat Rev Genet 11: 539–548

Dou, D, Zhou, JM (2012) Pengesan fitopatogen menumbangkan imuniti perumah: musuh yang berbeza, medan pertempuran yang serupa. Mikrob Hos Sel 12: 484–495

Du, Y, Zhao, J, Chen, T, Liu, Q, Zhang, H, Wang, Y, Hong, Y, Xiao, F, Zhang, L, Shen, Q (2013) Jenis I J-domain NbMIP1 protein ialah diperlukan untuk kedua-dua jangkitan virus mozek Tembakau dan imuniti semula jadi tumbuhan. PLoS Pathog 9: e1003659

Fan, H, Hu, Y, Tudor, M, Ma, H (1997) Interaksi khusus antara domain K AG dan AGL, ahli keluarga domain MADS bagi protein pengikat DNA. Tumbuhan J 12: 999–1010

Feys, BJ, Moisan, LJ, Newman, MA, Parker, JE (2001) Interaksi langsung antara protein isyarat rintangan penyakit Arabidopsis, EDS1 dan PAD4. EMBO J 20: 5400–5411

Garcı´a, AV, Blanvillain-Baufume´, S, Huibers, RP, Wiermer, M, Li, G, Gobbato, E, Rietz, S, Parker, JE (2010) Aktiviti nuklear dan sitoplasma seimbang EDS1 diperlukan untuk tindak balas imun semula jadi tumbuhan yang lengkap. PLoS Pathog 6: e1000970

Gassmann, W, Hinsch, ME, Staskawicz, BJ (1999) Gen rintangan bakteria Arabidopsis RPS4 ialah ahli keluarga gen rintangan penyakit TIR-NBS-LRR. Tumbuhan J 20: 265–277

Gloggnitzer, J, Akimcheva, S, Srinivasan, A, Kusenda, B, Riehs, N, Stampfl, H, Bautor, J, Dekrout, B, Jonak, C, Jime´nez-Go´mez, JM (2014) Mengarut- pereputan mRNA pengantara memodulasi tahap reseptor imun untuk mengawal pertahanan antibakteria tumbuhan. Mikrob Hos Sel 16: 376–390

Ham, BK, Park, JM, Lee, SB, Kim, MJ, Lee, IJ, Kim, KJ, Kwon, CS, Paek, KH (2006) Tobacco Tsip1, protein jari Zn jenis DnaJ, diambil untuk dan mempotensiasi Tsi1-pengantaraan pengaktifan transkrip. Sel Tumbuhan 18: 2005–2020

Heidrich, K, Blanvillain-Baufume', S, Parker, JE (2012) Kekangan molekul dan ruang pada isyarat reseptor NB-LRR. Curr Opin Plant Biol 15: 385–391

Heidrich, K, Wirthmueller, L, Tasset, C, Pouzet, C, Deslandes, L, Parker, JE (2011) Arabidopsis EDS1 menghubungkan pengecaman efektor patogen kepada tindak balas imun khusus petak sel. Sains 334: 1401–1404

Hu, Y, Zhou, L, Huang, M, He, X, Yang, Y, Liu, X, Li, Y, Hou, X (2018) Giberelin memainkan peranan penting dalam embriogenesis lewat Arabidopsis. Tumbuhan Nat 4: 289–298

Huang, M, Hu, Y, Liu, X, Li, Y, Hou, X. (2015) Arabidopsis LEAFY COTYLEDON1 mengantara perkembangan postembrionik melalui interaksi dengan FAKTOR BERINTERAKSI FITOCHROME4. Sel Tumbuhan 27: 3099–3111

Jelenska, J, Yao, N, Vinatzer, BA, Wright, CM, Brodsky, JL, Greenberg, JT (2007) AJ domain virulensi effector Pseudomonas syringae merombak kloroplas perumah dan menindas pertahanan. Curr Biol 17: 499–508

Jones, J, Dangl, J (2006) Sistem imun tumbuhan. Alam 444: 323–329

Khan, M, Subramaniam, R, Desveaux, D (2016) Pengawal, umpan, umpan dan perangkap: persepsi patogen dalam tumbuhan mengikut penderia efektor jenis III. Curr Opin Microbiol 29: 49–55

Kinkema, M, Fan, W, Dong, X (2000) Penyetempatan nuklear NPR1 diperlukan untuk pengaktifan ekspresi gen PR. Sel Tumbuhan 12: 2339–2350

Koch, E, Slusarenko, A (1990) Arabidopsis terdedah kepada jangkitan oleh kulat cendawan bulu halus. Sel Tumbuhan 2: 437–445

Lam, E, Kato, N, Lawton, M (2001) Kematian sel terprogram, mitokondria, dan tindak balas hipersensitif tumbuhan. Alam 411: 848–853

Lee, DW, Kim, JK, Lee, S, Choi, S, Kim, S, Hwang, I (2008) Peptida transit plastid berkod nuklear Arabidopsis mengandungi berbilang subkumpulan jujukan dengan motif jujukan sasaran kloroplas yang tersendiri. Sel Tumbuhan 20: 1603–1622