Transkriptom Sel Tunggal Mendedahkan Interaksi Sel-Sel Penapis Buah Pinggang Terganggu Selepas Kecederaan Podocyte Awal Dan Selektif

Keputusan

Single-Cell Profiling of >29,000 Sel Buah Pinggang Diperkaya Glomerular

Protokol sel tunggal semasa untukkeseluruhan buah pinggang mengenal pasti<2.5% glomerular cells,9 and although a penyediaan glomerular yang disucikanmenggunakan manik magnet memperkayakan populasi ini,22 ia gagal menangkap sel lainjenis buah pinggangitu mungkin menarik. Kaedah penapisan digunakan untuk memperkayakan glomeruli secara serentak dan menangkap jenis sel buah pinggang tambahan untuk memanjangkan penemuan ini dan membangunkan pemahaman terperinci tentang interaksi sel-sel dalam glomerulus dalam konteks keseluruhan landskap selular buah pinggang, sebelum dan selepas kecederaan podosit.

Untuk mengenal pasti kesan transkrip awal ablasi podocyte dalam cara khusus jenis sel, scRNAseq dilakukan dengantisu buah pinggangdaripada WT dan iCTCFpod / tikus yang dikumpul melalui penapisan bersiri selepas 1 minggu rawatan doxycycline (Rajah 1A). Tisu buah pinggang daripada empat haiwan WT (empat replika biologi) dan empat iCTCFpod / haiwan menghasilkan sejumlah 14,783 WT dan 14,727 iCTCFpod / sel yang diprofilkan selepas penapisan (Rajah Tambahan S1, A dan B; Jadual Tambahan S1 dan S2). Data telah dinormalisasi untuk membuang kesan disebabkan oleh bilangan UMI dan peratusan bacaan mitokondria. Selepas penyepaduan WT dan iCTCFpod / sampel, resolusi rendah pengelompokan digunakan untuk mengesan sembilan kelompok (Rajah 1B). Replika biologi WT dan iCTCFpod / sampel telah diedarkan di antara semua kelompok (Tambahan Rajah S2, AC). Semua jenis sel glomerulus, serta jenis sel buah pinggang tambahan, telah dikenal pasti menggunakan penanda yang ditubuhkan dan diperolehi data (Rajah 1C; Jadual Tambahan S3; Rajah Tambahan S3A).

Sel glomerular, mewakili sejumlah 82.1% daripada semua sel pulih [36.9% podosit, 42.1% sel endothelial glomerular (GEC), 2.7% sel mesangial dan 0.36% PECs] telah diasingkan dan dikelompokkan (Rajah 1D) . Empat kelompok podosit, lima kelompok GEC, dan satu kelompok setiap sel mesangial dan PEC, yang menyatakan penanda jenis sel kanonik, telah dikenal pasti (Rajah 1E; Rajah Tambahan S3B). Replika biologi WT dan iCTCFpod / sampel telah diedarkan ke seluruh kluster (Rajah Tambahan S2, DF; Jadual Tambahan S4). Seperti yang dijangkakan, memandangkan pemadaman CTCF khusus podosit membawa kepada kehilangan podosit yang boleh dikesan secara histologi pada 2 minggu, 13 iCTCFpod / sampel mengandungi peratusan podosit yang lebih rendah daripada sampel WT (Rajah 1F; Jadual Tambahan S5). iCTCFpod / sampel mempunyai 13.1% lebih sedikit sites podo, 11.9% lebih GEC dan 1.5% lebih banyak sel mesangial daripada sampel WT (Jadual Tambahan S5). PEC menyumbang<1% to either of the iCTCFpod / or WT samples. This finding suggests that disruption of transcriptional programs critical for podocyte survival precedes histologically detectable podocyte injury and loss and highlights the power of scRNAseq in discerning subtle changes that can be missed by histologic analysis.

HERBA BARU UNTUK KESIHATAN BUAH PINGGANG

Penghapusan CTCF Terinduksi Khusus Podocyte Membawa kepada Perubahan Ekspresi Gen dalam Semua Jenis Sel Glomerular

Analisis ekspresi pembezaan dilakukan dalam setiap 11 kelompok membandingkan sel iCTCFpod / dan WT (Jadual Tambahan S6). Gen dianggap dinyatakan secara berbeza jika ditemui dalam sekurang-kurangnya 10% sel dalam kelompok tertentu, dengan perubahan lipatan log mutlak minimum 0.1 dan P terlaras < 0. 05. Ctcf dinyatakan secara berbeza dalam setiap empat gugusan podosit, dengan perubahan lipatan log purata sebanyak 0.390, 0.189, 0.331 dan 0.303, masing-masing. Bilangan sel dalam setiap kelompok telah diturunkan sampel dan analisis ekspresi pembezaan diulang untuk membandingkan bilangan gen yang dinyatakan secara berbeza di antara 11 kelompok. Kelompok podocyte mempunyai gen yang paling berbeza dinyatakan, diikuti oleh GEC-1 dan GEC-2 (Rajah 1G). Tiga gugusan GEC yang selebihnya, bersama-sama dengan sel mesangial dan PEC, mempunyai gen yang dinyatakan secara berbeza jauh lebih sedikit (Rajah 1G), menunjukkan bahawa GEC-1 dan GEC-2, antara semua gugusan glomerular, paling terjejas. oleh sekuela kecederaan podosit yang didorong oleh penghapusan CTCF.

Program Gen Berkaitan Penyakit Dikenal pasti dalam Kluster Podosit dan Sel Endothelial Tertentu

Kajian ini mula-mula berusaha untuk mengkaji bagaimana kluster podosit individu bertindak balas terhadap kecederaan. Gambar rajah Venn bagi gen yang dinyatakan secara berbeza dalam setiap empat kelompok podosit mendedahkan bahawa podosit 1 mempunyai gen yang dinyatakan secara berbeza secara unik daripada empat kelompok podosit (Rajah 2A; Jadual Tambahan S7). Pemerhatian bahawa satu daripada empat kluster podosit lebih ketara terjejas adalah selaras dengan data histologi terdahulu yang menunjukkan bahawa tidak semua podosit terjejas dengan keterukan yang sama dalam menghadapi kecederaan dan menyerlahkan kuasa scRNAseq untuk mencirikan molekul heterogenitas keadaan sel dalam jenis sel yang sama.23

Analisis overrepresentation dilakukan untuk mengenal pasti program gen yang diperkaya sebagai akibat daripada kehilangan CTCF dalam kelompok podocyte 1 (Jadual Tambahan S8). Istilah yang diperkaya teratas telah divisualisasikan dengan peta pengayaan untuk mengelompokkan set gen yang saling bertindih (Rajah 2B). Sekumpulan istilah yang diperkayakan yang terkenal ialah fungsi mitokondria, termasuk sintesis ATP, organisasi mitokondria, rantai pengangkutan elektron, dan lasi fosfori oksidatif (Rajah 2B). Data ini melanjutkan kerja baru-baru ini yang menunjukkan disfungsi mitokondria sebagai tanda kecederaan podosit.24 Selain itu, genetik manusia telah menunjukkan kepentingan fungsi mitokondria dalam podosit, termasuk beberapa mutasi dalam laluan biosintesis CoQ (PDSS1, PDSS2, COQ2, COQ6, dan ADCK4) yang menyebabkan sindrom nefrotik, terutamanya pada kanak-kanak.25,26 Oleh itu, telah dikemukakan bahawa disfungsi mitokondria podosit mungkin mewakili keadaan sel yang menonjol yang dikaitkan dengan semua penyakit yang berpunca daripada kehilangan podosit.24 Data memberikan sokongan untuk tanggapan ini secara tunggal. resolusi sel, menunjukkan bahawa disfungsi mito chondrial mungkin mewakili keadaan kecederaan terawal dalam populasi podosit tertentu, yang membawa kepada kehilangan podosit.

Analisis overrepresentation dilakukan untuk mengenal pasti program gen yang diperkaya sebagai akibat daripada kehilangan CTCF dalam kelompok podocyte 1 (Jadual Tambahan S8). Istilah yang diperkaya teratas telah divisualisasikan dengan peta pengayaan untuk mengelompokkan set gen yang saling bertindih (Rajah 2B). Sekumpulan istilah yang diperkayakan yang terkenal ialah fungsi mitokondria, termasuk sintesis ATP, organisasi mitokondria, rantai pengangkutan elektron, dan lasi fosfori oksidatif (Rajah 2B). Data ini melanjutkan kerja baru-baru ini yang menunjukkan disfungsi mitokondria sebagai tanda kecederaan podosit.24 Selain itu, genetik manusia telah menunjukkan kepentingan fungsi mitokondria dalam podosit, termasuk beberapa mutasi dalam laluan biosintesis CoQ (PDSS1, PDSS2, COQ2, COQ6, dan ADCK4) yang menyebabkan sindrom nefrotik, terutamanya pada kanak-kanak.25,26 Oleh itu, telah dikemukakan bahawa disfungsi mitokondria podosit mungkin mewakili keadaan sel yang menonjol yang dikaitkan dengan semua penyakit yang berpunca daripada kehilangan podosit.24 Data memberikan sokongan untuk tanggapan ini secara tunggal. resolusi sel, menunjukkan bahawa disfungsi mito chondrial mungkin mewakili keadaan kecederaan terawal dalam populasi podosit tertentu, yang membawa kepada kehilangan podosit.

Salah satu kumpulan utama istilah yang diperkaya daripada analisis perwakilan berlebihan (Rajah 2B) ialah organisasi sitoskeletal serta istilah diperkaya tunggal yang berkaitan untuk lekatan sel-matriks. Sitoskeleton aktin memainkan peranan penting dalam mengekalkan struktur unik dan kompleks podosit, dan lekatan pada GBM adalah penting untuk fungsi podosit.27 Lekatan fokus matang mengandungi beratus-ratus protein yang menghubungkan sitoskeleton aktin, pengikatan matriks semula reseptor, transduksi isyarat intrasel. , dan pempolimeran aktin. Salah satu gen yang paling dikawal ke bawah dalam podocyte 1 ialah Rhpn1 (Supplemental Figure S4A), komponen penting untuk mewujudkan dinamik sitoskeleton podocyte dan mengekalkan seni bina proses kaki podocyte.28 Arp2/3 compo nent Arpc3, pemacu pempolimeran aktin, telah dikawal selia dalam kelompok podocyte 1 (Rajah 2C; Rajah Tambahan S4B). Gen untuk komponen tambahan kompleks, Actr2, juga dikawal selia dalam kedua-dua podocyte 1 dan podocyte 4. Selain itu, Wasl, yang produk proteinnya, N-WASP, mengaktifkan kompleks Arp2/3 dan diperlukan untuk penyelenggaraan. daripada proses kaki podosit dalam vivo29, juga dikawal selia dalam podosit 1, podosit 3, dan podosit 4. Pengatur sitoskeletal Arhgdia, yang pemadamannya dikaitkan dengan syn drome nefrotik pada tikus,30 dikawal ke bawah dalam podosit 1 (Rajah 2C). Tahap ekspresi dua Rho GTPase

Rajah 3 Kelompok Podocyte mengawal selia Col4a5. A: Col4a5 dikawal dengan ketara dalam pemadaman CTCF spesifik podosit (iCTCFpod / ) podocyte 1 yang boleh diinduksi berbanding sel podosit 1 jenis liar (WT). Reseptor jenis kolagen IV ɑ5 (COL4A5) dinyatakan dengan kuat dalam sel mesangial dan subkluster sel endothelial glomerular (GEC) 1 hingga 4. Saiz anak panah mewakili ekspresi relatif reseptor. B: Kuantifikasi tindak balas rantai hibridisasi (HCR). Col4a5 dikawal selia dengan ketara dalam sel ekspresi iCTCFpod / Nphs{19}}berbanding sel ekspresi WT Nphs{{2{23}}}}. Empat WT dan empat iCTCFpod / tikus telah dinilai. Semua glomeruli daripada tiga imej dikira. C: Ekspresi Col4a5 dalam glomeruli WT dan iCTCFpod / haiwan seperti yang dinilai oleh HCR. *P <0.0001 (ujian-t dua ekor dengan pembetulan Welch). Pembesaran asal, 40; 63 (pembesaran kawasan berkotak) (C). Bar skala Z 50 mm (C). IFI, pengimejan immunofluorescent.

GEC-1 and GEC-2 had nearly as many differentially expressed genes as podocyte clusters 2 to 4, whereas the remaining GEC clusters, mesangial cells, and PECs had fewer differentially expressed genes. Therefore, these two endothelial clusters were most affected by podocyte injury. GEC-1 expressed >600 gen yang dinyatakan secara unik (Tambahan Rajah S6A; Jadual Tambahan S9). Analisis lebihan perwakilan menunjukkan bahawa gen yang dinyatakan secara unik berbeza dalam GEC-1 telah diperkaya dalam program gen untuk penghijrahan dan lekatan sel (Tambahan Rajah S6, B dan C; Jadual Tambahan S10). Lisan ana ini mendedahkan perubahan transkrip terawal yang berlaku dalam GEC sebagai tindak balas kepada kecederaan podosit.

Pemodelan Komunikasi Antara Sel Mendedahkan Interaksi Utama antara Jenis Sel sebagai Tindak Balas terhadap Kecederaan Podocyte Awal

Setelah mengenal pasti program gen yang terganggu dalam beberapa kelompok sel yang berbeza, kajian seterusnya berusaha untuk memahami bagaimana crosstalk sel sel glomerular dipengaruhi oleh kecederaan podosit. Kajian itu mula-mula menyiasat senarai gen yang dinyatakan secara berbeza dalam kelompok sel podosit, GEC, dan mesangial. Ekspresi dua ligan prosurvival autokrin utama, Vegfa dan Pdgfb, serta ekspresi reseptor PDGFB, Pdgfrb, telah terganggu (Jadual Tambahan S6). Ungkapan Vegfa telah dikurangkan dalam semua kelompok podocyte (min perubahan lipatan log antara 0.034 dan 0.149). Sebaliknya, ungkapan Pdgfb telah ditingkatkan dalam semua gugusan GEC (min perubahan lipatan log antara 0.031 dan 0.140), dan reseptor Pdgfrb telah dikawal selia dalam sel mesangial (min perubahan lipatan log bagi 0.155). Analisis ini mencadangkan bahawa kecederaan podocyte membawa kepada penurunan ekspresi ligan prosurvival Vegfa, yang memberi kesan negatif kepada GEC. Untuk mengimbangi, GEC boleh mengawal selia ligan prosurvival Pdgfb, mencetuskan sel mesangial untuk mengawal selia reseptor Pdgfrb.

NicheNet, algoritma baru yang menyimpulkan bagaimana interaksi reseptor ligan yang diperoleh daripada data ekspresi boleh menjejaskan sasaran tertentu dengan menyepadukan pengetahuan sedia ada tentang rangkaian isyarat dan pengawalseliaan, telah digunakan untuk menyiasat lebih mendalam interaksi reseptor ligan dan gen sasaran yang diduga mereka.20 NicheNet telah digunakan untuk model dalam teraksi antara podosit dan GEC serta sel mesan gial dan GEC yang berpotensi mendorong gen yang dinyatakan secara berbeza (gen sasaran) dalam GEC dalam penetapan kecederaan podosit (Rajah 4A). Untuk analisis ini, semua kelompok setiap jenis sel digabungkan menjadi satu kelompok. Ligan ramalan teratas yang dinyatakan oleh sel mesangial dan/atau podosit ialah pleiotrophin (Ptn), angiopoietin 2 (Angpt2), Col4a1, molekul lekatan sel vaskular 1, protein morfogenetik tulang 4 (Bmp4), Ephrin B1, faktor pertumbuhan tisu penghubung, dan semaforing 3e (Sema3e) (Rajah 4B). Corak ekspresi reseptor GEC di mana ligan ini diketahui bertindak dipetakan di sebelah analisis aktiviti ligan. Di samping itu, gen sasaran yang diramalkan yang dinyatakan secara berbeza dalam iCTCFpod / GEC berbanding dengan kawalan WT juga dipetakan. Keputusan dalam Rajah 4B diringkaskan sebagai petak bulat dalam Rajah 4, C dan D.

Beberapa ligan, reseptor, dan gen sasaran adalah ketara daripada analisis ini. Pleiotrophin, ligan yang sangat dinyatakan dalam sel mesangial (Rajah 4B), adalah faktor pertumbuhan yang dirembeskan yang boleh mengikat dan menghalang protein reseptor tyrosine phosphatase jenis B, merangsang penghijrahan sel endothelial melalui peningkatan Tek (Tie2)/Angpt137 dan Kdr (Vegfr2)/Vegfa38 memberi isyarat. Sehubungan itu, Tek dikawal dengan ketara dalam GEC (Rajah 4B). Angpt2, sangat dinyatakan dalam sel mesangial, adalah ligan antagonis Tek, menghalang pengikatan Angpt1.39 Kerana isyarat Angpt1 diketahui menggalakkan kemandirian podosit dan gangguan nisbah Angpt1/Angpt2 menyumbang kepada pembangunan DKD,40 ligan ini analisis reseptor nampaknya menunjukkan isyarat Tek maladaptif dalam GEC sebagai salah satu akibat terawal kecederaan podosit

Kajian ini juga mendapati perubahan ketara dalam ekspresi kolagen jenis IV dalam beberapa sel glomerular (Rajah 4B). Biasanya dihasilkan oleh podosit yang sihat, peralihan kolagen IV het erotrimer daripada ɑ1ɑ1ɑ2 kepada ɑ3ɑ4ɑ5 semasa perkembangan glomerular, yang diperlukan untuk pembentukan dan fungsi GBM yang betul.33,34 Peningkatan pengawalseliaan Col4a1, bersama-sama dengan pengembangan matriks mesangial, sering diperhatikan dalam DKD.41,42 Dalam analisis semasa, Col4a1 dinyatakan oleh kedua-dua sel mesangial dan GECs (ungkapan min peta haba ligan) (Rajah 4B) dan dikawal selia secara khusus dalam iCTCFpod / GEC berbanding dengan kawalan WT. Data ini mencadangkan bahawa GEC mengawal selia Col4a1 dalam keadaan kecederaan podosit, yang mungkin membawa kepada GBM berserabut yang lebih kaku yang menyumbang kepada perkembangan sklerosis segmental.33

Bmp4 adalah ligan mesangial yang sangat dinyatakan yang dikenal pasti oleh analisis NicheNet (Rajah 4, BD). BMP memainkan peranan penting dalam pembangunan buah pinggang dan penyakit.43 Bmp4 dikawal selia dalam penetapan nefropati diabetik pada tikus,42 dan merawat tikus dengan diabetes dengan antibodi anti-BMP4 menghalang pengawalan naik Col4a1 dan pengembangan matriks mesangial .44 Kepentingan tertentu, Bmp4 mesangial didapati mencetuskan ekspresi GEC Smad6 (Rajah 4B). Ungkapan Smad6 diinduksi oleh BMP dan dalam gelung maklum balas negatif, Smad6 secara khusus menghalang BMP, termasuk BMP4.45 Smad6 dikawal ke bawah dalam iCTCFpod / GEC berbanding dengan kawalan WT, mencadangkan peningkatan isyarat BMP dalam sel endothelial dalam penetapan kecederaan podocyte .

Salah satu ligan yang diutamakan yang dikenal pasti dalam podosit ialah Sema3e (Rajah 4, BD). Semaforin kelas 3 ialah protein yang dirembeskan yang berfungsi dalam pelbagai proses biologi, termasuk angiogenesis, limfangiogenesis dan penyakit.46 Sema3a dikawal selia dalam DKD manusia,47 dan Sema3g baru-baru ini dikenal pasti sebagai gen khusus podosit yang melindungi podosit daripada keradangan dalam vivo. 48 Peranan Sema3e dalam podosit masih tidak jelas. Analisis semasa mendedahkan pasangan ligan reseptor yang tidak dikenali sebelum ini di mana podocyte Sema3e berinteraksi dengan plexinD1 pada GEC untuk mencetuskan beberapa sasaran gen hiliran dalam penetapan kecederaan podocyte (Rajah 4, C dan D).

Antara beberapa gen sasaran GEC yang baru dikenal pasti, Hes1 dan Cx3cl1 juga ditemui dalam program gen lekatan yang diperkaya dalam GEC-1 (Rajah 4, BD; Rajah Tambahan S6). Hes1 ialah sasaran isyarat Notch, yang memainkan peranan penting dalam buah pinggang yang sedang berkembang, tetapi pengaktifan semula boleh membawa kepada fibrosis.49 Cx3cl1 ialah kemokin yang dihasilkan terutamanya oleh endothelium glomerular yang bertindak sebagai molekul chemoattractant dan perekatan untuk reseptornya, Cx3cr1, yang dinyatakan di mana-mana pada leukosit limfa mononuklear dan peredaran darah.50 Cx3cl1 telah terlibat dalampelbagai penyakit buah pinggang, termasukDKD, nefropati IgA, dan glomerulonephritis.50 Hes1 dan Cx3cl1 kedua-duanya dikawal selia dalam iCTCFpod / GEC berbanding dengan kawalan WT, menunjukkan bahawa GEC bertindak balas terhadap kecederaan podosit melalui program proinflamasi dan profibrosis yang mengawal selia.

Akhir sekali, kerana banyak ligan dan sasaran yang dikenal pasti dalam analisis NicheNet terlibat dalam DKD, dalam kedua-dua model tikus dan juga manusia, set data dibandingkan dengan set data transkriptom nukleus tunggal DKD manusia awal.10 A khusus perbandingan dibuat daripada gen yang dinyatakan secara berbeza antara kelompok sel manusia dan tetikus. Daripada 138 gen yang dinyatakan secara berbeza dalam GEC DKD manusia, 25 gen juga dikenal pasti dalam iCTCFpod / sel endothelial tetikus, termasuk Col4a1 (Rajah Tambahan S7; Jadual Tambahan S11). Bersama-sama, keputusan ini mencadangkan bahawa program sel endothelial yang kerap terganggu dalam DKD manusia boleh sebahagiannya direkapitulasi dalam model tetikus kecederaan glomerular awal melalui ablasi podosit terpilih. Di samping itu, keputusan ini mencadangkan bahawa, sebagai tambahan kepada podosit, mungkin terdapat potensi sasaran khusus endothelial dan strategi terapeutik untuk menghentikan atau memperlahankan perkembangan kompleks dan sangat tinggi.penyakit buah pinggang yang berleluasa, sepertiDKD.