Kuantifikasi Kemerosotan Neurit Dengan Ketepatan Dan Kecekapan yang Dipertingkatkan dalam Model In Vitro Penyakit Parkinson Bahagian 2

Keputusan

Penubuhan model kultur sel degenerasi neurit yang dikaitkan dengan PD

Untuk membangunkan kaedah untuk menyiasat degenerasi neurit dalam model kultur sel PD, kami menggunakan sel LUHMES berbudaya, populasi sel mesencephalic manusia yang diabadikan secara bersyarat. Selepas pembezaan, sel LUHMES menjadi postmitotic, menggunakan ciri profil ekspresi gen neuron dopaminergik matang, dan membangunkan morfologi neuron dengan neurit yang memanjang sehingga 500 mm panjang (Rajah 1A; Lotharius et al., 2005; Scholz et al. , 2011; Kraemer et al., 2021).

Neurodegeneration, keadaan di mana sel saraf bermutasi atau mati, berkait rapat dengan ingatan. Dalam model kultur sel, kita boleh mengawal keadaan kultur untuk mengurangkan ekspresi neurodegenerasi dan dengan itu meningkatkan prestasi ingatan.

Kajian telah menunjukkan bahawa homeostasis sel saraf memainkan peranan penting dalam kelangsungan hidup sel dan fungsi sistem. Kita boleh meningkatkan kestabilan sel dengan mengawal faktor seperti nutrien dan faktor pertumbuhan dalam medium kultur. Pada masa yang sama, beri perhatian untuk menjaga kebersihan dan kawalan suhu persekitaran kultur untuk mengelakkan sel daripada diganggu dan dirosakkan oleh persekitaran.

Di samping itu, dalam model kultur sel, kita juga boleh menyuntik sebatian atau ubat tertentu ke dalam sel untuk mengurangkan ekspresi neuromodulasi, dengan itu meningkatkan kadar survival dan prestasi ingatan sel. Teknik ini juga digunakan secara meluas dalam kajian penyakit neurodegeneratif.

Ringkasnya, neurodegeneration mempunyai kesan penting terhadap kestabilan sel dan fungsi sistem, dan teknologi kultur sel ialah kaedah penyelidikan model yang baik, yang boleh menjalankan penerokaan dan penyelidikan mendalam tentang hubungan antara neurodegeneration dan ingatan. Kami boleh mengurangkan prestasi neuromodulasi dengan memupuk kawalan alam sekitar, menyuntik ubat ke dalam sel, dan lain-lain, untuk meningkatkan kemandirian sel dan prestasi ingatan dan menyediakan asas yang lebih komprehensif untuk kajian penyakit neurodegeneratif. Dapat dilihat bahawa kita perlu meningkatkan daya ingatan. Cistanche boleh meningkatkan ingatan kita dengan ketara, kerana Cistanche juga boleh mengawal keseimbangan neurotransmitter, seperti meningkatkan tahap asetilkolin dan faktor pertumbuhan, yang sangat penting untuk ingatan dan pembelajaran. Selain itu, daging juga boleh meningkatkan aliran darah dan menggalakkan penghantaran oksigen, yang dapat memastikan otak menerima nutrisi dan tenaga yang mencukupi, seterusnya meningkatkan daya hidup dan daya tahan otak.

Klik tahu suplemen untuk meningkatkan ingatan

Kerana kualiti optik kaca yang unggul berbanding dengan plastik, kultur telah ditubuhkan pada slaid kaca yang mengandungi lapan ruang media. Berdasarkan laporan terdahulu (Lotharius et al., 2005; Scholz et al., 2011; Kurowska et al., 2014), kami pada mulanya cuba untuk mewujudkan budaya pada slaid ruang yang disalut dengan PLO dan fibronektin; walau bagaimanapun, kultur sedemikian menunjukkan defisit lekatan dan daya maju yang rendah. Hasilnya, kami menguji sama ada salutan dengan substrat tambahan akan meningkatkan daya maju kultur sel LUHMES yang ditubuhkan pada permukaan kaca.

Kultur sel LUHMES telah ditubuhkan pada slaid yang sama ada tidak bersalut atau disalut dengan PLO dan fibronektin, PDL dan laminin, atau gabungan keempat-empat substrat. Analisis nukleus berdaya maju oleh mikroskop pendarfluor mendedahkan bahawa salutan slaid memberi kesan ketara kepada daya maju kultur [Friedman x2 (3)=18, p, 0.0001], dengan analisis perbandingan berbilang post hoc mendedahkan bahawa slaid disalut dengan gabungan keempat-empat substrat yang dinyatakan di atas menghasilkan kadar sel berdaya maju yang jauh lebih tinggi jika dibandingkan dengan slaid yang hanya disalut dengan PLO dan fibronektin (p= 0.0437; Rajah 1B, C).

Selepas mengenal pasti substrat salutan optimum untuk mengkultur sel LUHMES pada slaid kaca, kami menilai kesan ketumpatan sel terhadap kesesuaian kultur untuk pengukuran degenerasi neurit. Sel LUHMES telah dikultur dalam medium pembezaan dengan ketumpatan penyaduran 57,500 sel setiap telaga, 115,000 sel setiap telaga, atau 230,000 sel setiap telaga, dan pada hari kelima pembezaan, sel telah ditetapkan dengan 4% PFA dan digambarkan oleh mikroskop fasa kontras.

Ketumpatan 57,500 sel setiap perigi menghasilkan kultur dengan neurit yang tidak berangkaian dan morfologi neurit yang tidak teratur, manakala kultur yang ditubuhkan dengan ketumpatan penyaduran 230,000 sel, walaupun berdaya maju, mengandungi ketumpatan neurit yang terlalu tinggi untuk pengukuran neurit yang tepat. Ketumpatan sel perantaraan sebanyak 115,000 sel setiap telaga memberikan daya maju yang tinggi dan saluran akson yang dipisahkan dengan baik yang kondusif untuk pengukuran degenerasi neurit yang tepat (Rajah 1D).

Untuk memodelkan degenerasi neurit yang berkaitan dengan PD secara in vitro, kami mendedahkan sel LUHMES yang dibezakan kepada 6-OHDA, neurotoksin yang digunakan secara meluas yang menggalakkan tekanan oksidatif dan degenerasi neuron katekolaminergik (Bové dan Perier, 2012). Pendedahan sel LUHMES yang dibezakan kepada 6-OHDA menggalakkan peningkatan yang bergantung kepada dos dalam degenerasi neurit, dengan masing-masing 5.0 mM 6-OHDA dan 7.5 mM 6-OHDA mendorong degenerasi neurit sederhana dan teruk (Rajah . 2F). Untuk mengukur kemerosotan neurit dalam kultur sel LUHMES yang terdedah kepada 6-OHDA, kami menggunakan kaedah yang disebut secara meluas di mana imej kontras fasa bagi kultur diduakan, badan sel dalam imej dikeluarkan secara digital dan algoritma penganalisis zarah bagi ImageJ digunakan untuk mengukur luas serpihan neurit. Kawasan neurit yang berpecah-belah kemudiannya dijumlahkan dan dibahagikan dengan jumlah kawasan neurit untuk menentukan DI (Rajah 2A–E; Sasaki et al., 2009; Kraemer et al., 2014; Di Stefano et al., 2015; Hill et al. ., 2018; Geisler et al., 2019).

Seperti yang dijangkakan, pendedahan sel LUHMES yang dibezakan kepada 6- OHDA menyebabkan peningkatan bergantung dos dalam DI (F(3,24)= 119.8, p=0.0001, R{ {8}}.9374; Rajah 2G). Walau bagaimanapun, semasa analisis sel yang terdedah kepada 6-OHDA, kami melihat beberapa isu yang kelihatan memberi kesan negatif terhadap ketepatan dan kecekapan pengukuran DI. Oleh itu, kami berusaha untuk mengoptimumkan kaedah biasa ini untuk melakukan pengukuran DI, yang seterusnya kami rujuk sebagai kaedah DI tradisional, untuk menjana protokol yang memudahkan pengukuran pemecahan neurit yang lebih berkesan.

Mengurangkan pemecahan buatan yang dikaitkan dengan perduaan mikrograf

Semasa menggunakan kaedah DI tradisional, kami sering memerhatikan isu di mana neurit utuh dalam imej kontras fasa kelihatan berpecah-belah dalam imej terdua yang sepadan (Rajah 3A). Pemecahan buatan ini terutamanya menjejaskan neurit dengan penonjolan yang rendah. Oleh itu, kami menyiasat sama ada isu itu boleh dikurangkan dengan prosedur yang meningkatkan kontras imej. Untuk meningkatkan kontras imej, kami mula-mula menangkap imej neurit menggunakan pelbagai keamatan cahaya untuk menentukan tahap kecerahan imej yang akan menghasilkan kontras yang optimum.

Imej yang ditangkap dengan keamatan cahaya optimum kemudiannya tertakluk kepada peningkatan kontras selanjutnya dengan menggunakan ImageJ untuk menggunakan LUT dengan nilai keamatan minimum dan maksimum 90 dan 205, masing-masing. Penggabungan peningkatan kontras ini memberikan perwakilan neurit yang sederhana lebih tepat dalam imej terdua yang dijana daripada imej kontras fasa (Rajah 3B). Namun begitu, analisis kuantitatif imej terdua neurit sihat menunjukkan bahawa peningkatan kontras tidak mengurangkan pemecahan tiruan dengan ketara (p=0.9999; Rajah 3D). Oleh itu, kami seterusnya menyiasat sama ada penggunaan pengimejan imunofluoresensi akan menghasilkan imej dengan kontras yang unggul dan dengan itu memudahkan pengeluaran imej neurit binari yang lebih tepat dengan pemecahan buatan yang dikurangkan.

Slaid yang diterangkan dalam Rajah 2, yang menampilkan sel LUHMES tetap yang terdedah kepada pelbagai kepekatan 6- OHDA, telah diimunostainkan untuk protein sitoskeletal b III-tubulin, diimej menggunakan mikroskop pendarfluor dan dianalisis oleh penyiasat buta untuk pemecahan buatan (Rajah). 3C). Analisis kuantitatif imej terdua yang diperoleh daripada mikrograf pendarfluor dan mikrograf kontras fasa yang sepadan mendedahkan bahawa jenis mikroskopi mempengaruhi tahap pemecahan buatan [Friedman x2 (3)=15.44, p, 0.0001] . Khususnya, mikrograf pendarfluor menghasilkan imej terdua dengan pemecahan buatan yang dikurangkan dengan ketara berbanding dengan mikrograf kontras fasa (p=0.0016; Rajah 3D).

Hasilnya, imej kultur yang sihat menghasilkan skor DI yang jauh lebih rendah apabila mikrograf pendarfluor digunakan berbanding mikrograf kontras fasa (F(1,8)= 131.4, p=0.{{12} }001, R2=0.1442; Rajah 3E). Selain itu, trend keseluruhan yang ketara ialah perubahan lipatan antara nilai purata DI yang dikaitkan dengan budaya dan budaya sihat (dirawat dengan kenderaan) yang mempamerkan kemerosotan neurit (5.0 atau 7.5 mM 6-OHDA-dirawat) lebih besar apabila diukur menggunakan mikrograf pendarfluor. berbanding apabila diperoleh daripada mikrograf kontras fasa (Rajah 3E). Ini berlaku walaupun mikrograf pendarfluor kultur dengan degenerasi neurit sederhana (disebabkan oleh pendedahan kepada 5 mM 6-OHDA) mempunyai skor DI yang jauh lebih rendah daripada imej fasa sepadan kerana pengurangan pemecahan buatan (p=0.0001 , d=0.6312).

Mengoptimumkan parameter untuk pengesanan neurit terserpihan dan jumlah neurit
Kaedah tradisional untuk melaksanakan pengukuran DI melibatkan penggunaan pemalam Analyze Particles untuk ImageJ dengan parameter saiz 20 10,000 piksel untuk mengesan serpihan neurit. Walau bagaimanapun, kami mendapati bahawa sebahagian besar serpihan neurit tidak dapat dikesan oleh penganalisis zarah apabila menggunakan parameter yang disebut secara meluas ini (Shin et al., 2012; Di Stefano et al., 2015; Sasaki et al., 2016; Loreto et al. , 2020; Shin dan Cho, 2020) untuk mengukur degenerasi neurit dalam mikrograf fasa kontras sel LUHMES yang terdedah kepada 6-OHDA, yang dijana seperti yang diterangkan dalam Rajah 2.

Oleh itu, kami menganalisis semula imej daripada set data itu menggunakan had saiz minimum yang berbeza untuk pengesanan zarah untuk menentukan parameter optimum untuk pengenalpastian serpihan neurit. Daripada penilaian kualitatif bagi imej terdua yang dijana daripada mikrograf kontras fasa, parameter saiz 5–10,000 piksel meningkatkan pengesanan serpihan neurit, tetapi juga dikaitkan dengan kesilapan pengecaman bunyi latar belakang, artifak imej atau kecil lain. bahan bukan neurit sebagai serpihan neurit. Berbanding dengan parameter yang digunakan secara meluas iaitu 20–10,000 piksel, bagaimanapun, parameter 10–10,000 piksel meningkatkan pengesanan serpihan neurit tanpa peningkatan ketara yang ketara dalam positif palsu (Rajah 4A , dibiarkan).

Analisis serupa juga dilakukan dengan imej binari yang diperoleh daripada mikrograf pendarfluor sel LUHMES yang diimunolabelkan untuk b III-tubulin. Parameter saiz penganalisis zarah 5–10,000 piksel memudahkan pengesanan serpihan neurit yang paling sensitif dan, memandangkan mikrograf pendarfluor menampilkan serpihan yang kurang kecil, parameter tersebut tidak meningkatkan kesilapan pengecaman bahan bukan neurit sebagai serpihan neurit dengan ketara. (Gamb. 4A, kanan).

Kaedah tradisional untuk melaksanakan pengukuran DI, dengan menggunakan parameter saiz penganalisis zarah 20– 10,000 piksel, mengecualikan objek yang lebih kecil daripada 20 piksel daripada pengukuran serpihan neurit.

Walau bagaimanapun, objek kecil seperti itu biasanya tersilap dimasukkan dalam jumlah ukuran kawasan neurit, kerana kaedah pengukuran DI tradisional melibatkan pengiraan jumlah kawasan neurit dengan menjumlahkan semua piksel hitam dalam imej terdua. Untuk mengatasi isu ini, kami menggunakan pemalam Pembuang Zarah untuk ImageJ, yang ditulis oleh pembangun ImageJ Wayne Rasband, untuk mengalih keluar objek kecil bukan neurit daripada imej terdua. Penggunaan pemalam ini semasa melakukan pengukuran DI menggunakan mikrograf kontras fasa sel LUHMES yang terdedah kepada 6-OHDA, yang dijana seperti yang diterangkan dalam Rajah 2, menghasilkan peningkatan ketara dalam pengukuran DI merentas semua kepekatan pendedahan neurotoksin (F(1). ,8)=83.43, p=0.0001, R2=0.0416).
Tambahan pula, interaksi yang ketara menunjukkan bahawa peningkatan DI yang disebabkan oleh penggunaan penyingkir zarah menjadi lebih kuat pada kepekatan yang lebih tinggi (F(1.881,15.05)=59.97, p=0.0001, R{ {8}}.0094; Rajah 4B, C). Kami juga menggambarkan slaid sel yang sama dengan mikroskop pendarfluor dan menilai kesan penyingkiran zarah kecil pada pengukuran DI yang diperoleh daripada mikrograf pendarfluor. Walaupun penyingkiran zarah kecil memberikan nilai DI yang secara teorinya lebih tepat, nilai tersebut secara purata tidak jauh berbeza daripada yang diperoleh tanpa menggunakan pemalam penyingkir zarah apabila diukur menggunakan mikrograf pendarfluor (F(1,8)=2. 613, p=0.1446, R2=0.0013; Rajah 4D).

Automasi pengukuran DI daripada mikrograf pendarfluor

Prestasi pengukuran DI menggunakan kaedah tradisional memerlukan pemprosesan imej yang membosankan dan memakan masa, penggunaan alat tangan bebas untuk mengeluarkan badan sel individu secara digital dan pengukuran neurit terserpihan dan jumlah kawasan neurit daripada setiap imej. Oleh itu, kami berusaha untuk meningkatkan kecekapan kaedah dengan menulis makro yang mengautomasikan sepenuhnya analisis DI. Untuk mengautomasikan penyingkiran soma, makro, bertajuk ANDI, melaksanakan penduaan imej nukleus sel, yang dilabelkan melalui pewarnaan nuklear DAPI, diikuti dengan pengubahsuaian imej terdua supaya kawasan nuklear ambang diperbesarkan untuk merangkumi seluruh kawasan soma. Imej sedemikian dengan nukleus binari dan diperbesarkan kemudiannya ditolak daripada mikrograf pendarfluor sepadan neuron yang diimunolabelkan untuk b III-tubulin, menghasilkan imej yang menampilkan neurit secara eksklusif (Rajah 5A, B).

Untuk melaraskan saiz nuklear berubah-ubah yang disebabkan oleh pengecutan nuklear atau pemecahan yang dikaitkan dengan neurodegenerasi, imej binar nukleus dibesarkan melalui gabungan pelebaran dan hakisan yang menggabungkan serpihan nuklear dan mengembangkan kawasan terdua untuk menduduki kawasan yang lebih besar daripada soma sel LUHMES yang dibezakan. . Imej yang mengandungi neurit secara eksklusif kemudiannya diduakan dan tertakluk kepada analisis DI melalui satu siri fungsi automatik (Rajah 5C, D). Untuk menilai ketepatan operasi makro yang dikaitkan dengan penyingkiran soma daripada imej, kami membandingkan skor DI yang diperoleh berikutan penyingkiran manual badan sel daripada mikrograf pendarfluor menggunakan alat bebas ImageJ (seperti yang digambarkan sebelum ini dalam Rajah 4D), kepada skor DI dihasilkan daripada analisis imej yang serupa berikutan penyingkiran badan sel automatik menggunakan operasi penyingkiran soma yang dipaparkan dalam Makro ANDI. Analisis kami mendedahkan bahawa skor DI yang dikira menggunakan penyingkiran badan sel automatik berkorelasi hampir sama dengan pengukuran DI yang diperoleh daripada imej yang tertakluk kepada penyingkiran soma manual (r(34)=0.980, p, 0.0001; Rajah. 5E).

Untuk meningkatkan ketepatan analisis, kami menggabungkan beberapa pelarasan yang diterangkan sebelum ini yang meningkatkan pengukuran DI ke dalam ANDI. Makro menampilkan operasi peningkatan kontras, penggunaan pemalam Penghapus Zarah untuk mengalih keluar bahan bukan neurit daripada imej neurit dan bahan bukan nuklear daripada imej nukleus dan pengesanan serpihan neurit menggunakan parameter saiz 5–10,000 untuk pemalam Analyze Particles.

Kami membuat hipotesis bahawa, secara kolektif, penggunaan mikroskop pendarfluor, operasi peningkatan kontras, penyingkiran objek kecil dengan penyingkir zarah, dan parameter yang dioptimumkan untuk pengesanan zarah akan menyumbang kepada pengukuran degenerasi neurit yang lebih tepat. Untuk menguji hipotesis ini, imej kontras fasa sel LUHMES yang terdedah kepada pelbagai kepekatan 6-OHDA, yang dijana seperti yang diterangkan dalam Rajah 2, telah dianalisis dengan pemarkahan buta dan subjektif menggunakan julat nilai antara 0. 0 dan 1.0, dengan nilai yang mewakili bahagian ketara bagi kawasan neurit terserpihan. Kami kemudiannya menilai korelasi antara skor subjektif dan pengukuran DI yang diperoleh melalui kaedah tradisional, serta korelasi antara skor subjektif dan pengukuran DI yang diperoleh menggunakan Makro ANDI.

Walaupun pengukuran DI yang diperoleh menggunakan kaedah tradisional dikaitkan dengan skor subjektif (r {{0}}.7850, p,0.0001; Rajah 5F), Makro ANDI menghasilkan ukuran yang berkorelasi lebih kuat dengan penilaian subjektif (r 2=0.978, p, 0.0001; Rajah 5G). Perbandingan statistik langsung mendedahkan bahawa skor yang diperoleh melalui Makro ANDI berkorelasi jauh lebih kuat dengan penilaian subjektif berbanding skor yang diperoleh melalui kaedah tradisional (z=6.626, p, 0.0001; Rajah 5F, G). Analisis lanjut mendedahkan bahawa makro memudahkan prestasi pengukuran DI dengan peningkatan yang teguh dan ketara dalam kecekapan masa. Analisis DI yang dilakukan menggunakan Makro ANDI memerlukan masa purata 12.75 s bagi setiap imej yang dianalisis, berbanding dengan purata masa 5.27 min bagi setiap imej yang dianalisis melalui kaedah tradisional [Friedman x2 (1)=9, p {{22} }.0027]. Secara keseluruhannya, keputusan ini menunjukkan bahawa ANDI menghasilkan penjanaan pantas pengukuran DI yang, berbanding dengan skor yang diperoleh melalui kaedah tradisional, lebih hampir menghampiri kemerosotan yang dilihat oleh penyiasat daripada analisis kualitatif imej neurit.

Selepas menentukan ketepatan dan kecekapan Makro ANDI untuk mengukur degenerasi neurit dalam sel LUHMES terbeza yang terdedah kepada 6-OHDA, kami menilai kesesuaian makro untuk eksperimen yang melibatkan model kultur sel lain. Kajian rintis pertama kali dijalankan untuk menilai ketepatan ANDI dalam melakukan pengukuran DI menggunakan mikrograf kultur simpatis primer yang diimunolabelkan untuk b III-tubulin dan DAPI. Menariknya, bagaimanapun, badan sel neuron bersimpati adalah lebih besar daripada sel LUHMES yang dibezakan, dan oleh itu operasi dalam ANDI yang berkaitan dengan penyingkiran soma automatik tidak mengeluarkan keseluruhan soma (data tidak ditunjukkan).

Untuk mengatasi isu ini, kami menyemak ANDI untuk menampilkan kotak dialog yang membolehkan pengguna memilih saiz penyingkiran soma dengan mengawal bilangan kali mikrograf terdua nukleus diluaskan. Versi ANDI ini, versi 1.1, kemudiannya digunakan untuk melakukan pengukuran DI daripada mikrograf yang menggambarkan neuron simpatetik yang sihat, dirawat kenderaan atau neuron simpatetik yang merosot yang terdedah kepada hidrogen peroksida. Imej neuron yang terdedah kepada hidrogen peroksida menghasilkan skor DI yang jauh lebih tinggi berbanding dengan imej neuron yang dirawat kenderaan (F(1,3)=71.2, p=0.0035, R2=0 .9301; Rajah 6A, C). Selain itu, kami membandingkan skor DI ini yang diperoleh menggunakan ukuran ANDI ke DI yang diperoleh daripada set imej yang sama berikutan penyingkiran manual badan sel daripada mikrograf pendarfluor menggunakan alat bebas ImageJ. Tiada perbezaan ketara dalam skor DI yang dikira selepas penyingkiran soma manual berbanding dengan skor yang diperoleh menggunakan ANDI (F(1,3)=0.1082, p=0.7639, R2=0. 0000; Rajah 6A–C). Ujian post hoc juga mengesahkan bahawa skor DI yang diperoleh menggunakan ANDI tidak jauh berbeza dalam kes neuron yang tidak dirawat (p=0.0972) dan dalam kes neuron yang terdedah kepada hidrogen peroksida (p=0. 9986).

Tambahan pula, skor DI yang dihasilkan daripada ANDI berkorelasi hampir sama dengan skor DI yang diperoleh berikutan penyingkiran manual badan sel daripada mikrograf yang sepadan (r(34)=0.991, p, 0.0001). Data ini menunjukkan bahawa ANDI sesuai untuk mengukur kemerosotan neurit dalam budaya neuron primer, dengan operasi penyingkiran soma yang pengguna boleh menyesuaikan untuk memadankan jenis neuron yang berbeza. Selain itu, pengesanan serpihan neurit dalam kultur yang terdedah kepada hidrogen peroksida menunjukkan kebolehgunaan makro untuk digunakan dalam eksperimen yang melibatkan degenerasi neurit yang disebabkan oleh sumber selain 6-OHDA. Untuk mengesahkan lagi penggunaan ANDI dalam mengesan degenerasi neurit yang dikaitkan dengan pelbagai punca, kami juga menggunakan makro untuk mengukur degenerasi neurit dalam mikrograf budaya simpatik yang sihat atau kultur yang tertakluk kepada pengeluaran NGF. Seperti yang dijangkakan, imej budaya yang tertakluk kepada penarikan NGF menghasilkan nilai DI yang jauh lebih tinggi berbanding dengan imej budaya sihat (F(1,2)= 287, p= 0.0035, R2=0. 958; Rajah 6D, E). Secara kolektif, penemuan ini menunjukkan bahawa ANDI boleh digunakan untuk mengesan degenerasi neurit yang dikaitkan dengan pelbagai konteks biologi.

Oleh kerana pewarnaan untuk TH biasanya digunakan untuk menggambarkan neuron katekolaminergik, kami juga menilai kesesuaian mikrograf yang menggambarkan pewarnaan TH untuk mengukur degenerasi neurit menggunakan ANDI. Budaya neuron simpatis yang sihat yang dirawat dengan larutan kenderaan atau neuron simpatik yang merosot yang terdedah kepada hidrogen peroksida telah ditetapkan dan tertakluk kepada pelabelan imunofluoresensi untuk TH dan b III-tubulin, serta pewarnaan balas untuk DAPI. Imej neurit yang menggambarkan pewarnaan untuk TH atau b III-tubulin, dan imej nukleus sepadan yang memaparkan pelabelan DAPI, kemudian ditangkap pada medan pandangan yang sama. ANDI telah dilaksanakan, dan imej yang memaparkan pewarnaan TH atau pewarnaan b III-tubulin telah dipilih sebagai imej neurit. Analisis kami mendedahkan bahawa skor DI yang diperoleh menggunakan imej pewarnaan TH berkorelasi sangat kuat dengan skor yang diperoleh daripada imej pewarnaan b III-tubulin (r(28)= 0.962, p, 0.0001; Rajah 6F, G). Data ini menunjukkan bahawa pengukuran DI yang tepat boleh diperolehi oleh ANDI menggunakan prosedur pewarnaan alternatif yang melabelkan keseluruhan neurit, seperti immunolabeling untuk TH.

Untuk menunjukkan kegunaan kaedah yang lebih baik untuk melakukan pengukuran DI dalam eksperimen saintifik, kami menggunakan kaedah baharu untuk menilai peranan JNK dalam degenerasi neurit yang disebabkan oleh tekanan oksidatif dalam sel mesencephalic manusia. Sel LUHMES yang dibezakan telah diprarawat selama 1 jam dengan perencat JNK SP600125 atau penyelesaian kenderaan. Sel-sel tersebut kemudiannya dirawat selama 24 jam dengan 6- OHDA untuk mendorong tekanan oksidatif atau dengan larutan kenderaan. Sel tetap tertakluk kepada immunolabeling untuk pewarnaan b III-tubulin dan DAPI, dan ANDI digunakan untuk mendapatkan pengukuran DI daripada mikrograf pendarfluor. Walaupun budaya yang tidak mempunyai prarawatan dengan perencat JNK menunjukkan kemerosotan neurit berikutan pendedahan kepada 6-OHDA, perencatan JNK mengakibatkan pengurangan yang ketara dan ketara dalam 6- degenerasi neurit yang disebabkan oleh OHDA (p= 0.0001 , d= 2.0209; Rajah 7). Penemuan ini menyokong peranan penting untuk isyarat JNK dalam degenerasi neurit yang disebabkan oleh tekanan oksidatif dalam sel mesencephalic manusia, dan yang penting, menunjukkan kegunaan kaedah baharu kami untuk menjana penemuan saintifik dengan memudahkan pengukuran degenerasi neurit yang cepat dan tepat.

Perbincangan

Degenerasi neurit dikaitkan dengan pelbagai keadaan neuropatologi, namun mekanisme molekul yang mendasari degradasi neurit masih tidak difahami sepenuhnya. Kaedah yang memudahkan analisis degenerasi neurit yang tepat dan cekap adalah penting untuk kejayaan mengenal pasti faktor-faktor baru yang mengawal selia peristiwa selular yang penting ini. Dalam kajian ini, kami mendedahkan pelbagai sumber ralat yang dikaitkan dengan kaedah yang biasa digunakan untuk mengukur degenerasi neurit. Kami melaporkan data percubaan yang menyokong pengubahsuaian prosedur yang boleh dilaksanakan untuk mengurangkan ralat analisis DI, dan pengubahsuaian tersebut digabungkan ke dalam makro ImageJ baharu untuk menyediakan alat untuk analisis DI yang pantas, tepat dan objektif menggunakan perisian sumber terbuka dan percuma. Selain itu, kami menunjukkan bagaimana kaedah yang lebih baik boleh digunakan untuk mengukur degenerasi neurit dalam model kultur sel PD, gangguan di mana pemecahan akson dalam neuron dopaminergik adalah peristiwa peringkat awal yang mendahului kehilangan neuron akhirnya (Tagliaferro dan Burke, 2016) .

Dalam kajian ini, kami menunjukkan kegunaan Makro ANDI dalam mengukur degenerasi neurit dalam model kultur sel PD yang terdiri daripada sel LUHMES terbeza yang terdedah kepada 6-OHDA.

Kami melaporkan penemuan eksperimen yang menyokong substrat optimum di mana budaya harus ditubuhkan, serta menunjukkan ketumpatan penyaduran yang paling sesuai untuk analisis degenerasi neurit. Penggunaan sistem model ini untuk mengkaji degenerasi neurit mempunyai beberapa kelebihan. Sel-sel membina neurit yang mempunyai rangkaian yang baik dan biasanya .500 mm panjang, dan kultur terdedah kepada neurodegeneration yang disebabkan oleh model neurotoksin klasik PD seperti 6-OHDA, 1-metil{{4 }}ion phenylpyridinium (MPP1), dan rotenone (Lotharius et al., 2005; Zhang et al., 2014; Smirnova et al., 2016; Kraemer et al., 2021). Tambahan pula, asal usul manusia sel LUHMES meningkatkan kebolehterjemahan penemuan yang berkaitan dengan model, dan pengabadian bersyarat memudahkan penjanaan dan penyebaran budaya yang pesat (Scholz et al., 2011). Oleh itu, ditambah dengan analisis automatik yang dilakukan menggunakan ANDI, sel LUHMES boleh digunakan untuk membuat penemuan baru yang berkaitan dengan degenerasi neurit yang berkaitan dengan PD sambil memudahkan daya pemprosesan yang jauh lebih tinggi berbanding dengan analisis bukan automatik yang dilakukan dengan kultur neuron primer.

Banyak kumpulan penyelidikan telah melakukan analisis DI menggunakan imej kontras fasa untuk mendapatkan pandangan tentang faktor yang mengawal degenerasi neurit (Press dan Milbrandt, 20{{10}}9; Kraemer et al., 2014 ; Di Stefano et al., 2015; Hill et al., 2018; Geisler et al., 2019). Di sini, kami melaporkan kelemahan penting yang berkaitan dengan kaedah yang digunakan secara meluas ini untuk mengukur degenerasi neurit: perduaan imej kontras fasa menyebabkan sebahagian besar neurit utuh kelihatan berpecah-belah. Walaupun tahap kontras yang boleh dicapai semasa menangkap mikrograf berbeza-beza bergantung pada sistem mikroskop yang tersedia untuk penyiasat, isu ini merebak di kalangan pelbagai kumpulan penyelidikan, kerana DI 0.2 lazimnya diterima sebagai ambang di atas kultur yang dianggap mengalami kemerosotan. akson, dan kebanyakan laporan saintifik yang memaparkan pengukuran DI daripada mikrograf kontras fasa telah melaporkan skor DI untuk neuron yang sihat antara 0.1 dan 0.3 (Sasaki et al., 2009, 2016; Di Stefano et al., 2015; Hill et al., 2018; Loreto et al., 2020). Analisis DI kami yang diperoleh daripada mikrograf pendarfluor, serta skor subjektif daripada penyiasat buta, menunjukkan bahawa 10-20% pemecahan neurit tidak biasa dalam budaya neuron yang sihat. Sebaliknya, budaya sedemikian menunjukkan hanya 2.5% pemecahan neurit secara purata. Oleh itu, penemuan kami menekankan keperluan untuk kaedah yang meningkatkan ketepatan analisis degenerasi neurit dengan mengurangkan sumber ralat pengukuran yang biasa dan ketara ini.

Walaupun majoriti kajian yang melibatkan pengukuran DI telah menggunakan imej kontras fasa untuk melakukan analisis degenerasi neurit, beberapa kumpulan penyelidikan baru-baru ini telah melakukan pengukuran DI menggunakan imej neuron yang dilabelkan untuk filamen sitoskeletal seperti polipeptida sederhana neurofilamen atau b -b-tubulin (Wakatsuki). et al., 2011; Li et al., 2017; Pease-Raissi et al., 2017; Hernandez et al., 2018; Sundaramoorthy et al., 2020). Walau bagaimanapun, bentuk mikroskop manakah yang paling sesuai untuk pengukuran degenerasi neurit masih tidak jelas, kerana penyiasatan diperlukan untuk memahami sama ada perubahan dalam penyetempatan protein sitoskeletal ini semasa degenerasi neurit dengan sewajarnya memodelkan jumlah perubahan dalam morfologi neurit, serta untuk menilai sejauh mana ukuran DI yang diperolehi dengan mikrograf pendarfluor berkorelasi dengan ukuran serupa yang diperoleh daripada mikrograf kontras fasa. Di sini, kami menunjukkan bahawa mikrograf pendarfluor yang menggambarkan pewarnaan b III-tubulin bukan sahaja mewakili pemecahan neurit dengan tepat, tetapi juga memudahkan pengukuran DI yang lebih tepat kerana kontras unggulnya dan penurunan kerentanan terhadap pemecahan buatan pada binarisasi. Oleh itu, keputusan kami menyerlahkan kegunaan menggunakan pewarnaan b III-tubulin untuk mengukur degenerasi neurit.

Antara kajian yang diterbitkan yang melibatkan analisis DI untuk mengukur kemerosotan neurit, saiz dan parameter pekeliling yang dilaporkan digunakan untuk mengesan serpihan neurit telah banyak berubah. Sebagai contoh, kajian terbaru yang melibatkan penilaian degenerasi neurit dalam neuron hippocampal berbudaya menggunakan parameter saiz 4–900 piksel (Li et al., 2017), manakala kajian yang melibatkan neuron DRG berbudaya menggunakan parameter pengesanan 0–10,000 piksel (Wakatsuki et al., 2011). Satu sebab yang berpotensi untuk variasi sedemikian ialah keberkesanan parameter saiz analisis zarah dalam mengesan serpihan neurit berbeza-beza bergantung pada resolusi imej kerana parameter saiz untuk pengesanan zarah dikaitkan dengan unit piksel. Malangnya, kebanyakan kajian yang diterbitkan melibatkan analisis DI tidak menyertakan perihalan resolusi imej yang digunakan untuk analisis. Oleh itu, penubuhan parameter analisis standard melalui protokol yang mendedahkan sepenuhnya butiran penting seperti resolusi imej yang disyorkan telah diperlukan. Di sini, kami melaporkan bahawa parameter yang paling biasa disebut untuk pengesanan serpihan neurit, 20– 10,000 piksel (Shin et al., 2012; Di Stefano et al., 2015; Sasaki et al., 2016; Loreto et al. al., 2020; Shin dan Cho, 2020), mengakibatkan sebahagian besar serpihan neuron tidak dapat dikesan. Mengurangkan kriteria saiz minimum untuk pengesanan serpihan neurit meningkatkan sensitiviti pengesanan serpihan, pada masa yang sama meningkatkan bilangan artifak imej dan serpihan bukan neurit yang dikesan secara palsu sebagai serpihan neurit. Dalam mencari parameter yang paling baik mengimbangi sensitiviti pengesanan dan kadar positif palsu, kami mengenal pasti parameter analisis 10–10,000 sebagai menyediakan pengesanan serpihan neurit yang paling tepat dalam imej terdua yang diperoleh daripada mikrograf kontras fasa, manakala parameter 5– 10,000 memudahkan pengesanan serpihan neurit yang paling tepat dalam imej terdua yang diperoleh daripada mikrograf pendarfluor. Walaupun penentuan ini dibuat menggunakan resolusi imej 1280 1024, parameter sedemikian juga harus membolehkan pengesanan serpihan neurit yang tepat dalam imej yang ditangkap pada resolusi lain yang menampilkan saiz menegak 1024 piksel, seperti resolusi skrin penuh biasa {{ 27}}, kerana neuron yang digambarkan dalam imej sedemikian akan mempunyai saiz piksel yang serupa.

Banyak kumpulan penyelidikan telah menggunakan kriteria saiz minimum apabila mengkonfigurasi parameter analisis zarah untuk mengelakkan serpihan kecil bukan neurit daripada dimasukkan dalam ukuran serpihan neurit (Shin et al., 2012; Cosker et al., 2013; Di Stefano et al., 2015; Sasaki et al., 2016; Li et al., 2017; Loreto et al., 2020; Shin dan Cho, 2020; Sundaramoorthy et al., 2020). Walau bagaimanapun, kajian sedemikian telah tersilap memasukkan jirim bukan serpihan kecil dalam pengukuran jumlah kawasan neurit, kerana pengukuran tersebut diperoleh dengan menjumlahkan luas semua piksel hitam dalam imej. Di sini, kami menunjukkan utiliti pemalam Penghilang Zarah untuk mengeluarkan serpihan kecil bukan serpihan daripada imej sebelum analisis DI. Penggunaan pemalam dengan ketara meningkatkan sensitiviti ukuran degenerasi neurit yang diperoleh daripada imej kontras fasa. Oleh itu, keputusan kami menyerlahkan nilai pemalam Pembuang Zarah untuk penyiasat yang melakukan analisis DI menggunakan mikrograf kontras fasa. Menariknya, mikrograf pendarfluor menampilkan serpihan bukan neurit yang kurang kecil, dan oleh itu, kriteria saiz yang lebih rendah iaitu lima piksel boleh digunakan untuk pengesanan serpihan. Walaupun penyingkiran zarah serpihan bukan neurit bersaiz kurang daripada lima piksel tidak memberi kesan ketara kepada pengukuran DI yang diperoleh daripada mikrograf pendarfluor, operasi sedemikian memberikan nilai yang secara teorinya lebih tepat dan oleh itu dimasukkan dalam ANDI.

Memandangkan analisis DI mesti dilakukan menggunakan imej yang memaparkan neurit secara eksklusif, penggunaan kaedah analisis terutamanya terhad untuk digunakan dengan sistem kultur yang sesuai untuk penyingkiran badan sel, seperti kultur eksplan di mana badan sel boleh dikeluarkan secara fizikal (Catenaccio et al. , 2017; Shin dan Cho, 2020) atau budaya dalam peranti mikrofluid yang memudahkan pengasingan petak soma dan akson (Cosker et al., 2013; Pease-Raissi et al., 2017; Tan et al., 2018). Secara alternatif, melakukan analisis DI dengan budaya yang dipisahkan boleh dicapai melalui kerja yang membosankan dan memakan masa yang berkaitan dengan penyingkiran digital badan sel daripada mikrograf (Kraemer et al., 2014). Dalam kajian ini, kami mendedahkan bahawa ANDI mendayakan prestasi pengukuran DI daripada mikrograf yang menampilkan sel LUHMES yang diasingkan dan diedarkan secara mozek merentas sistem kultur 2D. Penemuan kami juga menunjukkan bahawa ANDI memudahkan 24-penurunan kali ganda dalam masa yang diperlukan untuk melaksanakan analisis dan operasi dalam ANDI yang berkaitan dengan penyingkiran soma menghasilkan keputusan analisis DI yang mengaitkan 98% dengan analisis serupa yang dilakukan berikutan penyingkiran soma manual menggunakan alat bebas ImageJ. Oleh itu, makro dengan ketara meningkatkan kecekapan analisis dengan melaksanakan penyingkiran soma automatik melalui proses yang tidak mengorbankan ketepatan, dan operasi sedemikian mengembangkan kesesuaian kaedah untuk menganalisis kultur tercerai dengan badan sel teragih mozek.

Selain memudahkan penyingkiran badan sel automatik daripada imej, ANDI menampilkan beberapa semakan kepada kaedah tradisional untuk melaksanakan analisis DI, termasuk penggunaan mikrograf pendarfluor, parameter analisis zarah yang disemak semula dan penggunaan penyingkir zarah untuk membuang serpihan kecil bukan neurit. daripada imej. Penemuan kami menunjukkan bahawa pengoptimuman ini secara kolektif menghasilkan nilai DI yang lebih dekat dengan nilai yang diperoleh melalui pemarkahan buta dan tertakluk. Oleh itu, sebagai tambahan kepada banyak mengurangkan masa yang diperlukan untuk melaksanakan analisis, ANDI memudahkan pengukuran DI yang, berbanding dengan kaedah tradisional, lebih tepat mencerminkan degenerasi neurit yang dilaporkan penyiasat daripada analisis imej kualitatif.

Satu kelemahan kaedah tradisional untuk melaksanakan analisis DI ialah analisis sedemikian memerlukan latihan dalam penggunaan ImageJ supaya pengguna biasa dengan set operasi ImageJ yang membosankan. Selain itu, untuk melaksanakan analisis dengan cekap, latihan lanjut diperlukan untuk pengguna melakukan analisis kelompok atau menulis skrip untuk separa mengautomasikan pelaksanaan langkah tertentu. Dengan mengautomasikan sepenuhnya analisis, ANDI memudahkan pengukuran DI hanya dalam beberapa langkah yang berkaitan dengan memuat turun dan melaksanakan makro. Untuk meningkatkan kemesraan pengguna, makro termasuk kod untuk menyediakan antara muka untuk memilih direktori yang mengandungi imej untuk dianalisis, serta untuk memudahkan output imej hasil dan jadual data ke direktori pilihan pengguna. Selain itu, skrip mengandungi banyak ciri yang direka untuk mengelakkan ketidaktepatan pengukuran atau kesilapan pengguna, termasuk pembersihan automatik hasil ImageJ sebelumnya; penyingkiran maklumat skala imej untuk memastikan pengukuran dilakukan dengan tepat menggunakan unit piksel; konfigurasi yang sesuai bagi tetapan warna ImageJ, tetapan pengukuran dan parameter penganalisis zarah; persembahan mesej ralat jika pengguna tersilap memilih direktori yang mengandungi bilangan imej yang tidak sama yang menggambarkan b pewarnaan tubulin III dan pewarnaan DAPI; perihalan log yang menunjukkan kemajuan analisis; dan pengekodan untuk mengelakkan pepijat yang dikaitkan dengan penjanaan fail .ini automatik oleh Windows 10. Secara keseluruhannya, ciri ini menjadikan analisis DI lebih mesra pengguna, yang mungkin memupuk minat dalam kajian yang berkaitan dengan degenerasi neurit.

Untuk menunjukkan kegunaannya dalam percubaan, kami menggunakan ANDI untuk menilai sumbangan JNK kepada degenerasi neurit dalam kultur sel LUHMES yang terdedah kepada 6-OHDA. JNK ialah kinase diaktifkan tekanan yang telah dilaporkan sebagai kunci kepada degenerasi neurit dalam neuron periferi yang bukan primata (Shin et al., 2012), tetapi kajian lanjut diperlukan untuk memahami peranan kinase dalam degenerasi neurit dalam sel manusia mesencephalic . Di sini, kami menunjukkan bahawa perencatan JNK dengan ketara melindungi sel mesencephalic manusia daripada degenerasi neurit yang dikaitkan dengan tekanan oksidatif. Penemuan sedemikian bukan sahaja mendedahkan peranan penting untuk JNK dalam degenerasi neurit yang dikaitkan dengan model penyakit manusia tetapi juga menunjukkan kegunaan ANDI untuk melakukan analisis imej automatik dan objektif untuk membuat penemuan saintifik baharu.

Walaupun ANDI pada mulanya direka untuk memudahkan pengukuran degenerasi neurit yang cepat dan tepat dalam kultur sel LUHMES yang dibezakan yang terdedah kepada 6-OHDA, penemuan kami juga menunjukkan bahawa makro boleh digunakan untuk mengesan degenerasi neurit yang disebabkan oleh sebab lain, seperti pendedahan kepada hidrogen peroksida atau pengeluaran neurotropin. Selain itu, versi 1.1 makro menampilkan kotak dialog yang membolehkan penyiasat menyesuaikan operasi penyingkiran soma untuk neuron dengan saiz tertentu. Data kami juga menyokong bahawa kaedah pewarnaan selain daripada immunolabeling untuk b III-tubulin boleh digunakan untuk pengukuran tepat degenerasi neurit. Walaupun kami mengesyorkan penggunaan kajian rintis untuk mengesahkan ketepatan pengukuran DI apabila menggunakan ANDI dengan jenis sel atau kaedah pewarnaan yang belum pernah diuji sebelum ini, penemuan ini menyokong bahawa makro ialah alat yang umumnya serba boleh untuk mengukur degenerasi neurit dalam neuron berbudaya. Memandangkan ANDI belum dioptimumkan untuk mengukur kemerosotan neurit dalam tisu, pada masa ini kami hanya mengesyorkan penggunaannya untuk menganalisis kemerosotan neurit yang dikaitkan dengan sel kultur. Walau bagaimanapun, kod untuk ANDI tersedia secara terbuka dan oleh itu mungkin juga berguna untuk penyiasat yang berminat untuk mengubah suai skrip agar sesuai dengan kajian in vivo atau aplikasi lain.

Kesimpulannya, artikel ini membentangkan data yang mendedahkan sumber ralat biasa yang dikaitkan dengan kaedah yang digunakan secara meluas untuk mengukur degenerasi neurit. Pendekatan eksperimen digunakan untuk menambah baik kaedah, dan peningkatan tersebut telah digabungkan ke dalam makro ImageJ bebas dan sumber terbuka yang boleh digunakan untuk melaksanakan analisis mikrograf pendarfluor yang pantas, tepat dan objektif untuk degenerasi neurit. Penemuan kami mendedahkan keberkesanan ANDI untuk mengukur degenerasi neurit dalam mikrograf yang menggambarkan model kultur sel PD, serta memberikan bukti prinsip bahawa makro boleh mengesan degenerasi neurit yang dikaitkan dengan konteks biologi yang lain. Makro mesra pengguna akan mengurangkan masa yang diperlukan untuk penyiasat untuk belajar mengukur pemecahan neurit sambil meningkatkan daya pemprosesan dan ketepatan kajian menilai faktor yang mendasari degenerasi neurit. Makro ANDI tersedia di URL berikut: https:// github.com/kraemerb/kraemerlab.

Rujukan

1. Aarsland D, Creese B, Politis M, Chaudhuri KR, Ffytche DH, Weintraub D, Ballard C (2017) Kemerosotan kognitif dalam penyakit Parkinson. Nat Rev Neurol 13:217–231.

2. Adalbert R, Coleman MP (2013) Kajian: patologi akson dalam gangguan neurodegeneratif yang berkaitan dengan usia. Neuropathol Appl Neurobiol 39:90–108.

3. Bové J, Perier C (2012) Model berasaskan neurotoksin bagi penyakit Parkinson. Neurosains 211:51–76.

4. Catenaccio A, Llavero Hurtado M, Diaz P, Lamont DJ, Wishart TM, Court FA (2017) Analisis molekul axonal-intrinsic dan glial-related co-regulation of axon degeneration. Kematian Sel Dis 8: e3166.

5. Cosker KE, Pazyra-Murphy MF, Fenstermacher SJ, Segal RA (2013) transkripsi koordinat neurotropin yang diperolehi sasaran.

6. Di Stefano M, Nascimento-Ferreira I, Orsomando G, Mori V, Gilley J, Brown R, Janeckova L, Vargas ME, Worrell LA, Loreto A, Tickle J, Patrick J, Webster JRM, Marangoni M, Carpi FM, Pucciarelli S, Rossi F, Meng W, Sagasti A, Ribchester RR, et al. (2015) Peningkatan NAD prekursor nicotinamide mononucleotide (NMN) selepas kecederaan menggalakkan degenerasi akson. Kematian Sel Berbeza 22:731–742.

7. Fukui K (2016) Spesies oksigen reaktif mendorong degenerasi neurit sebelum induksi kematian sel. J Clin Biochem Nutr 59:155–159.

8. Geden MJ, Deshmukh M (2016) Degenerasi akson: konteks mentakrifkan laluan yang berbeza. Curr Opin Neurobiol 39:108–115.

9. Geisler S, Doan RA, Cheng GC, Cetinkaya-Fisgin A, Huang SX, Höke A, Milbrandt J, DiAntonio A (2019) Vincristine dan bortezomib menggunakan mekanisme huluan yang berbeza untuk mengaktifkan kemerosotan akson yang bergantung kepada SARM1-yang biasa program. JCI Insight 4:e129920.

10. Hernandez DE, Salvadores NA, Moya-Alvarado G, Catalan RJ, Bronfman FC, Court FA (2018) Kemerosotan aksonal yang disebabkan oleh excitotoxicity glutamat dimediasi oleh nekroptosis. J Sel Sci 131:jcs214684.

For more information:1950477648nn@gmail.com