Kuantifikasi Kemerosotan Neurit Dengan Ketepatan Dan Kecekapan yang Dipertingkatkan dalam Model In Vitro Penyakit Parkinson Bahagian 1

Abstrak

Kemerosotan neurit dikaitkan dengan peringkat awal gangguan neurodegeneratif seperti penyakit Alzheimer, penyakit Parkinson (PD), dan amyotrophic lateral sclerosis. Satu kaedah yang biasa digunakan untuk menganalisis degenerasi neurit melibatkan pengiraan Indeks Degenerasi (DI) berikutan penggunaan alat Analyze Particles ImageJ untuk mengesan serpihan neurit dalam mikrograf sel kultur. Walau bagaimanapun, analisis DI terdedah kepada beberapa jenis ralat pengukuran, boleh memakan masa untuk dilaksanakan, dan terhad dalam aplikasi.

Neurodegeneration merujuk kepada perubahan yang berlaku di dalam atau di sekeliling neuron, yang mungkin menjejaskan fungsi kognitif manusia, kecerdasan, emosi, tingkah laku, dan lain-lain. Ramai orang berpendapat bahawa neurodegeneration berkait rapat dengan kemerosotan ingatan, tetapi ini mungkin tidak berlaku.

Pertama, neurodegeneration tidak semestinya bermakna bahawa ingatan menurun dengan usia. Sesetengah orang boleh mengekalkan ingatan yang baik dan juga dapat memahami kebenaran. Ini kerana daya ingatan seseorang dipengaruhi oleh gabungan faktor seperti senaman, diet dan gaya hidup.

Kedua, otak manusia boleh membina semula sambungan saraf baru dan membentuk ingatan baru, yang dipanggil keplastikan. Tidak kira usia, otak sentiasa belajar dan membentuk kenangan baru. Oleh itu, neurodegeneration hanyalah perubahan semula jadi dalam otak dan tidak semestinya memori akan merosot.

Akhir sekali, mengekalkan sikap optimistik juga dapat meningkatkan daya ingatan seseorang. Kebimbangan dan tekanan boleh memberi kesan buruk pada otak, menyebabkan kehilangan ingatan. Sikap positif boleh menggalakkan kesihatan otak, dan meningkatkan daya ingatan dan keupayaan kognitif.

Ringkasnya, neurodegeneration tidak semestinya membawa kepada kehilangan ingatan, dan sikap optimis terhadap kehidupan boleh membantu kita mengekalkan ingatan yang baik dan keupayaan kognitif. Oleh itu, kita harus mengekalkan sikap optimis, dan menguatkan pengurusan senaman, diet, dan gaya hidup untuk mengekalkan kesihatan otak dan ingatan. Dapat dilihat bahawa kita perlu meningkatkan daya ingatan. Cistanche boleh meningkatkan ingatan dengan ketara, kerana Cistanche juga boleh mengawal keseimbangan neurotransmitter, seperti meningkatkan tahap asetilkolin dan faktor pertumbuhan. Bahan-bahan ini sangat penting untuk ingatan dan pembelajaran. Selain itu, daging juga boleh meningkatkan aliran darah dan menggalakkan penghantaran oksigen, yang dapat memastikan otak menerima nutrisi dan tenaga yang mencukupi, seterusnya meningkatkan daya hidup dan daya tahan otak.

Klik tahu cara untuk meningkatkan fungsi otak

Di sini, kami menerangkan kaedah yang lebih baik untuk melaksanakan analisis DI. Ketepatan ukuran dipertingkatkan melalui pengubahsuaian kriteria pemilihan untuk mengesan serpihan neurit, penyingkiran artifak imej dan bahan bukan neurit daripada imej, dan pengoptimuman kontras imej. Penambahbaikan sedemikian telah dilaksanakan ke dalam makro ImageJ yang membolehkan analisis DI yang pantas dan automatik sepenuhnya bagi berbilang imej. Makro ini menampilkan operasi untuk penyingkiran automatik badan sel daripada mikrograf, sekali gus mengembangkan aplikasi analisis DI untuk digunakan dalam eksperimen yang melibatkan budaya tercerai.

Kami membentangkan penemuan eksperimen yang menyokong bahawa, berbanding dengan kaedah konvensional, kaedah analisis yang dipertingkatkan menghasilkan pengukuran dengan ketepatan yang lebih tinggi dan memerlukan masa yang lebih sedikit untuk dilakukan.

Tambahan pula, kami menunjukkan kegunaan kaedah untuk menyiasat degenerasi neurit dalam model kultur sel PD dengan menjalankan eksperimen yang mendedahkan kesan c-Jun N-terminal kinase (JNK) pada degenerasi neurit yang disebabkan oleh tekanan oksidatif dalam sel mesencephalic manusia. Kaedah analisis yang lebih baik ini boleh digunakan untuk mendapatkan pandangan baru tentang faktor-faktor yang mendasari degenerasi neurit dan perkembangan gangguan neurodegeneratif.

Kata kunci:

Kemerosotan akson; indeks degenerasi; degenerasi neurit; kemerosotan saraf; tekanan oksidatif; Penyakit Parkinson.

Kenyataan Kepentingan

Degenerasi neurit ialah peristiwa selular yang dikaitkan dengan peringkat awal pelbagai jenis gangguan neurodegeneratif. Faktor molekul yang mengawal degenerasi neurit masih kurang difahami, dan kaedah sedia ada untuk mengkaji degenerasi neurit mempunyai aplikasi dan kecekapan yang terhad. Di sini, kami mengenal pasti pengubahsuaian kepada prosedur yang digunakan secara meluas untuk menganalisis degenerasi neurit yang mengurangkan ralat pengukuran.

Peningkatan metodologi sedemikian telah dimasukkan ke dalam makro ImageJ, dengan itu memudahkan analisis degenerasi neurit yang cepat dan automatik sepenuhnya menggunakan set mikrograf yang besar. Menggunakan model kultur sel penyakit Parkinson (PD), kami menunjukkan bahawa makro memudahkan pengukuran degenerasi neurit yang lebih tepat dan cekap sambil mengembangkan kesesuaian kaedah analisis untuk eksperimen yang melibatkan budaya tercerai.

pengenalan

Degenerasi neurit ialah proses selular di mana akson atau dendrit mengalami disfungsi progresif dan perubahan morfologi, yang membawa kepada kehilangan integriti neurit. Kemerosotan neurit ialah proses yang dipelihara secara evolusi yang penting untuk penubuhan rangkaian saraf yang betul semasa pembangunan sistem saraf pusat (Neukomm dan Freeman, 2014).

Walau bagaimanapun, proses itu juga dicetuskan sebagai tindak balas kepada pelbagai bentuk kecederaan seperti kerosakan mekanikal atau pendedahan kepada ubat yang digunakan untuk kemoterapi (Salvadores et al., 2017). Tambahan pula, degenerasi neurit dikaitkan dengan perkembangan pelbagai gangguan neurodegeneratif yang berkaitan dengan usia, termasuk penyakit Alzheimer, penyakit Parkinson (PD), penyakit Huntington dan sklerosis lateral amyotrophic.

Menariknya, untuk semua gangguan neurodegeneratif sedemikian, bukti terkumpul menunjukkan bahawa degenerasi neurit adalah peristiwa peringkat awal utama yang mendahului kematian neuron atau permulaan gejala klinikal (Serrano-Pozo et al., 2011; Adalbert dan Coleman, 2013; Marangoni et al. ., 2014; Suzuki et al., 2020). Oleh itu, kajian yang meneroka faktor yang mengawal proses selular ini mungkin mendedahkan sasaran baru untuk merawat pelbagai keadaan neurodegeneratif.

Menyiasat degenerasi neurit amat penting untuk memahami PD, penyakit yang dicirikan oleh pengumpulan agregat protein yang mengandungi a-synuclein, kehilangan progresif neuron dopaminergik dalam substantia nigra pars compacta (SNpc), dan perkembangan pelbagai gejala motor dan kognitif. (Aarsland et al., 2017).

Bukti daripada kajian postmortem dan pengimejan manusia menunjukkan bahawa agregat a-synuclein lebih banyak terdapat dalam gentian neuron berbanding badan sel, dan degradasi akson dopaminergik berlaku pada tahap yang lebih besar daripada kehilangan neuron dopaminergik dalam SNpc semasa tempoh yang membawa kepada permulaan klinikal. (Tagliaferro dan Burke, 2016).

Walaupun interaksi molekul yang menyumbang kepada kemerosotan progresif neurit dopaminergik masih tidak difahami sepenuhnya, bukti terkini menunjukkan bahawa kemerosotan neurit boleh dimediasi oleh peristiwa yang bebas daripada isyarat lata yang mendasari kematian neuron (Fukui, 2016; Geden dan Deshmukh, 2016). Oleh itu, kajian yang menilai secara langsung asas fisiologi degenerasi neurit adalah penting untuk pembangunan terapi yang menghalang perkembangan awal PD.

Sebagai tindak balas kepada bukti peranan utama untuk degenerasi neurit dalam perkembangan gangguan neurodegeneratif, pelbagai kaedah telah dibangunkan untuk mengukur degenerasi neurit menggunakan mikrograf neuron berbudaya. Sebagai contoh, pelbagai kaedah berbeza telah diwujudkan untuk mengukur degenerasi neurit menggunakan perisian untuk mengesan penurunan bilangan atau panjang neurit (Ofengeim et al., 2012; Johnstone et al., 2018).

Walau bagaimanapun, oleh kerana kaedah sedemikian tidak menilai secara langsung pemecahan neurit, tafsiran keputusan untuk menentukan kesan pembolehubah ke atas degenerasi neurit boleh dikelirukan oleh kesan potensi pembolehubah ke atas pertumbuhan neurit. Kumpulan penyelidikan tertentu juga telah mengukur degenerasi neurit dengan menskor imej neurit secara subjektif berdasarkan ciri morfologi dan tahap pemecahan yang jelas (Zhai et al., 2003; Nakamura et al., 2016; Krishtal et al., 2017). Walau bagaimanapun, kaedah alternatif ini memakan masa dan mungkin menimbulkan ralat penyiasat.

Satu kaedah yang memudahkan pengukuran objektif dan langsung pemecahan neurit melibatkan penggunaan algoritma Analisis Zarah ImageJ untuk mengukur luas serpihan neurit dalam mikrograf sel kultur. Pengukuran digunakan untuk mengira Indeks Degenerasi (DI), skala antara {{0}}.0 dan 1.0 mencerminkan tahap kemerosotan neurit (Sasaki et al., 2009).

Walaupun analisis DI boleh digunakan untuk mengesan tahap pemecahan neurit yang berbeza-beza, ketepatan pengukuran biasanya dihadkan oleh beberapa sumber ralat, dan penggunaan kaedah tersebut telah dihadkan terutamanya kepada kultur eksplan atau sel yang ditanam dalam peranti mikrofluidik berpetak. Selain itu, analisis DI memakan masa apabila diekstrapolasi kepada set imej yang besar. Oleh itu, kami berusaha untuk mengatasi batasan ini dengan mengubah suai prosedur analisis DI untuk memudahkan ketepatan dan kecekapan yang lebih tinggi, sambil mengembangkan kebolehgunaan.

Dalam kajian ini, kami mengenal pasti beberapa sumber ralat yang biasanya dikaitkan dengan analisis DI dan melaporkan semakan metodologi yang mengurangkan pelbagai bentuk ralat. Kami menggabungkan penambahbaikan prosedur dalam makro ImageJ yang dinamakan Indeks Degenerasi Neurit Automatik (ANDI) untuk mengautomasikan sepenuhnya analisis DI daripada set imej yang besar. Operasi Makro ANDI hanya memerlukan perisian dan fail yang sumber terbuka dan tersedia secara bebas. Pengukuran yang diperoleh menggunakan ANDI mendapat manfaat daripada peningkatan ketepatan sambil dengan ketara mengurangkan masa yang diperlukan untuk melaksanakan analisis.

Lebih-lebih lagi, kami menunjukkan cara kaedah analisis baharu boleh digunakan untuk melakukan pengukuran degenerasi neurit yang tepat dan pantas dalam model kultur sel PD yang melibatkan sel tercerai yang tumbuh tanpa pembahagian. Secara kolektif, peningkatan metodologi ini boleh membawa kepada wawasan baru tentang faktor-faktor yang mendasari proses selular penting yang berkaitan dengan neurodegenerasi.

Bahan dan Kaedah

Kultur sel

Kultur sel mesencephalic manusia Lund (LUHMES) telah ditubuhkan dalam slaid ruang lapan telaga Lab Tek II yang disalut dengan poli-L-ornithine (PLO) dan fibronektin, poli-D-lisin (PDL) dan laminin, keempat-empat substrat, atau tidak. substrat, seperti yang ditunjukkan. Untuk menyalut dengan PLO dan fibronektin, slaid diinkubasi semalaman pada suhu bilik dengan larutan yang mengandungi 200 mg/ml PLO (Sigma-Aldrich, katalog #P3655).

Selepas mencuci dengan air steril (Avantor), slaid diinkubasi dengan 2 mg/ml fibronektin (Sigma-Aldrich, katalog #F0895) selama 3 jam pada 37 darjah . Slaid kemudiannya dibasuh dengan PBS steril (Corning Life Sciences, katalog #21-040-CV) dan dibiarkan kering dengan udara. Untuk menyalut dengan PDL dan laminin, slaid diinkubasi pada suhu bilik dengan larutan yang mengandungi 100 ng/ml PDL (Sigma-Aldrich, katalog #P7280) dan 10 mg/ml laminin (Corning, katalog #354232).

Selepas pengeraman semalaman, slaid dibasuh dengan PBS steril dan dibiarkan kering di udara. Untuk menyalut dengan keempat-empat substrat, prosedur yang disebutkan di atas dilakukan secara berurutan. Sel LUHMES (ATCC, RRID: CVCL_B056) disalut dalam slaid ruang bersalut pada ketumpatan yang ditunjukkan dalam medium pembezaan yang terdiri daripada DMEM/F12 (Invitrogen, katalog #11330057) ditambah dengan 2 mM glutamin (VWR), 1% (v/v) N-2 tambahan, 1 mg/ml tetrasiklin (Sigma-Aldrich, katalog #87128-25G), 1 mM N6,29-Kem Odibutyryladenosine (db-cAMP ; Enzo Life Sciences, katalog #BML-CN125-0100), dan 2 ng/ml glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF; R&D Systems, katalog #212-GD-010).

Kecuali jika dinyatakan sebaliknya, semua kultur disalut pada ketumpatan 115,000 sel setiap telaga. Penggantian media volum 50% dilakukan setiap 48 jam sehingga rawatan. Untuk mengelakkan hanyutan genetik, stok sel yang telah dilalui enam kali atau kurang digunakan untuk semua eksperimen.

Eksperimen yang melibatkan budaya utama neuron bersimpati telah diluluskan oleh Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan di Universiti Kentucky Timur atau Universiti Virginia. Ganglia serviks superior telah dibedah dari hari selepas bersalin 0–6 C56Bl/6 tikus, diinkubasi pada 37 darjah dalam penimbal pemisahan enzimatik, dan dibasuh dengan media pertumbuhan untuk mengeluarkan enzim proteolitik dan triturasi.

Suspensi sel disalut pada ketumpatan 7000 sel setiap telaga dalam slaid ruang lapan telaga Lab Tek II. Media ditukar pada hari in vitro (DIV) 1, diikuti dengan penggantian media setiap hari. Media telah ditambah dengan cytosine arabinofuranoside (Ara-C, Millipore-Sigma) pada DIV1-DIV3 untuk menghalang pertumbuhan sel bukan neuron, diikuti dengan penyingkiran Ara-C daripada media selama sekurang-kurangnya 24 jam sebelum rawatan seperti yang ditunjukkan. Untuk eksperimen yang dijalankan di Universiti Kentucky Timur yang melibatkan rawatan hidrogen peroksida, slaid ruang telah disalut dengan 200 mg/ml PLO (Sigma-Aldrich, katalog #P3655), 2 mg/ml fibronektin, 100 ng/ml PDL (Sigma-Aldrich, katalog #P7280) dan 10 mg/ml laminin (Corning, katalog #354232) sebelum digunakan dan pemisahan dilakukan melalui 30-pengeraman min dalam penimbal yang terdiri daripada DMEM (ThermoFisher, katalog #11960- 044) yang mengandungi 0.025% trypsin (Corning Life Sciences, katalog #25-053-CI) dan 0.3% kolagenase (Worthington Biochemical, katalog #LS004176).

Media pertumbuhan untuk eksperimen tersebut terdiri daripada DMEM yang ditambah dengan 10% serum lembu janin (Invitrogen, katalog #26140-079), 2 mM L-glutamin (Corning, katalog #25-005-CI) dan 40 ng/ml faktor pertumbuhan saraf (Fisher Scientific, katalog #13-257-019); 5 mM Ara-C (Sigma-Aldrich) digunakan untuk penyingkiran sel nonneuronal.

Untuk eksperimen yang dijalankan di Universiti Virginia yang melibatkan pengeluaran NGF, sel telah disalut pada slaid ruang yang disalut dengan 100 ng/ml PDL (Millipore Sigma) dan 10 mg/ml laminin (Invitrogen), dan pemisahan dilakukan melalui 20-min. pengeraman dalam penimbal yang terdiri daripada DMEM/F12 yang mengandungi BSA (10 mg/ml, Sigma-Aldrich), jenis kolagenase 2 (4 mg/ml, Biokimia Worthington), deoxyribonuclease 1 (Millipore Sigma), dan hyaluronidase (Sigma-Aldrich). Media pertumbuhan untuk eksperimen tersebut terdiri daripada DMEM yang ditambah dengan 10% serum lembu janin (Invitrogen), 1 U/ml penisilin/streptomycin (Invitrogen), dan 45 ng/ml NGF (dimurnikan daripada kelenjar air liur); 10 mM Ara-C digunakan untuk penyingkiran sel bukan neuron.

Rawatan sel

Sel LUHMES yang dibezakan telah terdedah kepada kepekatan {{0}}hidroksidopamin (6-OHDA; Sigma-Aldrich, katalog #162957) atau larutan kenderaan yang ditunjukkan pada hari kelimanya dalam medium pembezaan. Stok 6- OHDA telah disediakan dalam PBS sejuk yang mengandungi 0.02% askorbat (Sigma-Aldrich, katalog #A5960), dan aliquot disimpan dalam botol terlindung cahaya di bawah gas lengai pada 80 darjah . Selepas 24 jam rawatan, sel-sel telah diperbaiki dengan pengeraman dalam PBS yang mengandungi 4% paraformaldehyde (PFA) selama 25 minit pada suhu bilik.

Untuk menentukan peranan c-Jun N-terminal kinase (JNK) dalam degenerasi neurit yang disebabkan oleh tekanan oksidatif, kultur telah dirawat terlebih dahulu selama 1 jam dengan 10 mM SP600125 (Sigma-Aldrich, katalog #S5567) atau penyelesaian kenderaan sebelum penggantian lengkap media dengan media yang mengandungi 7.5 mM 6-OHDA, 7.5 mM 6-OHDA dan 10 mM SP600125, atau penyelesaian kenderaan. Stok SP600125 telah disediakan dengan melarutkan perencat dalam dimetilsulfoksida steril (DMSO), dan alikuot beku disimpan dalam botol terlindung cahaya yang diisi dengan gas lengai pada 20 darjah . Rawatan telah dilakukan supaya sel terdedah kepada tidak lebih daripada 0.1% DMSO.

Budaya utama neuron bersimpati telah dirawat pada DIV5. Untuk eksperimen yang melibatkan degenerasi neurit yang disebabkan oleh hidrogen peroksida, kultur telah didedahkan kepada 500 mM hidrogen peroksida (Sigma-Aldrich, katalog #H1009-100ML) atau larutan kenderaan yang terdiri daripada air steril (Cytiva, katalog #SH30529.02) selama 24 jam.

Untuk eksperimen yang melibatkan pengeluaran NGF, budaya SCG sama ada menerima penggantian media dengan media pertumbuhan atau tertakluk kepada kekurangan NGF. Budaya SCG yang akan dilucutkan NGF dibilas tiga kali dengan media pertumbuhan bebas NGF dan kemudian diinkubasi dalam media pertumbuhan bebas NGF selama 80 jam tanpa perubahan media. Selepas rawatan, sel-sel telah diperbaiki dengan inkubasi dalam 4% PFA dalam PBS selama 30 minit, diikuti dengan penyingkiran PFA dengan membilas dengan PBS.

Mikroskopi pewarnaan dan pendarfluor

Untuk eksperimen dengan sel LUHMES, serta eksperimen yang melibatkan neuron simpatik yang dirawat dengan hidrogen peroksida, slaid kebuk lapan telaga yang mengandungi sel tetap telah diperbolehkan dengan 0.1% Triton X-100 dalam PBS dan disekat untuk 1 jam dengan 10% serum kambing biasa dalam PBS yang mengandungi 0.1% Triton X-100. Slaid kemudiannya diinkubasi dengan antibodi primer khusus untuk b I tubulin (Covance; 1:1000, RRID: AB_2313773) dalam larutan penyekat pada 4 darjah semalaman. Selepas itu, slaid dibasuh dengan PBS, diinkubasi dengan antibodi sekunder yang digabungkan dengan Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific; 1:500, RRID: AB_142495) selama 90 minit pada suhu bilik dan tertakluk kepada pencucian tambahan.

Untuk eksperimen yang melibatkan pewarnaan tyrosine hydroxylase (TH), slaid telah tertakluk kepada pengeraman tambahan dalam PBS yang mengandungi 10% serum kambing biasa, 0.1% Triton X-100, antibodi khusus untuk TH (Sigma- Aldrich, 1:400, AB152) pada 4 darjah semalaman. Slaid kemudiannya dibasuh dengan PBS, diinkubasi dengan antibodi sekunder yang digabungkan dengan Alexa Fluor 568 (Thermo Fisher Scientific; 1:500, RRID: AB_1500889), dan tertakluk kepada pencucian PBS tambahan.

Selepas penyiapan imunolabeling untuk b III-tubulin atau TH, slaid diinkubasi dengan 5 mg/ml 49,69-diamidino-2-phenylindole (DAPI; katalog #D9542) dalam PBS selama 5 minit. Slaid kemudiannya dibasuh dengan PBS, dan slip penutup dipasang menggunakan medium pelekap Fluoromount G (Southern Biotech, katalog #0100-01).

Untuk eksperimen yang melibatkan neuron simpatik yang tertakluk kepada penarikan NGF, slaid telah disekat selama 1 jam dengan pengeraman pada suhu bilik dalam penimbal yang terdiri daripada 5% serum kambing biasa (Life Technologies) dan 0.0005% Triton X-100 dalam PBS, diikuti dengan pengeraman dalam larutan antibodi primer yang mengandungi Tuj1 anti-tikus tetikus (1:1000, Covance) semalaman pada 4 darjah . Selepas itu, slaid dibilas dengan PBS, diinkubasi selama 1 jam dalam IgG Alexa Fluor 488 anti-tikus kambing (1:800, Invitrogen) dan 0.1 mg/ml Hoechst 33342 (Invitrogen) dalam penampan penyekat, tertakluk kepada bilasan PBS tambahan, dan dibenarkan. untuk mengeringkan. Slaid telah dipasang dengan Fluoromount-G (Southern Biotech, katalog #0100-01) dan disimpan pada suhu bilik.

Slaid yang mengandungi sel LUHMES telah divisualisasikan dengan objektif 20 bagi Sistem Mikroskop Terbalik Nikon Eclipse II Ti-U dengan sumber cahaya LED Lumencor Mira 4-. 1280 1024-imej piksel telah ditangkap menggunakan Kamera CCD Nikon DSQi1Mc 5 MP dan NIS Elements 3.22.15 (Build 738). Kecuali jika dinyatakan sebaliknya, semua imej kontras fasa telah ditangkap menggunakan tetapan keamatan cahaya dan masa pendedahan yang menghasilkan purata keamatan latar belakang 165 dalam 8-imej bit.

Untuk mengurangkan teduhan latar belakang atau ketidakkonsistenan lain, sebelum setiap sesi mikroskopi, imej perigi kosong telah ditangkap dan digunakan untuk pembetulan latar belakang semasa pengimejan sel LUHMES. Slaid yang mengandungi neuron bersimpati yang dibiakkan di Universiti Kentucky Timur atau Universiti Virginia telah diimej menggunakan sistem mikroskop Zeiss LSM 800 atau sistem mikroskop Zeiss LSM 980, masing-masing. Imej telah ditangkap pada pembesaran 20 dan resolusi 1024 1024 menggunakan perisian Zen (Carl Zeiss Microscopy).

Analisis daya maju sel

Kultur sel LUHMES yang dibezakan telah ditubuhkan pada slaid ruang lapan telaga Lab Tek II yang disalut seperti yang ditunjukkan dengan pelbagai substrat. Perubahan media sebanyak 50% dilakukan setiap 48 jam, dan sel telah ditetapkan dengan 4% PFA dalam PBS pada hari keenam pembezaan. Slaid yang mengandungi sel tetap telah mengalami pewarnaan dengan DAPI, dan imej pewarnaan nuklear telah ditangkap dengan Sistem Mikroskop Terbalik Nikon Eclipse II Ti-U dan Kamera CCD Nikon DS-Fi1 5 MP.

Sel telah dijaringkan sebagai sihat atau tidak sihat oleh penyiasat buta berdasarkan rupa nukleus. Sel-sel dengan kawasan nuklear berkurangan atau pemecahan nuklear dinilai sebagai tidak sihat. Bilangan sel sihat bagi setiap imej telah dijaringkan untuk sekurang-kurangnya lima medan pandangan bagi setiap keadaan dalam setiap percubaan.

pengukuran DI

Pengukuran DI tradisional dilakukan menggunakan pakej Fiji Is Just ImageJ (FIJI) yang mengandungi ImageJ 1.52p melalui kaedah yang melibatkan parameter yang dipetik secara meluas untuk analisis DI (Shin et al., 2012; Di Stefano et al., 2015; Sasaki et al., 2016; Loreto et al., 2020; Shin dan Cho, 2020). Imej lapan bit sel LUHMES yang dibezakan dengan saluran akson yang dipisahkan dengan baik tertakluk kepada perduaan menggunakan algoritma perduaan lalai, dengan pilihan perduaan dikonfigurasikan untuk menghasilkan imej dengan sel hitam di latar depan dan latar belakang putih.

Alat lukisan tangan bebas digunakan untuk mengesan secara manual semua kawasan imej yang menampilkan badan sel, dan semua piksel hitam ditukar kepada putih di kawasan yang dikesan. Alat Ukur ImageJ digunakan untuk mengukur jumlah kawasan hitam bagi imej terdua yang menampilkan neurit secara eksklusif. Alat Analyze Particle kemudiannya digunakan menggunakan tetapan saiz 20–10,000 piksel dan tetapan pekeliling 0.2–1.0 untuk mengesan serpihan neurit. Luas penjumlahan semua serpihan neurit kemudiannya dibahagikan dengan jumlah kawasan hitam untuk mengira DI imej.

Untuk eksperimen yang berkaitan dengan pengoptimuman parameter saiz untuk pengecaman serpihan neurit, kriteria pekeliling {{0}}.2–1.00 telah digunakan untuk semua ukuran zarah. Pemalam Particle Remover (versi 20{{10}}4/02/09), yang dibangunkan oleh Wayne Rasband, diperoleh daripada https:// imagej.nih.gov/. Di mana dinyatakan, aplikasi pemalam Penghapus Zarah menggunakan parameter saiz 0–9 piksel dan parameter pekeliling 0.0–1.0 telah dilakukan untuk mengalih keluar objek kecil bukan neurit daripada imej terdua yang diperoleh daripada mikrograf kontras fasa.

Begitu juga, parameter saiz {{0}}–4 piksel dan parameter pekeliling 0–1.0 digunakan untuk mengalih keluar objek kecil daripada imej terdua yang diperoleh daripada mikrograf pendarfluor yang mewakili b III-tubulin immunostaining. Melainkan dinyatakan sebaliknya, sebelum analisis DI semua imej kontras fasa tertakluk kepada peningkatan kontras dengan menggunakan ImageJ untuk menggunakan Jadual Carian (LUT) dengan minimum 90 dan maksimum 205.

Pengukuran pemecahan buatan

Kultur yang mengandungi sel LUHMES yang sihat telah ditetapkan dengan 4% PFA pada hari keenam pembezaan dan imunolabel untuk b III-tubulin. Menggunakan 20 objektif, 1280 1024-mikrgraf kontras fasa piksel dan mikrograf pendarfluor, setiap satu menggambarkan medan pandangan yang sama, telah ditangkap daripada kawasan sampel rawak. Sebanyak sepuluh set imej telah ditangkap daripada sembilan budaya yang berasingan.

ImageJ digunakan untuk menjana salinan terdua bagi mikrograf kontras fasa dan pendarfluor asal, serta salinan mikrograf kontras fasa yang telah diduakan selepas peningkatan kontras melalui penggunaan LUT dengan minimum 90 dan maksimum 205. Untuk setiap set daripada imej, seorang penyiasat buta mengenal pasti kawasan kecil, 150 150-piksel mikrograf kontras fasa asal yang menampilkan neurit yang sihat dan utuh secara eksklusif.

Saiz dan koordinat wilayah kemudiannya disimpan dalam pengurus kawasan kepentingan (ROI) ImageJ dan digunakan untuk melakukan pengukuran DI dalam kawasan analog imej terdua daripada set imej yang sama. Pengukuran DI dilakukan menggunakan kaedah tradisional yang menampilkan parameter saiz serpihan 20 -10,000 piksel. Memandangkan semua kawasan yang diukur mengandungi neuron utuh secara eksklusif, sebarang serpihan yang dikesan dianggap sebagai serpihan buatan.

ANDI Makro

Makro ANDI ditulis menggunakan bahasa Makro ImageJ. Makro ini menampilkan satu siri operasi yang membolehkan pengguna memilih laluan untuk tiga direktori, satu direktori yang mengandungi imej neuron yang dilabelkan untuk penanda neuron seperti b III-tubulin, direktori kedua yang mengandungi imej sepadan yang menggambarkan pewarnaan nuklear dan direktori ketiga. ditetapkan untuk menyimpan fail hasil. Kawasan serpihan dan jumlah kawasan neurit imej dalam direktori yang dipilih kemudian dikira melalui satu siri operasi ImageJ. Secara ringkasnya, imej yang menggambarkan pelabelan nuklear dibuka, tertakluk kepada peningkatan kontras dan diduakan. Pemalam penghapus zarah digunakan untuk mengalih keluar artifak kecil bukan nuklear daripada imej terdua dan imej terdua tertakluk kepada siri pelebaran dan hakisan.

Imej sel yang sepadan dengan imunolabel untuk b III-tubulin (atau penanda neuron lain) dibuka dan tertakluk kepada peningkatan kontras. Imej terdua yang menggambarkan nukleus sel yang diperbesarkan kemudiannya ditolak daripada imej yang memaparkan sel yang dilabelkan untuk b III-tubulin, dengan itu menghasilkan imej yang menampilkan neurit secara eksklusif. Imej neurit kemudiannya diduakan dan tertakluk kepada penyingkiran zarah antara 0 dan 4 piksel. Kawasan serpihan Neurite dikira dengan menggunakan algoritma Analyze Particle untuk mengukur zarah dengan pekeliling antara 0.2 dan 1.0 dan saiz antara 5 dan 10,0000 piksel. Jumlah kawasan neurit dikira dengan menggunakan alat Ukur untuk mengira jumlah kawasan hitam. Imej yang menggambarkan kawasan neurit terdua dengan serpihan yang diserlahkan disimpan ke direktori yang ditetapkan oleh pengguna, bersama-sama dengan fail .csv yang melaporkan kawasan neurit terserpihan dan jumlah ukuran kawasan neurit.

Sebagai tambahan kepada operasi yang disebutkan di atas, beberapa operasi tambahan disertakan dalam makro untuk menyokong kemudahan penggunaan dan mengehadkan ralat pengguna. Ini termasuk fungsi yang mengalih keluar maklumat skala daripada imej dan memastikan pengukuran diperoleh dalam unit piksel; konfigurasikan tetapan warna ImageJ dan pilihan binari untuk penolakan dan perduaan imej yang sesuai; sahkan bahawa direktori yang dipilih untuk imej pewarnaan b III-tubulin dan pewarnaan DAPI mengandungi bilangan imej yang sama; tutup imej yang digunakan sebelum ini untuk meningkatkan masa pemprosesan; keputusan yang jelas daripada analisis terdahulu sebelum prestasi analisis baharu; dan mengelakkan ralat yang berkaitan dengan penciptaan fail .ini oleh Windows 10.

Untuk eksperimen yang melibatkan analisis neuron bersimpati, Makro ANDI telah disemak untuk memasukkan operasi yang membentangkan kotak dialog yang membolehkan pengguna mengawal bilangan kali imej terdua nukleus akan diluaskan. Versi ANDI yang memaparkan semakan ini dinamakan ANDI v1.1. Menukar nilai dalam kotak dialog kepada nombor yang lebih tinggi meningkatkan saiz penyingkiran soma manakala menukar nilai kepada nombor yang lebih rendah mengurangkan saiz penyingkiran soma. Nilai lalai ialah 12, iaitu bilangan pelebaran yang digunakan untuk semua eksperimen yang melibatkan sel LUHMES. Nilai 16 digunakan untuk membuang kawasan badan sel yang lebih besar semasa analisis neuron bersimpati.

Makro ANDI ialah sumber terbuka dan tersedia secara percuma untuk digunakan atau diubah suai melalui URL berikut: https://github. com/kraemerb/kraemerlab. Operasi tepat ANDI telah disahkan menggunakan berbilang komputer peribadi yang menampilkan sistem pengendalian Windows 10. Set imej yang memaparkan kultur sel LUHMES yang mempamerkan pelbagai darjah degenerasi neurit juga tersedia di alamat web yang dinyatakan di atas dan boleh digunakan untuk menyiasat pelaksanaan makro yang tepat oleh jenis komputer lain. Alamat web juga menyediakan akses kepada protokol yang menerangkan cara menggunakan makro.

Anggaran masa

Untuk menilai masa yang diperlukan untuk melakukan pengukuran DI secara manual, mikrograf kontras fasa yang menggambarkan sel LUHMES yang dirawat dengan larutan kenderaan, 2.5 mM 6-OHDA, 5.0 mM 6-OHDA, atau 7.5 mM 6-OHDA tertakluk kepada pemarkahan DI menggunakan kaedah yang telah ditetapkan sebelum ini (Kraemer et al., 2014). Setiap imej tertakluk kepada peningkatan kontras dan binarisasi. Alat bebas ImageJ kemudiannya digunakan untuk mengalih keluar semua badan sel yang digambarkan secara digital daripada imej terdua. Alat Analyze Particle digunakan untuk mengukur serpihan dengan pekeliling antara 0.2 dan 1.0 dan saiz antara 20 dan 10,000 piksel dan alat Ukur digunakan untuk menentukan jumlah kawasan neurit.

Nilai mengenai kawasan neurit berpecah dan jumlah luas neurit telah dipindahkan ke hamparan dalam Microsoft Excel, dan operasi matematik dalam Excel digunakan untuk mengira skor DI. Selepas imej dibuka dengan ImageJ, masa yang diperlukan untuk melaksanakan setiap prosedur ini secara manual diukur. Purata masa analisis dikira daripada 36 jumlah imej. Imej-imej diperoleh daripada sembilan persediaan kultur sel bebas, dan analisis dilakukan menggunakan satu imej setiap keadaan rawatan daripada setiap penyediaan kultur sel. Untuk menentukan kelajuan pengukuran DI yang dilakukan menggunakan Makro ANDI, set imej yang sama digunakan untuk menentukan masa yang diperlukan untuk membuka makro dalam ImageJ, menjalankan operasi makro, memindahkan data ke hamparan Excel dan mengira DI.

Perangkaan

Perbandingan kuantitatif dibentangkan sebagai plot kotak dan misai, di mana garis tengah mewakili median, kotak memanjang ke persentil ke-25 dan ke-75, dan misai menggambarkan persentil ke-5 dan ke-95. Min dibandingkan secara statistik dalam GraphPad Prism 9.1.2 dengan langkah berulang ANOVA dengan perbandingan post hoc menggunakan pembetulan Sidák. Normaliti untuk data kuantitatif telah diuji menggunakan ujian Shapiro-Wilk dalam IBM SPSS 26.

Apabila andaian kenormalan dilanggar (Rajah 1C, 3D), perbandingan kumpulan telah dijalankan melalui ujian Friedman bukan parametrik dengan ujian Dunn dilakukan untuk perbandingan post hoc. Analisis korelasi digambarkan sebagai plot serakan dan termasuk garisan yang paling sesuai. Hubungan sedemikian dianalisis menggunakan korelasi momen produk Pearson atau Spearman's r apabila andaian normaliti dilanggar. Normaliti sisa untuk analisis korelasi dinilai melalui pemeriksaan visual plot QQ yang sepadan.

Pekali korelasi momen produk Pearson dibandingkan antara satu sama lain menggunakan ujian z tanpa gejala Steiger (Steiger, 1980; Lee dan Preacher, 2013). Tiada outlier dikecualikan. Kepentingan statistik telah diterima pada p, 0.05. Nilai-P dibundarkan kepada empat tempat perpuluhan dan dilaporkan di seluruh teks utama. Saiz kesan dan selang keyakinan 95% juga dilaporkan untuk analisis parametrik, dengan saiz kesan diterangkan sepanjang teks utama dan selang keyakinan disenaraikan dalam Jadual 1.

Ketersediaan data

Data tambahan tentang artikel ini akan dikongsi atas permintaan yang munasabah.

Kebolehaksesan kod

Kod/perisian yang diterangkan dalam kertas boleh didapati secara percuma dalam talian di https://github.com/kraemerb/kraemerlab. Kod ini tersedia sebagai Data Lanjutan 1.

For more information:1950477648nn@gmail.com