Kesan Perlindungan Resveratrol Pada Kerosakan Buah Pinggang yang disebabkan oleh Akrilamida
Feb 23, 2022
latar belakang: Acrylamide (ACR) mempunyai pelbagai kegunaan. Ia mempunyai akerosakan buah pinggangkesan. Kerja ini bertujuan untuk mengkaji kemungkinan peranan perlindungan resveratrol (RVS) ke atas pengantaraan ACRkerosakan buah pinggangdalam tikus. Mekanisme asas yang dicadangkan untuk mengambil bahagian dalam perlindungan tersebut telah disiasat.Bahan dan kaedah:Tiga puluh tikus albino dewasa Sprague-Dawley dibahagikan kepada tiga kumpulan: kawalan, ACR, dan RVS. Selepas 4 minggu,buah pinggangtelah dikeluarkan dan disediakan untuk kajian histologi, imunohistokimia, dan biokimia. Aktiviti penanda oksidatif tisu (malondialdehyde [MDA]) dan anti-oksidatif (glutathione [GSH]) telah dinilai.Keputusan:Glomerular teraruh akrilamidabuah pinggangkasih sayang dalam bentuk pengecutan dan herotan glomeruli dengan kedutan membran bawah tanah dan pelebaran ruang kencing. Perubahan tiub degeneratif nyata terdapat dalam tubul berbelit proksimal. Sel-sel tiub nekrotik mempamerkan vakuolasi sitoplasma dengan sel-sel epitelium yang disquamated dalam lumen tiub. ACR meningkatkan pemendapan gentian kolagen dalam membran bawah tanah kapilari glomerular dan penebalan teraruh membran bawah tanahbuah pinggangcorpuscles danbuah pinggangtubulus. Pentadbiran RVS memberikan perlindungan yang tinggi kepadabuah pinggang. Glomeruli danbuah pinggangtubulus hampir normal. Kandungan gentian kolagen dan asid berkala tindak balas Schiff membran bawah tanahbuah pinggangtubul adalah 70 peratus dan 19 peratus lebih rendah dikaitkan dengan kumpulan ACR. Tahap kreatinin dan urea menurun sebanyak 51 peratus dan 47 peratus. RVS mendorong peranan perlindungan sedemikian melalui kesan antioksidannya kerana tahap MDA menurun sebanyak 45 peratus , manakala tahap GSH meningkat sebanyak 83 peratus berbanding dengan kumpulan ACR. Kesimpulan: Akrilamida menyebabkan gangguan struktur dan fungsianbuah pinggang.Ia mendorongbuah pinggangkerosakan melalui tekanan oksidatif dan apoptosis. Dengan penggunaan RVS, biasabuah pinggangseni bina telah dipelihara dengan sedikit perubahan struktur. Menambah, berfungsibuah pinggangujian menjadi normal. RVS memberikan kesan perlindungannya melalui ciri anti-apoptosis dan antioksidannya. (Folia Morphol 2021; 80, 4: 985–993).
PENGENALANAcrylamide (ACR) ialah pencemar alam sekitar yang terkenal yang memberikan pelbagai kesan toksik sistemik kepada orang selepas pendedahan pekerjaan dan pemakanan [2, 22]. Ia mempunyai pelbagai sifat berbahaya: kekarsinogenan, genotoksisiti, neurotoksisiti, dan ketoksikan pembiakan [5, 7]. ACR dan analognya digunakan secara meluas dalam pelbagai aplikasi kimia dan alam sekitar dan dihasilkan dengan memanaskan bahan biologi yang berasal dari tisu tumbuhan [25]. Pembentukan ACR berlaku semasa pemprosesan makanan kerana pendedahan karbohidrat kepada suhu melebihi 200 darjah [12]. Tahap ACR yang tinggi telah ditemui dalam bahan makanan yang biasa dimakan, khususnya; kerepek kentang dan roti [31].
Akrilamida diserap dari saluran gastrousus dan tersebar secara meluas dalam cecair badan dan disimpan di dalam hati danbuah pinggang[28]. ACR diketahui menyebabkan perubahan struktur dan fungsi dalam banyak organ. Thebuah pinggangsel tubular mengalami perubahan vakuolar degeneratif, penyusupan sel radang dan edema periglomerular [28]. Tambahan pula, pemberian ACR pada tikus meningkatkan paras serum urea, kreatinin, asid urik, danbuah pinggangsitokin proinflamasi [1]. Metabolisme ACR mencetuskan pembebasan radikal bebas (ROS), yang memulakan tekanan oksidatif yang membawa kepada ketidakseimbangan dalam pembangunan dan degradasi ROS [19]. Ia juga mendorong peroksidasi lipid dan kemudaratan DNA [1].
Kesan banyak sebatian antioksidan dan anti-radang seperti minyak zaitun, vitamin E dan 5-asid aminosalicylic telah dikaji untuk mencegah dan merawat akibat ACR.kerosakan buah pinggang[9, 19]. Resveratrol (RVS) ialah phytoalexin yang terdapat dalam sekurang-kurangnya72 spesies tumbuhan, kebanyakannya dimakan oleh manusia, termasuk mulberi, kacang tanah, dan anggur [8]. RVS mempunyai aktiviti anti-radang, antiplatelet, antioksidan, dan anti-karsinogenik, serta keupayaan untuk mengurangkankerosakan buah pinggangdisebabkan oleh sebatian kimia [8, 10]. Walau bagaimanapun, tidak jelas sama ada RVS boleh bertahan terhadap akibat ACRkerosakan buah pinggangatau tidak. Oleh itu, kami mengkaji kesan kerosakan oksidatif dan apoptosis ACR ke atasbuah pinggangdan menyiasat peranan melindungi RVS terhadap perkara tersebutkerosakan buah pinggangdalam tikus.
Kata kunci:resveratrol, akrilamida, buah pinggang, Renal, Kerosakan Buah Pinggang
BAHAN DAN KAEDAH
HaiwanTiga puluh ekor tikus albino dewasa Sprague-Dawley seberat 170-200 g telah disertakan dalam kajian kami. Haiwan-haiwan itu dipelihara dalam sangkar dawai yang luas di dalam bilik khas dengan cahaya siang langsung dan pengudaraan semula jadi. Tikus-tikus itu mempunyai akses percuma kepada makanan dan air tikus standard. Semua haiwan telah dirawat mengikut garis panduan standard untuk penjagaan dan penggunaan haiwan makmal. Kajian itu dibenarkan oleh Jawatankuasa Etika, Fakulti Perubatan, Universiti Kaherah, Mesir.Prosedur yang diikuti adalah mengikut piawaian etika organisasi yang bertanggungjawab dan dengan Deklarasi Helsinki 1975 seperti yang disemak pada tahun 1983.
Reka bentuk eksperimenTikus telah diagihkan kepada tiga kumpulan (10 dalam setiap kumpulan): kawalan (diberikan air suling pada dos 1 mL), kumpulan ACR, dan kumpulan RVS (ACR bersamaan RVS).
Bahan kimiaAkrilamida diperolehi dalam bekas serbuk yang dibeli oleh Syarikat Biostain (United Kingdom) seberat 500 g. Ia dibubarkan dalam air suling, dalam kepekatan 10 g/L. Ia diberikan pada dos 1 mL air suling yang mengandungi 40 mg/kg/hari secara lisan melalui gavage gastrik [9]. Resveratrol (ketulenan, > 99 peratus ) dibeli daripada Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Ia telah dibubarkan dalam dimetil sulfoksida dan dicairkan dalam 0.9 peratus garam fisiologi. Ia diberikan pada dos harian 20 mg/kg/hari secara lisan melalui gavage gastrik [18]. Menjelang akhir eksperimen (selepas 4 minggu), setiap haiwan ditimbang, dan sampel darah dikeluarkan dari urat ekor menggunakan tiub kapilari heparin halus. Thebuah pinggangtelah diekstrak, dibasuh dengan garam, dan dibiarkan kering di atas kertas petak.
Kajian mikroskopik cahayabuah pinggangspesimen telah ditetapkan dalam formalin 10 peratus, dehidrasi dalam etil alkohol, dibersihkan dalam xylol, dan dibenamkan dalam lilin parafin. Bahagian dengan ketebalan 5 µm dipotong dan dipasang pada slaid kaca. Bahagian lain dipasang pada slaid bercas positif untuk imunohistokimia. Bahagian-bahagian tersebut tertakluk kepada yang berikut: — haematoxylin dan eosin (H&E) dan bahagian bernoda trichrome Masson telah disediakan mengikut Suvarna et al. [24]; — penilaian histokimia: pewarnaan asid berkala Schiff (PAS): Bahagian bernoda PAS disediakan mengikut Suvarna et al. [24]; analisis imunohistokimia Bcl-2-associa ted X protein (BAX) [20]. Bahagian parafin telah disediakan. Kemudian, kuantiti serum yang sesuai telah ditambah ke bahagian tersebut selama 30 minit. Peroksidase endogen telah dinyahaktifkan dengan larutan metanol yang mengandungi H2O2 (1:50) selama 10 minit dan dibasuh dengan garam terkumpul fosfat (PBS). Bahagian tisu disekat dengan 1.5 peratus serum selama 30 minit. Bahagian tersebut diinkubasi dengan antibodi utama Bax (protein BAX anti-manusia, DakoCytomation, Denmark), diikuti oleh antibodi sekunder (pautan biotinilasi universal dari kit komersial LSAB: DakoCytomation, Denmark). Selepas itu, sampel diinkubasi dengan enzim AB selama 30 minit dan dibilas dalam PBS. Isyarat positif dikesan menggunakan substrat kromogenik peroksidase. Kawalan negatif termasuk PBS dan bukannya antibodi sekunder.
Analisis imej dan ukuran morfometrikMenggunakan sistem komputer penganalisis imej Leica LAS V3.8 (Switzerland), parameter berikut dinilai: diameterbuah pinggangglomeruli dan tubul berbelit proksimal, lebarnyabuah pinggangruang, dan ketinggian lapisan epitelium tiub proksimal. Menambahkan, bilangan glomeruli yang diubah secara struktur dinilai sebagai peratusan daripada jumlah glomeruli. Kandungan gentian kolagen juga dinilai. Dalam bahagian histologi yang diwarnai PAS, ketumpatan optik membran bawah tanah tubul berbelit proksimal dan lapisan parietal kapsul Bowman juga ditentukan. Dalam kawasan pewarnaan imunohistokimia BCL2 peratusan tindak balas imun juga diukur.
Kajian biokimiaSampel darah yang dikeluarkan daripada tikus sebelum korban digunakan untuk penilaian biokimia di Jabatan Biokimia dan Biologi Molekul, Fakulti Perubatan, Universiti Kaherah, Mesir.
Tahap urea dan kreatinin serumtelah dianggarkan dengan kaedah kolorimetrik konvensional menggunakan Kit Ujian Quanti Chrom TM (DIUR-500 dan DICT-500), berdasarkan kaedah Jung dan Jaffe yang dipertingkatkan, masing-masing [32]. Nilai min parameter biokimia ini dikira dan tertakluk kepada analisis statistik.
Tahap tisu malondialdehid (MDA) dan glutation terkurang (GSH).Thebuah pinggangtisu dihomogenkan dalam 5–10 mL penimbal sejuk (50 mM kalium fosfat, pH 7.5. 1 mM EDTA) setiap tisu gram kemudian ia disentrifugasi pada 100,000 g selama 15 minit pada 4 darjah . Supernatan dikeluarkan untuk ujian dan disimpan di atas ais. Ujian malondialdehid dilakukan dengan ujian asid thiobarbituric (TBA) dalam supernatan, mengikut kaedah yang dicadangkan oleh Buege dan Aust [4].MDA bertindak balas dengan TBA untuk memberikan sebatian merah yang menyerap pada 535 nm. Pengukuran GSH adalah berdasarkan pengurangan 5,5-dithiobis (2-asid nitrobenzoik) (DTNB) dengan GSH yang dikurangkan untuk menghasilkan sebatian kuning [6].
Analisis statistikNilai min relatifbuah pinggangberat, ukuran histomorfometrik, dan tahap biokimia dianalisis menggunakan SPSS versi 22. Anggaran statistik dilakukan menggunakan ANOVA diikuti dengan perbandingan berpasangan Bonferroni.
KEPUTUSAN
Penilaian mikroskopik cahayaPemeriksaan kumpulan kawalan menunjukkan seni bina utuhbuah pinggangkorteks. Thebuah pinggangkorteks terbentuk daripadabuah pinggangcorpuscles, dan tubulus berbelit proksimal dan distal (Rajah 1A). Pemeriksaan terhadapbuah pinggangkorteks kumpulan ACR mendedahkan perubahan struktur yang ketara. Thebuah pinggangglomeruli menunjukkan pengecutan yang sederhana hingga ketara, herotan, segmentasi, dan vakuolasi dengan ruang kencing yang melebar. Thebuah pinggangtubul diluaskan dengan pengurangan ketara ketinggian epitelium dan pelebaran lumina mereka. Sel lapisan mereka menunjukkan vakuolasi sitoplasma, pemecahan selular, dan pembentukan tuangan intraluminal diperhatikan dalam banyak tubul berbelit. Interstitium menunjukkan saluran darah tersumbat dengan penebalan intim dan penyusupan selular besar-besaran juga boleh dilihat (Rajah 1B–D). Pemeriksaan kumpulan RVS mendedahkan penampilan hampir normal kebanyakan glomeruli dan tubulus. Penyusupan selular keradangan interstisial yang minimum ditemui (Rajah 1E).
Kandungan serat kolagenKandungan gentian adalah minimum dalam kumpulan kawalan. Kandungan meningkat di sekitar lapisan parietal kapsul Bowman dan membran bawah tanahbuah pinggangtubul dalam kumpulan ACR (9-fold) dan RVS (2-fold) apabila berkaitan dengan kumpulan kawalan. Kandungan dalam kumpulan RVS adalah 70 peratus lebih rendah apabila dikaitkan dengan kumpulan ACR (Rajah 2A–C, Jadual 1).
Histokimia buah pinggangDalam kumpulan kawalan, membran bawah tanahbuah pinggangtubul dan lapisan parietal kapsul Bowman menunjukkan tindak balas PAS yang lemah. Menambah, sempadan berus apikal proksimal berbelit-belit
tubul (PCT) adalah utuh dan sebahagiannya menutupi lumina tiub (Rajah 3A). Membran bawah tanahbuah pinggangtubulus dan lapisan parietal kapsul Bowman kumpulan ACR menunjukkan tindak balas PAS yang sengit (42 peratus lebih tinggi daripada kumpulan kawalan). Menambah, sempadan berus apikal PCT telah dilemahkan (Rajah 3B). Dengan penggunaan RVS, tindak balas PAS menjadi setanding dengan kumpulan kawalan dan 19 peratus lebih rendah daripada kumpulan ACR (Rajah 3C, Jadual 1).
Pewarnaan imunohistokimia BAXBAX menunjukkan tindak balas yang lemah dalam kumpulan kawalan (Rajah 4A). Peratusan kawasan sel imunopositif BAX meningkat 4.5-kali ganda dalam kumpulan ACR dipadankan dengan kumpulan kawalan (Rajah 4B, C, Jadual 1). Dengan penggunaan RVS, peratusan kawasan sel imunopositif menurun 56 peratus disamakan dengan kumpulan ACR; walau bagaimanapun, peratusan kawasan dalam kumpulan RVS ialah 1.4-kali ganda lebih tinggi daripada kumpulan kawalan (Rajah 4D, Jadual 1).
Penanda biokimia dan oksidatif/antioksidatifTahap kreatinin dan urea serum meningkat dalam kumpulan ACR sebanyak 2.75-lipat, 1.9-lipat dipautkan kepada kumpulan kawalan. Dengan penggunaan RVS secara serentak, tahap kreatinin dan urea menurun sebanyak 51 peratus, 47 peratus bersekutu dengan ACR. Namun begitu, paras kreatinin dan urea dalam kumpulan RVS adalah 83 peratus, 55 peratus lebih tinggi daripada kumpulan kawalan (Jadual 1).
Nilai penanda oksidatif (MDA) dalam kumpulan ACR meningkat sebanyak 1.4-kali ganda, manakala penanda anti-oksidatif (GSH) menurun sebanyak 1.3-kali ganda berbanding dengan kumpulan kawalan. Dengan penggunaan RVS, tahap MDA menurun sebanyak 45 peratus, manakala tahap GSH meningkat sebanyak 83 peratus berbanding kumpulan ACR. Namun, tahap kedua-dua penanda berada jauh daripada kumpulan kawalan (Jadual 1).
Perubahan morfometrik glomerular dan PCTPeratusan glomeruli yang terjejas dalam kumpulan ACR meningkat 8.8-kali ganda dipadankan dengan kumpulan kawalan. Dengan penggunaan RVS, peratus glomeruli yang terjejas menurun 71 peratus bersamaan dengankumpulan ACR; walau bagaimanapun, peratusan dalam kumpulan RVS ialah 1.6-kali ganda lebih tinggi daripada kumpulan kawalan (Jadual 2).
Dalam kumpulan ACR, diameter glomerular berkurangan 58 peratus dengan peningkatan dalam lebar ruang kencing 2.4-lipatan dipadankan dengan kumpulan kawalan. Dengan penggunaan RVS, diameter glomerular meningkat 1.26-kali ganda dengan pengurangan lebar ruang kencing 57 peratus disamakan dengan kumpulan ACR. Diameter glomerular dan lebar ruang kencing dalam RVS dan kumpulan kawalan adalah sama (Jadual 2). Dalam kumpulan ACR, diameter PCT meningkat 31 peratus, manakala ketinggian epi lapisan merekathelium menurun 62 peratus berbanding kumpulan kawalan. Dengan penggunaan RVS, diameter PCT berkurangan 18 peratus , manakala ketinggian epitelium lapisannya meningkat 1.4-kali ganda disamakan dengan kumpulan ACR. Kedua-dua parameter adalah setanding dalam RVS dan kumpulan kawalan (Jadual 2).
PERBINCANGANGlomerular teraruh akrilamidabuah pinggangkasih sayang dalam bentuk pengecutan dan herotan glomeruli dengan kedutan membran bawah tanah dan pelebaran ruang kencing. Menambah, perubahan tiub degeneratif hadir dengan ketara dalam PCT. Sel-sel tiub nekrotik mempamerkan vakuolasi sitoplasma dengan sel-sel epitelium yang disquamated dalam lumen tiub. Menambahkan, ACR menyebabkan penyusupan sel radang besar-besaran dengan kesesakan saluran darah glomerular. Fibrosis teraruh akrilamida yang diwujudkan oleh 9-peningkatan pemendapan gentian kolagen dalam membran bawah tanah kapilari glomerular. Gentian kolagen sedemikian boleh menjadi hasil daripada faktor pertumbuhan epidermis yang merangsang percambahan fibroblast dan sintesis kolagen [14].Membran bawah tanahbuah pinggangcorpuscles danbuah pinggangtubul kumpulan ACR menunjukkan tindak balas PAS yang sengit (42 peratus lebih tinggi daripada kumpulan kawalan). Penebalan membran bawah tanah tiub adalah ciri umum atrofi dan mungkin dikaitkan dengan hyalinosis [14]. Penebalan juga merupakan punca kemungkinan pengurangan pengangkutan aktif dalam PCT menyebabkan mikro-albuminuria [14].
Sempadan berus PCT dalam kumpulan ACR telah terganggu. Kehilangan sempadan berus adalah tanda morfologi terawal fungsi tiub proksimal terjejas [17, 27]. Tambahan pula, kehilangan sempadan berus menjejaskan kuasa reabsorptif PCT dengan kehilangan glukosa, garam, dan sejumlah besar air dalam air kencing [17, 27]. Ini kebanyakannya menerangkan perubahan serologi yang diperhatikan (paras serum urea dan kreatinin yang tinggi). Diameter PCT meningkat 31 peratus dalam kumpulan ACR yang kebanyakannya merupakan mekanisme pampasan untuk memuliharafungsi buah pinggang [15].
Tekanan oksidatif adalah mekanisme patogenik utama di mana ACR mendorongkerosakan buah pinggang. Tekanan oksidatif adalah perubahan dalam keseimbangan antara oksidan dan antioksidan yang memihak kepada oksidan [3]. Ramai penyelidik membuktikan peranan tekanan oksidatif ACR ke atasbuah pinggang[23]. Nilai penanda oksidatif (MDA) dalam kumpulan ACR meningkat sebanyak 1.4-kali ganda, manakala penanda anti-oksidatif (GSH) menurun sebanyak 1.3-kali ganda. Tekanan oksidatif menghasilkan radikal bebas oksigen (ROS) yang bertindak balas dengan banyak biomolekul dalam sel, yang akhirnya membawa kepada kerosakan oksidatif [16]. ROS disingkirkan oleh beberapa mekanisme pertahanan selular yang melibatkan bukan enzimatik (GSH). Protein GSH peroksidase menukar hidrogen peroksida kepada air dan lipidperoksida kepada alkohol masing-masing [30]. Penggunaan ACR yang berpanjangan mengurangkan aktiviti GSH. Akibat ini dalam pengeluaran tambahan O2– dan H2O2 yang menghasilkan pengeluaran OH– [11]. Ramai penyelidik percaya bahawa tahap MDA adalah bukti yang mencukupi bagi tekanan oksidatif [13] dan nilai MDA yang lebih tinggi menunjukkan peningkatan dalam peroksidasi lipid.
Apoptosis juga merupakan satu lagi mekanisme patogen yang melaluinya ACR diinduksibuah pinggangkasih sayang [23]. Tindak balas BAX meningkat 4.5-kali ganda dalam kumpulan ACR. BAX melakukan aktiviti proapoptotik [29]. Resveratol, sebagai salah satu flavonoid, memberikan perlindungan yang tinggi kepadabuah pinggangsebagai glomeruli danbuah pinggangtubulus hampir normal. Berbanding dengan kumpulan ACR, kandungan serat kolagen dan tindak balas PAS daripadabuah pinggangtubul menurun sebanyak 70, 19 peratus . Menambah, tahap kreatinin dan urea menurun sebanyak 51, 47 peratus. Ramai penyelidik merekodkan kesan perlindungan antioksidan eksogen RVS ke atasbuah pinggang[21]. RVS mendorong peranan perlindungan sedemikian melalui kesan antioksidannya kerana tahap MDA menurun sebanyak 45 peratus , manakala tahap GSH meningkat sebanyak 83 peratus berbanding dengan kumpulan ACR. RVS menghalang pengeluaran superoksida daripada sintase nitrik oksida endothelial yang tidak berganding dan meningkatkan ekspresi pelbagai enzim antioksidan [30]. Aktiviti antioksidan banyak flavonoid adalah disebabkan oleh penghapusan langsung radikal bebas oksigen atau spesies oksigen teruja serta perencatan enzim oksidatif yang menghasilkan ROS [26]. Satu lagi mekanisme perlindungan kepada RVS adalah melalui kesan anti-apoptosisnya. Dengan penggunaan RVS, peratusan kawasan sel BAX imunopositif menurun 56 peratus disamakan dengan kumpulan ACR.
KESIMPULANKesimpulannya, ACR menyebabkan gangguan struktur dan fungsi albuah pinggang. Ia mendorongkerosakan buah pinggangmelalui tekanan oksidatif dan apoptosis. Dengan penggunaan RVS, perkara biasabuah pinggangseni bina telah dipelihara dengan sedikit perubahan struktur. RVS menggunakan perlindungannya melalui ciri anti-apoptosis dan antioksidannya.
